En la actualidad existe un creciente interés en el desarrollo de procesos industriales biocatalíticos eficientes desde el punto de vista económico y medioambiental. Uno de los procesos más prometedores para la industria es la biocatálisis de la formación de enlaces C-C para la producción de compuestos de estereoquímica definida, de aplicación en diversos campos y, en especial, en la industria farmacéutica.El presente trabajo de Tesis Doctoral es una aportación al desarrollo de un bioproceso catalítico empleando ramnulosa-1-fosfato aldolasa recombinante como biocatalizador para la producción estereoselectiva de un compuesto precursor de inhibidores de glicosidasas de acción terapéutica mediante adición aldólica de dihidroxiacetona fosfato y (S)-Cbz-alaninal.En primer lugar, se ha procedido a la obtención de un modelo cinético de la reacción catalizada por la enzima soluble en un medio acuoso con dimetilformamida como cosolvente para permitir la disolución simultánea de ambos reactivos. Este modelo cinético incluye la reacción secundaria de degradación enzimática de dihidroxiacetona fosfato que tiene lugar paralelamente a la reacción de síntesis.En segundo lugar, y con el fin de aumentar la estabilidad de la enzima y mejorar la operación en biorreactor, se estudió la inmovilización de la enzima en dos tipos de soportes: soportes de afinidad metálica y nanopartículas de oro. El primer soporte permite realizar la purificación e inmovilización en un solo paso de la enzima, con el consiguiente ahorro de etapas y aumento del rendimiento global del proceso. El segundo tipo de soporte permite reducir las limitaciones difusionales que aparecen con frecuencia en los soportes porosos convencionales y obtener elevadas cargas enzimáticas específicas. Los biocatalizadores inmovilizados por ambas técnicas se emplearon en la catálisis de la adición aldólica de interés en un medio acuoso con dimetilformamida como cosolvente, evaluando su estabilidad en el medio.Por último, se estudiaron otras estrategias de reacción para mejorar la solubilidad simultánea de los reactivos de la reacción. Por un lado se analizó el empleo de novedosos medios de reacción, los líquidos iónicos, como alternativa al empleo de cosolventes orgánicos en la biocatálisis de interés. Por otro lado, se evaluó la aplicación de un biorreactor de membrana empleando un medio bifásico acuoso/orgánico en el mismo sistema biocatalítico. / Nowadays, there is a growing interest in the development of efficient industrial bioprocesses from an economic and environmental point of view. One of the most promising processes for the industry is the biocatalytic C-C bond formation that yields compounds with defined stereochemistry for diverse applications, especially in the pharmaceutical industry.This PhD Thesis is a contribution to the development of a catalytic bioprocess for the production of precursors of compounds with therapeutic potential as inhibitors of glycosidases for a wide range of diseases. The biocatalytic reaction employed was the aldol addition between dihydroxyacetone phosphate and (S)-Cbz-alaninal using recombinant rhamnulose-1-phosphate aldolase as biocatalyst.First, a kinetic model for the aldol addition catalyzed by soluble enzyme was obtained. The reaction was carried out in an aqueous medium with dimethylformamide as a cosolvent in order to achieve a suitable solubility of both reactants. This kinetic model includes the secondary reaction of enzymatic degradation of dihydroxyacetone phosphate that takes place simultaneous to the synthetic reaction.Secondly, enzyme immobilization was studied with the aim of increasing enzyme stability and improving bioreactor operation. Two types of supports were used: metal-chelated supports (IMAC) and gold nanoparticles. The use of metal-chelated supports allows simultaneous purification and immobilization in only one-step, reducing the number of steps of the process and increasing the global yield. Gold nanoparticles as supports for enzyme immobilization allow obtaining high enzymatic loads due to its high surface-to-volume ratio. Moreover, the diffusional limitations that frequently appear while working with conventional porous supports can be also reduced. Immobilized biocatalysts were produced by both immobilization techniques and they were applied in the biocatalysis of the selected aldol addition in an aqueous medium with dimethylformamide as a cosolvent. The stability of these biocatalysts in the reaction conditions was determined as well.Finally, other reaction strategies were employed in order to improve the simultaneous solubility of dihydroxyacetone phosphate and (S)-Cbz-alaninal. Ionic liquids, considered as promising reaction solvents, were assessed as an alternative to organic cosolvents in the selected biocatalysis. On the other hand, a membrane bioreactor with an aqueous/organic biphasic medium with high solubility of both substrates was studied with the same biocatalytic system.

En aquest treball hem investigat el rol de la p120-catenina en la via de senyalització de Wnt. Hem demostrat per primera vegada la importància d’aquesta catenina en l’activació de la GTPasa Rac1 i en la translocació de la β-catenina al nucli en resposta a la via canònica de Wnt. La via de Wnt ha estat àmpliament estudiada degut a la seva forta implicació en funcions essencials de cèl·lules epitelials normals i patològiques. Tot i que s’han descrit moltes proteïnes implicades en la via de Wnt, queden encara molts detalls per descriure sobre la regulació de l’activitat d’aquestes. Recentment, s’ha descrit que Rac1 és essencial per la translocació de la β-catenina al nucli (Wu X, et al. Cell 2008,133:340-53). El Rac1 actiu controla la localització nuclear de la β-catenina durant la via canònica de Wnt. Tot i així, el mecanisme d’activació d’aquesta GTPasa no ha estat investigat. En aquest treball es demostra que la p120-catenina és necessària per l’activació de Rac1, actuant com a proteïna acobladora de Rac1 i el seu activador Vav2. La interacció de les dues proteïnes amb la p120-catenina és estimulada per la fosforilació de CK1 i la defosforilació en residus tirosina, dues modificacions post-traduccionals que són activades pel factor Wnt3a. Quan sobre-expressem en cèl·lules diferents mutants de la p120-catenina que no uneixen ni Vav2 ni Rac1, o específicament Rac1, aquests no són capaços d’estimular l’activitat de Rac1. A més a més, sabent que la depleció de la p120-catenina en Xenopus produeix defectes en el procés de gastrulació, hem analitzat la capacitat dels diferents mutants de p120-catenina en rescatar aquest fenotip. Al contrari que la proteïna salvatge, els mutants de la p120-catenina que no uneixen Rac1 i Vav2, o que només uneixen Vav2, no són capaços de rescatar la depleció de p120-catenina. Així doncs, els nostres resultats indiquen que la p120-catenina és necessària per l’activació de Rac1 estimulada per Wnt, a través de la unió de Vav2 i de Rac1. Mitjançant la combinació d’experiments in vitro, transfeccions de cultius cel·lulars i anàlisis in vivo en embrions de Xenopus, proposem un mecanisme detallat del control de l’activitat transcripcional de la β-catenina i la via de senyalització de Wnt. / In this work we have investigated the involvement of p120-catenin in Wnt signaling. We demonstrate for the first time the relevance of this catenin in the activation of Rac1 GTPase and in the translocation of β-catenin to the nucleus in response to canonical Wnt signals. The Wnt pathway has been broadly studied due to its involvement in essential functions in normal and pathological epithelial cells. Although the involvement of many proteins in the process has been genetically demonstrated, many details of its activation remain to be clarified yet. Recently, Rac1 has been shown to be essential for β-catenin translocation to the nucleus (Wu X, et al. Cell 2008,133:340-53). Rac1 activation controls the nuclear localization of β-catenin during canonical Wnt signaling. However, the mechanism of activation of this GTPase has not been investigated. Here we report that p120-catenin is required for Rac1 activation, acting as an anchor protein for both Rac1 and its activator Vav2. The interaction of both proteins with p120-catenin is stimulated upon phosphorylation by CK1 and dephosphorylation in tyrosine residues, two p120-catenin post-translational modifications promoted by Wnt3a. When over-expressed, p120-catenin point mutants unable to bind Rac1 and Vav2, or specifically Rac1, fail to stimulate Rac1 activity. Moreover, since p120-catenin depletion disrupts gastrulation in Xenopus, we analyzed p120-catenin mutants for their ability to rescue such phenotype. In contrast to the wild-type protein, p120-catenin point mutants unable to bind Rac1 and Vav2, or to bind Vav2 alone, failed to rescue p120 depletion. Therefore, our results indicate that p120-catenin is required for Rac1 activation upon Wnt signaling, through binding to Vav2 and Rac1 proteins. Combining in vitro binding experiments, cell culture transfections and in vivo analysis in Xenopus embryos, we provide a more detailed picture of the mechanism controlling β-catenin transcriptional activity and Wnt signaling.

