Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2018-04-19T17:29:27Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1046673 bytes, checksum: 303cdb874bd37b4e599895a7138301a8 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-19T17:29:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1046673 bytes, checksum: 303cdb874bd37b4e599895a7138301a8 (MD5) Previous issue date: 2017-07-21 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Recentemente, uma nova camada de defesa antiviral foi caracterizada em Arabidopsis thaliana, que é mediada pelo receptor NIK (NSP-Interacting Kinase) e protege a planta contra begomovirus. Quando a planta é infectada por um vírus, NIK1 oligomeriza com outro receptor imune ou com NIK1 para transfosforilar um ao outro e consequentemente, ativar o domínio cinase de NIK1. NIK1 é capaz de se ligar a proteína ribossomal L10 (RPL10), e é capaz de mediar sua fosforilação e subsequente translocação ao núcleo, onde RPL10 interage com LIMYB (L10-interacting Myb domain-containing protein) para regular negativamente a expressão de genes de proteínas ribossomais, levando a supressão global da tradução. Os mRNAs virais não são capazes de escapar ao mecanismo de regulação de tradução do hospedeiro, aumentando assim a resistência contra begomovirus. A proteína viral NSP interage com NIK1 e inibe sua atividade cinase, aumentando a patogenicidade do begomovírus em seu hospedeiro. Foi demonstrado em trabalhos anteriores que o mutante NIK1-T474D é um excelente alvo para engenharia genética, pois é constitutivamente ativada em linhagens transgênicas. Nesse trabalho, primeiramente foi realizado a reconstrução in silico da via de sinalização antiviral mediada por NIK1 em tomateiro, identificando possíveis componentes homólogos dessa via. Em seguida, foi examinada a possibilidade do duplo mutante T474D-T469A de conferir resistência contra begomovírus em linhagens transgênicas de tomateiro. Além disso, a linhagem transgênica NIK1-T474D-T469A foi transformada com o componente a jusante da via de sinalilzação antiviral, LIMYB de Arabidopsis, e examinamos o efeito da reconstituição dessa via de defesa durante a infecção viral. Os resultado dessa investigação indicam que a expressão de NIK1-T474D/T469A em linhagens transgênicas de tomateiro foi efetiva para suprimir a expressão de genes ribossomais, indicando que o duplo mutante é constitutivamente ativado em tomateiro. Além disso, a expressão de LIMYB em combinação com NIK1-T469A/T474D promoveu um efeito aditivo na repressão dos genes de proteínas ribossomais, possivelmente revelando uma melhorestratégia para obtenção de resistência a begomovírus. Para averiguar essa hipótese, as linhagens transgênicas foram desafiadas com os begomovírus de tomateiro ToYSV e ToSRV e a infecção foi monitorada por meio de sintomatologia e quantificação do DNA viral. Os resultados demonstraram que a expressão de NIK1-T469A/T474D em combinação com LIMYB é potencialmente um alvo melhor para modificar geneticamente genótipos suscetíveis. / Recently, a new layer of antiviral defenses was characterized in Arabidopsis thaliana, which is mediated by the immune receptor NIK (NSP-Interacting Kinase) and protects plants against begomoviruses. Upon virus infection, NIK1 oligomerizes with itself or another immune receptor to transphosphorylate one another and to activate the NIK1 kinase domain. Activated NIK1 mediates the phosphorylation of the ribosomal protein L10 (RPL10) and subsequent translocation to the nucleus, where RPL10 interacts with LIMYB (L10-interacting Myb domain-containing protein) to down-regulate the expression of ribosomal protein genes, leading to global translation suppression. The viral mRNAs are not able to escape this host translation regulatory mechanism enhancing host resistance against begomoviruses. The viral protein NSP interacts with NIK1 and inhibits its kinase activity, increasing the pathogenicity of begomoviruses by their hosts. We have previously demonstrated that the NIK1 mutant T474D is an excellent target for engineering begomovirus resistance because it is constitutively activated in transgenic lines. In this investigation, we first reconstructed in silico the NIK1-mediated antiviral signaling in tomato by identifying the tomato homologs of the components of the signaling pathway. Then, we examined the property of the double mutant T474D-T469A to confer resistance against begomoviruses in tomato transgenic lines. Furthermore, we overexpressed the downstream component of NIK1 antiviral signaling, LIMYB from Arabidopsis, in the T474D-T469A transgenic lines and examined the effect of reconstituting the antiviral pathway on begomovirus infection. Our results indicated that expression of T474D/T469A in transgenic lines was effective to suppress the expression of ribosomal protein genes, indicating that this double mutant is constitutively activated in tomato. Furthermore, expression of LIMYB in combination with T469A/T474D promoted an additive effect in ribosomal protein gene repression, possibly uncovering a better strategy to acquire begomovirus resistance. To examine this hypothesis, we challenged the transgenic lines with the tomato-infecting begomoviruses ToYSV and ToSRV and monitored the infection by symptomatology and quantitation of viral DNA.Our results demonstrated that expression of T469A/T474D in combination with LIMYB holds the potential to be a better target for engineering begomovirus resistance in susceptible genotypes. / Ficha catalográfica com erro: Morais de Ávila, Larissa Gabriela.

