Los tumores del sistema nervioso central (SNC) abarcan menos de un 2 % del total de casos de cáncer diagnosticados cada año a nivel mundial (aproximadamente 175.000) representado entre 0,4 y 25,4 de casos por 100.000 adultos. A pesar de ello, constituyen una fuente importante de mortalidad y discapacidad. Actualmente los conocimientos que se tienen sobre el desarrollo de los tumores es reducido, porque en la mayor parte de los casos los tumores cerebrales se detectan en estado avanzado de desarrollo (como consecuencia, principalmente, de la aparición de síntomas que llevan al paciente a indagar sobre su estado). Es por esto que se tienen pocos datos de las fases iniciales de desarrollo de estos tumores. Por tanto, es necesario esclarecer el fenotipo molecular de la progresión de tumores cerebrales in vivo, con el objeto de conocer mejor su evolución y poder así mejorar su detección, ya que cuanto más se tarde en alcanzar el diagnóstico correcto, más se reducen las posibilidades de la persona afectada de sobrevivir al tumor. El trabajo de esta tesis, se ha centrado en intentar comprender los lípidos móviles. Cuando se habla de lípidos móviles (ML, en la abreviatura clásica anglosajona) visibles por espectroscopía de RMN, se hace referencia básicamente a las resonancias provenientes de las cadenas de ácidos grasos de lípidos neutros en triacilgliceroles, apareciendo las más características a 0,9, 1,3, 2,0 y 5,3 ppm. El interés por entender el origen celular de estas resonancias proviene de su aparición en numerosas muestras biológicas, tanto asociadas con malignidad y muerte celular como con procesos benignos como diferenciación y variación de la velocidad de proliferación. Actualmente no se conoce el significado celular de los cambios vistos en espectroscopia de resonancia magnética en los lípidos móviles, aunque se cree que se trata más bien de cambios biofísicos más que bioquímicos, ya que se ha comprobado que su concentración no varía, lo que varía es la detección mediante MRS. Para obtener más información sobre el origen celular de los lípidos móviles, se trabajó con cultivos celulares de células de glioma de rata (C6) que se estudiaron con HR-MAS a diferentes velocidades para estudiar el efecto de dicha velocidad en la “visualización” de dichos lípidos móviles. Así mismo, se desarrollaron modelos in vitro de gotículas celulares y se inmovilizaron dichos modelos para ver cómo afectaba a la “visualización” de lípidos móviles. La espectroscopia de resonancia magnética nuclear de protón (¹H MRS) se presenta como una posible alternativa para la caracterización de tumores cerebrales, ya que es una técnica que permite obtener información, de forma no invasiva, de la presencia de algunos productos del metabolismo celular. Con estos datos se pretende esclarecer el fenotipo molecular de tumores cerebrales in vivo, lo que nos permitiría reconocer patrones que nos ayuden a identificar los diferentes tipos de tumores cerebrales. Siguiendo este objetivo, en esta tesis se trabajó con modelos preclínicos de ratón con glioblastoma, oligodendroglioma de grado II y III y parénquima cerebral sano y se desarrollaron cuatro clasificadores de tipo y grado tumoral nuevos para tumores cerebrales preclínicos en ratón mediante el uso del programa Spectra Classifier aplicado a matrices de datos de imagen espectroscópica (IERM). / Central nervous system tumors (CNS) represent less than 2% of all cases of cancer diagnosed each year worldwide (approximately 175,000), which means between 0.4 and 25.4 cases per 100,000 adults. Despite this, they constitute an important source of mortality and disability. Current knowledge about the etiology of these tumors is scarce, because in most cases they are detected when they are already in an advanced state, when symptoms appear. Due to this fact, there is not much information about the early stages of development of those tumors. Therefore, it is necessary research on the progression of the molecular phenotype of brain tumors in vivo, in order to better understand their evolution and improve their detection, because the time spent to achieve the correct diagnosis may reduce the survival possibilities of the person afflicted by the pathology. Work in this thesis has mostly focused on mobile lipids. Mobile lipids (ML), visible by NMR spectroscopy, are resonances from fatty acyl chains of neutral lipids in triacylglycerols, the most characteristic of them resonating at frequencies of 0.9, 1.3, 2.0 and 5.3 ppm. The interest in understanding the cellular origin of those resonances arises from their presence in many biological tissues, associated with malignancy and cell death, as well as with benign processes such as differentiation or with changes in the proliferation rate. Currently, the cellular meaning of the changes observed with magnetic resonance spectroscopy in ML remains unknown. One hypothesis is that it could be associated to biophysical rather than biochemical changes, since it is not the concentration of ML that changes, but their detectability by MRS. In order to obtain more information about the cellular origin of ML, the work of this thesis was performed on rat glioma cells (C6) and High-resolution, Magic Angle Spinning (HR-MAS) NMR spectroscopy, at different spinning rates, to evaluate how such spinning rate affects the "visualization" of ML. Also, an in vitro model of artificial liipid droplets was developed. These artificial lipid droplets were than immobilized into a solid support to see how this would perturbate their NMR "visibility". Proton nuclear magnetic resonance spectroscopy (¹ H MRS) in vivo, is also a feasible alternative for the preoperative characterization of brain tumors, since it is a technique that allows to obtain information, in a non-invasive way, about the presence of products of cellular metabolism. In vivo ¹ H MRS data were also used in this thesis to clarify the molecular phenotype of brain tumors in vivo, thus allowing to recognize patterns that may be of help to identify the different types of brain tumors. To reach this goal, magnetic resonance spectroscopic imaging data from preclinical mouse models with glioblastoma, grade II and III oligodendroglioma and healthy brain parenchyma were used to develop four tumor type and grade classifiers using the program Spectra Classifier.

