La superfamília de receptors scavenger rics en cisteïna (SF-SRCR) és un grup de proteïnes de membrana i/o secretades molt antic i conservat al llarg de l’evolució. Els membres de la SF-SRCR es caracteritzen per la presència d’una o més repeticions d’un domini anomenat SRCR, d’aproximadament 100 aminoàcids (aa) i ric en cisteïna. Malgrat l’alt grau de conservació del domini SRCR, no s’ha descrit una funció o lligand comú per tots els membres de la SF-SRCR. Els estudis realitzats a llarg d’aquesta tesi han permès caracteritzar molecular i funcionalment dos membres solubles relativament nous de la SF-SRCR, S5D-SRCRB (soluble 5 domains-SRCR of group B) i S4D-SRCRB (soluble 4 domains-SRCR of group B). A més, s’ha aprofundit en la descripció del paper que juga DMBT1/Hensin en la diferenciació terminal de les cèl•lules intercalades de ronyó. S5D-SRCRB és una glicoproteïna secretòria altament glicosilada, formada per cinc dominis SRCR, espaiats per pèptids rics en els aa Pro, Ser, Thr (PST), a més d’un domini C terminal de tipus mucina. Les glicosilacions que S5D-SRCRB presenta són del tipus N i O. Al seu torn, S4D-SRCRB és una glicoproteïna formada per quatre dominis SRCR també espaiats per pèptids PST, però únicament conté glicosilacions de tipus O. A més de la caracterització bioquímica dels dos membres, la generació d’anticossos monoclonals contra S5D-SRCRB va permetre estudiar el patró d’expressió tissular d’aquesta proteïna. L’estudi va desvetllar que S5D-SRCRB s’expressava principalment als epitelis, on el tracte urogenital presentava els nivells d’expressió més importants a nivell protèic i d’ARN. Pel que fa la funció de S5D-SRCRB i S4D-SRCRB, es va observar que ambdues proteïnes s’unien de manera dosi-depenent a proteïnes de la matriu extracel•lular (fibronectina i laminina). S5D-SRCRB, a més, interaccionava amb galectina-1 i galectina-3, mitjançant els seus dominis d’unió a lectines. D’altra banda, S5D-SRCRB i S4D-SRCRB interactuaven amb components de la paret bacteriana (peptidoglicà i lipopolisacàrids) i fúngica (glucans lineals), actuant com a reconeixedors dels patrons moleculars associats a patògens (pathogen-associated molecular patterns, PAMPs). Les dues proteïnes eren també capaces d’agregar cultius bacterians (E. coli i S. aureus) i fúngics (C. albicans). Per tant, S5D- i S4D-SRCRB podien actuar com a receptors duals capaços de reconèixer estructures endògens i exògenes, i participar en el manteniment de la homeòstasi de l’organisme. La possibilitat que S5D-SRCRB jugués un paper en la defensa dels epitelis contra infeccions es va estudiar amb més detall en el tracte urogenital, emprant models in vitro i in vivo. Els resultats van revelar que l’expressió de S5D-SRCRB augmentava tant en cultius de la línia cel•lular clone C tipus ß expossats a components de la paret bacteriana, com en els ronyons de ratolins a un model d’infecció en el tracte urinari (urinary tract infection, UTI). El patró d’expressió de S5D-SRCRB també canviava durant el procés de diferenciació terminal de les cèl•lules intercalades de ronyó, i durant l’espermatogènesi en els túbuls seminífres. Per aquest motiu s’ha proposat que S5D-SRCRB pot jugar un paper en la diferènciació cel•lular, com s’ha demostrat que passa en el cas de DMBT1/Hensin. La secreció de DMBT1/Hensin és clau en el procés de diferenciació terminal que pateixen les cèl•lules intercalades en condicions d’acidosi, i pel qual passen d’expressar un fenotip de cèl•lula intercalada tipus ß a un de tipus α. / The scavenger receptor cysteine-rich superfamily (SRCR-SF) members are transmembrane and/or secreted receptors exhibiting one or several repeats of a cysteine-rich protein module of +/-100 aa, named scavenger receptor cysteine-rich (SRCR). Despite the high degree of conservation of SRCR domain, non a shared function neither a ligand has been described for all the SRCR-SF members. Studies conducted on this work characterized two relatively new members of the SRCR-SF: S5D-SRCRB (soluble 5-SRCR domains of group B) and S4D-SRCRB (soluble 4-SRCR domains of group B). In addition, we better described the role of DMBT1/Hensin in terminal differentiation of renal intercalated cells. S5D-SRCRB is a highly glycosylated secretory glycoprotein, consisting of five SRCR domains, spaced by peptides rich in Pro, Ser, Thr (PST), and a mucin-like domain at the C terminal extreme. S5D- SRCRB contains N- and O- glycosylations. On the other hand, S4D-SRCRB is a glycoprotein consisting of four SRCR domains also spaced by PST peptides, but only contains O-glycosylations. S4D- and S5D-SRCRB were shown to bind endogenous extracellular matrix proteins (laminin fibronectin), as well as Pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) present on Gram-positive and Gram-negative bacteria and fungi. PAMP binding by S4D- and S5D-SRCRB induced microbial aggregation and changes in PAMP-induced cytokine release. These abilities suggest that S4d- and S5D-SRCRB might play a role in the innate defense and homeostasis of certain specialized epithelial surfaces. Immunohistochemical and real-time PCR analysis showed significant S5D-SRCRB expression in murine genitourinary and digestive tracts. S5D-SRCRB expression increased when collecting duct cells were infected. S5D-SRCRB expression pattern also changed during terminal differentiation of renal intercalated, and during spermatogenesis in the seminiferous tubule. It has been proposed that S5D-SRCRB may play a role in cell differentiation, in a similar way it does DMBT1/Hensin. This work has shown that DMBT1/Hensin secretion is required during terminal differentiation carried out by intercalated cells in conditions of acidosis, which drives type ß- intercalated cells to α- intercalated cells.