Les tècniques proteòmiques basades en l’espectrometria de masses (MS) permeten la caracterització de la complexa i dinàmica natura del proteoma. Aquestes eines han contribuit a entendre millor certes funcions biològiques i respostes cel·lulars i a obtenir biomarcadors específics per a l’estudi d’algunes malalties. En aquest treball, es van utilitzar tècniques proteòmiques de quantificació i validació, basades en l’espectrometria de masses (MS), en diferents estudis de recerca biomèdica. En el primer estudi es va comparar el perfil de proteïnes del fluid vitri de pacients diabètics amb retinopatia diabètica proliferativa (PDR) amb el de pacients no diabètics amb forat macular idiopàtic (MH). L’anàlisi proteòmica comparativa es va fer amb el sistema d’electroforesi diferencial en gel bidimensional basat en el marcatge fluorescent (2D-DIGE). Per MS es van identificar 11 proteïnes diferencials entre els pacients amb PDR i els individus no diabètics. Cinc de les proteïnes diferencials és van validar per western blot en fluids vitris i per RT-PCR en retines. L’anàlisi proteòmica 2D-DIGE va servir per a identificar potencials candidats involucrats en la patogènesis de la PDR. En el segon estudi es va estudiar l’efecte del gen REgulador AutoImmune (AIRE) mitjançant la comparació dels proteomes de cèl·lules epitelials transfectades o no amb AIRE. L’anàlisi comparativa es va realitzar combinant dues tècniques de proteòmica quantitativa: la 2D-DIGE i l’etiquetatge isotòpic codificat de proteïna (ICPL) en combinació amb cromatografia líquida acoblada a espectrometria de masses (LC-MS). Els resultats van mostrar un nivell incrementat de varies xaperones en les cèl·lules que expressaven AIRE, mentre que diferents proteïnes de interacció del citoesquelet es van trobar disminuïdes. A més, algunes proteïnes relacionades amb apoptosi tenien abundàncies diferencials entre unes cèl·lules i les altres. Aquests resultats es van confirmar per western blot i citometria de flux. Finalment, assajos d’apoptosi amb annexin V i etopòsid van demostrar que les cèl·lules positives en AIRE patien més apoptosi espontània i eren menys resistents a la inducció d’apoptosi. Els resultats obtinguts van corroborar el paper d’AIRE com a inductor d’apoptosi. En el tercer estudi, amb l’objectiu de identificar possibles proteïnes biomarcadores de l’activitat TGFβ en gliomes es van analitzar les proteïnes secretades en els cultius cel·lulars primaris derivats de tumors (PCTCs), tractats o no amb TGFβ, mitjançant experiments quantitatius de LC-MS sense marcatge i ICPL. Es van identificar varies proteïnes candidates per a les que es van desenvolupar mètodes d’anàlisi de seguiment d’una reacció seleccionada (SRM) per a poder validar-les en mostres de líquid cefaloraquidi (CSF) i plasma de pacients amb glioma. Per l’anàlisi dels CSFs els resultats van mostrar una clara correlació entre les proteïnes candidates i els nivells de TGFβ en aquestes mostres. Igualment, al analitzar les proteïnes candidates per SRM en mostres de plasma de pacients amb glioma en fases alternades de tractament amb un inhibidor de TGFβ es va observar que els nivells de les proteïnes d’interès eren modulades pel tractament. Aquestes proteïnes conformarien una firma proteica que podria ser útil per al diagnòstic i el seguiment del tractament dels pacients. En conjunt, els resultats obtinguts en cada un dels tres estudis demostren la utilitat de l’anàlisi proteòmica en diferents aspectes de la investigació biomèdica. / Proteomic techniques based on mass spectrometry (MS) allow the characterization of the complex and dynamic nature of the proteome. These tools have contributed to better understand certain biological functions and cellular responses and to obtain specific biomarkers useful for the management of some diseases. In this work, quantitative and validation proteomic techniques, based on mass spectrometry, were applied to different biomedical research projects. In the first study, the protein profile of the vitreous fluid of diabetic patients with proliferative diabetic retinopathy (PDR) and non diabetic patients with macular hole (MH) was compared. Comparative proteomic analysis was performed using differential in gel electrophoresis based on fluorescent labeling (2D_DIGE). Eleven differential proteins between PDR and non diabetic patients were identified by MS. Five differential proteins were validated by western blot analysis of vitreous fluid and by RT-PCR of retinas. 2D-DIGE proteomic analysis allowed the identification of potential candidates involved in the pathogenesis of PDR. In the second study, the effect of AutoImmune Regulator (AIRE) gen was studied by comparison of the proteomic profile of epithelial cells transfected or not with AIRE. The comparative analysis was done using to proteomic techniques: 2D-DIGE and Isotopic Coded Protein Labeling (ICPL) in combination with liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LC-MS). Results showed an increased level of some chaperons in the cells expressing AIRE, while some cytoskeleton interacting proteins were decreased. Moreover, proteins related wit apoptosis had differential abundances between samples. These results were confirmed by western blot and flow cytometry. Finally, apoptosis assays with annexin V and etoposide demonstrated that AIRE-positive cells suffer more spontaneous apoptosis and are less resistant to apoptosis induction. These results confirm the role of AIRE as an inducer of apoptosis. In the third study, the main objective was the identification of biomarker proteins of TGFβ activity in gliomas. Secreted proteins from primary cultures of tumor cells (PCTCs), treated or not with TGFβ, were analyzed by label free and ICPL LC-MS quantitative experiments. Some candidate proteins were identified. Selected reaction monitoring (SRM) methods were designed to analyze these candidate proteins in cerebrospinal fluid (CSF) and plasma of glioma patients. CSF analysis showed a clear relationship between the protein levels and the TGFβ concentration. When the SRM methods were applied to the plasma of glioma patients under alternate periods of treatment with a TGFβ inhibitor, the levels of proteins of interest were observed to be modulated by the treatment. These proteins can thus constitute a protein signature useful for diagnostic and treatment monitoring. Overall, the results obtained in each of the projects show the usefulness of the proteomic analysis in different aspects of de biomedical research