Submitted by Maurílio Figueiredo (maurilioafigueiredo@yahoo.com.br) on 2013-03-06T21:13:13Z No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_ClonagemExpressãoCDNA.PDF: 1649529 bytes, checksum: 00aae23f984e9db472f5a8b04b6c2e83 (MD5) / Approved for entry into archive by Neide Nativa (neide@sisbin.ufop.br) on 2013-03-13T19:33:50Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_ClonagemExpressãoCDNA.PDF: 1649529 bytes, checksum: 00aae23f984e9db472f5a8b04b6c2e83 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-03-13T19:33:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_ClonagemExpressãoCDNA.PDF: 1649529 bytes, checksum: 00aae23f984e9db472f5a8b04b6c2e83 (MD5) Previous issue date: 2006 / O veneno de cobras, escorpiões, aranhas e outros animais venenosos é uma fonte rica em toxinas. Uma característica importante de algumas toxinas é o fato de serem espécie específicas. Neste trabalho, nós realizamos a clonagem da seqüência codificante para a toxina LTx2 da aranha Lasiodora sp. no vetor de expressão pET11a. Esta toxina foi previamente identificada, através da varredura de uma biblioteca de cDNA da glândula de veneno desta aranha. A análise de similaridade, feita com o programa de alinhamento local BLAST, mostrou que esta toxina apresenta similaridade com as toxinas huwetoxina-II e huwetoxina-VII da aranha Selenocosmia huwena, bem como com as toxinas LTx1 e LTx3 da Lasiodora sp. Após a clonagem no vetor de expressão, nós sequenciamos o produto da clonagem pelo método de Sanger e verificamos que o mesmo foi inserido no frame correto. A indução da expressão da toxina recombinante foi feita usando IPTG na concentração de 0,6 mM, por 3-4 horas. Através de ensaios imunoquímicos, nós constatamos que neste sistema a proteína recombinante é expressa sobretudo na forma de corpos de inclusão. Definimos então, uma estratégia para obter a toxina solúvel renaturada. Utilizando uma solução contendo uréia na concentração de 6 M realizamos a desnaturação dos corpos de inclusão, e procedemos a renaturação da proteína recombinante através de diálise em um tampão de renaturação. A amostra foi então submetida a uma cromatografia líquida de alta pressão em coluna de fase reversa. Através de eletroforese e Western Blotting, nós observamos que a estratégia de purificação foi eficiente. Realizamos então um ensaio antimicrobiano, onde observamos que a toxina recombinante, na concentração de 400 mg/mL. inibiu o crescimento dos microrganismos Escherichia coli, Salmonella Agona e Staphylococcus epidermidis. A expressão e recuperação da proteína recombinante em maior quantidade permitirá a realização de testes em outros organismos e a realização de ensaios eletrofisiológicos. ____________________________________________________________________________________________________ / ABSTRACT: The venom from snakes, scorpions, spiders and other venomous animals is a very rich source of potent toxins. An interesting feature of some toxins is their remarkable species specificity. In the present work we cloned a sequence which codifies for the toxin LTx2 from the venom of the spider Lasiodora sp, in the expression vector pET11a. This toxin was previously identified in the screening of the cDNA library of the total venom. This toxin, when submitted to the local alignment tool, BLAST, shown similarity with the toxins huwetoxina-II and huwetoxina-VII, from the venom of the spider Selenocosmia huwena, as well as with the toxins LTx1 and LTx3 from Lasiodora sp. venom. After cloning in expression vector we verified if the fragment was inserted in the correct frame using the Sanger DNA sequencing method. The expression of the target protein was made by adding 0,6 mM IPTG to the media followed by a 3 to 4 hours incubation. With the assistance of immunochemical assays, we were able to detect that the target protein was been expressed in the form of inclusion bodies. Then we defined a strategy to recover the soluble refolded protein. Using a solution containing 6 M urea we proceed the solubilization of the inclusion bodies. The refolding of the soluble protein was made by the dialysis method in refolding buffer. The sample was, then, submitted to high pressure liquid chromatography, in a reversed phase column, to purify the protein. The purifying process was efficient, as shown by the Western Blotting and electrophoresis results. After that, we made an anti microbial assay, where we could see that the target protein, in the concentration of 400 mg/mL, inhibited the growth of the organisms used in the test. The expression and recovery of larger amounts of the target protein will allow tests with this toxin in other organisms and electrophysiological experiments.