Aquesta tesis s’emmarca en el camp de les carboxipeptidases citosòliques de mamífers, centrant-­‐se particularment en els membres 2 i 3 d’aquesta subfamília de metalocarboxipeptidases. Aquest treball constitueix el primer estudi sobre la funció d’aquests enzims a través d’aproximacions in silico, in vitro i in vivo. Aquesta tesis consta de les parts descrites a continuació. El primer capítol introdueix el camp de les matalocarboxipeptidases, els microtúbuls, les modificacions post-­‐traduccionals de la tubulina i estableix els objectius de la tesi. El segon capítol és una compilació dels procediments experimentals i materials utilitzats en el treball experimental. El tercer capítol presenta la caracterització funcional de la carboxipeptidasa citosòlica 3 humana. Els resultats d’aquest estudi han estat la base pel quart capítol, on es descriu la funció de la CCP2. Ambdues CCP2 i CCP3 isoformes de ratolí s’estudien mitjançant enginyeria de proteïnes i utilitzant els models de ratolí knockout de CCP2 i CCP3. Els capítols III i IV es subdivideixen en un resum del capítol, els resultats que descriuen el detall dels descobriments i una discussió. A continuació es presenta una discussió general sobre CCP2 i CCP3, el seu rol en la cèl·∙lula i en el context de la subfamília de carboxipeptidases que, en mamífers, consta de sis gens codificants per enzims amb activitat deglutamilasa. La tesis finalitza amb un resum de les conclusions. El capítol IV juntament amb els experiments de modelat estructural del capítol III són la base de la següent publicació científica: Tort O, Tanco S, Rocha C, Bièche I, Seixas C, Bosc C, Andrieux A, Moutin MJ, Avilés FX, Lorenzo J, Janke C. The cytosolic carboxypeptidases CCP2 and CCP3 catalyze posttranslational removal of acidic amino acids. MBoC. doi:10.1091/mbc.E14-­‐06-­‐1072 / This thesis is situated in the field of the mammalian cytosolic carboxypeptidases, particularly focusing in members 2 and 3 from this subfamily of metallocarboxypeptidases. This work gives insight for the first time into the role of those enzymes by in silico, in vitro and in vivo approaches. The thesis is divided in parts as described below. The first chapter introduces the fields of metallocarboxypeptidases, microtubules, tubulin posttranslational modifications and settle the objectives of the thesis. The second chapter is a compilation of the experimental procedures and materials used for the experimental work. The third chapter presents the functional characterization of human cytosolic carboxypeptidase 3. The results from this study were the basis for chapter four, where the function of CCP2 is described and both CCP2 and CCP3 mouse isoforms are studied by protein engineering and using CCP2 and CCP3 knock-­‐out mouse models. Chapters III and IV are subdivided into a summary of the chapter, the results describing the findings in detail and a discussion. The following chapter sets a general discussion on CCP2 and CCP3, their role in the cell and in the context of a family, in mammals, of six genes coding deglutamylating enzymes. A final section includes a summary of the conclusions. Chapter IV together with the modeling experiments form Chapter III is the basis of the following scientific paper: Tort O, Tanco S, Rocha C, Bièche I, Seixas C, Bosc C, Andrieux A, Moutin MJ, Avilés FX, Lorenzo J, Janke C. The cytosolic carboxypeptidases CCP2 and CCP3 catalyze posttranslational removal of acidic amino acids. MBoC. doi:10.1091/mbc.E14-­‐06-­‐1072

La via canònica de Wnt és essencial pel desenvolupament embrionari i per la proliferació cel·lular. A més, la desregulació d’aquesta via causa diferents malalties, com per exemple el càncer. La unió del lligand Wnt als receptors específics promou la fosforilació de Dvl-2 per una quinasa directament associada a p120-catenina, la CK1ε, i indueix una cascada d’activació que inhibeix l’activitat de la quinasa GSK-3 sobre la β-catenina. Com a resultat, la β-catenina s’estabilitza i es transloca al nucli on activa l’expressió de gens diana. Els nostres resultats expliquen com la CK1ε és activada ràpidament en Wnt i permet els diferents esdeveniments que acumulen la β-catenina. Prèviament s’havia descrit que la CK1ε presenta un domini autoregulador que inhibeix l’activitat quinasa de la CK1ε quan aquest està fosforilat, suggerint que es necessita una fosfatasa encara no descrita perquè s’activi la senyalització de Wnt. En aquest treball es mostra que la PP2A permet la defosforilació de la CK1ε en Wnt, i també s’ha identificat la PR61ε com la subunitat reguladora de la PP2A que controla l’activació de CK1ε. A més, la PR61ε interacciona directament amb el receptor Fz i s’associa al complex LRP5/6-p120-catenina-CK1ε després de l’activació de Wnt. En global, aquests resultats suggereixen que la PR61ε regula específicament la defosforilació de la CK1ε mediada per la PP2A, i té un paper essencial en la senyalització de Wnt. Un altre pas determinant de l’activació de la via de Wnt és la inhibició de l’activitat de la GSK-3, tot i que el mecanisme pel qual s’inactiva la quinasa encara és matèria de debat. S’han proposat dos models per explicar-ho, un dependent del reclutament de la GSK-3 al correceptor LRP5/6 fosforilat, que crea un lloc d’inhibició, i l’altre basat en el segrest de la quinasa dins de cossos multivesiculars (MVBs). Degut a que el nostre grup ha descobert una connexió directa entre les cadherines i la p120-catenina (dues proteïnes involucrades en les unions adherents) amb el correceptor LRP5/6, es va hipotetitzar que les cadherines podrien estar involucrades en l’endocitosi de la GSK-3 dependent dels factors Wnt. Els nostres resultats demostren que el complex receptor de Wnt que conté la GSK-3, s’internalitza dins de MVBs, i que aquesta endocitosi depèn de la dissociació prèvia de la p120-catenina-cadherina del correceptor LRP5/6. La disrupció de la interacció cadherina-LRP5/6 és regulada per la fosforilació de la cadherina i requereix de la separació prèvia de la p120-catenina. D’aquesta manera, mutants de la p120-catenina i de la cadherina que no es dissocien del complex bloquegen el segrest de la GSK-3 dins de MVBs. Aquests mutants inhibeixen l’acumulació de β-catenina, tot i que no de forma total. Aquests resultats expliquen com es segresta la GSK-3 dins dels MVBs i suggereixen que aquest mecanisme d’internalització, juntament amb la inhibició de la GSK-3 per la interacció directa amb l’LRP5/6 fosforilat, són necessaris per la completa estabilització de la β-catenina en Wnt. / Canonical Wnt signalling is essential for embryonic development and cell proliferation. Deregulation of this pathway leads to some diseases, such as cancer. Binding of extracellular Wnt ligands to specific receptors induces the phosphorylation of Dvl-2 protein by CK1ε- associated-p120-catenin kinase, and a cascade of events that inhibit the activity of GSK3 kinase on β-catenin. As a result, β-catenin is stabilized and translocated to the nucleus where it activates the expression of target genes. Our results explain how CK1ε is quickly activated in Wnt signalling, allowing the cascade of events that accumulate β-catenin. It was previously described that CK1ε presents an autoregulation domain which strongly inhibits CK1ε kinase activity when it is phosphorylated, suggesting that a phosphatase is required to activate Wnt signalling. However, which phosphatase dephosphorylates CK1ε in Wnt and how this phosphatase regulates the pathway were not clear. In this study, we have described that PP2A permits the dephosphorylation of CK1ε upon Wnt, and we have also identified PR61ε as the regulatory subunit of PP2A that controls this CK1ε activation. PR61ε directly interacts with Fz receptor, and associates with LRP5/6-p120-catenin-CK1ε complex upon Wnt activation. Taken together, these results suggest that PR61ε specifically regulates PP2A-mediated CK1ε dephosphorylation and plays an essential role in Wnt signaling. Another key step in the pathway is the local inhibition of GSK3 activity on β-catenin, although the mechanism of this inactivation remains unclear. Two models have been proposed, one dependent on the recruitment and subsequent block of GSK3 by phosphorylated LRP5/6 coreceptor that creates an inhibitory site, and another one based on its sequestration into multivesicular bodies (MVBs). Since our group has uncovered a physical link between cadherins and p120-catenin (two proteins involved in adherens junctions) with the Wnt coreceptor LRP5/6, we wonder whether cadherins may be involved in the endocytosis of GSK3 triggered by Wnt factors. Our results demonstrate that Wnt receptor complexes containing GSK3 are internalized into multivesicular bodies and this endocytosis depends on the previous dissociation of p120-catenin and cadherin from LRP5/6 coreceptor. Thus, disruption of cadherin-LRP5/6 interaction is regulated by cadherin phosphorylation and requires the previous release of p120-catenin. Accordingly, p120-catenin and cadherin mutants unable to dissociate from the complex block GSK3 sequestration into MVBs. These mutants substantially inhibit, but do not completely prevent, the β-catenin accumulation caused by Wnt. These results elucidate how GSK3 is sequestered into MVBs and suggest that this mechanism of internalization together with the inhibition of GSK3 by direct interaction with phosphorylated LRP5/6, are both required for complete β-catenin stabilization upon Wnt stimulation.