En el presente trabajo se han determinado las propiedades de la lipasa recombinante de Rhizopus oryzae contenida en un extracto proteico obtenido mediante el cultivo de Pichia pastoris (rROL). Posteriormente, se ha estudiado la inmovilización de la lipasa recombinante en soportes de diferente naturaleza, como son el polvo de polipropileno (EP100) y el Eupergit®. Con el objetivo de realizar una comparación, se realizaron los mismos estudios de caracterización e inmovilización con la lipasa nativa contenida en un extracto proteico obtenido del cultivo de Rhizopus oryzae (nROL). Los análisis de caracterización revelaron dos isoformas de la lipasa recombinante con idéntico N-terminal y con masas muy similares. Por otra parte, el extracto nativo mostró tres isoformas de nROL. En cuanto a los estudios de especificidad frente a triacilglicéridos, se determinó un comportamiento igual de nROL y rROL, mientras que con los análisis frente a ésteres de p-nitrofenol se dedujo la presencia de la esterasa en el extracto nativo. En los estudios de inmovilización, tanto nROL como rROL fueron hiperactivadas a ciertas relaciones de actividad ofrecidas por miligramo de soporte. Además, la estabilidad en función de la temperatura y el pH reveló que nROL es más estable que rROL tanto inmovilizada como en solución. Se estudió la síntesis de un aromatizante utilizándose tres derivados inmovilizados: rROL-EP100, rROL-Eupergit®CM y rROL-Sepabeads. Se analizó el efecto de diversas variables sobre la velocidad inicial de reacción y conversión final. El derivado que mostró unos mejores resultados fue el obtenido a partir del EP100 aunque rROL-Sepabeads fue el derivado inmovilizado más estable. Mediante la metodología de la superficie de respuesta, pudo analizarse el efecto de la concentración de ácido butírico y la relación molar butírico:etanol sobre la velocidad inicial de síntesis, la conversión y la producción. Los resultados de velocidad inicial y conversión mostraron un claro efecto inhibidor e inactivación a elevadas concentraciones de butírico. De igual modo un exceso de etanol también resultaba inhibidor. Las condiciones óptimas se determinaron en base a un modelo para maximizar la producción de butirato de etilo. Finalmente, rROL mostró capacidad catalítica en otras reacciones de interés industrial como son, la síntesis de la cortexolona-21-acetato, lípidos estructurados de baja carga calórica además de triacilglicéridos sustitutivos de las grasas presentes en leches maternas. / Extracts of mature Rhizopus oryzae lipase overexpressed in Pichia pastoris (rROL) and commercial ones from the native microorganism (nROL) have been characterized. Specific activity of rROL extract was more than 40 fold higher than nROL. The presences of multiple bands of lipases around 34 kDa were both extracts. The influence of ionic strength on optimum temperature and pH was also determined from both extracts, significant differences were observed. Finally, the specificity against triacylglycerol esters and p-nitrophenols esters was also analyzed. Similar behaviour was obtained in front of triacylglycerol esters; however rROL shown an opposite behaviour compared to nROL in front of p-nitrophenol esters with preferences for long chain derivatives because of the presence of an esterase in the commercial product. Two different kinds of support, the polypropylene powder EP100 and Eupergit®C, were tested to immobilize the enzymes. The study of the stability of soluble and immobilized enzymes was performed by means of the Box-Hunter experiment design. The stability of a soluble extracts as well as immobilized derivatives was analyzed and the studies showed higher stability or nROL. In order to apply rROL a flavour synthesis, it was immobilized in three different kinds of support (EP100, Eupergit®CM and Octadecyl-Sepabeads) with the aim of using it in the production of ethyl butyrate. The effect of different parameters on initial reaction rate and yield has been studied for each biocatalyst. The results showed the EP100 derivative as the best choice in terms of initial rate and yield but Sepabeads derivative was the most stable. Moreover, by means of a response surface methodology, the effect of butyric acid concentration and molar ratio butyric acid:ethanol on yield, initial synthesis rate and production was studied. An inhibitory effect as well as inactivation of the enzyme was detected at high concentration of butyric acid. The ethanol also showed an inhibitory effect. The optimum conditions were selected in order to maximise the production. Finally, rROL was used to synthesize cortexolone-21-acetate as well as different kinds of structured lipids, obtaining good results

Progression through the cell cycle is directed by cyclin dependent kinases (CDKs), which are essential for normal and cancer cell proliferation. CDKs are activated by association with cyclins specific to each cell cycle phase (G1, S, G2, and M). Thus, CDK associated with G1 phase cyclins promote the expression of proteins necessary for DNA replication, but is unable to activate it. CDK associated with S phase cyclins, in turn, triggers the activation of chromosomal origins of replication, but is unable to promote chromosome condensation and segregation of sister chromatids, which is carried out by CDK associated with mitotic cyclins. Despite the essential role of CDKs in cell cycle progression, how the different cyclins promote specifically the various processes of the cell cycle was still an open question by the time this thesis was initiated. Since the discovery of cyclins by Nobel laureate Tim Hunt [Evans et al. (1983) Cell 33:389] it was assumed that cyclins confer substrate specificity. However, later on, fellow Nobel laureate Paul Nurse proposed an alternative quantitative model, [Stern & Nurse (1996) Trends Genet 12:345], based on the observation that successive waves of cyclins result in increased levels of CDK activity. While low levels of activity (CDK associated with G1 cyclins) are sufficient promote progression through the G1 phase and start the pro-S phase transcription program, would be unable to trigger replication. Moderate levels of activity (CDK associated with S phase cyclins) would be able to activate replication but not mitosic events, which would require the high CDK activity associated with M phase cyclins. If correct, the quantitative model should fulfill two predictions, but only one was demonstrated by the Nurse lab. Eukaryotic unicellular yeast cells are able to survive with a single mitotic cyclin, which is notwithstanding able to orderly drive the cell through the different cell cycle phases [Fisher & Nurse (1996) EMBO J 15:850]. Therefore M-CDK activity is able to promote the previous phases of the cycle in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe However, if a purely quantitative mechanism applies, the complementary prediction should be true as well: an early cyclin to be able to trigger later events if expressed at levels high enough. To test such prediction we generated a budding yeast Saccharomyces cerevisiae strain carrying a G1 cyclin G1 resistant to degradation, under a strong inducible promoter, and fused to a nuclear localization signal. Our results show that one such cyclin is capable of firing chromosome replication conditions in which the S phase cyclins, G2 and M are suppressed. Therefore, our results support the quantitative model against the requirement of substrate specificity. How eukaryotic cells prevent premature activation of the critical cell cycle processes that lead to genomic instability, seems therefore trust in the regulation of activity levels and limiting the presence of cyclin at specific time and space.

