In the present work we focus into the potential relevance of PUFAs in some models and human samples from patients suffering amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Due to its pathological implication, oxidative stress was our first goal. We started from simple oxidative methodology screening to search for an antioxidant substance (among 21 different candidates) available in a Mediterranean diet. The results demonstrated high heterogeneity in carbonyl (measured by DNP) accumulation, regarding the oxidative source, substrate suffering it and the antioxidant structure. Further, thanks to GC/MS and LCQTOF, we detailed the protection over specific accrual of protein and lipid peroxidation markers as well as lipid profile modifications (as % of total fatty acids -FA) in oxLDL thanks to those dietary compounds. Moreover, we demonstrated its in vitro relevance, in terms of survival, when two cell lines (HMEC-1, HepG2) were treated with this oxidized (and protected) compounds, and finally address in vivo importance of those findings, demonstrating decreased carbonyl and oxidative accumulation in hamsters under an atherogenic diet supplemented with antioxidants. Once described the protective effect of antioxidants and specific signatures found regarding lipid oxidation markers, we extend the study focusing in different ALS samples. From previous work, we demonstrated an altered docosohexaenoic acid (DHA) composition in different location for patients suffering sporadic ALS. Hence, we though necessary to define whether the enzymatic machinery aimed to synthesize DHA from its precursors, are affected in sALS. Interestingly, we found a tissue specific variation (spinal cord vs cortex), compatible with our previous FA results. Further, thanks to inmunohistochemistry, differential involvement was unveiled for motor neurons (MN) and surrounding glia. Therefore, trying to depict cellular contribution, we switch to a neuronal model (N2A under oxidative stressors and/or aggregation-prone-TDP-43) and a tissular one (OT). There, we showed decreased desaturase (Δ6) and drebrin expression as well as increased DHA synthesis and an unreported inverse correlation of drebrin loss and aberrant p-TDP-43 expression under oxidative conditions in the cell culture. In the OT model, lipidomic analysis showed specific accretion of 8-iso-PGF2α and NPD1 as well as increased DHA (and dramatically decreased precursors) and reduced AA concentrations (GC measured). Analysis of slice O2 consumption showed decreased O2 levels under excitotoxic treatment and alleviation by antioxidant (tocopherol) addition. Treatment of OT slices with Ω-3 precursors (better than final products) and DHA plus tocopherol ameliorated MNs number. Finally, we wanted to disclose PUFA’s implication and phenothype of an animal model (SODG93A) under a dietary intervention with opposed FA unsaturation levels. Not surprisingly, FA profile was difficult to be altered in nervous system, although subtle specific variations were found. More importantly, differences in survival and clinical manifestations, UPR (Ubiquitin inclusions), mt-DNA (8- oxo-dG) and protein oxidative modifications revealed sex as a relevant factor in lipid handling for this model. Hence, whereas male under a low PUFA diet showed increased survival, females lack this beneficial outcome. Last but not least, we wanted to dig deeper regarding this sexual dimorphism. For this purpose, we focused in mitochondria and analyzed spinal cord oxygen consumption, oxidative damage to proteins and lipid profile along disease progression and also in a neuronal model (N2A overexpressing SODG93A, treated with 17β-estradiol).We could demonstrate a clear sexual implication, with females having late onset clinical symptoms concomitant to an upgraded mitochondrial function and lower protein and mitochondrial damaged proteins compared with males. Finally, to further confirmed steroid potential as a protective element in disease progression, in vitro estradiol pretreatmet of N2A showed increased oxygen consumption, with no relation with the mitochondrial complex expression. / En el trabajo que aquí se presenta se ha profundizado en la relevancia que los ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) puedan tener en el tratamiento de la esclerosis lateral amiotrófica (ALS). Dada su implicación en el desarrollo de la patología, el estudio del estrés oxidativo asociado fue uno de nuestros primeros objetivos. Para ello hemos empezado por un cribado metodológico simplista, tratando de encontrar una sustancia antioxidante (entre 21), biodisponible en una dieta Mediterránea equilibrada y que fuese capaz de reducir un daño oxidativo generado desde diversos frentes (medido como acumulación de carbonilos) y sobre diferentes substratos. Los resultados demostraron una alta heterogeneidad, dificultando así la elección de un único antioxidante. Aún así, gracias a la GCMS y la LCQTOF pudimos detallar la acumulación específica diferenciada de marcadores de daño oxidativo proteico y daño lipoxidativo producido cuando partículas de lipoproteínas de baja densidad (LDL) son oxidadas bajo la acción de diversos compuestos. Además se pudo objetivar el cambio en la composición lipídica de estas LDL (medida como % del total presente) y su relevancia biológica in vitro, medida en términos de supervivencia, cuando se exponen a dos líneas celulares (HMEC-1, HepG2). Por último se demostró la importancia in vivo, puesto que se pudo observar una menor acumulación de productos carbonílicos en hámsters alimentados con una dieta aterogénica, pero suplementada con antioxidantes. Una vez se demostró el papel jugado por estos antioxidantes en la acumulación diferenciada de productos de oxidación, extendimos el estudio a muestras y modelos de ALS. En trabajos previos habíamos evidenciado una composición tisular diferenciada en diversas localizaciones del sistema nervioso en pacientes diagnosticados de ALS. Por ello consideramos interesante el estudio de la expresión de la maquinaria enzimática necesaria para la síntesis lipídica. De un modo destacado, pudimos ver de nuevo una variación tisular, compatible con niveles reducidos de docosohexaenoico (DHA), y gracias a la inmunohistoquímica también se observaron diferencias entre las motoneuronas (MNs) y la glia circundante. Así pues, para poder revelar las aportaciones diferenciales de los distintos tipos celulares, utilizamos una línea celular (N2A) a la que sometíamos a diferentes estresores (daño oxidativo y sobreexpresión de una versión de TPD-43 que causa agregados) y a un cultivo tisular de médula espinal (OT), dónde se produce una muerta progresiva y selectiva de las MNs. Tras estos experimentos, observamos un descenso tanto en la expresión de la Δ6 desaturasa como de drebrin (marcador presináptico) tras la sobreexpresión de TDP-43, así como una mayor síntesis de DHA y una correlación inversa entre la pérdida de drebrina y la expresión de pTDP- 43 bajo condiciones de estrés oxidativo. Por otro lado, en el modelo OT, el análisis lipidómico reveló la acumulación especifica de 8-iso-PGF2α y NDPD1 (posiblemente en respuesta a un incremento del daño oxidativo) así como el aumento en la concentración de DHA (con un descenso muy marcado de sus precursores) y el descenso de araquidónico. Quisimos analizar también el consumo de oxígeno, tanto en tejido intacto como permeabilizado, pudiendo observar como la excitoxicidad reducía considerablemente su capacidad y como ésta era, en parte, rescatada con el uso de tocoferol. Además, el tratamiento del OT con precursores Ω-3 mejoró también el número de MNs. Por último, quisimos caracterizar la implicación que los PUFA dietarios podrían tener en un modelo animal bien conocido (SODG93A). No fue sorprendente encontrar que el perfil lipídico en el sistema nervioso fue muy difícil de alterar. Aún así, se observaron diferencias en supervivencia, en el devenir clínico, la respuesta UPR (con acumulaciones de Ub), el daño al DNA mitocondrial (8-oxo-dG) y modificaciones oxidativas en las proteínas y cómo éstas tenían un grado de afectación diferencial cuando considerábamos el sexo de los animales. Esto es, mientras que los machos sometidos a una dieta baja en PUFAs de cadena larga demostraron una mayor supervivencia, en las hembras no se apreció mejoría. Por último, pero no menos importante, quisimos profundizar más respecto a este dimorfismo. Centrándonos en la mitocondria, pudimos hacer un seguimiento del consumo de oxígeno a lo largo de la enfermedad, el daño oxidativo a proteínas y el perfil lipídico. Por lo tanto pudimos demostrar una clara implicación sexual, siendo las hembras las que más tarde comienzan su manifestación clínica, con mejores funciones mitocondriales asociadas a un menor daño oxidativo. Finalmente, la relevancia del papel protector de los estrógenos se pudo comprobar in vitro, mediante el pretratamiento con 17β-estradiol en la línea N2A que sobreexpresa SOD1G93A, relacionado con la ALS familiar, proponiéndose el estradiol como un nuevo elemento que juega un papel relevante en el desarrollo de la enfermedad. / En aquest treball s’ha intentat profunditzar en la possible rellevància dels àcids grassos poliinsaturats (PUFA) en el tractament de l’esclerosi lateral amiotròfica (ELA). Atesa la seva implicació en el desenvolupament de la patologia, l’estudi de l’estrès oxidatiu associat fou un dels primers objectius. Per això, es va començar amb un cribratge metodològic simplista, intentant trobar una substància antioxidant biodisponible en una dieta mediterrània equilibrada i que fos capaç de reduir el dany oxidatiu generat des de diferents fronts i sobre diferents substrats. Els resultats van demostrar una alta heterogeneïtat, dificultant així l’elecció d’un únic antioxidant. Malgrat això, mercès a tècniques de GC-MS i LC-QTOF, es va poder detallar l’acumulació específica diferenciada de marcadors de dany oxidatiu proteic i dany lipoxidatiu produït quan partícules de lipoproteïna de baixa densitat (LDL) s’oxiden per l’acció de diversos compostos. A més, es va poder objectivar el canvi en la composició lipídica d’aquestes LDL i la seva rellevància in vitro, mesurada en termes de supervivència, quan es cocultiven amb les línies cel·lulars. Per últim, es va demostrar la importància in vivo, atès que es va observar una menor acumulació de productes carbonílics en hàmsters alimentats amb una dieta aterogènica suplementada amb antioxidants. Un cop es va demostrar el paper d’aquests antioxidants en l’acumulació diferenciada de productes d’oxidació, es va estendre l’estudi a mostres i models d’ELA. En treballs previs s’havia evidenciat una composició tissular diferenciada en diverses localitzacions del sistema nerviós central en pacients d’ELA (respecte l’àcid docosahexaenoic (DHA), depleció en medul·la espinal i acumulació en còrtex). Per aquesta raó es va considerar interessant l’estudi de l’expressió de la maquinària enzimàtica necessària per la síntesi lipídica. D’una manera destacada, es va poder veure de nou una variació tissular, compatible amb nivells reduïts de DHA i, per tècniques d’immunohistoquímica, es van observar diferències entre les motoneurones i la glia circumdant. Per tant, per poder revelar les aportacions diferencials dels diferents tipus cel·lulars, es va utilitzar la línia cel·lular N2A, sotmesa a diferents estressos (dany oxidatiu i sobreexpressió d’una forma de TDP-43 que causa agregats) i un cultiu tissular de medul·la espinal, en el que es produeix una mort progressiva i selectiva de les motoneurones. Es va observar un descens en l’expressió de FADS2 i de drebrina, un marcador sinàptic, així com una major síntesi de DHA i una correlació inversa entre la pèrdua de drebrina i l’expressió de TDP-43 sota condicions d’estrès oxidatiu. Per altra banda, en el model organotípic, l’anàlisi lipidòmica va revelar l’acumulació específica de 8-isoPGF2α i NDPD1, així com l’augment de la concentració de DHA i el descens motl marcat del seus precursors a mes del àcid araquidònic. Es va mesurar també el metabolisme oxidatiu, observant-se que l’excitotoxicitat reduïa considerablement la seva capacitat i, en part, es rescatava amb l’ús de tocoferol. A més, el tractament dels cultius organotípics amb precursors d’àcids grassos n-3 va millorar el nombre de motoneurones. Per últim, es va caracteritzar la implicació dels PUFA dietaris en un model animal d’ELA. Malgrat que el perfil lipídic del sistema nerviós central era difícil d’alterar, es van observar diferències en supervivència, fenotip clínic, resposta al malplegament de proteïnes (UPR) amb acumulació d’ubiquitina, dany en el DNA mitocondrial i modificacions oxidatives en les proteïnes, amb un grau d’afectació diferencial quan es considerava el sexe dels animals. En aquest sentit, mentre que els mascles sotmesos a una dieta baixa en PUFA de cadena llarga van mostra una major supervivència, en les femelles nomes va apreciar cap efecte millora. Per profunditzar en el dimorfisme sexual en ELA, i especialment la disfunció mitocondrial, es va analitzar mitjançant respirometria d’alta resolució la medul·la espinal durant tot el desenvolupament de la malaltia. Es va revelar una clara diferència de gènere, amb una manifestació clínica més tardana en femelles que correlaciona amb una millor conservació de la funció mitocondrial i un menor dany oxidatiu. El possible paper protector dels estrògens es va demostrar in vitro mitjançant el pretractament amb estradiol de cèl·lules N2A que sobreexpressen una forma de SOD1 humana mutada associada a l’ELA familiar (G93A-SOD1).