Submitted by Maurílio Figueiredo (maurilioafigueiredo@yahoo.com.br) on 2013-03-13T22:26:00Z No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_InfluênciaManutençãoLeishmania.PDF: 347399 bytes, checksum: 25dc8ca820f87dc97fb24a9b64724315 (MD5) / Approved for entry into archive by Neide Nativa (neide@sisbin.ufop.br) on 2013-03-15T16:03:13Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_InfluênciaManutençãoLeishmania.PDF: 347399 bytes, checksum: 25dc8ca820f87dc97fb24a9b64724315 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-03-15T16:03:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_InfluênciaManutençãoLeishmania.PDF: 347399 bytes, checksum: 25dc8ca820f87dc97fb24a9b64724315 (MD5) Previous issue date: 2008 / Parasitos pertencentes ao gênero Leishmania quando são mantidos em cultura por passagens sucessivas apresentam redução na infecciosidade. As cepas infectantes dos parasitos possuem maior atividade ecto-nucleotidásica do que as não infectantes. Para avaliar a existência de correlação entre o tempo de manutenção em cultura, a infecciosidade e a hidrólise de nucleotídeos em Leishmania amazonensis o parasito citado foi mantido em cultura por passagens sucessivas. Os parasitos mantidos em cultura por poucas passagens (p<15) apresentaram maior hidrólise dos nucleotídeos ATP, ADP e AMP e maior porcentagem de formas infectantes quando comparados com aqueles mantidos em cultura por várias passagens (p>100). Para avaliar o curso da infecção causada por passagens diferentes do parasito, os camundongos C57BL/6 foram inoculados na pata com formas promastigotas totais ou metacíclicas. O curso da infecção foi acompanhado por um período de oito semanas. Os camundongos inoculados com os parasitos mantidos em cultura por poucas passagens desenvolveram lesões maiores e produziram IFN- em menor quantidade quando comparados com o grupo de animais que recebeu o inóculo dos parasitos mantidos em cultura por várias passagens. Não foi verificada a produção de IL-4. O re-isolamento de parasitos, dos animais inoculados com os parasitos mantidos em cultura por várias passagens, mostra que apenas uma passagem pelo hospedeiro vertebrado não alterou a atividade ecto-nucleotidásica. O observado indica que a manutenção dos parasitos em cultura pode selecionar aqueles que apresentam reduzida atividade ecto-nucleotidásica. O tratamento dos parasitos mantidos em cultura por poucas passagens com adenosina causou alteração no metabolismo de nucleotídeos e na infecciosidade dos mesmos. Os dados sugerem a existência de correlação entre o tempo de manutenção em cultura, a infecciosidade e a atividade ecto-nucleotidásica em L. amazonensis. _______________________________________________________________________________ / ABSTRACT: It is usually accepted that maintenance of Leishmania parasites in culture leads to a decrease in the parasite’s ability to cause infection in the vertebrate host. Previous work from our laboratory suggests that the infectivity of different Leishmania species correlates with the level of ecto-nucleotidasic activity. Studies from other laboratories, also demonstrated that no infectivity strains of Leishmania amazonensis have decreased apirasic activity. Based on these evidences, the present study evaluated the correlation between the maintenance of L. amazonensis in culture for several passages (>100), the ecto-nucleotidasic activity, its infectivity and the immune response induced by the infection in C57BL/6 mice. Our results show that long term culture of L. amazonensis not only leads to decreased metacyclogenesis but, more importantly, that these parasites present reduced ecto-nucleotidasic activity. This decreased infectivity is associated with a decrease in IFN-g production by lymph node and spleen cells. Furthermore, re-isolation of long term cultured parasites from lesions of infected mice did not recover the level of ectonucleotidasic activity. Finally, we show that treatment of L. amazonensis promastigote cultures with adenosine leads to a decreased ability to hydrolyze extracellular ATP and ADP and that infection by these parasites resulted in decreased lesion development. Our results reinforce the hypothesis that infectivity by Leishmania parasites is, at least, partially dependent on the activity of ecto-nucleotidases.

Submitted by Maurílio Figueiredo (maurilioafigueiredo@yahoo.com.br) on 2013-03-15T20:31:46Z No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_ClonagemExpressãoSequência.PDF: 5671313 bytes, checksum: 6449585170e71dbb4b26ba69ffcac214 (MD5) / Approved for entry into archive by Neide Nativa (neide@sisbin.ufop.br) on 2013-03-20T14:11:44Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_ClonagemExpressãoSequência.PDF: 5671313 bytes, checksum: 6449585170e71dbb4b26ba69ffcac214 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-03-20T14:11:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_ClonagemExpressãoSequência.PDF: 5671313 bytes, checksum: 6449585170e71dbb4b26ba69ffcac214 (MD5) Previous issue date: 2010 / Peptídeos neurotóxicos encontrados em venenos animais têm despertado um grande interesse de pesquisadores. A possibilidade de utilizá-los como ferramentas moleculares para estudos em canais iônicos, além do uso como bioinseticidas e/ou como biofármacos, tem impulsionado as pesquisas nessa área. Experimentos com o veneno bruto da aranha caranguejeira Lasiodora sp mostraram que o mesmo atua em canais iônicos de pequenos vertebrados e de invertebrados. Recentemente, construímos uma biblioteca de cDNA a partir dos mRNAs presentes na glândula de veneno dessa aranha. A varredura desta biblioteca, usando a técnica de ELISA, e o sequenciamento de DNA, permitiram a identificação de cinco toxinas presentes no veneno, nomeadas LTx1, LTx2, LTx3, LTx4 e LTx5. Experimentos realizados com a toxina recombinante LTx2, em células musculares BC3H1, mostraram que esse peptídeo bloqueia canais de cálcio tipo-L e inibe a recarga de Ca2+ dos estoques