Alzheimer’s disease (AD) is the most common cause of dementia in the elderly, with more than 25 million people affected worldwide. First described in 1907 by the German physician Alois Alzheimer, AD is a neurodegenerative disease characterized by a dramatic progressive loss of synapses and neuronal populations, initially affecting medial temporal lobe structures and finally resulting in diffuse cortical atrophy. The earliest clinical symptoms are episodic memory loss, especially in remembering new items (anterograde amnesia). As the disease progresses, amnesia occurs in conjunction with major executive dysfunctions, such as impairment of language (aphasia), object use (apraxia), recognition of faces or objects (agnosia), abstract reasoning, step-by-step planning, and decision making. This gradual erosion of cognition slowly increases in severity until the symptoms eventually become incapacitating, and at the histological level it is reflected by the progressive spread of specific pathological lesions in a non-random manner across various brain regions. At the histopathological level AD shows two main hallmarks: amyloid plaques and neurofibrillary tangles, occurring in a context of vascular damage, inflammation, oxidative stress, synaptic loss and neurodegeneration. Reelin is an extracellular matrix protein crucial for neural development. In addition, recent studies have shown that in the adult brain Reelin controls distinct plasticity events, including synaptic plasticity and adult neurogenesis. The Reelin signalling cascade has been previously related to Alzheimer Disease (AD) pathogenesis. However, the exact role that Reelin itself plays on the disease is not fully understood. The main aim of this thesis is to investigate the involvement of Reelin in AD aetiology, addressing the question of whether Reelin could act as a protective factor, with eventual therapeutic implications, or rather if it might favour the onset of the pathology. To this end established an strategy to purifiy Reelin protein and to study in vitro its involvement in the process of amyloid fibrils formation. By this approach we found in vitro that Reelin delays amyloid- (Aβ42) fibril formation until it is recruited into amyloid fibrils. Further, Reelin protects against both Aβ42-oligomer induced neuronal death and synaptic loss. We also generated AD mouse models overexpressing Reelin, to address in vivo the impact of Reelin overexpression on the main hallmarks of the disease, such as amyloid fibril formation and phosphorylation of Tau. In detail, we crossed a model of conditional Reelin overexpression (TgRln) from our lab (Pujadas et al., 2010) with two models of AD pathology: J20 and Tet/GSK-3β mice. J20 mice constitutionally express a mutated form of human APP, bearing both the Swedish and the Indiana mutation (hAPP we/Ind) (Mucke et al., 2000), thus being a good model to analyse Aβ pathology. The generated J20 mice overexpressing Reelin are referred to as TgRln/J20. Tet/GSK-3β is a conditional transgenic model of overexpression of GSK-3β, the main kinase for Tau protein, thus being a good model of Taupathology. In TgRln/J20 we showed that Reelin transgene expression delays amyloid plaque formation in vivo. The generated Tet/GSK-3β mice overexpressing Reelin are referred to as TgRln/GSK-3β. Moreover, we show that overexpression of Reelin in J20 AD mice rescues the dendritic spine loss documented for this mouse strain with consequent rescue of the cognitive deficits associated to this AD model, such as non-spatial recognition tasks (assessed by Novel Object Recognition test). Additionally, both aged TgRln and TgRln/J20 mice behaved better than aged wild-type mice, indicating that Reelin protects also from the impairments due to physiological aging. In TgRln/GSK-3β mice we show that Reelin decreases Tau phosphorylation and reduces cognitive deficits in a non-spatial recognition task (Novel Object Recognition). All together these data indicate that by delaying Aβ plaque formation, protecting against neuronal death and synaptic loss, reducing Tau phosphorylation and preventing AD cognitive deficits the Reelin pathway should be considered a therapeutic strategy for the treatment and amelioration of AD pathogenesis and cognitive deficits in normal aging. / La Reelina es una proteína de la matriz extracelular crucial para el desarrollo neural. Además, estudios recientes han demostrado que en el cerebro adulto Reelina controla eventos de plasticidad sináptica y neurogénesis. La cascada de señalización de Reelina ha sido previamente relacionada con la enfermedad de Alzheimer (EA). Sin embargo, aún no se conoce exactamente el papel que Reelina juega en la enfermedad. La EA es la forma más común de demencia en personas mayores y se caracteriza por una dramática pérdida progresiva de sinapsis y poblaciones neuronales. A nivel histopatológico se han descrito dos características principales: los ovillos neurofibrilares (paquetes intracelulares de la proteína Tau hiperfosforilada ) y las placas amiloides (depósitos extracelulares de péptido Aβ). El péptido Aβ se genera por el corte proteolítico de la proteína transmembrana APP (Amyloid precursor protein) por la acción secuencial de las proteasas de membrana β- y γ-secretasa. El Aβ monomérico comienza a agregarse en especies oligoméricas solubles, capaces de provocar disfunción sináptica en la EA. El proceso de agregación termina con la formación de fibrillas amiloides, los constituyentes principales de las placas. En esta tesis se demuestra que Reelina retrasa in vitro la formación de fibrillas amiloides, hasta que queda secuestrada en las mismas, perdiendo su actividad biológica. Además, Reelina protege contra la muerte neuronal y el daño sináptico inducidos por oligómeros de Aβ. También se generan modelos murinos de EA sobreexpresantes de Reelina. En uno de estos modelos (TgRln/J20) se demuestra que la expresión transgénica de Reelina disminuye in vivo la deposición de placas amiloides, previene la pérdida de espinas dendríticas y rescata el deterioro cognitivo asociado a este modelo de EA. En otro modelo (TgRln/GSK-3β) la sobreexpresión de Reelina reduce la fosforilación de Tau. El conjuntos de datos presentados en esta tesis indica que, al disminuir la formación de placas amiloides, al proteger contra la muerte neuronal y la pérdida sináptica, al reducir la fosforilación de Tau y al prevenir el deterioro cognitivo de la EA, la vía de Reelina debe ser considerada una estrategia terapéutica para el tratamiento y la mejora de la patogénesis de la EA.