Una de les principals fites en aqüicultura és aconseguir una reducció de les proteïnes que se subministren amb la dieta, procedents majoritàriament de farines de peix, i incrementar la presència de nutrients més rendibles, com ara els carbohidrats. En tractar-se principalment d'espècies carnívores, la substitució de proteïnes per carbohidrats està limitada per les característiques metabòliques dels peixos en cultiu. L'activitat alanina aminotransferasa (ALT) hepàtica juga un paper central com a connexió entre el metabolisme d'aminoàcids i el de carbohidrats, i s'ha mostrat com l'aminotransferasa hepàtica més sensible a canvis en l'estat nutricional i la utilització de proteïna en moltes espècies de peixos. L'ALT pot estar implicada en múltiples processos cel.lulars i la seva activitat podria estar sotmesa a un sistema complex de regulació. El nostre grup va clonar tres isoenzims d'ALT a partir de fetge de Sparus aurata, indicant l'existència de dues isoformes citosòliques, cALT1 i cALT2, i una isoforma mitocondrial mALT, de diferent distribució tissular i regulació nutricional. Donat que les modificacions posttraduccionals a què pot estar sotmesa l'ALT són poc conegudes, es va voler estudiar si existeixen proteïnes capaces d'interaccionar i modular l'activitat de les isoformes citosòliques d'ALT. Mitjançant un assaig de doble híbrid en llevat s'ha identificat els fragments de quatre proteïnes amb potencialitat d'interacció amb cALT2, que corresponen a l'F-lectina, RPS20, RBP2 i HABP2. F-lectina és una proteïna d'unió a carbohidrats present en peixos i amfibis, que presenta un pèptid senyal de secreció. Estudis de localització subcel•lular indiquen que, tot i que cALT1 i cALT2 són preferentment citosòliques, quan s'expressen conjuntament amb l'F-lectina, les proteïnes passen a formar vesícules perinuclears de gran mida que colocalitzen amb marcadors de cis-Golgi, trans-Golgi i vesícules de secreció. Aquest fet suggereix que les proteïnes cALT1 i cALT2 són incorporades a la via de secreció a través de la interacció amb F-lectina. Els anàlisis de FRET validen la interacció entre cALT1 o cALT2 i F-lectina. En cèl.lules transfectades amb plasmidis d'expressió de cALT1, cALT2 i F-lectina, la presència d'F-lectina augmenta l'activitat ALT en els extractes on s'expressa cALT1 o cALT2, suggerint que l'F-lectina és capaç de modular l'activitat d'ALT. F-lectina s'expressa majoritàriament en fetge, ronyó i teixit adipo& teixits on també s'expressen cALT1 i cALT2. En orades injectades intraperitonealment amb lipopolisacàrid (LPS) 1mg/kg de peix, 24 hores després del tractaments'observa un increment en l'expressió d'F-lectina, i un augment en l'activitat ALT en extractes hepàtics, sense observar canvis en els nivells d'mRNA de cap de les isoformes ALT. L'augment de l'activitat ALT és degut, hipotèticament, a un augment en l'expressió d'F-lectina, que a la seva vegada provoca un augment en l'activitat de l'enzim ALT a través de la interacció de l'F-lectina amb cALT1 i cALT2. Addicionalment, s'ha observat que la incubació de cultius bacterians E. coli amb extractes cel.lulars on se sobreexpressen les proteïnes cALT2, F-lectina i cALT2 conjuntament amb F-lectina, produeix una inhibició del creixement bacterià. Aquesta efecte antibacterià es podria donar pel fet que cALT2 conté una regió homòloga a la regió d'unió a endotoxines de la proteïna LBP, responsable de la unió i presentació de I'LPS a altres proteïnes del sistema immunitari. Els nostres estudis suggereixen que a més del seu paper metabòlic, les isoformes citosòliques d’ALT poden estar implicades en processos del sistema immunitari en orada. / One of the main goals in aquaculture is to reduce proteins and to increase the presence of more sustainable nutrients in diets. The substitution of proteins for carbohydrates is limited by the metabolic characteristics of carnivorous fish. The activity of alanine aminotransferase (ALT) in liver plays a central role as a link between amino acids and carbohydrate metabolism, and is sensitive to changes in nutritional status and utilization of protein in many species of fish. Our group cloned three isoenzymes of ALT in the liver of Sparus aurata (two cytosolic isoforms and a mitochondrial one), with different tissue distribution and nutritional regulation. ALT post-translational modifications are unknown, and we studied the existence of proteins which may interact and modulate ALT activity. We identified four fragments of proteins with potential interaction with cALT2, corresponding to F-lectin, RPS20, RBP2 and HABP2. Although cALT1 and cALT2 are preferably cytosolic, when coexpressed with F-lectin, a secretion protein, the proteins became part of large perinuclear vesicles that colocalize with cis-Golgi, trans-Golgi and secretion vesicles markers. This suggests that cALT1 and cALT2 are included in the secretory pathway through the interaction with F-lectin. The interaction between cALT1 or cALT2 and F-lectin was validated with an alternative method. The expression of F-lectin increased ALT activity in cells expressing cALT1 or cALT2, suggesting that F-lectin is able to modulate the activity of ALT. F-lectin is expressed mainly in liver, kidney and adipose tissue, tissues where cALT1 or cALT2 are also expressed. In fish treated intraperitoneally with lipopolysaccharide (LPS) we observed an increase in F-lectin expression, and an increase of ALT activity in liver extracts, without changes in mRNA levels of any ALT isoform. Hypothetically, the increased ALT activity is due to an increase in the expression of F-lectin, which in turn causes an increase in the activity of ALT enzymes. The incubation of bacterial E. coli cultures with cell extracts in which cALT2, F-lectin and cALT2 together with F-lectin are overexpressed, produces an inhibition of bacterial growth. This antibacterial effect could occur because cALT2 seems to contain a region homologous to endotoxin binding region in LBP protein. Our studies suggest that, in addition to their metabolic role, ALT cytosolic isoforms may be involved in immune processes in sea bream.

Tesi realitzada a l'Institut de Biologia Molecular de Barcelona (IBMB-CSIC) / Mycoplasma genitalium es un patógeno humano considerado uno de los organismos autorreplicativos más pequeños que existen. Su genoma fue completamente secuenciado en 1995, y actualmente, se ha convertido en un intenso objeto de estudio porque ha sido descrito como modelo ideal de célula mínima. M. genitalium presenta una morfología celular caracterizada por una extensión de la membrana en uno de los polos de la célula, conocido como Organela Terminal (OT). La OT está involucrada en procesos celulares tales como adhesión, división celular y motilidad con implicaciones directas en patogenicidad y virulencia. La chaperona molecular DnaK forma parte de uno de los sistemas procariotas de chaperonas (DnaK-DnaJ-GrpE) más estudiados pero su mecanismo alostérico aún no ha sido completamente esclarecido. Se resolvió la estructura cristalina de DnaK de un constructo al que le faltan los últimos 74 residuos del C-terminal, por difracción de rayos-X a una resolución de unos 2 Å. Este constructo contiene un dominio de unión a nucleótido y un dominio de unión a sustrato unidos entre sí por un enlazador muy flexible. En la estructura de DnaK el NBD se encuentra unido a un cofactor (ADP o AMP-PNP) y el SBD a un péptido que mimetiza un sustrato sin plegar, esta estructura corresponde a una conformación cerrada. Para estudiar desde un punto de vista estructural el mecanismo alostérico de DnaK, se determinó la estructura tridimensional del NBD en su forma apo, en presencia de AMP-PNP, ATP o ADP. La comparación de estas estructuras indicó que los cambios estructurales consecuencia de la hidrólisis de nucleótido son sutiles. Sin embargo, se apreciaron diferencias importantes en la coordinación del ión magnesio, que es imprescindible en el mecanismo de hidrólisis del nucleótido. Se estudiaron las interacciones de DnaK con sus posibles co-chaperonas (MG200 y MG019) y el factor intercambiador de nucleótido GrpE, tanto por la técnica de Resonancia Superficial por Plasmón como por cromatografía de gel filtración. No se detectó ninguna interacción entre DnaK y sus posibles co-chaperonas, debido a que las condiciones experimentales en las que se realizó el ensayo no fueron las idóneas. Se detectó una fuerte interacción entre DnaK y GrpE. La estequiometria de este complejo fue determinada por MALS y fue confirmada por Espectrometría de Masas Nativa y corresponde a una molécula de DnaK para dos de GrpE (1:2). Se estudió tanto este complejo como sus variantes por la técnica de difracción de rayos-X a bajo ángulo acoplada a una columna de gel filtración. Esta técnica permitió obtener modelos a baja resolución de los componentes del complejo MgNBD y MgDnaKΔCt y de MgGrpE. La estructura en solución de MgNBD es un dominio rígido y globular idéntico a su forma cristalina. MgDnaKΔCt presenta una conformación cerrada en solución que equivale a la conformación encontrada en el cristal, aunque existen variaciones en la orientación espacial entre los subdominios NBD y SBD. Este resultado refuerza la posible existencia de un paso intermedio extra en el modelo alostérico de DnaK propuesto hasta el momento. El modelo a baja resolución de MgGrpE fue validado por un modelo teórico tri-dimensional de MgGrpE puesto que las estructuras de otras GrpEs resueltas hasta el momento no se ajustaban al modelo en solución. Este modelo teórico de GrpE muestra una elevada flexibilidad de los dominios α-hélice de las dos subunidades que componen el dímero siendo el N-terminal de la proteína desestructurado pero con tendencia a formar estructuras helicales lo que parece confirmar la posibilidad de que el N-terminal desestructurado interaccione con el subdominio SBD de MgDnaKΔCt mientras se efectúa el intercambio de nucleótidos en el subdominio NBD MgDnaKΔCt. / The human pathogen Mycoplasma genitalium, one of the smallest self-replicating microorganisms, is characterized by the presence of a unique cytoskeleton protrusion called the Terminal Organelle (TO) which is known to be involved in key cellular processes such as cell division, adhesion to host cells, motility and virulence. The structure of the TO is composed by three main parts: the terminal button (distal with respect to the cell body), the electrodense core and the wheel complex (proximal with respect to the cell body. We have characterized the chaperone DnaK system from M. genitalium and investigated its possible role in the formation and functioning of the TO. Here we present the X-ray crystal structures, at about 2 Å resolution, of a construct of DnaK including the Nucleotide and the Substrate Binding Domains (respectively, NBD and SBD) bound to a putative substrate and to the nucleotidic co-factors ADP or AMP-PNP. Moreover, we also present the structures of NBD, at about 1.5 Å resolution, in its apo form and in complex with ADP, ATP or AMP-PNP, which helped to better understand nucleotide hydrolysis. Surface Plasmon Resonance (SPR), and Small Angle X-ray Scattering (SAXS) coupled to HPLC (a relatively new and powerful variant of the technique) allowed, respectively, to detect the interaction between DnaK and the nucleotide exchange factor GrpE and to model DnaK in solution alone and in complex with GrpE.