intracelulares. A estrutura primária do peptídeo LTx2 é muito similar a dos peptídeos LTx1 e LTx3, portanto, espera-se que essas toxinas possuam mescanismos de ação semelhantes. Por outro lado, a sequência de aminoácidos da LTx4 e da LTx5 são bem diferentes, tanto quando comparadas com a LTx1, LTx2 e LTx3, quanto entre si, o que leva a acreditar que elas possam atuar em diferentes canais e/ou ter diferentes mecanismos de ação. Neste trabalho, a sequência codificante para o peptídeo maduro LTx4 foi subclonada no vetor de expressão pET21b (Novagen). A estratégia foi inserir o gene de interesse sob o controle do promotor T7 e obter um produto expresso em fusão com uma cauda de seis histidinas. A confirmação da clonagem foi realizada através de PCR, digestão do DNA plasmidial com endonucleases de restrição e, finalmente, seqüenciamento dos DNAs extraídos dos clones positivos. A indução da expressão do peptídeo LTx4 foi realizada com a adição de 1mM de IPTG ao meio de cultura. Nos ensaios de imunodetecção utilizamos o anticorpo monclonal anti His-Tag. O peptídeo recombinante foi identificado tanto em experimentos de Western Blot como em experimentos de Dot Blot. O peptídeo recombinante foi expresso exclusivamente na forma de corpos de inclusão e em maiores quantidades após três a quatro horas de indução. O perfil protéico foi analisado em géis de poliacrilamida (Tricina-SDS). Experimentos de purificação do peptídeo encontramse em andamento. ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________ / ABSTRACT: Peptide neurotoxins found in animal venoms have attracted great interest of researchers. The possibility of using them as tools for molecular studies of ion channels in addition to use as biopesticides and/or as biopharmaceuticals has boosted research in this area. Experiments with the venom of the spider Lasiodora sp showed that it acts on ion channels of small vertebrates and invertebrates. Recently, we constructed a cDNA library from mRNAs present in the venom gland of this spider. The screen of this library, using ELISA and DNA sequencing, allowed the identification of five toxins in the venom, named LTx1, LTx2, LTx3, LTx4 and LTx5. Experiments conducted with recombinant toxin LTx2 in muscle cells BC3H1 showed that this peptide blocks L-type calcium channels and inhibits Ca+2 recharge from intracellular stores. The primary structure of the peptide LTx2 is very similar to the peptides LTx1 and LTx3, and consequently it is expected that these toxins have similar action mechanisms. On the other hand, the amino acids sequences of LTx4 and LTx5 are quite different, both when compared with LTx1, LTx2 LTx3 and as between themselves, which leads to believe that they can act on different channels and/or have different action mechanisms. In this work, the coding sequence for the mature peptide LTx4 was subcloned at the expression vector pET21b (Novagen). The strategy used was to insert the gene of interest under the control of T7 promoter and obtain the expression product in fusion with a six histidine tag. The cloning confirmation was performed by PCR, plasmid DNA digestion with restriction enzymes, and finally, sequencing of DNAs extracted from the positive clones. The induction of LTx4 peptide expression was performed by addition of 1mM IPTG to the culture medium. At the immunodetection assay, we used monoclonal antibody anti His-tag. The recombinant peptide was identified by both Western Blot and Dot Blot experiments. The recombinant peptide was expressed exclusively as inclusion bodies and in larger amounts after three to four hours of induction. The protein profile was analyzed on polyacrylamide gel electrophoresis (Tricine-SDS). Peptide purification experiments are in course.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Ambiental, Florianópolis, 2015. / Made available in DSpace on 2016-02-23T04:04:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 337521.pdf: 7414124 bytes, checksum: 0aaf4be1c70017105366642a546315ab (MD5) Previous issue date: 2015 / O objetivo desta pesquisa foi avaliar o desempenho na remoção de nitrogênio em sistemas de wetlands de fluxo vertical para o tratamento de efluente doméstico bruto (Sistema Francês), com o aporte da biologia molecular para a compreensão dos processos. O estudo foi realizado na França ao longo de 16 meses. Dois filtros pilotos com superfície de 2m² cada foram testados e operados com um ciclo de alimentação intermitente (2,5 dias e carga hidráulica aplicada de 0,23 m/d) e um ciclo de repouso (4,5 dias). Uma camada de saturação foi criada no fundo do filtro a fim de propiciar condições para a desnitrificação subsequente à nitrificação. Duas profundidades de saturação foram testadas: 25 cm e 15 cm. O monitoramento incluiu parâmetros físico-químicos (SST, DQO dissolvida, N-NH4+, NTK e N-NO3-), bem como, medições contínuas (Eh, O2, °C e comportamento hidráulico). As análises estatísticas demostraram que o melhor desempenho de remoção para os parâmetros analisados ocorreu quando os filtros operaram com 25 cm de saturação (com TDH teórico de 6,66 h). Os resultados de todos os parâmetros avaliados demonstraram variações no desempenho do sistema, além de indicar que melhorias no projeto ou adição de um estágio de tratamento posterior são necessárias para que seja possível a remoção completa do nitrogênio. Levando em consideração que cada filtro piloto representa um único filtro do primeiro estágio do Sistema Francês, as eficiências de remoção (nitrificação de 57% e desnitrificação de 85%) foram consideradas satisfatórias. Em relação à verificação do perfil microbiano, três filtros em escala piloto e quatro estações em escala real foram testados. Para todos os sistemas avaliados não houve diferença estatística em relação aos diferentes pontos de coletas, demostrando uma boa e homogênea repartição do afluente na superfície dos filtros. Uma maior quantidade (n° cópias gene/g pellet) de bactérias nitrificantes foi observada