Les metal·lotioneïnes (MT) constitueixen una superfamília de metal·loproteïnes de baix pes molecular que es caracteritzen pel seu elevat contingut en residus Cys, els quals els confereixen les seues propietats coordinants i reductores. És com a conseqüència d’aquestes propietats que se’ls atribueixen funcions d’homeòstasi i destoxicació de metalls, així com de regulació i protecció en processos redox. Les MT són ubíqües i les seues seqüències són molt diverses. En la present Tesi Doctoral hem tractat d’ampliar els coneixements actuals sobre aquestes metal·loproteïnes i aprofundir en la seua relació estructura-funció. Així, d’una banda s’han analitzat les preferències metàl·liques envers metalls mono- i divalents de les dues isoformes de MT presents en l’eriçó de mar (Strongylocentrotus purpuratus), SpMTA i SpMTB, les quals presenten patrons de Cys alineables. S’ha determinat que SpMTA mostra millors habilitats per a coordinar Zn(II) i Cd(II) que SpMTB i que, en canvi, SpMTB mostra millors propietats per a coordinar Cu(I) que SpMTA. Aquestes preferències metàl·liques s’han relacionat amb una diferenciació funcional en l’organisme. D’altra banda, s’han estudiat els sistemes MT de les plantes de soja (Glycine max) i gira-sol (Helianthus annuus), les quals s’ha vist que sintetitzen representants de les quatre subfamílies en què es divideix la família de les MT de planta, que presenten patrons de Cys no alineables. Així, s’ha determinat que les MT1 i MT2 de gira-sol estudiades (HaMT1 i HaMT2) presenten una major capacitat de coordinació de Cd(II) que les MT1 i MT2 de soja (GmMT1 i GmMT2), probablement a causa del seu major contingut en Cys. A més, s’ha vist que les His C-terminals que ambdues MT3 (GmMT3 i HaMT3) contenen i que es troben semiconservades en la subfamília participen en l’enllaç al Cd(II). MT4 de soja (GmMT4) presenta la mutació natural His54Tyr que trenca amb el patró de Cys i His conservat en la subfamília MT4, la qual s’ha demostrat que suposa una disminució en la capacitat de coordinació de Zn(II). En canvi, tant GmMT4 com MT4 de gira-sol (HaMT4), que presenta el patró típic de Cys i His, presenten capacitats de coordinació de Cd(II) anàlogues, donat que cap de les seues His no participa en l’enllaç al Cd(II). A més, l’estudi de capacitats antioxidants i/o de captadors de radicals lliures de les quatre MT de soja ha permés proposar que la llargària de l’espaiador (regió lliure de Cys) és determinant per a la protecció enfront de l’oxidació de les Cys provocada per l’exposició a peròxid d’hidrogen, així com que Zn-GmMT1 és el complex que ha mostrat les millors propietats per a protegir les cèl·lules davant l’atac de les espècies reactives d’oxigen. / Metallothioneins (MT) constitute a low molecular weight metalloprotein superfamily characterised by their high Cys residue content, which confers them their coordinative and reducing properties. As a result of these properties, MTs are proposed to be involved in homeostasis and metal detoxification functions, as well as in regulation and protection during redox processes. MTs are ubiquitous and their sequences are extremely variable. In this PhD Thesis we have tried to expand the current knowledge about these metalloproteins and to deepen into their structure-function relationship. Thus, on the one hand, the metallic preferences towards mono- and divalent metal ions of the two MT isoforms present in sea urchin (Strongylocentrotus purpuratus), SpMTA and SpMTB, which display alignable Cys patterns, have been analysed. It has been determined that SpMTA shows better Zn(II)- and Cd(II)-binding abilities than SpMTB, and that, on the contrary, SpMTB shows better Cu(I)-binding abilitites than SpMTA. These metallic preferences have been related to a functional differentiation within the organism. On the other hand, the MT systems from the soybean (Glycine max) and sunflower (Helianthus annuus) plants have been studied, which have been proven to synthesise representatives of the four subfamilies in which the plant MT family is divided, and that show non-alignable Cys patterns. Thus, it has been shown that sunflower MT1 and MT2 (HaMT1 and HaMT2) display a greater Cd(II)-binding capacity than MT1 and MT2 from soybean (GmMT1 and GmMT2), probably due to their higher Cys content. In addition, it has been shown that the C-terminal His present in both MT3 (GmMT3 and HaMT3), which are semiconserved within this subfamily, are involved in Cd(II) coordination. Soybean MT4 (GmMT4) presents the natural His54Tyr mutation that breaks the highly conserved Cys and His pattern in MT4 subfamily, which has been shown to provoke a decrease in its Zn(II)-binding capacity. However, both GmMT4 and sunflower MT4 (HaMT4), which presents the typical MT4 Cys and His pattern, show analogous Cd(II) coordination capacities, since none of their His are involved in Cd(II) binding. In addition, the study of the antioxidant and/or free radicals scavenging capacities of the four soybean MTs has allowed to propose that the length of the spacer (Cys-free region) is crucial to protect Cys from the oxidation caused by hydrogen peroxide exposure, and that the Zn-GmMT1 complex has been the best suited to protect the cells against the attack by reactive oxygen species.