La presente Tesis Doctoral es un fruto de colaboración entre el Instituto Catalán de Nanociencia y Nanotecnología (ICN2) y el Hospital Clínic de Barcelona, implicados en el proyecto “Marató TV3 2012”, con el objetivo de utilizar las nanopartículas de óxido de Cerio (CeO2 Nps o “nanoceria”) como una nueva herramienta terapéutica en la regeneración del tejido hepático en las enfermedades del hígado. CeO2NPs son un material inorgánico fascinante, con una gran variedad de aplicaciones y muchas más por llegar. Lo que las hace tan interesantes es su alta capacidad de hacer de buffer de electrones en un entorno oxidante/reductor, gracias a su estructura electrónica incompleta en la capa 4f. Ésto hace posible que presente una habilidad de ser oxidada o reducida, seguida de captura o liberación de oxígeno o especies reactivas de oxígeno (ROS y los radicales libres, tales como OH·). Como consecuencia, nanoceria se comporta como una esponga natural de electrones libres. El desequilibrio de ROS tiene lugar en un gran número de enfermedades humanas. También, la sobreproducción de ROS es crítica en la neurodegeneración. A pesar de la atractiva capacidad antioxidante de CeO2 NPs, una controversia importante, en cuanto a su función biológica, fue descrita en la literatura actual. A lo largo de ésta Tesis, los métodos existentes de síntesis de nanoceria han sido analizados en detalle, cómo también la calidad de los productos obtenidos y los aspectos toxicológicos de ámbos (los procesos y los productos). Éste trabajo de investigación fue enfocado en sobrepasar las problemáticas existentes de la toxicidad de nanoceria (debida a la agregación de nanopartículas, la toxicidad del surfactante o el solvente, o a la contaminación de las muestras con endtoxina) y en diseño de soluciones útiles, con el objetivo de sacar el provecho máximo de las propiedades antioxidantes de CeO2NPs en recerca y aplicaciones biomédicos. Asimismo, el presente trabajo fue centrado en el estudio de las propiedades físico-químicas y bio-quimicas de nanoceria, para optimizar su preparación y tamaño (Capitulo 2), evaluar su reactividad (Capitulo 3), biodistribución (Capitulo 4) y no-toxicidad (Capitulo 2, Anexo 2). Finalmente, la biodistribución de nanoceria y sus efectos sobre los mediadores fibrogénicos e inflamatorios fueron evaluados a nivel molecular y celular, demostrando que la administración de CeO2NPs podría ser de interés terapéutico en enfermedades del hígado (Anexo 3). / The current Doctoral Thesis is the fruit of collaboration between the Catalan Institute of Nanoscience and Nanotechnology (ICN2) and the Hospital Clinic of Barcelona, involved in the project “Marató TV3 2012”, with the objective to apply Cerium oxide nanoparticles (CeO2 NPs) as a new therapeutic tool for tissue regeneration in liver diseases. CeO2NPs is a fascinating inorganic material with many applications and more to come. What makes nanoceria very appealing is its high capacity to buffer electrons from an oxidant/reducing environment due to the unfilled 4f electronic structure. This is due to its easy ability of being oxidized and reduced, followed by the capture or release of oxygen or reactive oxygen species (ROS and free radicals as OH·). As a result, nanoceria behaves as a natural electron sponge. Note that ROS disbalance takes place in an enormous number of human diseases. Also, the overproduction of ROS is critical in neurodegeneration. Despite the appealing redox catalytic capacity of CeO2 NPs, an important controversy upon biological effects of CeO2 has been numerously reported. During this Thesis, the existent methods of nanoceria preparation have been analyzed in detail, as well as the quality of the obtained products and the toxicological aspects of both (the processes and the products). This Doctoral research has been focused in overtaking the existent problematics of the nanoceria toxicity (due to aggregation of NPs, toxic surfactant or solvent, or contamination with endotoxin) and offering suitable solutions, in order to take full advantage of the antioxidant CeO2NPs properties in biomedical research and applications. Thus, the current work has been focused on the study of physicochemical and biochemical properties of CeO2 NPs, to optimize the preparation methods and the obtained product, in an environmentally-friendly way (Chapter 2, Annex 2). The optimization of the NPs size and monodispersity (Chapter 2); as well as the evaluation of the correspondent antioxidant activity (Chapter 3) were also performed. Finally, the in-vivo biodistribution study of CeO2 NPs, as well as their effects on inflammatory and fibrogenic mediators were evaluated at molecular and cellular level, demonstrating that administration of CeO2 NPs could be of therapeutic value in liver diseases (Annex 3).