no período de inverno, o que retrata um efeito temporal, visto que as bactérias nitrificantes possuem crescimento lento. Através do sequenciamento, foi observado para ambos os filtros a presença dos gêneros Nitrosonomas, Nitrosospira e Nitrospira, sendo dominantes as bactérias oxidantes de amônia (AOB). Os filtros pilotos apresentaram diferença significativa (p: 0,001) para a variável estação do ano. Todas as estações em escala real apresentaram resultados semelhantes. Dentre as profundidades testadas, a maior quantidade de AOB foi observada em 30 cm. Esse resultado demonstra que a camada de matéria orgânica depositada na superfície tem papel importante na estrutura do perfil microbiano. O ciclo de alimentação/repouso avaliado apresentou um aumento quantitativo e qualitativo na comunidade bacteriana nos dias de alimentação e decaimento nos dias de repouso, o que demonstra a dinâmica de crescimento das bactérias. Esse resultado pode indicar que um período de repouso utilizado no Sistema Francês de no máximo sete dias é suficiente para impedir que haja decaimento excessivo da comunidade bacteriana, otimizando, assim, a eficiência do tratamento.<br> / Abstract : This research aims to evaluate the performance on nitrogen removal in vertical flow wetlands systems for the treatment of raw wastewater (French system), with the contribution of molecular biology to understand the processes. This study was performed in France over 16 months. Two pilot systems with 2m² surfaces each, were tested and operated with intermittent feeding cycle (2.5 days and a 0.23 m/d applied hydraulic load) and 4.5 days resting cycle. A saturation layer was created in the in the filter background in order to provide conditions for the denitrification subsequent to nitrification. Two saturations depths were tested: 25 and 15 cm. The monitoring included physico-chemical parameters (TSS, dissolved COD, NH4+ - N, NO3- - N and TKN), as well as continuous measurements (Eh, O2, °C and hydraulic behavior). The statistical analysis demonstrated that the best removal performance for the parameters analyzed occurred when the filters operated at 25 cm saturation (with theoretical HRT of 6.66 h). The results of all evaluated parameters showed variations in system performance, they also indicate that improvements in the design or addition of a further processing stage are required so that complete removal of nitrogen is possible. Considering that each pilot filter represents a single filter of the first stage of the French system, the removal efficiencies (57% nitrification and 85% denitrification) were considered satisfactory. Regarding the verification of the microbial profile, three pilot scale filters and four real scale systems were tested. For all evaluated systems, there was no statistical difference in relation to the different collection points, demonstrating a good and homogeneous distribution of the surface of the affluent filters. A larger amount (nº gene copies/g pellet) of nitrifying bacteria was observed in the winter period, which illustrates a temporal effect, since the nitrifying bacteria have slow growth. Through sequencing, it was observed for both filters the presence of Nitrosomonas sp, Nitrosospira sp and Nitrospira sp, being dominant ammonia oxidizing bacteria (AOB). The pilots systems showed significant differences (p: 0.001) for the variable season of year. All full-scale systems showed similar results. Among the tested depths, the greater amount of AOB was observed in 30 cm. This result shows that the organic matter layer deposited on the surface, plays an important role in microbial profile structure. The evaluated feeding?resting cycles showed a quantitative and qualitative increase in the bacterial community in the feeding days and decay in the resting days, which demonstrates the growing bacteria dynamic. This result can indicate that a resting period used in the French System of up to seven days, is enough to prevent excessive decay of the bacterial community, thus optimizing the efficiency of the treatment.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Físicas e Matemáticas, Programa de Pós-Graduação em Química, Florianópolis, 2013 / Made available in DSpace on 2013-07-16T21:03:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 316807.pdf: 34709679 bytes, checksum: 94a98b5a2513edf19ba85c6d27bc617f (MD5) / Sistemas que se conectam através de múltiplas ligações de hidrogênio são a pedra angular dos processos de reconhecimento molecular e estão cada vez mais sendo empregados em processos de auto-montagem molecular. Sendo assim, optou-se por conduzir uma investigação dos efeitos causados por substituintes na estrutura eletrônica e na magnitude das ligações de hidrogênio intermoleculares em sistemas tipo AAA-DDD. Os efeitos dos substituintes foram investigados empregando-se duas análises topológicas, a Função de Localização de Elétrons e a Teoria Quântica dos Átomos em Moléculas (ELF e QTAIM, respectivamente), e duas análises energéticas, uma baseada na decomposição da energia de interação intermolecular, Su-Li EDA, e a outra no formalismo dos Orbitais Naturais de Ligação, NBO. Os resultados baseados QTAIM e ELF e NBO indicam que a presença de substituintes com grande poder retirador de elétrons aumentam o grau de covalência das interações intermolecular nos sistemas analisados, enquanto que substituintes doadores de elétrons tendem a diminuí-lo. Os resultados Su-Li EDA reforçam essas evidências e fornecem ainda um perfil quantitativo da influência dos diferentes grupos substituintes e da posição de substituição nas energia de interação intermolecular. Foi constatado que para os sistemas estudados, a influência dos substituintes na força das ligações de hidrogênio é apenas moderado.