Olfactory ensheathing cells (OECs) implantation has emerged as a promising therapy for spinal cord injury (SCI), but their regenerative properties seem to depend on the presence of a substrate permissive to cell migration. Studies demonstrate that when transplanted after SCI, the migratory properties of OECs are reduced compared to transplantation in not-injured spinal cords. As after SCI, inhibitory molecules such as myelin associated inhibitors (MAIs) are overexpressed in the site of lesion. Therefore we thought that these molecules could modulate OECs migration capacity. We used a rodent clonal OEC line, TEG3, and we demonstrated that these cells express all the components of the NgR-complex. This complex resulted to be active since TEG3s activated RhoA and increased ERK1-2 phosphorylation in response to acute stimuli of myelin. Indeed, myelin inhibited OECs migration over glass surfaces and also over linearly elastic PAA gels. Moreover using traction force microscopy (TFM), we quantitatively demonstrate that TEG3s largely decrease their traction stress over myelin. This decrease in traction force correlated with decreased focal contacts and redistribution the of F-actin cytoskeleton. In fact, OECs cultured on myelin largely reduced the number of protrusions, stress fibers and FAs. Finally we observed that the incubation of TEG3s with the NgR1 blocking peptide NEP1-40 mainly overcame MAIs-mediated migratory inhibition, restoring the traction forces of these cells and their cytoskeletal organization. Altogether these data suggested us that a cell-based strategy, using TEG3s that has the capacity to overcome the inhibitory action of MAIs, is required in other to enhance their migratory properties after SCI transplantation. Indeed in order to overcome the effects of MAIs over TEG3 we tested two strategies. First we investigated whether a particular type of magnetic nanoparticle (MNP) could be used to control the localization and migration of TEG3s. We confirmed that, in vitro, magnetized TEG3s can survive well without exhibiting stress-associated cellular responses. Moreover, their migration can be modulated by magnetic fields and their transplantation in organotypic culture of spinal cord and peripheral nerve, a model more similar to an in vivo situation, showed positive integration in the model. Second we genetically modified OEC to express the NgR(Ecto)coupled with a GFP using a lentiviral based system in order to visualize them. The NgR(Ecto), contains the amino acids 1–310 of NgR1 and blocks the signaling of myelin and previous studies demonstrated that its presence enhances axonal regeneration after SCI. Engineered OEC were able to express and secrete at high levels the ectodomain in vitro. Moreover, by time lapse analysis we could observe that these cells migrate longer distances than normal OEC over a myelin substrate. To observe the behavior of NgR(Ecto)-OECs in vivo we did a preliminary experiment where cells were implanted in a not-lesioned spinal cord of adult rats. The NgR(Ecto)-OECs migrated more distance both caudal and rostral from the site of injection in comparison with normal OEC. These data suggest a therapeutic potential of both strategies tested for SCI. NgR(Ecto)-OECs once implanted after SCI would migrate more and this would enhance their regeneration capacity. Moreover the secreted ectodomain would interfere with the myelin present at the lesion site improving intrinsic axonal regeneration. We could combine the use of these modified cells with MNPs. With the design of specific magnetic sources we could concentrate OECs near the lesion site and therefore increase their possible interaction with damaged axons. Indeed, further studies are necessary the behavior of this modified cells in a SCI model. / La implantación de OECs ha surgido como una terapia prometedora para lesiones medulares, pero sus propiedades regenerativas parecen depender de la presencia de un sustrato permisivo para la migración celular. En esta Tesis Doctoral demostramos que los inhibidores asociados a mielina (IAMs) pueden modular la capacitad migración de las OECs través la interacción y activación del complejo receptor de NgR (el receptor común para los IAMs). Con el uso de la microscopia de tracción, demostramos cuantitativamente que las OECs disminuyen en gran medida su fuerza de tracción sobre la mielina. Además, esta disminución se pudo correlacionar con una disminución de las adhesiones focales y la redistribución del citoesqueleto de F-actina. La incubación con el péptido NEP1-40, que bloquea NgR1, restableció in gran parte la capacitad migratoria, las fuerzas de tracción de estas células y su organización citoesqueletal. En base a los resultados obtenidos exploramos la viabilidad de dos estrategias diferentes para mejorar las propiedades migratorias de la OECs. Una de ellas trataba del posible uso de nanoparticulas magnéticas para guiar a las células. Aunque esta técnica no aumenta la velocidad intrínseca de migración de las células, permite la concentración y la guía de las mismas hace a un área específica después de la implantación in vivo. Pudimos comprobar que las OECs marcada con NPM no exhiben respuestas celulares asociadas al estrés, y pueden ser guiadas por un campo magnético in vitro. Además comprobamos que las células se integraban bien después de su trasplante de en un modelo organotípico de regeneración de médula espinal/nervio ciático. La segunda estrategia consistió en modificar genéticamente las OECs para que expresaran un ectodomínio por el NgR1 para bloquear los efectos negativos de los IAMs sobre su migración. Pudimos observar que las células modificadas migran más in vitro sobre un sustrato de mielinas comparadas con OECs normales. Además, una vez implantadas en una médula no lesionada, las células modificadas se integran bien en el modelo y migran más que células normal. Los resultados obtenidos indican un potencial terapéutico de ambas estrategias.

In the present thesis, we have studied the evolution of the inflammasome functions in fish. We observed that inflammasome and caspase-1 trigger pyroptotic cell death but they are not involved in the processing of IL-1β. In addition, we have developed a zebrafish-Salmonella infection model to study the role of the inflammasome in the clearance of intracellular bacteria. Finally, we have identified and characterized a new member of the IL-1 family, IL-1Fm2, which is exclusively present in most evolutionarily advanced teleosts. The identification of this new IL-1 family member helps to understand the evolution of this family of cytokines in vertebrates and point out to its complexity. / En la presente tesis doctoral se ha estudiado la evolución de las funciones del inflamasoma en peces, llegando a la conclusión de que tanto el inflamasoma como la caspasa-1 desencadenan muerte celular conocida como piroptosis, pero no son necesarios para el procesamiento de la IL-1β. Además se ha desarrollado un modelo de infección en pez cebra para el estudio del papel del inflamasoma en la eliminación de bacterias intracelulares, como Salmonella. Por último, se ha descrito un nuevo miembro de la familia de la IL-1, IL-1Fm2, perteneciente exclusivamente a los peces teleósteos más avanzados evolutivamente. La identificación de este nuevo miembro de la familia de la IL-1, IL-1Fm2, ayuda a entender la evolución de esta familia de citoquinas en vertebrados e indica su gran complejidad.