La polineuropatia diabètica (PND) és una de les complicacions secundàries més freqüents de la diabetis mellitus. Provoca un empobriment de la qualitat de vida dels malalts, causa dolor i úlceres i, en última instància, amputació de l’extremitat afectada. La patogènia és multifactorial, hi ha alteracions estructurals en els nervis perifèrics i els tractaments actuals són simptomàtics, no específics i poc efectius. El ratolí transgènic RIP/INFβ és un model de diabetis, que mimetitza la diabetis autoimmune humana, provocant la destrucció de les cèl·lules β pancreàtiques, que s’intensifica amb l’administració de dosis baixes repetides d’estreptozotocina (STZ). Partint de la base de que els processos biològics implicats en la degeneració i regeneració dels nervis perifèrics estan controlats pels ganglis de les arrels dorsals (GAD), l’objectiu d’aquesta tesi ha estat analitzar l’expressió gènica i els processos biològics que esdevenen en els GAD del nervi ciàtic després d’un traumatisme, en el ratolí transgènic RIP/INFβ tractat amb dosis baixes i repetides de STZ (Tg-STZ). S’ha treballat amb els GAD del nervi ciàtic de ratolins, en diferents condicions experimentals: controls ICR (ICR) atès que els ratolins transgènics presenten aquest fons genètic; ICR tractats amb STZ (ICR-STZ); transgènics RIP/INFβ (Tg); i Tg tractats amb STZ (Tg-STZ). Quatre setmanes després de considerar-ne instaurada la diabetis en els Tg-STZ, tots els animals van ser sotmesos a una lesió per aixafament en el nervi ciàtic de l’extremitat esquerra, mantenint la dreta intacta. Quatre setmanes desprès de la lesió es van prendre mostres dels GAD del nervi ciàtic d’ambdues extremitat. Es va extreure el RNA dels GAD per realitzar els estudis de microarrays (Affymetrix GeneChip® Mouse Genome 430 2.0 Array). Per validar els valors de l’expressió gènica es va realitzar una PCR quantitativa en temps real (RT-qPCR). Es van realitzar comparacions dels perfils gènics entre les diferents condicions experimentals: 1) ICR-STZ lesionades vs ICR lesionades; 2) ICR lesionades vs ICR no lesionades; 3) Tg-STZ no lesionades vs ICR no lesionades; i 4) Tg-STZ lesionades vs ICR lesionades. Les mostres de referència van ser els GAD de l’extremitat no lesionada dels ratolins ICR (baseline) amb un fold change (FC) de 1. Un cop obtinguts els perfils de les comparatives es van analitzar els gens sobrerregulats i infrarregulats, i els processos biològics implicats, amb diferents bases de dades (Database for Annotation, Visulaization and Integrated Discovery; Center for Quantitaive Biology; Gene Home). L’absència de diferències en l’expressió gènica entre els GAD de les extremitats lesionades dels animals ICR-STZ vs ICR, indica que, en aquests òrgans, la STZ no té un efecte neurotòxic. En animals control ICR a les 4 setmanes després d’una lesió en el nervi ciàtic, encara es sobrexpressen gens relacionats amb la regeneració nerviosa, que participen en les vies de senyalització (Gpr151, Nts), transmissió sinàptica (Npy), projeccions neuronals i guia de l’axó (Sox11, Atf3, Tnc, Sema6a, Sprr1a, Gal), el que indicaria que la lesió encara no està totalment resolta. En animals transgènics (Tg-STZ) diabètics, la infrarregulació de gens relacionats amb vies metabòliques (Vgf) i la sobrerregulació de gens implicats en el metabolisme de hidrats de carboni (Car3) i lípids (Gdpd3), indicaria que a les 8 setmanes d’iniciar el procés diabètic els GAD estarien afectats per la hiperglucèmia. En animals transgènics (Tg-STZ) diabètics, 8 setmanes després de començar la hiperglucèmia, la infrarregulació de gens implicats en desenvolupament del sistema nerviós (Gal, Bdnf, Erg3), regeneració axonal (Sprr1a, Lingo1), transmissió sinàptica (Calb1, Snapin), transducció de senyals (Nts, Rgs2), canals de potassi (Kcns1, Kcnq5, Knj13, Kcna6, Kcnt1) i apoptosi (Tfnaip, Ctsb, E2f1, Crh), indicaria l’existència de canvis degeneratius en els GAD deguts a la neuropatia diabètica. En animals transgènics (Tg-STZ) diabètics, 4 setmanes després d’una lesió per aixafament del nervi ciàtic, la sobreexpressió de gens relacionats amb guia de l’axó (Foxd1), regeneració axonal (Sprr1a), projeccions neuronals (Mapk8), supervivència de les neurones dels GAD i elongació de les neurites (Gal, Sox11), o de vies de senyalització nerviosa (Npy1r, Igf1, Rgs18, Gpr151), transmissió sinàptica (Gabrb3, Neto1, CcKbr) i apoptosi (Crh), assenyalaria que en els GAD hi ha processos de regeneració posttraumàtica. En animals transgènics (Tg-STZ) diabètics, 4 setmanes després d’una lesió per aixafament del nervi ciàtic, la infraexpressió de gens relacionats amb l’axogènesi (Nptx1, Cxcr4), transmissió sinàptica neuromuscular (Egr3) i transport de substàncies (Htr3a, Tnpo, Mlc1, Slc15a2, Slc6a4), mostraria un alentiment de la regeneració nerviosa. En animals control ICR a les 4 setmanes després d’una lesió en el nervi ciàtic, la sobreregulació de gens implicats en reorganització o remodelació de la matriu extracel·lular (MEC) i del microambient local a la part lesionada (Mmp16, Col18a1, Col3a1, Col5a2, Loxl2) i d’adhesió cel·lular (Lmo7, Flrt3), i transport de substàncies (Cacna2d1, Slc15a3, Slc15a9, Slc6a4) i apoptosi (Phb, Comp), indicaria que hi ha regeneració i remodelació a la part lesionada. En animals transgènics (Tg-STZ) diabètics, els processos de reorganització i remodelació de la MEC quasi no estan sobrerregulats, excepte Mmp16 i Tgfbi amb un FC>2, el que confirmaria que la regeneració estaria retardada, i encara no s’haurien iniciat els fenòmens de remodelació local. En animals control ICR a les 4 setmanes després d’una lesió en el nervi ciàtic, hi ha sobrexpressió de gens relacionats amb el dolor neuropàtic (Npy, Npy2r, Gal) i en animals transgènics (Tg-STZ) no hi ha expressió de Npy, i el gen Gal està infrarregulat. Això podria estar relacionat amb la pèrdua de la sensibilitat al dolor que s’observa en els pacients amb PND. El coneixement dels gens i els processos biològics involucrats en la degeneració i regeneració nerviosa en ratolins sans ICR i en ratolins transgènics Tg-STZ diabètics, obre noves vies de recerca per aprofundir en el coneixement de la patogènia de la PND i per l’estudi de molècules diana en el tractament de la PND i del dolor neuropàtic. / Diabetic neuropathy (PND) is the most frequent secondary complication of diabetes mellitus (DM). The most important contributors to reduction in the quality of life of patients with DM are neurological pain and foot ulcerations and, ultimately, non-traumatic amputation of the affected limb. The pathogenesis is multifactorial, there are structural changes in the peripheral nerves and current treatments remain largely symptomatic, non-specific and not uniformly effective. Transgenic diabetic RIP/INFβ mice when treated with low doses of streptozotocin (STZ) present with pancreatic β-cell destruction, mimicking autoimmune diabetes in humans. On the basis that mechanisms governing peripheral nerve degeneration and regeneration are