<br> / Abstract : Systems that connect via multiple hydrogen bonds are the cornerstone of molecular recognition processes in biology and are increasingly being employed in supramolecular chemistry, specifically in processes of molecular self-assembly. In this scenario, it was decided to carry out an investigation of the effects caused by different substituents on the electronic structure and thus on the magnitude of the intermolecular hydrogen bonds in AAA-DDD systems. The effects of substituents were investigated by employing two topological analyses, the Electron Localization Function of and Quantum Theory of Atoms in Molecules (ELF and QTAIM, respectively), and two energetic analyses, one based on the decomposition of intermolecular interaction energy, Su-Li EDA, and the other on the formalism of Natural Bonding Orbitals, NBO. The evaluation of variations in geometric parameters of hydrogen bonds caused by the substitution was also performed. The results based on hydrogen bond local descriptors (geometry, QTAIM and ELF) indicate that the presence of electron withdrawing substituents increases the degree of covalency of the intermolecular interactions for the analyzed systems, while electron donating substituents tend to decrease it. The strength of the intermolecular hydrogen bonds proved to be dependent on both nature and the position of the substituent group. The results of the energy decomposition analysis, Su-Li EDA, reinforce these evidences and also provide a quantitative profile of the influence of different substituents and the position of substitution on intermolecular interaction energy. It was found that for the systems under study, the influence of substituents on the strength of hydrogen bonds is only moderate.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. / Made available in DSpace on 2012-10-21T08:29:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 195580.pdf: 642656 bytes, checksum: 23ca54a36dcd034d40bc7b31793b886a (MD5) / O vírus rábico pertence à Ordem Mononegavirales e Família Rhabdoviridae, sendo constituído por um RNA de sentido negativo, não-segmentado e que codifica para cinco proteínas (N, NS, M, G e L). São conhecidos até o momento 7 genótipos virais, sendo o genótipo 1 formado pelo vírus rábico clássico, com distribuição mundial. A genotipagem de amostras do vírus é realizada mais comumente pela análise dos genes da nucleoproteína e glicoproteína, embora a região não-codificante G-L tenha sido sugerida para caracterização de amostras mais homogêneas. O presente trabalho descreve a genotipagem e a análise filogenética de amostras de vírus rábico isoladas em SC durante o ano de 2002, através do seqüenciamento automatizado de produtos de RT-PCR. A extração de RNA viral, transcrição para cDNA e amplificação via RT-PCR do gene da nucleoproteína e da região não-codificante G-L, são descritas em detalhes. Os resultados demonstraram que a porção 5´ do gene da nucleoproteína é altamente conservada entre as amostras estudadas e divergentes das amostras padrão de laboratório, sendo todas classificadas como genótipo 1. A comparação da seqüência nucleotídica destas amostras com outros isolados brasileiros disponíveis no GenBank, questiona a distribuição espécie-específica, sugerida por outros autores, levantando a possibilidade de que os agrupamentos por regiões geográficas possam ser relevantes. A análise da região não-codificante G-L revelou alto grau de variabilidade entre as amostras catarinenses, possibilitando a distribuição das mesmas em dois grupos. Nenhuma destas amostras apresentou o sinal clássico de parada de transcrição na extremidade 5´ do gene da glicoproteína, relatado no modelo de pseudogene viral. Além disso, três isolados também não apresentaram este sinal na extremidade 5´ da região não-codificante G-L, sugerindo uma possível transcrição bicistrônica entre o gene da glicoproteína e a polimerase viral. Outra possibilidade é que existam novos sinais de parada de transcrição (para o gene da glicoproteína e da região não-codificante G-L) e de início de transcrição (para o gene da polimerase) ainda não descritos. A relevância destes achados é discutida em detalhes.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:13Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-10-05Bitstream added on 2014-06-13T18:43:16Z : No. of bitstreams: 1 santos_ji_dr_botib.pdf: 2854322 bytes, checksum: 40144832d1328710b9a79f30a62356ba (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O envenenamento por picadas de serpentes é um importante problema de saúde pública em muitos países tropicais e subtropicais. Aspectos científicos, médicos e sociais relacionados ao envenenamento por serpentes do gênero Bothrops são especialmente importantes no Brasil já que estes animais são responsáveis por aproximadamente 90% dos acidentes ofídicos relatados em nosso país. Um dos principais problemas relacionados ao acidente botrópico é o proeminente dano tecidual local cuja patogênese é complexa e envolve a ação combinada de uma variedade de componentes do veneno. As fosfolipases A2 (PLA2s) são os componentes mais abundantes no veneno e tem papel fundamental quando se trata do estabelecimento de lesão muscular. O presente trabalho descreve estudos estruturais com miotoxinas que adotam enovelamento de PLA2s (PLA2s homólogas) com o objetivo de melhor entender a relação estrutura – função destas toxinas. Para tanto, estudos estruturais por cristalografia de difração de raios X com Lys49-PLA2s de venenos botrópicos complexadas com os inibidores manganês e ácido rosmarínico (AR) foram realizados. A estrutura cristalográfica de uma miotoxina Asp49-PLA2 homóloga complexada com cálcio também foi elucidada. Adicionalmente, o arranjo quaternário de miotoxinas Asp49-PLA2s homólogas do gênero Bothrops foi revisado e características estruturais relevantes para a expressão da miotoxicidade destas proteínas foram apontadas. A estrutura cristalográfica do complexo formado entre uma Lys49-PLA2 e o inibidor AR evidencia que este inibidor interage com a proteína na entrada de uma dos canais hidrofóbicos do dímero protéico, estabelecendo ligações de hidrogênio com átomos