El VIH és un patogen intracel·lular obligat i per tant està totalment subjecte als recursos intracel·lulars disponibles. El tractament antiretroviral actual suprimeix la replicació viral però no evita la persistència i la proliferació de les cèl·lules infectades de forma latent, posant en evidència la necessitat de desenvolupar noves estratègies que aconsegueixin eliminar de forma definitiva el virus. El descobriment de nous factors cel·lulars del VIH pot aportar noves dianes per al desenvolupament d’aquestes estratègies. Diversos estudis de cribatge i d’identificació de gens han identificat un número molt elevat de factors cel·lulars del VIH. Per poder traslladar el coneixement científic a la clínica cal un estudi més acurat que defineixi els mecanismes funcionals i la regulació de cadascun d’aquests factors. Partint de l’estudi sobre la dependència del VIH al complex proteic Mediator (MED) i per altra banda de la restricció del VIH mitjançada pel factor antiviral SAMHD1, en aquesta tesi demostro com en les interaccions virus-hoste sovint hi ha un comú denominador en quant a la seva implicació en el metabolisme cel·lular. Aquest tret comú suggereix que els factors cel·lulars del VIH, tot i que en la seva relació estreta amb el virus el potenciïn o l’inhibeixin, alhora sempre són modulats per mecanismes complexes associats a la regulació cel·lular que finalment són els què governen la replicació viral. S’inclou una avaluació de l’activitat MED sobre la replicació del VIH amb la identificació de 9 sobre 28 proteïnes del complex MED que de forma significativa afecten la replicació del VIH, sempre en una etapa posterior a la integració. D’entre les subunitats MED identificades algunes tenen un rol predominant en la transcripció de gens virals inicials i d’altres en la generació de transcrits virals més tardans, però totes comprometen la transcripció del VIH que és induïda per la proteïna viral Tat. Els assaigs de coimmunoprecipitació, a més, han suggerit que aquesta dependència passa per una interacció física entre MED i Tat. D’entre l’ampli grup de proteïnes cel·lulars que modulen el VIH, només algunes inhibeixen el virus. SAMHD1 ho aconsegueix bloquejant l’enzim del VIH transcriptasa inversa. La seva regulació sobre els nivells de dNTPs intracel·lulars s’investiga al llarg del segon capítol. L’activitat de SAMHD1 influencia la potència dels inhibidors de la transcriptasa inversa anàlegs a nucleòtids, de manera que una reducció intracel·lular dels nivells de SAMHD1 porta a una disminució significativa de la sensibilitat del VIH enfront els inhibidors anàlegs a Timidina. Un estudi molecular més extens ha permès identificar que en els limfòcits T CD4+ proliferants i en els macròfags s’expressa una forma fosforilada de SAMHD1 que correspon amb la susceptibilitat a la infecció. Específicament s’ha identificat CDK6 i ciclina D3 com un complex regulador de CDK2, que alhora controlaria la progressió a cicle cel·lular i la fosforilació de SAMHD1 per tal d’inactivar-lo en cèl·lules T i en macròfags, fent-los susceptibles a la infecció. La inhibició de CDKN1A (ó p21) porta a un alleujament en la restricció de VIH modulada per SAMHD1, generant més replicació viral. L’inhibidor de CDK6 palbociclib confirma la via de senyalització proposada ja que bloqueja efectivament la fosforilació de SAMHD1, els nivells intracel·lulars de dNTP, la transcripció inversa i l’activació de CDK2. En els propers anys l’estudi acurat del factors cel·lulars del VIH-1 permetrà el desenvolupament d’estratègies terapèutiques “anti-VIH” basades en fer diana a l’hoste més que en el virus, donant noves propostes que facin front a les limitacions del tractament antiretroviral. / HIV is an obligate intracellular pathogen and its replication is entirely reliant on intracellular resources, depending on its capacity of recruitment and utilization of a wide array of host proteins to complete the viral life cycle. Current antiretroviral treatments generally suppress viral replication but do not avoid persistence and proliferation of latently infected cells over time, thus not curing HIV/AIDS and evidencing the need to develop new strategies that may finally converge in eliminating the virus. The discovery of human cellular factors could provide new targets for the development of these strategies. Previous siRNA-based screenings and whole-genome studies published a high amount of alleged HIV-1 host factors but their functional mechanisms need to be addressed to translate scientific knowledge into the clinic. By studying both the HIV dependency on a protein complex from the cellular transcriptional machinery called Mediator (MED) and the HIV restriction mediated by the antiviral factor SAMHD1 whose mechanism of regulation is still under debate, I show how viral-host interactions usually converge in their implication on cell metabolism, suggesting that identified host factors that either enhance or inhibit HIV-1 are in turn modulated by cell regulation-associated mechanisms that finally govern viral replication. Concretely, we provide an evaluation of the MED complex activity on HIV replication identifying nine out of 28 human MED proteins significantly affecting HIV replication, all pointing at a post-integration step. Moreover, the identified MED proteins modulating the generation of new viral transcripts were differentially affecting early or late stages of HIV-1 transcription, apart from compromising particularly the HIV transcription induced by the HIV-1 protein Tat. Interestingly, co-immunoprecipitation experiments also suggested physical interaction between MED and Tat. Among the high number of cellular proteins modulating HIV, only a few actively inhibit viral replication. SAMHD1 achieves it by blocking the viral reverse transcriptase. Here, the regulation modulating the intracellular dNTP levels is investigated. The influence of SAMHD1 activity on nucleoside reverse transcriptase inhibitors was demonstrated, showing that a reduction of SAMHD1 levels significantly decreased HIV sensitivity solely on thymidine-analogue inhibitors. Proliferating primary CD4+ T cells or macrophages were then observed to express a phosphorylated form of SAMHD1 that corresponded with susceptibility to infection in cell culture and that was not present in non-cycling cells. Identified phosphorylation sites in cycling cells are mainly driven by cyclin-dependent kinases (CDK). In fact, we identified CDK6 and cyclin D3 as an upstream regulator of CDK2 induces SAMHD1 phosphorylation in primary T cells and macrophages. CDK2 is strongly linked to cell cycle progression and coordinates SAMHD1 phosphorylation and inactivation. Knockdown of the cellular CDK2 inhibitor CDKN1A (p21) led to a relief of the SAMHD1 restriction, increasing virus replication. The CDK6 inhibitor palbociclib blocked SAMHD1 phosphorylation, intracellular dNTP levels, HIV-1 reverse transcription and reduced CDK2 activation and its antiviral activity was lost when SAMHD1 was degraded by Vpx. Altogether, our results reinforce the idea that in the following years the deeper study of HIV-1 cellular factors will probably raise the possibility of a new class of “anti-HIV” therapeutics targeting the host rather than the virus, collectively giving new proposals to the unresolved challenge of curing HIV infection and AIDS.