controlled by dorsal root ganglion (GAD), the aim of this thesis was to characterize gene expression, and thus the biological processes that take place in the GAD of injured sciatic nerve, of transgenic RIP/INFβ mice treated with multiple low doses of STZ (Tg-STZ). Gene expression in GAD was studied in four different groups of mice: wild type ICR (ICR) as a wild type genetic background control; ICR treated with STZ (ICR-STZ); transgenic RIP/INFβ mice (Tg); and Tg mice treated with STZ (Tg-STZ). Four weeks after diabetes was established in Tg-STZ mice, a left sciatic nerve crush injury was performed in all groups, the right limb was left intact. Four weeks after sciatic nerve injury GAD samples were collected from both hind limbs. GAD RNA was extracted to perform microarray study (Affymetrix GeneChip® Mouse Genome 430 2.0 Array). Real time PCR (RT-qPCR) was performed to validate some of gene expression values obtained. Comparisons were made between the gene profiles from the different experimental conditions: 1) ICR-STZ injured vs ICR injured, 2) ICR injured vs ICR uninjured, 3) Tg-STZ uninjured vs ICR uninjured and 4) Tg-STZ injured vs ICR injured. Baseline samples were the uninjured limbs from ICR mice with a Fold Change value of 1. Once the compared profiles were obtained, upregulated and downregulated genes were analysed, as well as their related biological process, using different databases (Database for Annotation, Visulaization and Integrated Discovery; Center for Quantitaive Biology; Gene Home). The absence of differences in gene expression between injured limbs GAD from ICR-STZ mice vs ICR mice showed that STZ administration had no toxic effect in GAD. Four weeks after sciatic nerve injury, genes associated with nerve regeneration were still upregulated in ICR mice, particularly those involved in signalling (Gpr151, Nts), synaptic transmission (Npy), neuronal projection and axonal guidance (Sox11, Atf3, Tnc, Sema6a, Sprr1a, Gal). This finding indicates that the lesion was not completely resolved. Transgenic diabetic mice (Tg-STZ) showed downregulation of genes related to metabolic pathways (Vgf) and upregulation of genes implicated in carbohydrate (Car3) and lipid metabolism (Gdpd3), indicating that 8 weeks after DM onset, a sustained hyperglycaemia affects GAD. Transgenic diabetic mice (Tg-STZ) showed, after 8 weeks of sustained hyperglycaemia, downregulation of genes associated with nervous system development (Gal, Bdnf, Erg3), axonal regeneration (Sprr1a, Lingo1), synaptic transmission (Calb1, Snapin), signal transduction (Nts, Rgs2), potassium channel (Kcns1, Kcnq5, Knj13, Kcna6, Kcnt1) and apoptosis (Tfnaip, Ctsb, E2f1, Crh). Reflecting GAD degenerative changes due to PND. Four weeks after sciatic nerve injury, genes associated with nerve regeneration were still upregulated in diabetic transgenic mice (Tg-STZ) such as those involved in axon guidance (Foxd1), axonal regeneration (Sprr1a), neuronal projection (Mapk8), GAD neurons survival and neurite elongation (Gal, Sox11), or signalling (Npy1r, Igf1, Rgs18, Gpr151), synaptic transmission (Gabrb3, Neto1, CcKbr) and apoptosis (Crh). Suggesting ongoing posttraumatic GAD regeneration processes. Four weeks after sciatic nerve injury, several genes were downregulated in diabetic transgenic mice (Tg-STZ) involved in axogenesis (Nptx1, Cxcr4), neuromuscular synaptic transmission (Egr3) and transport (Htr3a, Tnpo, Mlc1, Slc15a2, Slc6a4), evidencing delayed nerve regeneration. Four weeks after sciatic nerve injury, genes associated with nerve regeneration were still upregulated in ICR mice, involved in extracellular matrix (MEC) reorganization and local microenvironment (Mmp16, Col18a1, Col3a1, Col5a2, Loxl2), cell adhesion (Lmo7, Flrt3), transport (Cacna2d1, Slc15a3, Slc15a9, Slc6a4) and apoptosis (Phb, Comp) indicating reorganization and regeneration of the injured site. Transgenic diabetic mice (Tg-STZ) only showed upregulation of 2 genes (Mmp16, Tgfbi) related to MEC reorganization. The remaining genes were barely upregulated. This finding is in accordance with a delayed regeneration, and with the fact that local remodelling is yet to be started. Four weeks after sciatic nerve injury, genes associated with neuropatic pain were upregulated in ICR mice (Npy, Npy2r, Gal). However, in diabetic transgenic mice Tg-STZ, no Npy expression was found and, moreover, Gal was downregulated. This finding could be related to PND loss of pain sensitivity. Our findings regarding genes and biological processes involved in nerve degeneration and regeneration mechanisms in ICR mice and in diabetic transgenic mice Tg-STZ lead to new research lines aimed to understanding PND pathogenesis and to the study of target therapeutic molecules for PND and diabetic pain.

Els test de resistència al antiretrovirals són utilitzats en la pràctica clínica per la personalització del tractament antiretroviral (TARV) de les persones infectades pel VIH-1. La seqüenciació poblacional (SP) és la tècnica més emprada pel genotipat del VIH-1 obtenint una bona correlació amb la resposta clínica dels pacients. No obstant, la baixa sensibilitat de la SP pel que fa a la detecció de mutacions de resistència als antiretrovirals (DRM) o soques X4-tròpiques presents en baixes prevalences pot comprometre l’eficàcia del TARV. L’aplicació de noves tècniques de seqüenciació massiva pel genotipat del VIH-1 (genotipat ultrasensible) permetria una caracterització de la població viral amb major resolució optimitzant el TARV. L’objectiu d’aquesta tesi era avaluar el valor clínic del genotipat ultrasensible pel maneig clínic de pacients infectats pel VIH-1 que han estat exposats a TARV. Durant la utilització de 454 sequencing per la determinació del tropisme viral, 454 sequencing va obtenir una major concordança amb ESTA (Enhanced Sensitivity TrofileTM Assay) en l’anàlisi de l’ARN viral. Tot i que la SP tenia una menor sensibilitat respecte 454 sequencing, la seva elevada especificitat li va permetre obtenir una millor precisió. Anàlisis filogenètics a partir de dades obtingudes per 454 sequencing van revelar que, encara que les determinacions eren equivalents entre amdós compartiments, en alguns pacients es va observar compartimentalització de seqüències pel que fa als haplotips i a la seva prevalença. Aquesta compartimentalització podria comprometre la determinació del tropisme viral en funció del compartiment que s’analitzi. Durant aquest treball també es va fer la validació de la SP per determinacions del tropisme a partir d’ADN proviral en un assaig clínic prospectiu i aleatoritzat. Aquest assaig va demostrar ser útil per guiar canvis de tractament antiretroviral que incloguin antagonistes de CCR5. De tota manera, 454 sequencing va ser capaç de detectar variants X4 tròpiques en dos pacients prèviament classificats com a R5 tròpics per SP. Pel que fa a la detecció de DRM en el gen pol, 454 sequencing va demostrar ser no-inferior a la SP durant l’avaluació de la susceptibilitat