dos resíduos Phe3, Lys7, Leu10, Gln11 e Gly15 do monômero com a qual interage. Já no... / Envenoming resulting from snakebites is an important public health problem in many tropical and subtropical countries. Scientific, medical and social aspects related to envenoming by snakes from Bothrops genus are especially important in Brazil because these animals are responsible for approximately 90 % of all ophidian accidents reported in our country. One of the main problems regarding bothropic accidents is a prominent local tissue damage whose pathogenesis is complex and involves the combined action of a variety of venom components. Phospholipases A2 (PLA2s) are the most abundant muscle-damaging components of these venoms playing a central role in the muscle damage establishment. The present work reports structural studies with myotoxins that adopt a PLA2 fold (PLA2- like myotoxins) aiming a better understanding of their structure-function relationship. For this purpose, X-ray crystallographic studies of Lys49-PLA2s from bothropic snake venoms complexed to the inhibitors manganese and rosmarinic acid (RA) were performed. The crystallographic structure of the complex formed between an Asp49-PLA2-like myotoxin and calcium was also solved. Additionally, the quaternary assembly of Asp49-PLA2-like myotoxins from Bothrops genus was reviewed and relevant structural features for their myotoxicity expression were pointed out. The crystallographic structure of the complex formed between a Lys49-PLA2 and the inhibitor RA demonstrates that the inhibitor interacts with the protein in the entrance of one of its hydrophobic channel, establishing hydrogen bonds with atoms of the residues Phe3, Lys7, Leu10, Gln11 and Gly15 of the monomer with which it interacts. For the complex formed between a Lys49-PLA2 and the inhibitor Mn2+ the manganese ion is coordinated by atoms of the... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:39Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2003-12Bitstream added on 2014-06-13T19:43:13Z : No. of bitstreams: 1 silva_mas_dr_botfca.pdf: 607178 bytes, checksum: 8767818b570f503bd311abcd47a19493 (MD5) / Na espécie Casearia sylvestris Sw. (Flacourtiaceae) são consideradas duas variedades botânicas: C. sylvestris var. língua, com característica arbustiva e ocorrência em savanas arbustivas e C. sylvestris var. sylvestris, de caráter arbóreo em vegetação florestal ou arbustiva. A literatura afirma ser bastante problemático definir os limites destas variedades através de parâmetros morfológicos sendo portanto, importante identificar diferenças genéticas e fitoquímicas entre estas. Este trabalho teve como objetivo identificar em seis populações naturais de Casearia sylvestris de ocorrência no Cerrado e Mata Atlântica do estado de São Paulo diferenças genéticas e químicas entre as variedades lingua e sylvestris, realizando estudo da variabilidade genética da espécie, por meio de marcador molecular do tipo RAPD. Foram coletados dados de localização geográfica (altitude, latitude e longitude). As extrações de DNA foram feitas a partir de 100 mg de folhas utilizando o método de extração CTAB. Nove primers foram utilizados para aplicação da técnica. A partir de matriz binária de similaridade gerou-se o dendrograma pelo índice de Jacard, utilizando o método de agrupamento UPGMA. A correlação das distâncias geográficas com distâncias genéticas foi obtida pelo teste de Mantel, enquanto que a análise de variância molecular (AMOVA) e o índice de Shannon foram utilizados para verificar as diferenças entre e dentro das populações. Folhas da espécie foram submetidas à extração em metanol, e a quantificação de rutina foi realizada utilizando um cromatográfo líquido de alta eficiência. Praticamente toda variabilidade da espécie é representada pela variabilidade intrapopulacional e a análise de agrupamento mostrou maior similaridade entre as populações de um mesmo bioma, revelando uma diferença genética entre as duas variedades botânicas... . / Two botanical varieties have been considered in Casearia sylvestris species: C. sylvestris, lingua variety with a shrubby characteristic, occurring in bushy savannah and C. sylvestris, sylvestris variety with an arboreous type in forest or shrubby vegetation. The limits of these varieties based on morphological parameters are vey tenuos, making molecular and phytochemical markers very important to identify. This work aimed to identify genetic and chemical diffrences between lingua and sylvestris varieties in six natural populations of Casearia sylvestris from Cerrado and the Atlantic Forest in São Paulo state, using (RAPD) molecular marker and chemical markers. Samples have been collected in order to analyze geographic location data (altitude, latitude and longitude). DNA extraction was performed using 100 mg of leaves through the CTAB procedure. Nine primers were used for the technique application. The dendrogram was obtained from the matrix of pairwise distances through the Jaccard’s similarity index using the UPGMA grouping method. A Mantel test was used to analyze correlations between genetic and geographical distances, while the molecular variance analysis and the Shannon index were used to determine the intra- and interpopulation divergences. For the phytochemical study leaves of the species were submitted to extraction in methanol and rutin quantification was carried out using a high-performance liquid chromatographer. Practically all species variability are represented by the intrapopulation variability and the grouping analysis showed higher similarity among populations of the same biome, revealing a genetic diversity between the two botanical varieties. The majority of soils where was collected“guaçatonga” is present is of high acidity and predominantly of medium texture. Nevertheless, most soil indicator values showed diversity among populations of savannah and forest... (Complete abstract, click electronic address below).