OBJETIVOS: 1. Evaluar la capacidad del EE2 de provocar una respuesta estrogénica en vivo en ejemplares macho de dorada 2. Evaluar la capacidad del EE2 de alterar la fisiología y la respuesta inmunitaria local de la gónada 3. Evaluar la habilidad del EE2 de alterar la respuesta inmunitaria sistémica, analizando actividades inmunitarias de leucocitos de riñón cefálico, el perfil de expresión de macrófagos y la capacidad en vivo de responder a un reto inmunológico. 4. Realizar una caracterización funcional del receptor de estrógenos asociado a proteína G tanto in vitro como in vivo. METODOLOGÍA: Se llevo realizó una experimentación in vivo e in vitro. Se usaron ejemplares sanos de dorada (Sparus aurata L.), especie hermafrodita protándrica y de puesta estacional, mantenidos en el Centro Oceanográfico de Murcia (IEO, Mazarrón, Murcia). La experimentación in vivo se llevo a cabo exponiendo a los ejemplares a EE2 o G1 a diferentes dosis y tiempos. En algunos casos, la exposición se simultaneó con una inmunización programada. A continuación, se realizaron, entre otros, análisis de supervivencia, de calidad del esperma, histológicos, determinación de hormonas e IgM en suero, de expresión génica y de citometría de flujo. La experimentación in vitro se desarrollo, principalmente, tratando con leucocitos de riñón cefálico con EE2 o G1 (para la activación específica de la señalización de GPER para su caracterización funcional) a diferentes dosis y tiempos y analizando actividades inmunitarias como fagocitosis y explosión respiratoria y el perfil de expresión génica. CONCLUSIONES: 1. La exposición in vivo a EE2 promueve una respuesta estrogénica evidente caracterizada por un descenso en el IGS, alteración en los niveles séricos de E2, T y 11KT y una inducción en la expresión hepática de vtg. Estos efectos son más evidentes cuando el EE2 se administra en la dieta que cuando se administra en el agua del baño. Además, estos efectos dependen, ligeramente, del estado de desarrollo de los ejemplares. 2. El EE2 incrementa la sensibilidad a estrógenos en gónada y en riñón cefálico ya que aumenta la expresión del REα. 3. La exposición in vivo a EE2 interrumpe la espermatogénesis e induce en el testículo la morfología característica de la etapa de post-puesta. Aunque los túbulos seminíferos continúan llenos de espermatozoides se observa una reducción en el volumen y motilidad de los espermatozoides. Además, el EE2 genera un proceso pro-inflamatorio en la gónada, promoviendo una infiltración masiva de leucocitos y un incremento en la expresión de citoquinas y moléculas implicadas en el reconocimiento y presentación de antígenos. 4. El EE2 disminuye la capacidad de los ejemplares de responder a un estímulo inmunológico in vivo ya que inhibe la producción de citoquinas pro-inflamatorias tras una inmunización aunque no se comporta como inmunosupresor. Además, el EE2 inhibe in vitro las actividades inmunitarias de leucocitos de riñón cefálico y dirige hacia un fenotipo anti-inflamatorio en macrófagos. 5. EL GPER se expresa en tejidos reproductores e inmunitarios de dorada y su expresión no es modulada por su activación. 6. Los granulocitos acidófilos son las células del riñón cefálico que tienen un mayor nivel de expresión de GPER. Éstos expresan un GPER funcional cuya activación in vitro dirige, de manera general, hacia un fenotipo anti-inflamatorio. Dichos efectos son regulados, en parte, por la activación de la ruta de señalización AMPc/PKA/CREB. 7. La activación de GPER no promueve una respuesta estrogénica aunque provoca, en general, un efecto anti-inflamatorio y modula ligeramente la respuesta inmunitaria adaptativa. / OBJETIVES: 1. To evaluate the ability of EE2 to provoke an estrogenic response in vivo in male gilthead seabream. 2. To evaluate the ability of EE2 to alter the physiology and the local immune response of the gonad. 3. To evaluate the ability of EE2 to alter the systemic immune response, analysing immune activities of head kidney leukocytes, the expression profile of macrophages and the in vivo capabilities to respond to an immune challenge. 4. To perform a functional characterization of the G protein-coupled estrogen receptor, GPER, both in vitro and in vivo. METHODOLOGY: In vivo and in vitro experimentation was carried out. For this, healthy specimens of gilthead seabream (Sparus aurata L.) were bred and kept at the Centro Oceanográfico de Murcia (IEO, Mazarrón, Murcia). In vivo experiments were carried out by exposing the specimens to EE2 or G1 at different doses and times. In some cases, the exposure was simultaneous to a scheduled immunization. Afterwards, analysis of survival, sperm quality, histological, determination of hormones and IgM in serum, gene expression and flow cytometry were performed. In general, for the in vitro experiments, leukocytes from head kidney (bone marrow equivalent) were treated with several doses of EE2 and G1 (to specifically activate GPER signalling) at different time points, and analyzing immune activities such as phagocytosis and respiratory burst and gene expression profile. CONCLUSIONS: 1. Exposure to EE2 in vivo promotes an evident estrogenic response characterized by decreased GSI, altered serum levels of E2, T and 11KT, and induced hepatic expression of vtg. These effects are more evident when EE2 is administered in the diet than when is administered in bath water. In addition, its effects slightly depend on the development stage of the specimens. 2. EE2 increases the sensitivity to estrogens in the gonad and the head kidney by increasing the expression of the gene coding for ERα. 3. Exposure to EE2 in vivo disrupts spermatogenesis and induces a characteristic morphology of the post-spawning in the testis. However, the seminiferous tubules were filled with sperm, causing a reduction in the volume and sperm motility. Moreover, EE2 also generates a pro-inflammatory process in the gonad, promoting a massive infiltration of leukocytes and an increased expression of the genes encoding cytokines and molecules involved in antigen recognition and presentation. 4. EE2 decreases the ability of specimens to respond to an immune stimulus in vivo by inhibiting the production of pro-inflammatory cytokines after immunization but does not behave as an immunosuppressor. Moreover, EE2 inhibits in vitro the immune activities of head kidney leukocytes and direct primary macrophages towards an anti-inflammatory phenotype. 5. GPER is expressed in reproductive and immune tissues in gilthead seabream and its expression is not modulated by its activation. 6. Acidophilic granulocytes are the head kidney cells with a higher level of expression of GPER. They express a functional GPER whose activation in vitro leads, in general, to an anti-inflammatory phenotype. These effects are regulated, in part, by activation of the cAMP/PKA/CREB signalling pathway. 7. GPER activation in vivo does not promote an estrogenic response, although in general, provokes an anti-inflammatory effect and slightly modulates the adaptive immune response.