al tractament antiretroviral. Cal destacar que 454 sequencing va aportar informació genotípica addicional en la majoria dels pacients, encara que aquesta modifiqués poques prediccions de susceptibilitat. A més, aquesta tecnologia va ser utilitzada per explorar l’origen de les DRM en el gen de la integrasa del VIH-1, demostrant que virus mutants detectats durant el fracàs virològic poden ésser originats a partir de virus mutants minoritaris preexistents. En resum, aquesta tesi ha mostrat la utilitat clínica del genotipat ultrasensible del VIH-1 en pacients experimentats al TARV. 454 sequencing ha permès una profunda caracterització de la diversitat viral dins l’hoste, facilitant l’estudi l’evolució viral i la seva patogènesi del VIH-1. A més, l’estandarització i automatització dels protocols de 454 sequencing permetria la implementació d’aquesta tecnologia pel diagnòstic del VIH-1. / Los ensayos de resistencia a los antiretrovirales son utilizados en la práctica clínica para la personalización del tratamiento antirretroviral (TARV) de las personas infectadas por el VIH-1. La secuenciación poblacional (SP) es la técnica más utilizada para el genotipado del VIH-1 obteniendo una buena correlación con la respuesta clínica de los pacientes. Asimismo, la baja sensibilidad de la SP para la detección de mutaciones de resistencia a los antiretrovirales o variantes X4-trópicas presentes en baja prevalencia puede comprometer la eficacia de la TARV. El objetivo de esta tesis era evaluar el valor clínico del genotipado ultrasensible para el manejo clínico de pacientes infectados por el VIH-1 que han estado expuestos a TARV. Durante la utilización de 454 sequencing para la determinación del tropismo viral, 454 sequencing obtuvo una mayor concordancia con ESTA (Enhanced Sensitivity TrofileTM Assay) en el análisis del ARN viral. Aunque la SP mostró una menor sensibilidad que 454 sequencing, su elevada especificidad le permitió obtener una mayor precisión. La información genotípica generada por 454 sequencing fue utilizada para evaluar la compartimentalización. Aunque las determinaciones del tropismo viral eran equivalentes entre los compartimentos, en algunos pacientes se observó compartimentalización de secuencias, lo que puede comprometer la determinación del tropismo viral en función del compartimento que analizado. Durante este trabajo también se hizo la validación de la SP para determinaciones del tropismo a partir de ADN proviral en un ensayo clínico prospectivo y aleatorizado. Este ensayo demostró ser útil para guiar cambios de tratamiento antirretroviral que incluyan antagonistas de CCR5. De todos modos, 454 sequencing fue capaz de detectar variantes X4 trópicas en dos pacientes previamente clasificados como R5 trópicos por SP. En cuanto a la detección de DRM en el gen pol, 454 sequencing demostró ser no inferior a la SP durante la evaluación de la susceptibilidad al tratamiento antirretroviral. Cabe mencionar que 454 sequencing aportó información genotípica adicional en la mayoría de los pacientes, aunque esta modificara pocas predicciones de susceptibilidad. Además, esta tecnología fue útil para explorar el origen de las DRM en el gen de la integrasa del VIH-1, mostrando que los mutantes detectados durante el fracaso virológico pueden ser originados a partir de mutantes pre-existentes. En resumen, esta tesis ha mostrado la utilidad clínica del genotipado ultrasensible del VIH-1 en pacientes experimentados al TARV. 454 sequencing ha permitido una profunda caracterización de la diversidad viral dentro del huésped, facilitando el estudio de la evolución viral i la patogénesis del VIH-1. Además, la estandarización i automatización de los protocolos de 454 sequencing permitiría la implementación de esta tecnología para el diagnóstico clínico del VIH-1. / Drug resistance testing is utilized in the clinical routine to personalize ART of HIV-1 infected people. Population sequencing is employed for HIV-1 genotyping obtaining good correlations with clinical outcomes. However, its lack of sensitivity to detect minority DRM mutations or minor CXCR4-using viruses can compromise the efficacy of antiretroviral therapy (ART). The use of next generation sequencing technologies for ultrasensitive HIV-1 genotyping might allow deep characterization of the viral population optimizing the ART. The objective of this work was to evaluate the clinical value of ultrasensitive HIV-1 genotyping obtained by 454 sequencing for the management of ART-experienced HIV- 1 subjects in different treatment situations. During the utilization of 454 sequencing for viral tropism determinations, this technology achieved the closest diagnostic accuracy to ESTATM in plasma ARN. Although population sequencing had lower sensitivity than 454 sequencing, its highest specificity led to obtain closest accuracy to ESTA. Even though tropism determinations were equivalent between plasma and cellular compartments, phylogenetic analyses from data generated by 454 sequencing revealed sequence compartmentalization in some subjects. We also validated triplicate population HIV-1 genotyping from PBMC-associated DNA for viral tropism determinations in a prospective and randomized clinical trial. Here, genotypic tropism testing in proviral DNA demonstrated to become a suitable tool to guide treatment switches to CCR5 antagonists in aviremic individuals. In this study, 454 sequencing was capable to detect non-R5 viral strains in two subjects previously classified as harboring R5 HIV-1 strains by population sequencing. This compartmentalization might compromise viral tropism determinations depending on the compartment analyzed. Furthermore, the absence of evolution observed during prolonged periods of aviremia suggested that testing of stored plasma sample would be generally safe and informative. Regarding the detection of minority DRM in pol gene, 454 sequencing for ultrasensitive HIV-1 genotyping was technically non-inferior than population HIV-1 genotyping during the assessment of antiretroviral drug susceptibility. However, although this technology provided additional genotypic information beyond population sequencing in most of heavily pre-treated individuals tested, only few antiretroviral susceptibility predictions were modified. This technology was also useful to explore the origin of DRM in integrase gene, revealing that mutants detected at the time of virological failure can be originated from pre-existing minority drug resistance variants. In summary, this thesis has shown the clinical utility of ultrasensitive HIV-1 genotyping in ART-experienced HIV-1 infected individuals. However, further studies should extend our findings. 454 sequencing allowed a deep characterization of the HIV-1 diversity within a host helping to understand viral evolution and HIV-1 pathogenesis. Moreover, the standardization and automation of 454 sequencing protocols for HIV-1 sequencing would allow the implementation of this technology for HIV-1 diagnosis.