Tesi realitzada al Barcelona Supercomputing Center – Centro Nacional de Supercomputación (BSC-CNS) / Proteins are large biomolecules that play essential functional and structural roles within cells and that typically act through their interaction with other proteins and biomolecules, forming highly specific functional complexes. Thus, a major biological challenge is to provide structural and energetics details for such interactions. In this context, computational methods can successfully contribute to predict and characterize the mechanistic aspects of protein function, in which conformational flexibility plays a major role. However, an accurate consideration of protein plasticity within computational modeling of protein function at molecular level is still far from trivial, mostly because of both technical and methodological limitations. Thus, the main purpose of this PhD thesis is the assessment, development and application of computational tools for the structural, energetic and dynamic characterization of protein molecules and their interactions. To fulfill these objectives, the first part of the thesis consists in the review and comparison of several existing computational protocols for the characterization of protein-protein interfaces, as well as in the evaluation and discussion of the performance of pyDock, the docking protocol previously developed in our group, as resulted from the last CAPRI (Critical Assessment of PRediction of Interactions) editions. These analyses confirm that current computational protocols aimed to model the phylogenetic, structural and energetic properties of residues within protein-protein interfaces show reasonably good predicting performance and consistency. However, as shown by CAPRI experiment, despite recent methodological advances in docking, dealing with protein plasticity is still a crucial bottle-neck. Based on these premises, the second part of the thesis is focused on understanding the role of protein conformational heterogeneity in protein-protein recognition. Subsequently, a novel protocol to integrate unbound conformational ensembles within a docking framework has been devised and systematically tested. The analysis of conformational heterogeneity in precomputed unbound ensembles reveals that docking encounters are favoured by improving the energetic complementarity of the docking partners rather than the geometrical similarity to the bound state. Moreover, the unbiased use of such ensembles is a successful strategy to incorporate flexibility into a docking approach for low-medium flexible cases, especially those that presumably follow a conformational selection mechanism. Finally the last part of the thesis consists in the application of computational methods to the modeling of protein interactions and the exhaustive exploration of their conformational space within different realistic contexts, thanks to the expertise previously acquired on the theoretical basis of protein interactions. Thus, the main lines of research include the energetic characterization of host-pathogen protein interactions (i.e., host GTPase Rab5 with pathogen phospholipase VipD), the ab-initio modeling of the encounter complex ensembles of redox proteins (i.e. PSI with alternative electron donors, cytochrome c6 and plastocyanin), and finally the description of the structural and dynamic basis of a protein kinase dysfunction under pathological conditions (i.e., MEK1 oncogenic and CFC-related mutants). The results confirmed that computational modeling can complement experimental data to improve the understanding of biological processes involving protein interactions and can help to rationalize and quantify the structural, energetic and dynamic effects of pathological mutations at molecular level. / Las proteínas son grandes biomoléculas que desarrollan funciones esenciales en las células, muy a menudo mediante la formación de complejos altamente específicos con otras proteínas y biomoléculas. Por tanto, uno de los mayores retos científicos en la actualidad es el estudio completo a nivel estructural y energético de todas las interacciones entre proteínas de interés biológico y terapéutico. Sin embargo, la consideración precisa de la plasticidad de las proteínas en los métodos computacionales de modelado molecular no es trivial, debido a limitaciones tanto técnicas como metodológicas. En este contexto, el objetivo principal de esta tesis doctoral ha sido el desarrollo, aplicación y evaluación de herramientas computacionales para la caracterización estructural, energética y dinámica de las proteínas y sus interacciones. Para cumplir con estos objetivos, durante la primera parte de la tesis se ha llevado a cabo la revisión de varios protocolos computacionales para la caracterización de las superficies de interación entre proteínas. Los métodos analizados proporcionan unas predicciones razonablemente consistentes y fiables. También se ha llevado a cabo la evaluación de la eficacia predictiva de nuestro método pyDock en CAPRI, un experimento comunitario de evaluación de métodos de modelado estructural de complejos entre proteínas. En general, a pesar de los avances metodológicos en los protocolos de docking, el modelado eficaz de la plasticidad de las proteínas sigue siendo un reto importante en el campo. En base a los análisis anteriores, se ha llevado a cabo un estudio sistemático sobre la importancia de la heterogeneidad conformacional en el reconocimiento entre proteínas. Los resultados indican que los ensamblados conformacionales generados a partir de proteínas en solución contienen confórmeros con mejor complementariedad energética que la estructura cristalográfica de dichas proteínas y que favorecen su reconocimiento intermolecular. A partir de estos resultados, se ha propuesto un nuevo métodode docking que usa ensamblados conformacionales generados a partir de las proteínas en solución. Esta estrategia resulta particularmente efectiva en casos poco o medianamente flexibles. Finalmente, en la última parte de la tesis se ha llevado a cabo la aplicación de métodos computacionales al modelado de varios casos de interés biomédico. En conclusión, los avances metodológicos en cuanto al modelado de proteínas y sus interacciones, junto a la inclusión eficaz de la flexibilidad conformacional, permiten tener herramientas computacionales cada vez más útiles para complementar los datos experimentales y mejorar la comprensión de procesos biológicos relevantes.

Tesi realitzada a l'Institut Català d'Oncologia (ICO) / ANTECEDENTES: Entre un 20-25% de pacientes con cáncer de mama y ovario muestran historia familiar de dicha enfermedad. Una porción de estos casos son debidos a mutaciones germinales en genes de predisposición conocidos y se engloban dentro del síndrome de cáncer de mama y ovario hereditario (SCMOH). Mutaciones en los genes BRCA1/2, genes de alta penetrancia para este síndrome, explican alrededor de un 20% de los casos familiares. El estudio mutacional de estos genes identifica entre un 2-15 de variantes cuyo significado biológico es desconocido (VSD), dependiendo de la población analizada y la casuística del laboratorio que las reporta. Debido a la imposibilidad de determinar el riesgo asociado a una VSD, éstas no pueden ser utilizadas como valor predictivo en el diagnóstico genético y dificultan el seguimiento clínico del portador. Por ello, la clasificación de estas variantes en patogénicas o neutras es de gran importancia desde del punto de vista del consejo genético. Además de lo mutaciones en los genes BRCA1/2, otras mutaciones de alta, moderada o baja penetrancia se han identificado en otros genes y con ellas se ha podido explicar una pequeña porción de los casos restantes del SCMOH. Muchos de estos genes han están involucrados en la vía de reparación de DNA de Anemia de Fanconi (FA)/BRCA, o son interactores de BRCA1/2. Si bien, más de un 50% de los casos familiares permanecen sin causa genética conocida. Estos casos son comúnmente conocidos como casos BRCAX. En este contexto, el uso de las nuevas técnicas de secuenciación de exomas ha demostrado ser una buena estrategia para la identificación de nuevos genes de predisposición al SCMOH. OBJETIVO: El objetivo global de esta tesis doctoral es mejorar el diagnóstico y el consejo genético de los pacientes con SCMOH mediante la clasificación de VSD en los genes BRCA1/2 y la búsqueda de nuevos genes de predisposición a este síndrome. RESULTADOS: Cuarenta VSD en BRCA1/2 fueron analizadas siguiendo diferentes aproximaciones experimentales. Veintiocho de ellas fueran analizadas a nivel transcripcional y 6 (4 en BRCA1 y 2 en BRCA2) fueron clasificadas como probablemente patogénicas en base a su efecto en el correcto splicing de estos genes. Otras 7 variantes, localizadas en la región C-terminal de BRCA1, fueron analizadas mediante el ensayo de actividad transcripcional. Tres de estas variantes pudieron ser clasificadas como probablemente patogénicas. Posteriormente, una de estas variantes, G1770V fué identificada por nuestro grupo como la primera mutación fundadora de origen Marroquí. Las cinco restante, situadas en