Les cèl·lules eucariotes estan constantment exposades a dany al DNA i a estrès replicatiu (estrès genotòxic), font d'inestabilitat genòmica. L'anomenat mecanisme de vigilància (checkpoint) de la fase S detecta la presència d'estrès genotòxic i genera una resposta que inclou l'aturada preventiva de la replicació i del cicle cel·lular, per tal de donar temps a la superació del problema, i la protecció de la replicació dels cromosomes. Quan els elements centrals d'aquest mecanisme de control estan mutants, les cèl·lules esdevenen genèticament inestables i, en humans, predisposa al càncer. Malgrat el seu paper crític en la preservació de la integritat del genoma, es desconeix la manera com el mecanisme de vigilància de la fase S executa bona part de la seva resposta. Els elements i vies que constitueixen el checkpoint estan conservats evolutivament. El nostre treball s'ha centrat en el llevat de gemmació Saccharomyces cerevisiae. En aquest organisme la proteïna quinasa efectora principal és Rad53. Amb l'objectiu de descobrir dianes a través de les quals Rad53 regula la fase S, s'han assajat en una reacció quinasa in vitro diferents proteïnes candidates a ser substrat de Rad53. Això ha permès la identificació de la ciclina de fase S Clb6 com a substrat de Rad53 in vitro.Les ciclines són les subunitats activadores de la quinasa dependent de ciclina Cdc28/Cdk1, que promou la progressió del cicle cel·lular. Cdc28/Cdk1 és activada per diferents ciclines específiques de les diferents fases del cicle cel·lular, que li confereixen especificitat de substrat. Clb6 és una de les dues ciclines de fase S (junt amb Clb5), que promouen la replicació del DNA. Mentre que Clb5 és present des del final de la fase G1 fins a anafase, Clb6 és eliminada durant la primera meitat de la fase S. Per tal d'estudiar si Clb6 és diana de Rad53 in vivo, s'ha estudiat el seu comportament en resposta a estrès genotòxic. Interessantment, en una fase S compromesa els nivells de Clb6 es mantenen estables, i aquesta estabilització és dependent de Rad53. Experiments amb l'inhibidor de la traducció proteica cicloheximida mostren que l'estabilització de Clb6 requereix síntesi de novo. Donat que en un cicle cel·lular no pertorbat Clb6 és expressada exclusivament en fase G1, sota el control del factor de transcripció MBF. Els nostres resultats indiquen que MBF es reactiva en una fase S compromesa: la subunitat transactivadora Swi6, exclosa del nucli en una fase S no pertorbada, és nuclear en una fase S compromesa; per altra banda, la sobreexpressió d'una forma hiperestable del repressor d'MBF Nrm1 dóna lloc a la desaparició de Clb6 malgrat la presència continuada d'estrès genotòxic i una resposta checkpoint funcional. Fins ara MBF era considerat un factor de transcripció exclusiu de la fase G1.Per últim hem explorat el paper de l'estabilització de Clb6 en una fase S compromesa. El mutant nul clb6 no presenta cap fenotip detectable, suggerint que Clb6 pot operar en forma redundant dins de la resposta a estrès genotòxic. Per aquest motiu hem optat pel plantejament complementari: estudiar l'efecte de mantenir la presència de Clb6 en una fase S no pertorbada (i per tant en absència de la resta de la resposta checkpoint). En aquestes condicions les cèl·lules repliquen el seu DNA amb aparent normalitat, però queden aturades en un estadi previ a anafase. Aquests resultats suggereixen que Clb6 pot ser un element efector de la branca S-M del mecanisme de vigilància de la fase S, que estaria constituïda per diversos punts de control solapat. Aquest paper justificaria que Clb6 hagi de ser eliminada de forma avançada respecte a Clb5. / Eukaryotic cells are permanently exposed to DNA damage and to replication stress (genotoxic stress), a source of genomic instability. A surveillance mechanism, the S phase checkpoint, detects and responds to genotoxic stress, and elicits a response that includes the arrest of cell cycle progression -to give time to overcome the insult- and the protection of chromosome replication. When the checkpoint central elements are mutated cells become genetically unstable, which in humans results in a high frequency of cancer.Despite such critical role to preserve genomic integrity, much remains unknown about the way how the S phase checkpoint executes its response. Because the checkpoint elements and pathways are conserved, our work has been carried out in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. In this organism Rad53 is the S phase checkpoint effector kinase. To identify novel Rad53 targets, we carried out an in vitro kinase assay with different potential substrate proteins involved in cell cycle control. This approach identified the S phase cyclin Clb6 as an in vitro Rad53 substrate.Cyclins are the activatory subunits for Cdc28/Cdk1, the cyclin dependent kinase that drives cell cycle progression in budding yeast. Cdc28/Cdk1 is activated by different cell cycle phase specific cyclins, that also confer substrate specificity to the kinase. Clb6 and Clb5 are the S phase cyclins, promoting the onset of DNA replication. Interestingly, whereas the presence of Clb5 spans from late G1 to anaphase, Clb6 is eliminated earlier, during S phase.To study whether Clb6 is a target of Rad53 in vivo, we explored the effect of genotoxic stress on the cyclin. When cells are exposed to replication stress or to DNA damage during S phase, the presence of Clb6 is stabilized, and such stabilization depends on Rad53.Experiments with the inhibitor of protein translation cycloheximide show that the stabilization of Clb6 requires de novo synthesis. In an unperturbed cell cycle Clb6 is expressed only during G1 phase, under the control of the transcription factor MBF. Our results show that MBF is reactivated in a compromised S phase: the transactivatory subunit Swi6, excluded from the nucleus in an unperturbed S phase, shows nuclear localization during a compromised S phase; in addition, the overexpression of a hyperstable form of the MBF repressor Nrm1 results in Clb6 elimination, despite the continued presence of genotoxic stress and a functional checkpoint response. To date, MBF was considered a transcription factor operating solely and characteristically during G1 phase.Finally we have explored the role of Clb6 stabilization in response to genotoxic stress. The clb6 null mutant does not present a detectable phenotype, which is compatible with a redundant role in the response to genotoxic stress. We therefore chose to address the question the other way round, and study the effect of keeping the levels of Clb6 stable during an otherwise unperturbed S phase (and therefore in the absence of the vast checkpoint response that could mask the specific role of Clb6). Under such conditions cells replicate normally, but arrest in a stage previous to anaphase. These results suggest that Clb6 may be an effector element in the S-M branch of the S phase checkpoint. One such role would explain why Clb6 must be eliminated in S phase, ahead of Clb5 during mitosis.

Les cèl·lules progenitores endotelials (EPC) derivades de la medul·la òssia tenen capacitat per diferenciar-se a cèl·lula endotelial (EC), contribuint així a la reparació endotelial, no obstant també poden diferenciar-se a altres tipus cel·lulars perpetuant lesions vasculars. En artèries pulmonars de pacients amb malaltia pulmonar obstructiva crònica (MPOC) s'ha relacionat un increment en el nombre de les EPC amb un engruiximent de la capa íntima d'aquestes. L'engruiximent d'aquesta està constituït principalment per cèl·lules musculars llises (SMC), així, aquest treball s'ha centrat en investigar la capacitat de les EPC per diferenciar-se a SMC, i per tant en contribuir en el remodelat vascular i en els mecanismes moleculars que hi intervenen. El factor de creixement transformant beta 1 (TGFß1) modula la migració i la diferenciació de EC a un fenotip mesenquimal mitjançant un procés anomenat "endothelial-to-mesenchymal transition" (EnMT). Per tant, el primer objectiu de l'estudi va ser avaluar la plasticitat de les EPC per diferenciar-se a SMC o EC. I el segon, investigar els mecanismes moleculars, relacionats amb la via del TGFß1, que podrien intervenir en la diferenciació i la migració d'aquestes. Per avaluar la plasticitat de las EPC, es van realitzar co-cultius amb EC i SMC in vitro i per una altra banda es van injectar les cèl·lules progenitores dins d'artèries pulmonars humanes aïllades. El fenotip de les cèl·lules es va caracteritzar morfològicament, per immunofluorescència i mitjançant microscopia electrònica. Per avaluar els mecanismes de diferenciació de les EPC, els co-cultius d'aquestes amb EC o SMC es van tractar amb inhibidors de la via del TGFß1 i es van analitzar per citometria de flux i immunofluorescència. També es va avaluar l'expressió gènica de marcadors endotelials i mesenquimals i l'expressió de factors de transcripció relacionats amb el procés d'EnMT. La migració de les EPC es va avaluar mitjançant assaigs en transweells en les mateixes condicions. Els resultats d'aquest treball mostren en primer lloc la capacitat de les EPC per diferenciar-se a EC, facilitant la reparació de l'endoteli vascular, però també per migrar a la capa íntima de les artèries pulmonars i diferenciar-se a SMC, contribuint així al remodelat vascular d'aquestes. Per últim, els resultats també demostren que les EPC es poden diferenciar a SMC i adquirir un fenotip migratori seguint un procés similar al de EnMT, que pot estar mediat pel factor TGFß1. / Bone marrow-derived endothelial progenitor cells (EPC) have shown in vitro and in vivo their ability to differentiate into endothelial cells (EC) and repair the endothelium. However, some evidences suggest that the plasticity of these cells to differentiate into other cell types might contribute to perpetuate vascular lesions. Studies in pulmonary arteries (PA) of patients with chronic obstructive pulmonary disease (COPD) suggest that bone marrow-derived EPC may infiltrate the intima and differentiate into smooth muscle cells (SMC). This study is aimed to evaluate the plasticity of EPC to differentiate into SMC and EC in both cell culture and human isolated PA. The study is also addressed to evaluate whether genes involved in the endothelial-to-mesenchymal transition (EnMT) may contribute to mesenchymal phenotype acquisition of EPC and whether transforming growth factor ß1 (TGFß1) is involved in this process. The in vitro studies demonstrated EPC may acquire the morphology and phenotype of the cells they were co-cultured with. EPC co-incubated with human isolated PA were able to migrate into the intima and differentiate into SMC. The results also show that co-culture of EPC with smooth muscle cells (SMC) increases the expression of the mesenchymal cell markers and decreases the expression of the endothelial cell markers. In the same conditions, we also observed an increase in the gene expression of the EnMT-related transcription factors. Inhibition of TGFß receptor I (TGFßRI) partially blocked the differentiation of EPC into SMC and facilitated their differentiation into endothelial cell lineage.This study provides evidences of plasticity of EPC to differentiate into both EC and SMC, reinforcing the idea of their potential role in remodeling process of PA in COPD. Finally, the results also indicate that EPC may differentiate into SMC-like cells through an EnMT-like process and that TGFß1 plays an important role in the fate of EPC.