Los tumores cerebrales se desarrollan dentro del sistema nervioso central y pueden ser originados por células del mismo sistema nervioso, o bien tratarse de una metástasis con origen en un órgano distinto. Representan menos de un 2% del total de casos de cáncer diagnosticados cada año a nivel mundial, pero a pesar de ello, constituyen una fuente importante de mortalidad y discapacidad. El diagnóstico de este tipo de tumores generalmente se lleva a cabo mediante técnicas de imagen (IRM) y espectroscopía (ERM) por resonancia magnética nuclear (RMN) gracias a sus características morfológicas y aspectos bioquímicos diferenciales. La ERM está considerada como el método no invasivo que permite estudiar más adecuadamente el metabolismo de los seres vivos ya que puede determinar cualitativa y cuantitativamente una gran variedad de metabolitos en el tejido intacto, proporcionando una información extensa sobre su composición. Sin embargo queda limitada por una baja resolución espectral, en comparación con la resolución que se puede llegar a obtener con los análisis in vitro. En ese sentido, la evaluación in vitro de biopsias de tumores cerebrales mediante la técnica de espectroscopía de alta resolución “high resolution magic angle spinning spectroscopy” (HRMAS) complementa la información bioquímica obtenida in vivo y en muchos casos puede contribuir a mejorar el diagnóstico no invasivo y manejo de la enfermedad. La espectroscopía HRMAS consiste en hacer girar una muestra a altas velocidades en un ángulo de 54,7o respecto al campo magnético principal. Este tipo de adquisición reduce la anchura de las señales detectados en el espectro de RMN que viene principalmente causada por las interacciones dipolares entre núcleos de la muestra, con contribuciones adicionales de la heterogeneidad de la muestra y parámetros residuales anisotrópicos. Los métodos de manipulación de muestras de tejido para su análisis por HRMAS son relevantes y pueden interferir en los resultados. La obtención, conservación y temperatura a la que están sometidas las muestras pueden ser determinantes y desencadenar el metabolismo post mortem. A ese respecto, el uso de la irradiación por microondas focalizadas (FMW) puede ser una opción eficiente, actuando rápidamente y causando la inactivación de dicho metabolismo postmortem. Este método es ampliamente utilizado para el sacrificio de animales y capaz de preservar el metaboloma de muestras o tejidos. En esta tesis se han desarrollado distintas optimizaciones y estudios alrededor de la irradiación por FMW. En un primer momento, se estudió la influencia del método de sacrificio (sobredosis de anestesia vs. irradiación por FMW) en el patrón espectral HRMAS de tejidos obtenidos de modelos preclínicos de tumor glial de alto grado (GL261) y de isquemia cerebral en rata. Luego, se ha desarrollado una estrategia para minimizar los cambios en el patrón espectral de tejido cerebral y patológico mediante protocolos de fijación por irradiación FMW previa al análisis HRMAS, en muestras que habían sido sometidas a la congelación. Dicho método se desarrolló con vistas a su aplicación a biopsias de tumores cerebrales humanos. Paralelamente, se llevaron a cabo estrategias de reconocimientos de patrones espectrales con espectros HRMAS adquiridos de muestras de tumores cerebrales humanos. Estas estrategias, aparte de validar el uso del programa SpectraClassifier (desarrollado en el grupo de investigación) como herramienta para reconocimiento de patrones, en el caso de espectros HRMAS también estudió la posible influencia de la temperatura y secuencias de adquisición sobre el rendimiento de los clasificadores desarrollados. Se ha comprobado además que la irradiación por FMW de las biopsias de tumores, aunque no se refleja en una mejora sustancial en el rendimiento del clasificador, no parece tener una influencia negativa sobre éste y puede ser utilizada como método de preservación del patrón espectral de las biopsias investigadas. / Brain tumors develop within the central nervous system and could originate from nervous system itself or they can be due to a metastasis originating from a different organ. They represent less than 2 % of all diagnosed cases of cancer each year worldwide, but despite this, they are a major source of mortality and disability. Their diagnosis is generally carried out by nuclear magnetic resonance (NMR) techniques, both imaging (MRI) and spectroscopy (MRS) due to their differential morphological and biochemical characteristics. MRS is considered one of the best noninvasive methods to study metabolism of living beings, due to its ability for assessing both qualitatively and quantitatively a panoply of metabolites in the intact tissue, providing extensive information on its composition. However, there are limitations related to the relatively low spectral resolution achieved, in comparison with the in vitro studies resolution. In this sense, the in vitro evaluation of brain tumor biopsies using the high resolution magic angle spinning spectroscopy (HRMAS) technique could complement the biochemical information obtained through in vivo studies, and could help to improve diagnosis and management of disease. The HRMAS spectroscopy technique consists in spinning the sample at high speeds with an angle of 54.7o respect to the main magnetic field. This type of acquisition reduces the width of the spectral signals which are due mainly to the dipolar interactions, which are caused, in turn, by intrinsec factors of the sample and residual anisotropic parameters. The handling methods for tissue samples which will be used in HRMAS analysis are relevant and could interfere with the final result. The collection, storage and temperature conditions of the samples could be determining and could also induce post mortem metabolism. In this respect, the use of focused microwave irradiation (FMW) could be an efficient option, acting in a fast way and inactivating any postmortem metabolism. FMW fixation is a widely used method for animal sacrifice, in order to preserve the metabolome of tissue samples. In this thesis we have developed different studies around the FMW irradiation. First, we have studied the influence of the method used for animal sacrifice (anaesthesia overdose vs. FMW irradiation) in the spectral pattern of tissue samples from preclinical high grade tumors (GL261) and samples from preclinical models of ischaemic rat brain. Afterwards, we have developed a strategy to minimize spectral pattern changes of normal and pathological brain tissue through FMW irradiation prior to HRMAS analysis in previously frozen samples. This method was developed with the objective of its application to human brain tumor biopsies. In parallel, pattern recognition studies were carried out with HRMAS spectra acquired from those human brain tumor biopsies. These studies, besides of making possible the validation of SpectraClassifier software (developed in house within the research group where this thesis was performed) as a pattern recognition tool for HRMAS spectra, also assessed the influence of temperature and acquisition sequence in the performance of the developed classifiers. It has been proved, in addition, that although the FMW irradiation of the biopsies does not have a substantial impact in the classifier performance, it does not seem to have a negative influence over it, and could be used as a spectral pattern preservation method for studies of human brain tumors biopsies.

El desenvolupament de la capacitat metastàtica és deguda a l’adquisició de característiques específiques que acompanyen a la cèl·lula tumoral durant la progressió tumoral, tant en el microentorn local com en llocs distants. El nostre grup s’ha centrat en la identificació de proteïnes que intervenen en la patogènesi de la òrgan-especificitat de la metàstasi del càncer de mama (1,2,3). Basant-nos en resultats genòmics i proteòmics previs que indicaven una sobreexpressió de la proteïna ERp57 en cèl·lules amb habilitat per metastatitzar a l’os, vam analitzar el caràcter òrgan-específic d’aquest fenotip funcional i la seva implicació en la patogènesis de la metàstasi òssia. La modulació dels nivells d’aquesta proteïna podria mediar l’adaptació metabòlica al microentorn ossi, ja que la seva expressió pot regular-se pels baixos nivells de glucosa i d’oxigen d’aquest microentorn (4). La sobre-expressió d’ERp57 intervé en la fallida del reconeixement immunitari de les cèl·lules metastàtiques a os, dificultant el transport de molècules d’HLA I a la membrana cel·lular i afavorint la retenció en el Golgi. Per una altra banda, ERp57 remodela el citoesquelet de vimentina. Aquest fet suggereix un paper en la transició mesènquima-epiteli, imprescindible per a l’establiment de la cèl·lula metastàtica en el nou òrgan. La infra-expressió d’ERp57 és suficient per interrompre el procés metastàtic a os, indicant la rellevància de la seva funció en la reprogramació metabòlica que facilita l’adaptació de les cèl·lules de càncer de mama que metastatitzen a l’os. La combinació de l’espectroscòpia de Raman (RS) amb tècniques d’anàlisi multivariat ens ha proporcionat un mètode quantitatiu poderós per a la discriminació de fenotips metastàtics, basant-nos en les seves característiques metabòliques (5). L’ús de RS ens ha permès distingir un fenotip lipídic associat a la òrgan-especificitat de la metàstasi. La determinació de les bandes dels àcids grassos totals o TFA (2845 cm-1) i dels àcids grassos insaturats o TUFA (3015 cm-1) distingeix les cèl·lules de càncer de mama amb capacitat per metastatitzar a l’os d’altres amb capacitat per a metastatitzar a cervell o pulmó. L’anàlisi de dades genòmiques de pacients va corroborar aquest fenotip amb una sobre-expressió de gens del metabolisme lipídic en metàstasi cerebral de càncer de mama. Aquestes cèl·lules presenten un augment òrgan-específic en els nivells de síntesi lipídica i en la presència d’àcids grassos saturats, així com en la capacitat oxidativa d’àcids grassos. Aquest fenotip confereix major supervivència en situacions d’hipoglucèmia. L’autofàgia col·labora amb aquests processos afavorint la degradació de proteïnes malplegades i aportant intermediaris per al cicle de Krebs. Finalment, estudis de morfologia i dinàmica mitocondrial recolzen les dades metabòliques i suggereixen que aquestes característiques poden ser conseqüència de l’expressió diferencial de proteïnes que regulen el mitocondri en cada microentorn. Aquestes noves troballes indiquen nous fronts terapèutics per combatre la progressió metastàtica en el càncer de mama. / The development of the metastatic capacity is owed to the acquisition of specific features that accompany the tumoral cell during the tumoral progression, in the local microenvironment or in distant places. Our group has focused on the identification of proteins that take part in the pathogenesis of the organ-specificity of breast cancer metastasis (1,2,3). We based our study on previous genomic and proteomic results, which showed an over-expression of ERp57 in cells metastatic to bone. We analyzed the organ-specificity of this functional phenotype and its implication in the pathogenesis of bone metastasis. The modulation of this protein could favor the metabolic adaptation to the bone, as ERp57 expression is regulated by the low glucose and oxygen levels found in this microenvironment (4). ERp57 over-expression is involved in the failure of immune recognition of bone metastatic cells, hampering the transport of HLA I molecules to the cell membrane and contributing to Golgi retention. On the other hand, ERp57 reorganizes the vimentin cytoskeleton. This fact suggests a role in the mesenchimal-epithelial transition, which is an essential step for the establishment of the metastatic cell in the new organ. ERp57 under-expression blocks bone metastasis formation suggesting the importance of this protein in the metabolic reprogramming that mediates bone metastatic breast cancer cells adaptation. The combination of Raman spectroscopy (RS) with multivariate analysis techniques has provided a powerful quantitative method for the discrimination of metastatic phenotypes based on metabolic features (5). RS allowed us to distinguish a lipid phenotype associated to the organ-specificity of the metastasis. The determination of total fatty acids or TFA band (2845 cm-1) and total unsaturated fatty acids or TUFA band (3015 cm-1) could distinguish breast cancer cells with the ability to metastasize to bone from those metastatic to brain or lung. The analysis of patients’ genomic data confirmed this phenotype, showing an over-expression of genes related to lipid metabolism in breast cancer brain metastasis. These cells present an organ-specific increase in lipid synthesis and in saturated fatty acids, as well as an increase in the lipid oxidative capacity. This phenotype confers a greater survival advantage in hypoglycemic conditions. Autophagy collaborates with these processes facilitating the degradation of misfolded proteins and providing intermediaries for the Krebs cycle. Finally, studies of morphology and mitochondrial dynamics confirm the metabolic data and they suggest that these features could be a consequence of the differential expression of proteins that regulate the mitochondrion in each microenvironment. These findings point to new therapeutic options to fight against metastatic progression in breast cancer.

El trabajo descrito en esta tesis doctoral se enmarca dentro del proyecto MELOGEN (GEN2013‑ 20237, 2004‑2007) uno de cuyos objetivos era la construcción de una plataforma de TILLING en melón. La disponibilidad de recursos genéticos y genómicos para el melón se ha incrementado a lo largo de los últimos años e incluso la secuencia del genoma está disponible. Sin embargo, las herramientas genómicas para determinar la funcionalidad de los genes en esta especie son todavía limitadas. El TILLING (Targeting Induced Local Lesions IN Genomes) es un método de genética inversa mediante el cual se pueden crear e identificar nuevas mutaciones en genes candidatos y observar su efecto fenotípico. Además, también se pueden detectar fenotipos de interés para posteriormente identificar la mutación responsable de los mismos. En este trabajo se ha desarrollado una población de TILLING en Cucumis melo a partir de la línea doble haploide del tipo “Piel de Sapo” M62‑113. Aplicando inicialmente el mutágeno químico EMS (Etil Metano Sulfonato) sobre 17.000 semillas se ha desarrollado una colección de mutantes compuesta por 3.268 familias M2. A partir de 400 familias M2 se observaron diversos fenotipos mutantes en las diferentes etapas de crecimiento de la planta. Algunos de estos mutantes se han descrito con detalle generando un catálogo de los fenotipos observados en cada familia, algunos de los cuales pueden tener interés comercial. Para medir la tasa de mutación de la población se han analizado cuatro genes, la fitoeno desaturasa PDS, los factores de iniciación de la traducción eIF4E y eIF(iso)4E y el receptor de etileno ETR1. Los mutantes detectados han permitido calcular la tasa de mutación de la población, una mutación cada 1,5 Mb. En el caso de PDS se ha podido obtener un mutante con fenotipo albino, demostrando así la efectividad del método TILLING en melón. Además, paralelamente se analizaron los mismos genes en otra población mutagenizada independiente. También se realizó un estudio de EcoTILLING con 113 accesiones de melón y se identificaron 19 haplotipos distintos en el gen eIF4E, uno de ellos, con un SNP que provoca un cambio de aminoácido y que sólo se encuentra en la accesión PI 505602 y dos haplotipos en el gen ETR1, uno de los cuales también contiene un SNP que provoca un cambio de aminoácido. El TILLING facilitará los estudios de genética inversa en melón y abre la puerta a futuros estudios de genómica funcional en un genoma recientemente secuenciado. Este trabajo ha representado también el primer paso para poder desarrollar nuevas poblaciones de TILLING en melón con mayores tasas de mutación y en otros fondos genéticos. / The work described in this thesis is part of the MELOGEN project (GEN2013‑20237, 2004‑2007) one of whose goals was to build a melon TILLING platform. The availability of genetic and genomic resources in melon has increased over recent years, and even the sequence of the genome is available. However, genomic tools to determine the functionality of genes in this species are still limited. TILLING (Targeting Induced Local Lesions IN Genomes) is a reverse genetics method by which you can create and identify new mutations in candidate genes and observe their phenotypic effect. Furthermore, it is also possible to detect phenotypes of interest in order to identify their responsible mutation. In this project we developed a TILLING population in Cucumis melo L. in the double haploid M62‑113 line from the ʺPiel de Sapoʺ type. Applying the chemical mutagen EMS (Ethyl methane sulfonate) over 17,000 seeds we have developed a collection of mutants consisting of 3268 M2 families. Phenotypic mutants were observed in 400 M2 families in different stages of plant growth during the development of the population. Some mutant phenotypes have been described and identified in detail by generating a catalogue of phenotypic changes. Some of these phenotypes may have a commercial interest. We have analysed four genes to identify the rate of mutation in the population: Phytoene desaturase (PDS), Eukaryotic translation initiation factors (eIF4E and eIFiso4E) and the Ethylene receptor (ETR1). Mutants detected allowed to calculate the mutation rate of the population, one mutation per 1.5 Mb. For PDS we were able to obtain a mutant with an albino phenotype, demonstrating the effectiveness of TILLING method in melon. Moreover, in parallel the same genes were analyzed in another independent mutagenized population. A study of Ecotilling was also performed in 113 melon accessions and 19 different haplotypes in the eIF4E gene were obtained. One of them contained a SNP that causes an amino acid change and was only found in the accession PI 505602 and two other haplotypes were found in the ETR1 gene, one of which also contains a SNP that causes an amino acid change. TILLING will facilitate reverse genetics studies in melon and opens the possibility of performing future functional genomics studies in a newly sequenced genome. This work has also represented the first step to developing new melon TILLING populations with higher rates of mutation and in other genetic backgrounds.