BRCA2, fueron analizadas mediante el ensayo funcional basado en células embrionarias de ratón. Todas ellas mostraron un efecto hipomórfico y fueron asociadas a un riesgo bajo/moderado a sufrir cáncer d mama y/o ovario. En cuanto a la búsqueda de nuevos genes de predisposición al SCMOH se utilizaron dos aproximaciones para su identificación. Por un lado, se secuenciaron dos genes nuevos genes de la vía de FA/BRCA, los genes ERCC4 y SLX4, en un set de pacientes BRCAX. Este estudio identificó varias variantes missense nuevas en cada gen. Varias de ellas fueron clasificadas como potencialmente deletéreas por varios programas de predicción in silico. No obstante, la validación funcional de estas variantes es necesaria para elucidar su asociación con el SCMOH. Como segunda aproximación, se secuenció el exoma de varios pacientes pertenecientes a familias BRCAX con un aparente patrón de herencia autosómico dominante. Como resultado, se identificaron 20 genes potencialmente candidatos para ser genes de predisposición al SCMOH. Entre ellos, POLE destaca como firme candidato. CONCLUSIÓN: Este trabajo, en su conjunto, contribuye a la mejora del diagnóstico y consejo genético mediantes la identificación de nuevas variantes de predisposición en al SMCOH en los genes BRCA1/2 y la identificación de nuevos genes candidatos al SCMOH. / BACKGROUND: Breast cancer is the most common cáncer diagnosed among women. Between 20-25% of breast cancer cases present familial history of the disease. Around 50% of familial breast cancer is due to germline mutations in predisposing genes and are included in the Hereditary Breast and Ovarian Cancer Syndrome (HBOCS) cases. The other 50% of familial cases remains genetically unsolved which indicates the need of identifing new predisposing genes for this syndrome. The most prevalent predisposing genes for this syndrome, BRCA1/2, account for least than the 20% of the familias cases. Genetic testing of this genes identifies between 2-15% of variants of unknown significance (VUS). This variants difficult the clinical monitoring of carriers, thus the need of classyfy them as pathogenic or neutral variant is paramount from the genetic counseling point of view. OBJECTIVE: The objective of this thesis is to improve the genetic diagnosis and gentic counseling os HBOCS patients by the classification of VUS in BRCA1/2 and the identification of new predisposing genes of this syndrome. RESULTADOS: Forty VUS in BRCA1/2 were analyzed using different experimental approaches (RNA analysis or funtional assays). Fourteen of them could be associated with the HBOCS. One of this variants, G1770V was later identified as the first founder mutation of Moroccan population. In the searching of new predisposing genes of the HBOCS we used two approaches. On one hand, we sequenced two new fanconi anemia genes, ERCC4 y SLX4, in 94 BRCAX families. This study didn’t find any clear loss of function variant in these genes, so their contribution to the HBOCS couldn’t be determined. On the other hand, we sequenced the whole exome of several patients from 12 independet BRCAX i families with an apparent autosomial dominant pattern of inheritance. AS a result of this study we identified 20 potential candidate HBOCS predisposing genes. Between them, POLE highlights as strong candidate. CONCLUSION: Overall, this work, by the identification of new predisposing variants in BRCA1/2 and the identification of new susceptybility candidates genes of the HBOCS, contributes to the improvement of the genetic diagnostic and counseling of HBOCS patients

Pantoea agglomerans CPA-2 es un agente de biocontrol (ACB) eficaz en el control de enfermedades de postcosecha en fruta de pepita y cítricos. No obstante, para implementar y registrar su uso como estrategia práctica de control en Europa es importante evaluar la capacidad del ACB para colonizar, persistir y propagarse en condiciones habituales de aplicación con un método de detección que permita diferenciar al antagonista del resto de la microbiota. La presente tesis doctoral tuvo como objetivo fundamental el desarrollo de técnicas moleculares para la detección y cuantificación específica de CPA-2 en su proceso de formulación y en su entorno de aplicación (pre- y postcosecha). Para cumplir este objetivo, en primer lugar se desarrolló y validó la técnica de qPCR, pero se observó la limitación de esta técnica al no discriminar entre el ADN de las células viables y las no viables de la superficie de manzanas conservadas a medio y largo plazo. Esta limitación se superó con un pre-tratamiento de las muestras con propidio de monoazida (PMA) en combinación con la qPCR (PMA-qPCR). Posteriormente, la técnica desarrollada del PMA-qPCR se aplicó para determinar la supervivencia del ACB después de su formulación por liofilización, lecho fluido y atomización pero también para evaluar su dinámica poblacional sobre la superficie de naranjas tratadas en pre- y postcosecha, siendo el primer estudio donde se aplica a un ACB. Finalmente, se estudió la persistencia de CPA-2 en tratamientos de pre- y postcosecha, confirmando su presencia mediante PCR convencional. Los resultados de esta tesis demuestran la versatilidad de las técnicas moleculares basadas en la PCR (qPCR, PMA-qPCR y PCR convencional) para detectar y cuantificar la población de CPA-2 durante su formulación y en las condiciones ambientales de aplicación. Así como la limitada dispersión y baja persistencia de CPA-2 en su entorno de aplicación. / Pantoea agglomerans CPA-2 és un agent de biocontrol (ACB) eficaç en el control de malalties de postcollita en fruita de llavor i cítrics. No obstant, per implementar  i registrar el seu ús com estratègia pràctica de control a Europa és important avaluar la capacitat de l’ACB per colonitzar, persistir i propagar-se en condicions habituals d’aplicació amb un mètode de detecció que permeti diferenciar a l’antagonista de la resta de la microbiota. La present tesis doctoral va tenir com objectiu fonamental el desenvolupament de tècniques moleculars per a la detecció i quantificació específica de CPA-2 en el seu procés de formulació i en el seu entorn d’aplicació (pre- i postcollita). Per complir aquest objectiu, en primer lloc es va desenvolupar i validar la tècnica de qPCR, però es va observar la limitació d’aquesta tècnica al no discriminar entre el ADN de les cèl·lules viables i les no viables de la superfície de pomes conservades a mig i llarg termini. Aquesta limitació es va superar amb un pretractament de les mostres amb propidi de monoàcida (PMA) en combinació amb la qPCR (PMA-qPCR). Posteriorment, la tècnica desenvolupada del PMA-qPCR es va aplicar per determinar la supervivència de l’ACB després de la seva formulació per liofilització, llit fluït i atomització però també per avaluar la seva dinàmica poblacional sobre la superfície de taronges tractades en pre- i postcollita, sent el primer estudi on s’aplica a un ACB. Finalment, es va estudiar la persistència de CPA-2 en tractaments de pre i postcollita, confirmant la seva presència mitjançant PCR convencional. Els resultats d’aquesta tesis demostren la versatilitat de las tècniques moleculars basades en la PCR (qPCR, PMA-qPCR i PCR convencional) per detectar i quantificar la població de CPA-2 durant la seva formulació i en les condicions ambientals d’aplicació. Així com la limitada dispersió i baixa persistència de CPA-2 en el seu entorn d’aplicació. / Pantoea agglomerans CPA‑2 is a biocontrol agent (ACB) effective in the control of postharvest diseases in pome fruit and citrus. However, in order to implement and register the use of this ACB as a practical control strategy in Europe, it is first necessary to evaluate the ability of the antagonist to colonize, persist and spread in its normal operating conditions with a screening method to identify and quantify the ACB of the rest of the microbiota. The main goal of the present thesis was the development of molecular techniques for the identification and quantification of CPA‑2 strain in its formulation and application in the environment (pre- and postharvest). To achieve this objective, the development and validation of qPCR technique was due at first, however this technique was not able to discriminate between the DNA of viable and non‑viable cells of apple surface stored at middle and long time. This limitation was overcome by treating the samples with the DNA intercalator, propidium of monoazide (PMA), combined with qPCR (PMA‑qPCR). Furthermore, PMA‑qPCR technique was applied to determine the survival of CPA‑2 after its formulation by freeze drying, spray drying and fluidized bed drying; and to assess the population dynamics of the antagonist on the surface of pre‑treated and postharvest oranges, it was the first study where this technique was applied in ACB. Finally, CPA‑2 persistence in pre‑ and postharvest treatment was studied and its presence was confirmed by conventional PCR. The results presented in this thesis demonstrate the versatility of molecular techniques based on PCR (qPCR, PMA‑qPCR and conventional PCR) to detect and quantify P. agglomerans CPA‑2 in normal operating conditions.