La lignificación de la pared de las células del xilema es un proceso extremadamente complejo, sometido a un estrecho control hormonal cuya función principal es la de conferir rigidez e impermeabilidad al sistema vascular. La lignificación es una secuencia de reacciones en cadena que conducen desde un metabolito primario, la fenilalanina, hasta los precursores inmediatos de las ligninas, los alcoholes hidroxicinamílicos (p-cumarílico, coniferílico y sinapílico). Estos alcoholes son oxidados, finalmente, por las peroxidasas para dar lugar a sus correspondientes radicales, que se ensamblan en la pared celular generando un polímero hidrofóbico y fuertemente polidisperso, que da rigidez e impermeabiliza la pared celular, constituyendo uno de los mayores sumideros metabólicos del CO2 fijado durante la fotosíntesis. Las peroxidasas siringilo son las enzimas responsables de la oxidación del alcohol sinapílico, lo que conduce a la formación de monómeros siringilo (S) que se incorporan al polímero de lignina. Estas enzimas han sido descritas como peroxidasas básicas que no presentan restricciones estéricas que impidan la entrada de alcohol sinapílico en el centro catalítico. Hasta el momento, las peroxidasas más estudiadas a nivel estructural han sido la ATP A2 de Arabidopsis y HRP A2 de rábano, las cuales son peroxidasas guaiacilo incapaces de oxidar el alcohol sinapílico. La peroxidasa siringilo mejor caracterizada hasta el momento es la de Zinnia elegans (ZePrx). En el genoma de Arabidopsis existen 73 peroxidasas pero ninguna de ellas ha sido identificada como una peroxidasa de tipo siringilo. Estudios previos buscaron en el genoma de A. thaliana peroxidasas que presentan una gran homología de secuencia con ZePrx, así como de estructura, carga superficial, punto isoeléctrico y regulación de su expresión. Teniendo en cuenta estos criterios se seleccionaron las peroxidasas AtPrx4, AtPrx52, y AtPrx72. En esta tesis, se muestra cómo la supresión de dichas peroxidasas en diferentes líneas mutantes de Arabidopsis afecta al contenido y a la composición de ligninas. En general, todas las líneas mutantes mostraron una disminución en el contenido de ligninas, medido con bromuro de acetilo, entre un 17 y un 37%. Además, la relación S/G, obtenida por tioacidolisis, indica una disminución en las unidades de S en todos los mutantes. Además, como se deduce de las tinciones de Wiesner y de Mäule, esta reducción en el contenido de monómeros S parece estar restringida a las fibras interfasciculares, pero no afecta a los vasos del xilema. Para analizar si este cambio en la composición de lignina era dependiente de la edad de la planta, también se realizaron análisis cualitativos y cuantitativos de ligninas en tallos en diferentes etapas de desarrollo. Nuestros resultados mostraron diferencias significativas en el contenido y la composición de ligninas entre plantas mutantes y WT solamente en las últimas etapas del desarrollo. Sin embargo, no se encontraron diferencias significativas en el tamaño de las plantas mutantes en comparación con el WT. Los análisis mediante qPCR revelaron que los genes implicados en la biosíntesis de ligninas, así como en la formación de la pared celular secundaria, redujeron su expresión en las plantas mutantes. Por otro lado, la expresión de genes implicados en la biosíntesis de ésteres sinapato y de flavonoides se incrementó en las plantas mutantes con respecto al WT lo cual indica que hay una reorientación de los esqueletos carbonados de la ruta de biosíntesis de las ligninas hacia otras rutas del metabolismo fenilpropanoide. En conjunto, nuestros resultados sugieren que AtPrx4, AtPrx52 y AtPrx72 son peroxidasas siringilo implicados en la síntesis de unidades S en las fibras interfasciculares y además, su represión afecta a toda la ruta fenilpropanoide y puede ser suficiente para alterar el metabolismo de la planta. / The lignification of xylem cell walls is an extremely complex process, under strict hormonal control, whose main function is to confer rigidity and impermeability to the vascular system. Lignification is the result of several reactions from a primary metabolite, phenylalanine, until the immediate precursors of lignin, the hydroxycinnamyl (p-coumaryl, coniferyl and sinapyl) alcohols. These alcohols are finally oxidized by peroxidases to give their corresponding radicals, which will be further assembled in the cell wall, generating a hydrophobic polymer (lignin) which gives rigidity and waterproof cell wall. Lignin constitutes a major metabolic sink for the CO2 fixed during photosynthesis. Syringyl peroxidases are the enzymes responsible for sinapyl alcohol oxidation that eventually lead to syringyl monomers formation. They have been described as basic peroxidases which show no steric restrictions that hinder the entry of sinapyl alcohol into the catalytic centre. So far, the most studied peroxidases at the structural level, such as ATP A2 from Arabidopsis and HRP A2 from horseradish, are guaiacyl peroxidases, unable to oxidize sinapyl alcohol. Unfortunately, little is known regarding structure and catalytic properties of syringyl peroxidases. The best characterized is ZePrx from Zinnia elegans. Since such a peroxidase similar to ZePrx has not been identified in Arabidopsis, a search through A. thaliana genome was performed, in order to identify the peroxidases which showed the highest homology to ZePrx. Based on several structural and molecular characteristics, AtPrx4, AtPrx52 and AtPrx72 were determined to be the most likely homologous to ZePrx in Arabidopsis. In this thesis, we show how the suppression of AtPrx4, AtPrx52 and AtPrx72 in different mutant lines of Arabidopsis affects lignin content and composition. Overall, all the mutant lines showed a decreased in lignin content, measured with acetyl bromide, ranging from 17 to 37%. Furthermore, the S/G ratio, obtained by both nitrobenzene oxidation and thioacidolysis, indicated a decrease in S units in all the mutants. As deduced from Wiesner and mainly Mäule stainings, this reduction in S monomers content seems to be restricted to the interfascicular fibers, but it does not affect xylem vessels. To assay whether this shift in lignin composition was age-dependent, we also performed qualitative and quantitative analyses of lignins in stems at different stages of development. Our results showed significant differences in both content and composition only in late stages of development of mutant plants. However, no significant differences were found regarding mutant size in comparison with WT when plants reached maturity. qPCR revealed that genes involved in lignin biosynthesis as well as in secondary cell wall formation were down-regulated in mutant plants. On the other hand, expression of genes involved in sinapate esters and flavonoid biosynthesis was up-regulated in mutant plants, which indicates a reallocation of carbon from lignin biosynthetic pathway to other routes of phenylpropanoid metabolism. Taken together, our results indicate that AtPrx4, AtPrx52 and AtPrx72 may be syringyl peroxidases involved in the synthesis of S units in interfascicular fibers. Moreover, the suppression of the last step of syringyl lignins biosynthesis affects the whole phenylpropanoid pathway and may be sufficient to alter plant metabolism.