En els darrers anys, el coneixement dels mixozous (Fílum Myxozoa) al Mediterrani ha crescut gràcies a la creixent necessitat de solucionar els problemes sanitaris que aquests paràsits ocasionen en cultius de peixos d'interès comercial. En aquest sentit, Enteromyxum leei és un dels patògens més importants per a l'aqüicultura al Mediterrani tant a nivell sanitari com econòmic. Això és degut a la susceptibilitat que presenten algunes espècies d'interès per l'aqüicultura al Mediterrani com els espàrids. D'altra banda, el seu control és difícil per la capacitat d'E. leei de transmetre's horitzontalment, per l'existència de possibles reservoris de la malaltia en els sistemes sublitorals mediterranis (Padrós i col. 2001), i pel desconeixement del seu cicle de vida i la falta d'estudis sobre el seu tractament i prevenció (Yokoyama i Shirakashi 2007).Per tal d'avaluar la situació de l'enteromixosi produïda per E. leei en els cultius d'espàrids al Mediterrani i per tal de desenvolupar mesures de prevenció i control es va plantejar el projecte europeu MyxFishControl: Diagnosis, epidemiology and control of an enteric myxosporosis of commercial Mediterranean fish (QLRT-2001-00722). La present tesi doctoral contribueix als objectius generals del projecte MyxFishControl en l'estudi de la transmissió, patogènia i desenvolupament d'E. leei dins dels seus hostes. En primer lloc, s'ha realitzat una descripció dels principals estadis de desenvolupament d'E. leei observats en orades (Sparus aurata) i en morrudes (Diplodus puntazzo) mitjançant tècniques d'estudi tradicional al microscopi òptic i electrònic de transmissió i tècniques citoquímiques complementàries com la detecció d'hidrats de carboni mitja o la detecció de lípids. Aquest estudi ha permès descriure cinc estadis de desenvolupament del paràsit i, a més, ha permès establir una possible seqüència temporal d'aquests estadis basada en les observacions del seu creixement i de la seva maduració.D'altra banda, s'ha realitzat un estudi comparatiu al microscopi òptic de l'establiment, la progressió de la infecció i la patogènia d'E. leei en diferents situacions experimentals. Aquest estudi ha permès avaluar estadísticament l'efecte que tenen la metodologia usada per infectar l'hoste, la seva edat i l'espècie a la que pertany, en les característiques de la infecció. En general, s'ha pogut establir que mentre que les lesions que provoca el paràsit són independents d'aquestes variables, la resposta inflamatòria, les taxes d'infecció i la progressió de la infecció sí que en depenen.Per últim, durant el transcurs de les infeccions experimentals en orada es va detectar un organisme desconegut de morfologia semblant a la d'un mixosporidi ancorat a les microvellositats dels entèrocits de l'epiteli intestinal. Per tal de definir la seva identitat i estudiar les característiques de la infecció en el seu hoste s'ha realitzat un estudi al microscopi òptic i electrònic que ha permès descartar la possibilitat que aquest mixosporidi sigui Leptotheca sparidarum o Ceratomyxa sparusaurati. D'altra banda, com aquest mixosporidi comparteix algunes característiques (com la localització o la patogènia) amb E. fugu, s'han realitzat una sèrie proves de PCR per tal d'avaluar la hipòtesi que aquest nou mixosporidi sigui en realitat E. fugu. Aquests estudis, però, no han permès confirmar la identitat d'aquest mixosporidi. / In last years, the knowledge about Mediterranean myxozoans (Phylum Myxozoa) has grown because of the rising necessity to solve the sanitary problems that these parasites cause in cultured commercial fish species. To date Enteromyxum leei is considered a risk to the development of Mediterranean aquaculture due to the high susceptibility showed by some important cultured species like the sparids, the fish-to-fish transmission of this parasite, the difficulty to apply prevention measures and the absence of effective treatments. In order to evaluate the situation of the enteromyxosis caused by E. leei in cultured sparids in the Mediterranean basin and to establish prevention and control measures, the European project MyxFishControl: Diagnosis, epidemiology and control of an enteric myxosporosis of commercial Mediterranean fish (QLRT-2001-00722) was developed. The present PhD thesis contributes to the main objectives of the MyxFishControl project in studying the transmission, pathogenesis and development of E. leei in their fish hosts. The developmental stages of E. leei in gilthead seabream (Sparus aurata) and sharpsnout seabream (Diplodus puntazzo) were described at light and electron transmission microscopes. In addition to traditional ones, some cytochemical techniques were used to detect carbohydrates and lipid inclusions. This morphological study let us to describe five developmental stages of E. leei inside their fish hosts and to propose a life cycle based on the growth and maturation of these stages. Moreover, a comparative study about the establishment, proliferation and pathogenesis of E. leei in different experimental conditions was carried out. Some statistical analyses were performed in order to evaluate the effect of the infection methodology, fish species and size. Although inflammatory reaction, prevalence and progression of the infection depend on these variables, the main pathological changes caused by E. leei in their fish host do not.Finally, during the experimental trials conducted with gilthead seabream, an unknown organism similar to a myxosporean was detected on the epithelial surface of the intestinal mucosa. Morphological and molecular studies were conducted in order to identify this new parasite and to describe the main infection characteristics. The observations at light and electron microscopes let us to rule out the hypothesis that this organism was Ceratomyxa sparusaurati or Leptotheca sparidarum. Although this unknown mixosporean shared some characteristics with Enteromyxum fugu, molecular studies didn't show an acceptable specificity. As a result, to date this mixosporean remain without identify.

El complejo de Golgi participa en el procesamiento, la distribución y el transporte de lípidos y proteínas hacia su destino final dentro de la célula. El transporte desde el Golgi está mediado por intermediarios de transporte (ITs), principalmente vesículas y túbulos. La formación de ITs se inicia con la gemación de la vesícula o el túbulo, a continuación se produce su elongación y finalmente tiene lugar su fisión. Este proceso requiere de una compleja maquinaria molecular en la que intervienen las llamadas proteínas de cubierta, proteínas motoras asociadas al citoesqueleto, y los lípidos de las membranas. Respecto al papel de los lípidos, éstos pueden actuar tanto en el reclutamiento de proteínas citosólicas que participan en la formación de los ITs, como dotando a la membrana de las propiedades físicas óptimas para su deformación en vesículas o túbulos. La curvatura de membrana está facilitada por lípidos con estructura cónica como el ácido lisofosfatídico (LPA), el ácido fosfatídico (PA) y el diacilglicerol (DAG). El DAG cumple una doble función en la formación de ITs desde el Golgi: por una parte actúa en el reclutamiento y la activación de la proteína cinasa D (PKD), necesaria para la correcta fisión de vesículas desde la red trans-Golgi (TGN). Por otra parte ayuda a la formación de curvatura negativa. El DAG en el Golgi está estrechamente regulado por diferentes vías que controlan su formación y metabolismo. Una de estas vías está mediada por las llamadas fosfatasas del ácido fosfatídico (PAPs), que producen DAG a partir de defosforilar el PA. Existen dos familias de proteínas que actúan como fosfatasas del ácido fosfatídico. Las enzimas de la familia PAP1son