Orientador : Prof. Dr. Alexander W. Biondo / Orientador : Prof. Albert Icksang Ko / Coorientador : Prof. Dr. Marco Aurélio Krieger / Coorientador : Dr. Alex Hoffmaster / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 27/02/2012 / Inclui referências : f. 150-169 / Resumo: cuja sintomatologia é inespecífica. Humanos desenvolvem formas graves de leptospirose e os métodos diagnósticos atuais não são eficazes para a detecção precoce da doença. O uso de um método de PCR em tempo real pode permitir o diagnóstico precoce e a quantificação das bactérias em amostras clínicas; além da quantificação do risco ambiental em amostras de água. Foi demonstrado que o método permite a detecção das leptospiras em amostras de sangue total coletadas nos primeiros seis dias de doença, após os quais a carga bacteriana decai de modo inversamente proporcional ao título de anticorpos. O limite mínimo de detecção foi estimado em 280 GEq/mL. O ponto de corte prognóstico foi estimado em 159 GEq/mL para o desenvolvimento de LPHS, com sensibilidade de 64,3% (IC 95% 35,1-87,2%), especificidade de 68,8% (IC 95% 62,8-74,3%) e acurácia 68,0%. Para óbito, o ponto de corte prognóstico foi definido em 1.181 GEq/mL, com sensibilidade de 76,5% (IC 95% 50,1-93,2%), especificidade de 89,3% (IC 95% 85,0-92,8%) e acurácia de 88,3%. A seleção do kit para extração do DNA e estabelecimento de parâmetros de concentração, volume inicial de amostra e limite mínimo de detecção permitiu a adaptação do método de qPCR para a quantificação das leptospiras em amostras ambientais. O método adaptado foi validado em estudo conduzido com amostras ambientais coletadas na comunidade de Pau da Lima, em Salvador (Bahia, Brasil). Os resultados apontaram maior positividade entre as amostras coletadas em baixa altitude (50% das amostras positivas), bem como entre as amostras coletadas pela manhã em comparação com a tarde (17,7% vs. 5,8%). A positividade foi maior entre amostras de esgoto do que entre amostras de água empoçada (17,7% vs. 5,6%). Também houve diferença de positividade entre as amostras coletadas nos períodos úmido e com umidade intermediária (16,0% vs. 9,7%). Assim, concluímos que o método de qPCR é uma ferramenta útil para o diagnóstico e avaliação prognóstica em pacientes com suspeita clínica de leptospirose. O método também foi eficaz na identificação de possíveis focos de infecção a partir da avaliação de amostras de água coletadas em área endêmica. Palavras-chave: Leptospira, leptospirose, PCR em tempo real, sangue total, carga bacteriana, prognóstico, amostra ambiental de água. / Abstract: are non-specific. Humans develop severe forms of leptospirosis and the current diagnostic methods are not suited for the early diagnosis of the disease. The use of a real-time PCR method allowed for an early diagnosis and bacterial quantification in clinical samples, as well as quantification of environmental burden in water samples. It has been shown that this method allows for the detection of leptospires in whole blood samples obtained during the first six days of illness, after which the bacterial load decrease is inversely proportional to the raise in antibody titer. The lower limit of detection was estimated to be 280 GEq/mL. The prognostic threshold was estimated at 159 GEq/mL for the development of LPHS, with sensitivity of 64.3% (95% CI 35.1- 87.2%), specificity of 68.8% (95% CI 62.8-74.3%) and accuracy of 68.0%. For death, the prognostic threshold was set at 1.181 GEq/mL, with sensitivity of 76.5% (95% CI 50.1-93.2%), specificity of 89.3% (95% CI 85.0-92.8%) and accuracy of 88.3%. Selection of the commercial kit for DNA extraction, and establishment of concentration parameters, initial sample volume and lower limit of detection led to the adaption of the qPCR method to allow for the quantification of leptospires in environmental samples. The adapted method was validated in a study conducted with environmental samples collected in the slum community of Pau da Lima, in Salvador (Bahia, Brazil). Results showed a higher positivity for samples collected at low altitudes (positivity of 50%), as well as for samples collected in the morning when compared to those collected in the afternoon (17.7% vs. 5.8%). Positivity was also higher for sewage than for puddle water (17.7% vs. 5.6%). There was also difference in positivity for samples collected during the wet season when compared to those collected during the period with intermediate humidity (16.0% vs. 9.7%). Therefore, we conclude that the qPCR method is a useful tool for the diagnosis and prognostic evaluation of patients with a clinical suspicion of leptospirosis. The method was also reliable in identifying possible infection sites through the evaluation of water samples collected from an endemic area. Keywords: Leptospira, leptospirosis, real time PCR, whole blood, bacterial load, prognosis, environmental water sample.