La Enfermedad de Alzheimer (AD) es una enfermedad neurodegenerativa cuyos síntomas incluyen no sólo la pérdida de memoria de los pacientes, sino también problemas en la función ejecutiva, cambios de personalidad, etc. Se trata de una enfermedad compleja, son numerosos los factores de riesgo que pueden estar implicados en su desarrollo y se observan también alteraciones a diferentes niveles, tanto neurohistológicas, como genéticas, metabólicas, etc. En los últimos años, se ha estudiado extensamente la implicación de la Diabetes Mellitus y la Resistencia a la Insulina como factores de riesgo para el desarrollo de la AD. Así, numerosos estudios demuestran que la administración de insulina es capaz de mejorar la memoria tanto en personas sanas como en pacientes de AD. También se ha demostrado que los péptidos IGF‐1 y GLP‐1, estrechamente relacionados con la vía de señalización de la insulina, pueden actuar como factores de crecimiento y neuroprotección a nivel del Sistema Nervioso Central. Además, los niveles de expresión de los receptores de insulina, IGF‐1 y GLP‐1, así como su capacidad de activación se encuentran significativamente reducidos en el cerebro de pacientes de AD y esto correlaciona con el avance de la enfermedad, especialmente con el avance de la patología amiloide. En esta tesis doctoral, demostramos que los niveles de mRNA de IGF‐1R aumentan significativamente en animales 3xTgAD de 9 meses, pero los niveles del receptor proteico total y activado se encuentran reducidos en animales 3xTgAD de 9 y 12 meses. Esta reducción coincide en el tiempo con el cambio en la acumulación de los péptidos desde una localización intraneuronal a una localización extraneuronal, y ambos fenómenos podrían estar relacionados. Para demostrar la implicación de IR/IGF‐1R y GLP‐1R en el correcto funcionamiento neuronal y en el desarrollo de los síntomas de la AD, hemos diseñado dos vectores adenoasociados (AAV) que expresan un shRNA‐IGF1R y un shRNA‐IR, respectivamente, y los hemos inyectado conjuntamente en el hipocampo de hembras 3xTgAD de 2 meses de edad. Este silenciamiento de la vía IR/IGF‐1R provocó un aumento en la acumulación intraneuronal de Aβ a los 4 meses de edad en comparación con la encontrada en hembras inyectadas con un shRNA‐scrambled. Por otra parte, también diseñamos dos vectores AAV para sobreexpresar el cDNA de IGF‐1R y GLP‐1R en el hipocampo y córtex prefrontal de animales 3xTgAD de 5 meses de edad. De esta manera hemos demostrado que la sobreexpresión de GLP‐1R, pero no la de IGF‐1R, consigue corregir los síntomas neuropsichiátricos asociados a la demencia (BPSD), así como la flexibilidad cognitiva de los machos 3xTgAD de 12 meses de edad. Esto correlaciona con una reducción en la acumulación de Aβ en el hipocampo, así como una reducción de la neuroinflamación y de la pérdida neuronal en el córtex cerebral. En las hembras, ambos tratamientos tienen efectos moderados sobre los BPSD, pero sólo la sobreexpresión de IGF‐1R consigue mejorar la capacidad de aprendizaje y memoria espacial de las hembras 3xTgAD de 12 meses de edad. Esto correlaciona con una reducción en la neuroinflamación en hipocampo y amígdala, una menor acumulación de la proteína tau fosforilada, así como una reducción de la pérdida neuronal en el córtex. / Alzheimer’s disease (AD) is a neurodegenerative disorder whose symptoms include not only memory loss, but also executive function problems, personality changes, etc. It is a complex disease, there are many risk factors implicated in its development and impairment in many aspects can be observed, as neurohistology, metabolism, genetics, etc. Diabetes Mellitus and Insulin Resistance have emerged in the late years as a risk factor for AD, as several studies demonstrate that insulin administration is able to improve memory in healthy patients as well as in AD patients, and the related peptides IGF‐1 and GLP‐1 can act as growth and neuroprotection factors in the Central Nervous System. Moreover, expression levels of IR, IGF‐1R, GLP‐1R, as well as their activation ability after binding of insulin, IGF‐1 and GLP‐1 to their corresponding receptors are impaired in brains of AD patients and this correlates to the stage of the disease, specially to the amyloid pathology. In this study, we demonstrate that IGF‐1R mRNA levels are significantly elevated in 3xTgAD animals when compared to WT at 9 months‐old, but there is a reduction at protein level and activation of IGF‐1R in 9 and 12 months‐old 3xTgAD animals. This reduction could be related to the change from an intra to an extraneuronal accumulation of Aβ peptides. To demonstrate the implications of IR/IGF‐1R and GLP‐1R for a correct neuronal function and in the developments of AD symptoms, we designed two AAV vectors expressing a shRNA‐IGF1R and a shRNA‐IR respectively, and we jointly injected them in the hippocampus of 2 months‐old 3xTgAD females. This IR/IGF‐1R silencing caused an increase in the intraneuronal Aβ accumulation at 4 months‐old when compared to females injected with a shRNA‐scrambled. We also designed two AAV vectors for the overexpression of IGF‐1R and GLP‐1R in the hippocampus and prefrontal cortex of 5months‐old 3xTgAD animals. We demonstrate that the overexpression of GLP‐1R, but not IGF‐1R, correct Behavioral and Psychiatric Symptoms associated to Dementia (BPSD) and cognitive flexibility in 12 months‐old 3xTgAD males, and this correlates with a reduction of Aβ accumulation in hippocampus, as well as with a reduction of neuroinflammation in amygdala and neuronal loss in cortex. In females, both treatments have moderate effect on BPSD, but only IGF‐1R overexpression improves spatial learning performance and spatial memory in 12 months‐old 3xTgAD females. This correlates with a reduction of neuroinflammation, accumulation of phosphorylated tau and neuronal loss in cerebral cortex.