En aquest treball s’ha desenvolupat un mètode en dues etapes per a l’obtenció d’extractes rics en monoglicèrids a partir de llavors de soja i de sèsam. La primera etapa consisteix en una hidròlisi i esterificació directa amb glicidol i solketal dels triglicèrids continguts en les llavors, catalitzada amb miceli liofilitzat de Rhizopus oryzae en absència de solvent. La segona etapa ha estat la desprotecció del glicerol protegit en forma de 1,2-acetonid (solketal) amb catalitzadors àcids. El rendiment màxim d’obtenció de monoglicèrids a l’extracte final de reacció ha estat del 81 %, amb les següents condicions: Temps d’hidròlisi de 24 h i d’esterificació de 6 h emprant solketal, a una temperatura de reacció de de 50 °C per a la primera etapa i utilitzant com a solvent una barreja acetonitril:HCl 1M en proporció 4:1 (v/v), amb un temps de reacció de 6 h a temperatura ambient per a la segona etapa. / En este trabajo se ha desarrollado un método en dos etapas para la obtención de extractos ricos en monoglicéridos a partir de semillas de soja y de sésamo. La primera etapa consta de una hidrólisis y esterificación directa con glicidol y solketal de los triglicéridos de las semillas, catalizada con micelio liofilizado de Rhizopus oryzae en ausencia de solvente. La segunda etapa ha consistido en la desprotección del grupo 1,2-acetonido (solketal), empleando catalizadores ácidos. El rendimiento máximo de obtención de monoglicéridos en el extracto final de reacción ha sido del 81 %, empleando las siguientes condiciones: tiempo de hidrólisis de 24 h y de esterificación de 6 h utilizando solketal, a una temperatura de reacción de 50 °C para la primera etapa y utilizando como solvente una mezcla de acetonitrilo:HCl 1M en proporción 4:1 (v/v), con un tiempo de reacción de 6 h a temperatura ambiente para la segunda etapa. / In this work, a two-step method has been developed to prepare monoglyceride enriched extracts from soybean and sesame seeds. In the first step, direct extraction, hydrolysis and esterification of triglycerides from seeds is performed with glycidol and solketal. Reactions are catalyzed with lyophilized mycelium of Rhizopus oryzae in solvent-free conditions. The second step is the cleavage of solketal ring (1,2-acetonide structure) using acid catalysts. The maximum yield of monoglycerides in the two-step reaction process is 81 % using the following conditions: reaction time of 24 h for hydrolysis and 6 h for esterification using solketal, at a temperature of 50 °C in the first step and using a solvent mixture of acetonitrile:1 M HCl in 4:1 (v/v) with a reaction time of 6 h at room temperature in the second step.

La forma en que el filamento de nucleosomas alcanza diversos estadios de compactación y acaba formando el cromosoma metafásico al final del ciclo celular sigue siendo uno de los problemas más difíciles de resolver en el campo de la biología estructural. La fibra de 30 nm ha sido considerada durante mucho tiempo el segundo nivel de plegamiento de la cromatina, pero la mayoría de los modelos de plegamiento basados en fibras han sido propuestos a partir de estudios realizados en condiciones de muy baja fuerza iónica. Nuestro grupo de investigación ha realizado diversos estudios acerca de la estructura interna del cromosoma metafásico empleando diversas técnicas microscópicas, que han permitido observar un nuevo elemento de plegamiento: la placa de cromatina. El objetivo general de esta tesis es, por un lado, investigar la estructura de la cromatina durante la interfase en condiciones iónicas fisiólogicas y, por otro lado, obtener información estructural de alta resolución de las placas de cromatina observadas en cromosomas metafásicos. En primer lugar, se ha realizado un estudio de la estructura de la cromatina procedente de núcleos bajo condiciones iónicas propias de la interfase mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM) y se ha evaluado la capacidad autoasociativa de fragmentos de cromatina procedentes de núcleos interfásicos. En segundo lugar, se ha estudiado la estructura interna del cromosoma metafásico mediante la técnica de dispersión de rayos X de sincrotrón a bajo ángulo (SAXS). Por último, se ha obtenido información ultraestructural de la cromatina metafásica empleando la técnica de crio-tomografía electrónica (crio-ET). Los resultados de TEM muestran que la cromatina emanada de núcleos interfásicos presenta agregados amorfos y placas. El análisis de la estructura en las fases G1, S y G2 indica que las placas están presentes a lo largo de toda la interfase y que su compactación aumenta a medida que el ciclo celular avanza. En comparación con las placas metafásicas, las interfásicas son de dimensiones más reducidas y presentan menor tendencia al apilamiento. La falta de cohesión entre placas podría estar relacionada con el aumento de accesibilidad del DNA que se requiere durante los procesos de transcripción y replicación. Los experimentos realizados con fragmentos de cromatina interfásica indican una clara tendencia a autoasociarse para formar estructuras laminares. Al utilizar fragmentos procedentes de núcleos en fase G1, S y G2 se observa que las placas formadas en la interfase temprana son pequeñas y laxas, mientras que las placas en la interfase tardía presentan tamaños mayores y son más compactas. El análisis mediante crio-TE de la cromatina procedente de cromosomas metafásicos ha permitido observar que, en medio acuoso vitrificado, en ausencia de sustratos y en condiciones iónicas próximas a la metafase, la cromatina presenta una estructura laminar. Las placas de cromatina analizadas presentan un grosor de unos 10 nm, similar al diámetro del nucleosoma. En las placas desestructuradas pueden visualizarse nucleosomas como entidades individuales, pero en las placas compactas únicamente se observan líneas transversales que corresponden al DNA nucleosomal. La distancia entre estas líneas es de unos 5 nm, y es equivalente a la distancia entre las líneas visibles en el interior de nucleosomas individuales con diversas orientaciones. Estos resultados sugieren que los nucleosomas en las placas se disponen irregularmente. Frecuentemente, se ha observado que las placas pueden interaccionar a través de sus bordes, formando estructuras cilíndricas, o lateralmente, formando bicapas o multicapas. El grosor de dos placas en contacto es de 16 nm, que es significativamente menor que el grosor esperado para dos placas individuales (20 nm). De acuerdo con observaciones anteriores, estos resultados indican que los nucleosomas de ambas placas se interdigitan. En una estructura multilaminar interdigitada, los nucleosomas pueden interaccionar lateralmente. La distancia entre nucleosomas con interacción lateral es de 6 nm; equivalente a la distancia entre placas apiladas y que coincide con la difracción dominante a 6 nm observada en los experimentos de SAXS en condiciones iónicas metafásicas. Los resultados obtenidos refuerzan el modelo de las placas finas de cromatina para el cromosoma metafásico. La existencia de placas en interfase sugiere que, además de proteger el DNA, estas estructuras laminares deben participar en las diversas funciones de la cromatina a lo largo del ciclo celular. / The mechanism by which the nucleosome filament reaches different stages of compaction and finally forms the metaphase chromosome at the end of the cell cycle still remains one of the most challenging problems in the field of structural biology. The 30 nm fiber has been considered for many years the second level of compaction of chromatin, but most folding models based in fibres have been proposed from studies performed under very low ionic strength conditions. Our research group has conducted several studies about the internal structure of metaphase chromosome using microscopic techniques, which have allowed to observe a new folding element: the chromatin plate. The overall objective of this thesis is, first, to investigate the structure of chromatin during interphase under physiological ionic conditions and, second, to obtain high-resolution structural information of the chromatin plates observed in metaphase chromosomes. Chromatin structure from interphase nuclei under physiological conditions has been studied by transmission electron microscopy (TEM) and self-assembly capability of chromatin fragments from interphase nuclei has also been investigated. The internal structure of the metaphase chromosome has been studied using small angle synchrotron X-ray scattering (SAXS). Finally, ultrastructural information from metaphase chromatin has been obtained using cryo-electron tomography (cryo-ET). TEM results show that chromatin from interphase nuclei is formed by amorphous aggregates and plates. The analysis of chromatin structure from G1, S and G2 nuclei shows that plates are present along the entire interphase and its compaction increases along the cell cycle. In contrast to metaphase plates, interphase plates have smaller dimensions and lower stacking tendency. The lack of cohesion between interphase plates could be related to the increased accessibility of the DNA required for the transcription and replication processes. Experiments with interphase chromatin fragments show a clear self-assembly tendency to form laminar structures. By using fragments from G1, S and G2 phase nuclei, it was found that plates formed in early interphase are small and show lower compaction, whereas in the latter interphase plates have larger sizes and are more compact. The analysis of chromatin from metaphase chromosomes by cryo-ET allowed to see that in vitrified aqueous medium, in the absence of substrates and close to the metaphase ionic conditions, chromatin has a laminar structure. Analyzed chromatin plates have a thickness of about 10 nm, similar to the diameter of the nucleosome. Nucleosomes can be seen as individual units in unstructured plates, but in the compact ones only transverse lines corresponding to nucleosomal DNA are observed. The distance between these lines is about 5 nm; it is equivalent to the distance between the visible lines within individual nucleosomes in different orientations. These results suggest that the nucleosomes in the plates are irregularly arranged. It has often been observed that the plates can interact through their edges, forming cylindrical structures, or laterally, forming bilayers or multilayers. The thickness of two plates in contact is 16 nm, which is significantly lower than expected for two individual plates (20 nm). Consistent with previous observations, the results indicate that nucleosomes from both plates are interdigitated. In an interdigitated multilayered structure, nucleosomes may interact laterally. The distance between nucleosomes with lateral interaction is 6 nm. This is equivalent to the distance between stacked plates and is consistent with the dominant diffraction peak at 6 nm observed in SAXS experiments. These results reinforce the model of thin plates for the metaphase chromosome. The existence of plates in interphase suggests that, besides protecting the DNA, these laminar structures must participate in diverse functions of chromatin throughout the cell cycle.