citosólicas, su actividad catalítica es dependiente de Mg+2, se inhiben por N-etilmaleimida (NSF) y el PA es su único sustrato. Las enzimas PAP2 son proteínas transmembrana, independientes de Mg+2 e insensibles a NSF. Las PAP2 también se conocen como fosfatasas de lípidos fosfato (LPPs), ya que además del PA pueden también catalizar la defosforilación de otros lípidos como la ceramida-1-fosfato (C1P), la esfingosina-1-fosfato (S1P) y el ácido lisofosfatídico (LPA), aunque con diferentes afinidades (PA ~ LPA > C1P > S1P). La inhibición de las PAP por el agente farmacológico propanolol, indica que el DAG que proviene de esta vía es necesario para la formación de ITs desde el Golgi al retículo endoplasmático (RE). En esta tesis hemos demostrado que uno de los miembros de la familia PAP2, la enzima PAP2b, también conocida como LPP3, se localiza en diferentes compartimentos de la vía secretora, desde los sitios de salida del RE (ERES) hasta el complejo de Golgi. El silenciamiento de LPP3: (i) reduce la formación de túbulos desde el compartimento intermedio entre el RE y el Golgi (ERGIC) y el complejo de Golgi, y a su vez incrementa la longitud de aquéllos túbulos formados desde el Golgi; (ii) causa un retraso en el transporte dependiente de Rab6 de la subunidad B de la toxina Shiga desde el Golgi al RE, sin afectar al transporte anterógrado de RE a Golgi; y (iii) a nivel ultraestructural incrementa el número de perfiles vesiculares asociados a las cisternas del Golgi. El silenciamiento de la LPP3 también reduce la síntesis de novo de DAG y los niveles de DAG en el Golgi. Además, también hemos demostrado que la sobreexpresión de un mutante catalíticamente inactivo de la LPP3 reproduce los efectos observados tanto con el silenciamiento de la LPP3, como al inhibir la actividad catalítica de las PAP2 por el propanolol. De forma conjunta, nuestros resultados demuestran que la LPP3, a partir de regular la homeostasis de DAG, participa en la formación de ITs en diferentes compartimentos de la vía secretora, regulando el transporte retrógrado entre el RE y el Golgi. / The Golgi complex is involved in the processing, sorting and transport of membrane components (lipids and proteins) to appropriate subcellular destinations, and is also a membranous platform for signalling, metabolic and cytoskeleton proteins. Transport to and from the Golgi complex is mediated by transport carriers (vesicles and/or tubules), which are generated in sequential stages beginning with the formation of a bud, followed by its elongation, constriction and final fission. Lipids play an essential role in this process through different mechanisms: they can recruit cytosolic proteins, modulate protein functions and modify the architecture and physical properties of the membrane bilayer. Thus, membrane curvature is facilitated by conical lipid molecules such as lysophosphatidic acid (LPA), phosphatidic acid (PA) and diacylglycerol (DAG). In previous results of our group we have demonstrated that the DAG produced by the phosphatidic acid phosphatase type 2 family of proteins (PAP2) is necessary for the retrograde transport from the Golgi to the endoplasmic reticulum (ER). In this thesis we have demonstrated that that the PAP2 family member lipid phosphate phosphatase 3 (LPP3, also known as PAP2b) localizes in compartments of the secretory pathway from ER export sites to the Golgi complex. The depletion of human LPP3: (i) reduces the number of tubules generated from the ER–Golgi intermediate compartment and the Golgi, with those formed from the Golgi being longer in LPP3-silenced cells than in control cells; (ii) impairs the Rab6-dependent retrograde transport of Shiga toxin subunit B from the Golgi to the ER, but not the anterograde transport of VSV-G or ssDsRed; and (iii) induces a high accumulation of Golgi-associated membrane buds. LPP3 depletion also reduces levels of de novo synthesized DAG and the Golgi-associated DAG contents. Remarkably, overexpression of a catalytically inactive form of LPP3 mimics the effects of LPP3 knockdown on Rab6-dependent retrograde transport. We conclude that LPP3 participates in the formation of retrograde transport carriers at the ER–Golgi interface, where it transitorily cycles, and during its route to the plasma membrane.

El teixit adipós blanc (WAT) exerceix un paper crític en el control del metabolisme de l'energia. En efecte, modificacions en la seva capacitat d'emmagatzematge o la seva funció endocrina, com en cas de l'obesitat i lipodistròfia, estan associades al desenvolupament de desordres metabòlics com resistència de la insulina i diabetis del tipus 2. Múltiples factors de transcripció i coreguladors modulen el desenvolupament apropiat i la funció del WAT. A més d'estar expressat en WAT, el paper de PGC-1β en aquest teixit encara no s'ha descrit. Per estudiar la seva funció en WAT, hem generat ratolins que manquen PGC-1β en teixits adiposos (PGC1β-FAT-KO) així com també un model in vitro en el qual PGC-1β es va silenciar en adipòcits 3T3-L1. L'anàlisi del perfil d'expressió gènica de WAT de ratolins de PGC1β-FAT-KO va revelar que PGC-1β regula gens mitocondrials implicats en la fosforilació oxidativa (OxPhos) i en el cicle de Krebs (TCA). Els nostres resultats mostren una correlació entre nivells mRNA disminuïts de gens de OXPHOS i els nivells de proteïnes codificades per aquests gens. A més, hem estudiat l'efecte down-regulació de gens diana de PGC-1β en la funció de mitochondrial. Hem analitzat l'activitat d'alguns enzims mitochondrials i hem trobat que l’activitat citrat sintasa i cytochrome c oxidasa disminueixen en WAT de ratolins PGC1β-FAT-KO, suggerint una disfunció mitochondrial. WAT és també el principal objectiu de les tiazolidinediones (TZDs), que es creu exerceixen el seu efecte sobre la sensibilització a la insulina mitjançant l'augment de la biogènesi mitocondrial en adipòcits. Un dels objectius d'aquest treball és el d'elucidar la contribució de PGC-1β per a aquest procés. Els nostres resultats mostren que PGC-1β s'indueix en WAT per estímuls farmacològics com TZDs, i també que PGC-1β, però no PGC-1α, és el principal mediador de l'augment de l'expressió de gens mitocondrials i la funció oxidativa induïda per TZDs en adipòcits blancs. De fet, l'ús de siRNA cobtra PGC-1β va demostrar que aquest coregulator es requereix per a l'augment d'expressió dels gens mitocondrials, el consum d'oxigen i l’oxidació de palmitat dependents de TZDs en cèl·lules 3T3-L1. A més, la supressió de PGC-1β en WAT va confirmar que PGC-1β és necessari per mediar el efectes de les TZDs sobre la inducció dels gens mitocondrials OxPhos, TCA i l'oxidació dels àcids grassos. No obstant això, els nostres resultats mostren que PGC-1β no és necessari per intervenir els efectes de les TZDs sobre biogènesi mitocondrial malgrat el seu paper de regulació transcripcional en processos oxidatius, ja que els ratolins augmenten normalment el seu mtDNA en resposta a la TZDs. D'altra banda, el treball actual és el primer a demostrar que no cal un ple metabolisme oxidatiu en WAT per la capacitat sensibilitzant de la insulina de les TZDs. A més dels adipòcits blancs, una proporció variable de adipòcits brite (cèl·lules capaces de dur a terme termogènesi) poden trobar-se en WAT. Per estudiar el paper de PGC-1β en el reclutament d'adipòcits marrons en WAT, hem exposat ratolins PGC1β-FAT-KO a CL-316,234, un β3-adrenergic agonista que és un potent inductor del reclutament de brite. Diverses evidències exposades en aquest treball donen suport al requisit de PGC-1β per a l'expressió de marcadors tipics d’adipocit marró en WAT. Per exemple, el tractament amb CL-316,234 indueix l’expressió de PGC-1β en paral·lel a l'expressió gens termogènics a WAT. Així