Esta tesis abarca un análisis estructural y funcional de las ribonucleasas antimicrobianas. Se han analizado los centros de interacción de ligandos nucleotídicos con la RNasa A como referencia. Los estudios estructurales, estadísticos y por cristalografía de rayos X, de complejos de RNasas han permitido definir, junto a la triada catalítica, otros subcentros de interacción secundarios. La superfamilia de la RNasa A incluye miembros con funciones no necesariamente relacionadas con la actividad RNasa. En particular, las propiedades antimicrobianas aparecen en miembros con puntos isoeléctricos elevados , que explican asimismo su elevada afinidad por componentes de membrana y estabilidad. No obstante, se ha observado una baja actividad RNasa, probablemente debido a modificaciones en el alineamiento del sustrato. Se han analizado los patrones de reconocimiento y unión de sustratos nucleotídicos para caracterizar mejor las ribonucleasas citotóxicas de secreción mediante estudios estadísticos generales con complejos estructurales con mono- y dinucleótidos, realizando asimismo una comparativa con las particularidades de familias seleccionadas de endorribonucleasas representativas. Se han establecido modelos generales de interacción entre proteínas y nucleótidos y se han identificado los aminoácidos y átomos presentes en estas interacciones, definiéndose los motivos tridimensionales para los grupos fosfato, ribosa y bases nitrogenadas dentro de la superfamilia de la RNasa A. Junto a la triada catalítica, conservada en el centro activo, se ha visto una variabilidad en los subcentros secundarios, de acuerdo con los patrones de unión preferenciales de las RNasas, alineamiento y especificidad de sustrato o eficiencia catalítica variable. Estos resultados se han completado con predicciones por modelado molecular y comparaciones evolutivas por alineamiento de secuencia y solapamiento estructural. Con una comparación final con la superfamilia de la RNasa T1 (RNasas microbianas) se han analizado las características comunes y particulares para aplicarlas al reconocimiento de biomoléculas polianiónicas y configurar un punto de partida para el diseño de nuevos fármacos. Finalmente, se han estudiado, por cristalografía de rayos X, distintas RNasas recombinantes nativas (RNasa A, RNasa 3, RNasa 6), así como variantes mutantes, expresadas en un sistema procariota de alto rendimiento. Se han resuelto sus estructuras cristalinas. En particular, el estudio estructural de la ribonucleasa 6 humana (RNasa k6), el primero para el enzima, supone el punto de partida para posteriores análisis de interacciones con potenciales sustratos nucleotídicos y otros ligandos relacionados. Por otra parte, se ha cristalizado un mutante de RNasa A (RNasa A/H7H10), en complejo con 3’-CMP, cuyo centro de unión de fosfatos p2 se ha convertido en un segundo centro activo, ocasionando cambios estructurales próximos. Con un segundo complejo de RNasa A con 3’-CMP, obtenido a resolución atómica, se ha realizado un análisis comparativo más detallado, en comparación con complejos similares a menor resolución, junto con un estudio de cada subcentro en relación al complejo de RNasa A mutante, permitiendo explicar las propiedades catalíticas del mutante. La observación del estado de protonación de los residuos del centro activo ha proporcionado información adicional sobre el mecanismo de catálisis. A continuación se han cristalizado dos mutantes de la RNasa 3/ECP (ECP/H15A, H128N). Los estudios estructurales confirman los estudios cinéticos previos sobre la abolición de la actividad catalítica. Adicionalmente, dos cristales de ECP nativa se utilizaron para la comparación estructural de sendas formas cristalográficas, cadenas laterales o centros de reconocimiento de aniones. Además, con las estructuras de RNasa A, RNasa 3/ECP y RNasa 6 con iones sulfato se compararon los centros de reconocimiento del anión, análogo a los grupos fosfato de nucleótidos. Se ha confirmado la mayor afinidad de la ECP, y se han identificado las regiones potenciales de reconocimiento de nucleótidos o derivados heterosacáridos. / This thesis encompasses the structural and functional analysis of antimicrobial ribonucleases. Nucleotide-type ligand interaction sites have been analysed using RNase A as a reference protein. RNase complexes were analysed by statistical structural analysis and X-ray crystallography. Together with the catalytic triad, other secondary interaction subsites were also defined at the protein surface. The RNase A superfamily embraces ribonucleases with diverse functions not necessarily related to RNase activity. In particular, antimicrobial properties are ascribed to members with high isoelectric point values, which also explain their stability and high affinity to membrane components. However, a noticeably lower RNase activity is seen for cationic RNases owing to the lack of key residues important for the correct substrate alignment. The different nucleotide-type substrate binding and recognition patterns were deduced from an overall structure complex statistics’ analysis and compared to the particular traits of selected families of representative endoribonucleases . A large amount of mono- and dinucleotide protein complexes was analysed. The results provided a general model of protein-nucleotide interactions for cytotoxic endoribonucleases. The identification of amino acids and atoms frequently involved in the recognition interactions defined three-dimensional motifs for phosphate, ribose and bases in the RNase A superfamily. Together with the conserved catalytic triad at the active site, residue variability is commonly observed throughout the secondary binding subsites, in agreement with the RNase preferential binding patterns, the different alignment capability, substrate specificity and variable catalytic efficiency. Results were complemented with molecular modelling predictions and evolution comparisons by sequence alignment and structural overlapping. A final side-by-side comparison with the microbial RNase T1 superfamily has allowed an analysis of the common and particular features of substrate recognition processes, thereby building a general interaction architecture applicable to recognition for polyanionic biomolecules that may set a structural basis for the design of new drugs. Additionally, structural studies by X-ray crystallography were carried out. Recombinant wild-type RNases (RNase A, RNase 3, RNase 6) and mutant variants were expressed and purified in a high-yield prokaryotic system andtheir crystal structures were solved. In particular, a crystallisation condition has been discovered for human RNase 6. We report here the first crystal structure of RNase 6, which sets the basis for further analysis of interactions with nucleotide molecules and other putative ligands. On the other hand, the structural analysis of an RNase A mutant (RNase A/H7H10), where the secondary phosphate binding site p2 has been converted into a second active site, in complex with 3’-CMP, enabled the visualisation of induced neighbouring conformational changes. A second RNase A – 3’-CMP complex, obtained at atomic resolution, has enabled a more detailed comparative analysis with lower-resolution protein-nucleotide complexes together with a side-by-side study of subsite environments with the mutant complex, explaining the mutant catalytic properties. The additional visualisation of the protonation state of the active site residues has also provided information about the mechanism of catalysis. Following, two RNase 3/ECP active site mutants (ECP/H15A, ECP/H128N) were crystallised. Structural studies confirmed the conservation of the protein overall three dimensional structure together with previous kinetic experiments related to the abolished catalytic activity. Also, two native ECP crystals obtained by two distinct crystallization conditions were used for a comparison of the different unit cell packing, residue side chain variability and anion recognition sites. Finally, the structures of RNase A, RNase 3/ECP and RNase 6 with bound sulphate anions were compared, and their putative anion recognition sites characterized. The comparison of the binding subsites confirmed the higher affinity of RNase 3/ECP for sulphate/ phosphate anionsand may lead to the identification of protein regions prone to host nucleotides or heterosaccharide compounds.