Tesi realitzada a l'Institut de Química Avançada de Catalunya (IQAC-CSIC) / One of the ultimate goals in biomedicine is to understand the relationship between structure, function, and dynamics of biomolecules in living cells. The biophysical tools designed to gain more insight into metabolism, trafficking and interaction of the sphingolipids (SLs), require the use of high molar concentrations of fluorescence lipid analogues, labelled with bulky chromophores, such BODIPY or NBD, resulting in altered biophysical properties of the cell membrane. Recently, lipids tagged with conjugated linear polyene moieties, which are strongly absorbing chromophores that may attain modest but useful fluorescence yields, have been reported to behave in vivo like their endogenous counterparts. Nevertheless, when these labelled lipids are part of the N-acyl or the O-acyl chains of the SLs, the fluorophore can be released by hydrolysis of the amide or the ester bonds, and the resulting sphingoid base is no longer traceable. Taking into account the above considerations, the main objective of this thesis is to synthesize novel intrinsically-fluorescent sphingosine (Sph) and ceramide (Cer) probes, labelled with five conjugated double bonds in the sphingoid base backbond, in order to analyse membrane microdomains that are temporarily enriched in certain lipids. Additionally, the fluorescence of these probes can be modulated with total spatiotemporal control by the presence of a suitable radical quencher that can be removed by the action of a specific enzyme. Initially, as a proof of concept, three probes derived from γ-aminobutyric acid (GABA), based on a conjugated pentaene system with a radical scavenger (n-DOXYL free radical group) at different positions, were synthesised. These probes are structural analogues of palmitoyl-Cer lacking the hydroxyl group at C1 of the sphingoid chain. In addition, the secondary hydroxyl group at C3 has been replaced with an ester group. Despite the overall effect is a lower polarity of the headgroup, GABA-pentaene probes were still useful tools to evaluate the biophysical properties of these dual fluorophore-quencher systems in model membranes. With the GABA-pentaene probes in hand, different biophysical studies were developed in lipid vesicles. Fluorescence studies, differential scanning calorimetry and electron paramagnetic resonance measurements exhibited the ability of these probes to detect membrane lipids in gel phase, being relevant in view of the novel evidences pointing at the existence of gel microdomains in cell membranes. In addition, these Cer analogues may be particularly useful probes for the observation of highly-ordered bilayers by confocal microscopy, since its emission was higher in gel than in fluid domains, and in liquid-ordered than in liquid-disordered areas. Finally, different synthetic protocols for the construction of conformationally constrained pentaene-Sph and -Cer analogues were designed. The combination of Horner-Wadsworth-Emmons (HWE) and Wittig olefinations gave access to triene and pentane alkyne intermediates. In turn, these alkynes were found to be versatile synthons for the preparation of SLs analogues. By means of nucleophilic alkynylations, polyenyne-Sph analogues were obtained, whereas a hydrozirconation approach allowed the synthesis of the first pentaene palmitoyl-Cer analogue. Additionally, in light of the apparent instability of the conjugated pentaene system under acidic conditions, an alternative unreported serinal derivative building block was synthesised, which enabled a selective deprotection under mild basic conditions. Overall, synthetic approaches to polyene sphingosine analogues have been achieved. Remarkably, the pentaene moiety has been introduced in the sphingoid base backbond for the first time, providing new tools to directly observe their distribution in lipid bilayers. In addition, biophysical studies revealed the suitability of polyene moieties for fluorescence detection, by means of the simplified models GABA-pentaene probes. / Actualmente, uno de los retos de la biomedicina es profundizar más en el metabolismo, señalización e interacciones de los esfingolípidos (SLs), mediante empleo de técnicas biofísicas que no alteren las propiedades de las membranas celulares. El estudio y la visualización de los SLs, generalmente, va asociado al uso de concentraciones molares muy elevadas de sondas marcadas con grupos fluorescentes, cuyos cromóforos presentan estructuras rígidas, de considerable tamaño y volumen (NBD, BODIPY), generando un escenario artificial que dista de las condiciones fisiológicas. Con objeto de reducir el impacto que produce el volumen de los grupos cromóforos en la estructura y empaquetamiento de los lípidos de membrana, se han utilizado sistemas de dobles enlaces conjugados, fluorescentes, los cuales se comportan in vivo de forma similar a sus análogos naturales. Sin embargo, hasta el momento, no se ha diseñado ninguna sonda que contenga el sistema pentaénico incorporado en la estructura de la base esfingoide, el cual permitiría observar la distribución de especies tipo esfingosina (Sph), por visualización directa. Con objeto de analizar los microdominios de membrana que son temporalmente enriquecidos en ciertos lípidos, en la presente tesis doctoral se han diseñado diversos protocolos sintéticos para la obtención de sondas análogas a la Sph y a la ceramida (Cer). Las nuevas sondas obtenidas, pentaenino-Sph y palmitoil pentaeno-Cer, han sido marcadas, por primera vez, en la base esfingoide con una estructura de cinco dobles enlaces conjugados, confiriendo un sistema intrínsecamente fluorescente. Además, el diseño de los pentaeno-SLs permite la introducción en la cadena N-acilo de un agente radical atenuador interno (n-DOXYL), el cual latentizaría la fluorescencia con total control espaciotemporal. Por acción de una enzima específica, se liberaría el atenuador, recuperando la fluorescencia del sistema pentaénico, lo que permitiría la visualización directa de los SLs a concentraciones más cercanas a las fisiológicas. Asimismo, como prueba de concepto, se han sintetizado tres sondas derivadas del ácido γ- aminobutírico (GABA), como modelos simplificados de la palmitoil-Cer natural, los cuales contienen un sistema pentaénico con un atenuador radicalario en la misma molécula. Los ensayos biofísicos llevados a cabo en membranas modelo con estas sondas alternativas, nos han proporcionado información interesante de las propiedades biofísicas que presenta el sistema dual pentaeno-atenuador radicalario en un entorno lipídico.