mateix, l’estimulació β3-adrenèrgica millora l'expressió de gens OxPhos, TCA i de l’oxidació de lipids, a causa del elevat contingut mitocondrial dels adipòcits brite. L'absència de PGC-1β en WAT impedeix l’up-regulació β-adrenèrgic-dependent d'aquests mateixos gens, suggerint un paper de PGC-1β en l'expressió de marcadors de l'adipòcit marró en els adipòcits brite. En conjunt els nostres resultats indiquen que PGC-1β és important per a la funció mitocondrial basal i induïda per TZDs en WAT, que la capacitat oxidativa mitocondrial completa no és essencial per als efectes insulinosensibilitzants de les tiazolidinediones. D'altra banda, els nostres resultats suggereixen que PGC-1β és necessàri per a la diferenciació d'adipòcits brite en WAT induïda per diversos estímuls com les TZD i els β-adrenèrgics. / White adipose tissue (WAT) plays a critical role in the control of energy metabolism. Indeed, alterations in its storage capacity or its endocrine function, as in the case of obesity and lipodystrophy, are associated with the development of metabolic disorders such as insulin resistance and type 2 diabetes. Multiple transcription factors and coregulators modulate proper development and function of WAT. Besides being expressed in WAT, the role of the coactivator PGC-1β in this tissue has not been addressed yet. To study its function in WAT, we have generated mice that lack PGC-1β in adipose tissues (PGC1β-FAT-KO mice) as well as an in vitro model in which PGC-1β was knocked down in 3T3-L1 adipocytes. Gene expression profiling analysis of WAT from PGC1β-FAT-KO mice revealed that PGC-1β regulates mitochondrial genes involved in Oxidative Phosphorylation (OxPhos) and Tricarboxylic Acid Cycle (TCA). Our results show a correlation between decreased mRNA levels of OxPhos genes and the levels of proteins encoded by these genes. In addition, we have studied the effect of down-regulation of PGC-1β-target genes on mitochondrial function. We have analyzed the activity of some mitochondrial enzymes and have found that citrate synthase and cytochrome c oxidase activity are decreased in WAT of PGC1β-FAT-KO mice, suggesting a mitochondrial dysfunction. WAT is also the main target of thiazolidinediones (TZDs), which are thought to exert their insulin-sensitizing effects by promoting mitochondrial biogenesis in adipocytes. One of the objectives of this work is to elucidate the contribution of PGC-1β to this process. Our results show that PGC-1β is highly inducible in WAT by pharmacological stimuli like TZDs, and also that PGC-1β, but not PGC-1α, is the main mediator of the increase in mitochondrial gene expression and oxidative function induced by TZDs in white adipocytes. Indeed, the use of short interfering RNA against PGC-1β demonstrated that this coregulator is required for TZDs-dependent increases in mitochondrial gene expression, oxygen consumption and palmitate oxidation in 3T3-L1 cells. Additionally, targeted deletion of PGC-1β in WAT confirmed that PGC-1β is necessary to mediate TZDs-induction of mitochondrial genes related to OxPhos, TCA cycle and fatty acid oxidation. However, our results show that PGC-1β is not necessary to mediate the effects of TZDs on mitochondrial biogenesis despite its role in transcriptional regulation of oxidative pathways, since mice normally increase mtDNA in response to TZDs. Moreover, the current work is the first to show that full mitochondrial gene expression and oxidative metabolism in WAT is not required for the insulin-sensitizing capacity of TZDs. In addition to white adipocytes, a variable proportion of brite adipocytes (cells capable of carrying on thermogenesis) can be found in WAT. To study the role of PGC-1β in recruitment of brown adipocytes within WAT, we have exposed PGC1β-FAT-KO mice to the β3-adrenoceptor agonist CL-316,234, a potent inductor of brite recruitment. Several evidences exposed in this work support the requirement of PGC-1β for the expression of brown-characteristic markers in white adipose tissue. For instance, CL-316,234 treatment up-regulated PGC-1β in parallel to thermogenic gene expression in WAT. Likewise, β3-adrenergic stimulation enhanced the expression of OxPhos, TCA and lipid oxidation genes, owing to the elevated mitochondrial content of brite adipocytes. The absence of PGC-1β in WAT prevented β-adrenergic-dependent up-regulation of these same genes, suggesting a role of PGC-1β in the expression of brown adipocyte markers in brite adipocytes. Taken together our findings indicate that PGC-1β is important for basal and TZDs-induced mitochondrial function in WAT, and that induction of mitochondrial oxidative capacity is not essential for the insulin-sensitizing effects of thiazolidinediones. Moreover, our results suggest that PGC-1β is required for the differentiation of brite adipocytes within WAT induced by diverse stimuli like TZDs and β-adrenergic agonists.

La integridad del ADN del espermatozoide es de vital importancia, dado que puede comprometer la viabilidad del embrión. Para cuantificar la fragmentación en el ADN espermático se han desarrollado distintas técnicas, que han servido para relacionar dicha fragmentación con la esterilidad de origen masculino. Teniendo en cuenta que algunos de los individuos estériles van a someterse a técnicas de reproducción asistida, se ha valorado si la fragmentación en el ADN espermático i) disminuye tras procesar el eyaculado mediante gradientes de densidad, ii) tiene algún impacto sobre los resultados clínicos tras un ciclo de Fecundación In Vitro, iii) se correlaciona con la presencia de anomalías meióticas en espermatocitos y/o anomalías cromosómicas en espermatozoides y iv) puede disminuir utilizando columnas MACS® para procesar la muestra seminal o acortando el periodo de abstinencia sexual. Los distintos resultados han concluido que el porcentaje de fragmentación en el ADN disminuye al procesar el eyaculado mediante gradientes de densidad, es independiente de los resultados clínicos obtenidos tras un ciclo de Fecundación In Vitro, no se correlaciona con la presencia de anomalías meióticas en espermatocitos ni anomalías cromosómicas en espermatozoides y disminuye tanto procesando la muestra seminal mediante MACS como acortando el periodo de abstinencia. Estos resultados nos han permitido un mejor asesoramiento a los pacientes que presentan un alto porcentaje de fragmentación en el ADN espermático y ofrecer herramientas para disminuirlo. / Sperm DNA integrity is of vital importance, since it may jeopardize the viability of the embryo. To quantify the sperm DNA fragmentation various techniques have been developed which have been used to correlate the said fragmentation with male sterility. Given that some of the sterile individuals will undergo assisted reproductive techniques, it has been assessed whether the fragmentation in the sperm DNA i) decreases after processing the ejaculate by means of density gradients, ii) has any impact on clinical outcomes after an IVF cycle iii) correlates with the presence of abnormal meiotic spermatocytes and/or chromosomal abnormalities in sperm and iv) may decrease using MACS columns to process the semen sample or shortening the period of sexual abstinence. Our results have concluded that the percentage of fragmented DNA decreases if the ejaculate is processed by means of density gradient, is independent of the IVF cycle outcome, does not correlate with the presence of meiotic abnormalities in spermatocytes and chromosomal abnormalities in sperm, and can decrease by processing the ejaculate with MACS or shortening the period of abstinence. These results have allowed us to give a better advice to the patients with a high percentage of sperm DNA fragmentation and to provide tools to decrease it.

El Teixit adipós epicàrdic (TAE) és un dipòsit de greix visceral inusual amb continuïtat anatòmica i funcional amb les artèries coronàries i amb el miocardi. S’ha vist que en condicions fisiològiques el TAE mostra propietats cardioprotectores però en condicions patològiques el TAE pot afectar localment a les artèries coronàries a través de la secreció de substancies proinflamatòries i pot estar implicat en la patogènesi de l'aterosclerosi. L’objectiu d’aquest estudi es determinar el paper del TAE en la fisiopatologia de l’aterosclerosi i l’efecte de la senyalització dels receptors Toll like (TLR). S’analitzen en el TAE i en el teixit adipós subcutani (TAS) els tipus de poblacions, la secreció de citocines i d’adipocines, l’activació dels STATs i els nivells d’expressió gènica dels pacients amb aterosclerosi (CAD) i individus control (NCAD) en estat basal i després de l’estimulació amb lligands TLR. A més també s’analitza la secreció de citocines i adipocines en mostres de sang perifèrica dels dos tipus de pacients. Els resultats van mostrar que el TAE dels pacients amb CAD presenta importants infiltrats compostos per limfòcits B, limfòcits T i macròfags i més producció de citocines inflamatòries i menys producció de adiponectina i leptina comparat els individus NCAD. En el TAE dels pacients amb CAD els nivells d’activació basals de STAT1 es troben més elevats i els nivells d’activació basals de STAT3 es troben més baixos comparat els individus NCAD. Es detecten per immunohistoquímica presencia de cèl·lules mesotelials en el TAE i s’observa major expressió gènica de IL18, IL13-RA2, de queratines (KRT7, KRT8, KRT18, KRT19) i de microRNAs (MIR-492 i MIR-622) en el TAE dels pacients amb CAD que reforcen la implicació de les cèl·lules mesotelials en la regulació del TAE i la seva implicació en la patologia CAD. A més en el TAS dels pacients amb CAD s’observa menor expressió gènica de varis membres de la família de RNAs petits nucleolar (snoRNAs): SNORD i SNORA. A mes, s’observa un perfil més proinflamatori del TAE en comparació el TAS, més marcat en els pacients amb CAD, tan a nivell basal com desprès de la resposta inflamatòria induïda pel lligands TLR. L’efecte de l’estimulació del teixit adipós a nivell d’expressió gènica mostra que la via canònica de l’interferó es trobava induïda exclusivament per LPS i no per FSL-1 i la xarxa integrada del PPAR-γ es troba reprimida exclusivament en el TAE i no en el TAS. A més en els pacients amb CAD mostren que els gens induïts tan a nivell basal com desprès de l’estimulació amb lligands TLR estan relacionats funcionalment amb la immunitat i per altra banda els individus NCAD inclouen gens induïts relacionats en el metabolisme Els nostres resultats mostren que tan el TAE com el TAS són capaços de respondre de manera adequada a l’estimulació dels lligands TLR, encara que el TAE mostra un perfil més inflamatori i disminució de l’expressió de gens relacionats amb el metabolisme. Per altra banda hem vist que la presència de cèl·lules immunes en el TAE dels pacients amb CAD pot alterar el metabolisme normal amb major producció de citocines inflamatòries, menor producció de adipocines i diferent activació dels STATs. Aquestes dades semblen indicar que en el TAE dels pacients amb CAD l’augment de l’estat inflamatori provocaria una disminució de l’activitat metabòlica normal, sembla que l’estimulació del TAE aproparia els mecanismes fisiològics que ocorrien en la patologia de l’aterosclerosi. Aquestes dades recolzen la idea que el TAE dels pacients amb CAD estaria amb un estat de inflamació que es caracteritzaria per l’augment de les respostes immunes i una disminució de l’activitat metabòlica normal. / Epicardial adipose tissue (TAE) is an unusual visceral fat depot with anatomical and functional continuity with the coronary arteries and myocardium. Under physiological conditions TAE shows cardioprotective properties but in pathological conditions TAE can affect locally the coronary arteries by secretion of proinflammatory substances and may be involved in the pathogenesis of atherosclerosis. The aim of this study was to determine the role of TAE in the pathophysiology of atherosclerosis and the effect of Toll-like receptor signaling (TLR). We analyzed in TAE and subcutaneous adipose tissue (TAS) types of cells, cytokine and adipokines production, STAT activation and gene expression in patients with atherosclerosis (CAD) and control subjects (NCAD) in the basal state and after stimulation with TLR ligands. In addition, we also analyzed cytokine and adipokines secretion of peripheral blood samples in both types of patients. The results showed that the TAE of patients with CAD has lymphocyte infiltrates composed of B and T lymphocytes and macrophages and produce more inflammatory cytokines and less production of adiponectin and leptin compared NCAD subjects. We detected in TAE of patients with CAD higher activation of STAT1 and lower activation of STAT3 compared to NCAD subjects. We detected by immunohistochemistry mesothelial cells in TAE and higher gene expression of IL18, IL13-RA2, keratins (KRT7, KRT8, KRT18, KRT19) and microRNA (MIR-492 and MIR-622) in TAE of patients with CAD, this results reinforce the involvement of mesothelial cells in the regulation of TAE and its implication in the disease of CAD. Furthermore, we observed in TAS of patients with CAD lower gene expression of several members of the small nucleolar RNAs family (snoRNAs): SNORD and SNORA. We detected that TAE has higher proinflammatory profile compared to TAS, more marked in patients with CAD, both baseline and after stimulation by TLR ligands. The effect of stimulation with TLR ligands in adipose tissue gene expression shows that the canonical pathway of interferon was induced only by LPS and not by FSL-1 and integrated network of PPAR-γ is suppressed only in TAE and not in the TAS. Also, in patients with CAD genes induced at both baseline and after stimulation with TLR ligands are functionally related to immunity and in NCAD subject induced genes related to metabolism Our results show that TAE and TAS are able to respond appropriately to stimulation of TLR ligands, although the TAE shows more inflammatory profile and decreased expression genes related to metabolism. Furthermore, we have seen that the presence of immune cells in the TAE of patients with CAD may alter the normal metabolism with increased production of inflammatory cytokines, with lower production of adipokines and different activation of STATs. These data suggest that patients with CAD, has increased TAE inflammatory profile would cause a decrease in the normal metabolic activity, it appears that stimulation TAE approaching physiological mechanisms that happened in the pathology of atherosclerosis. These data support the idea that the TAE patients with CAD would be a state of inflammation characterized by increased immune responses and decreased of normal metabolic activity.