This work is focused on the study of the stability and immunogenic properties of the Polypurine Reverse Hoogsteen hairpins (PPRHs), and on their use as a gene-silencing tool. PPRHs are non-modified DNA molecules formed by two antiparallel polypurine strands linked by a pentathymidine loop that allows the formation of intramolecular reverse Hoogsteen bonds between both strands. Previously in our laboratory it was demonstrated that these hairpins bind to their polypyrimidine target in a dsDNA via Watson-Crick bonds, displacing the polypurine strand of the target duplex. The effect of PPRHs in cells and their mechanism of action were first described using PPRHs designed against the template and coding strands of the DHFR gene. A PPRH against survivin was further validated in a xenograft tumor model, establishing the proof of principle for the use of PPRHs as a therapeutic tool. In this work we increased the knowledge we have about PPRHs. We were able to establish that PPRHs, unlike siRNAs, are very stable molecules in different types of serum and inside the cells. We also established that PPRHs do not induce the innate immune response, since they do not induce the levels of neither the transcription factors IRF3 and NF-κB, nor the proinflammatory cytokines IL-6, TNF-α, IFN-α, IFN-β, IL-1β, and IL-18. Additionally, unlike siRNAs, PPRHs did not trigger the activation of the inflammasome. Another element that we studied was the modification of the PPRH structure, since it has been shown that circular structures can provide advantages over linear structures. Therefore, we analyzed the efficacy of two other types of PPRH: i) nicked-circle-PPRHs, a new structure in which a second loop was introduced to form a nearly circular sequence, and ii) PPRHs made out of RNA (RNA-PPRHs). To broaden the applicability of PPRHs in cancer therapy, we evaluated their capacity to silence genes involved in a variety of biological functions linked to cancer hallmarks. The genes selected were: BCL2, MDM2, MYC, TOP1 and MTOR, and the validation of the PPRHs was performed in different cancer cells lines (PC3, MIA PaCa2, HCT116, SKBR3, MCF7 and MDA-MB-468). Regardless of the gene or cell line tested, PPRHs were able to decrease cell survival and mRNA expression levels, and to increase apoptosis, to a greater or lesser extent. Finally, we also present an approach to increase the specificity of PPRHs that involves the use of a DNA aptamer that has been shown to have an effect in HER2 positve cells. / Este trabajo se centra en el estudio de la estabilidad y potencial inmunogénico de las moléculas llamadas PPRHs (Polypurine Reverse Hoogsteen hairpins), y en su uso como herramienta de silenciamiento génico. Los PPRHs son moléculas de DNA no modificadas. Están formadas por dos cadenas antiparalelas de polipurinas unidas por un bucle pentatimidínico, lo que permite la formación intramolecular de enlaces de Hoogsteen reversos entre ambas cadenas. Anteriormente se demostró que los PPRH son capaces de unirse a una secuencia de dsDNA mediante enlaces de Watson-Crick, formando un triplex que desplaza la cadena polipurínica de la diana. La prueba de principio para el uso de los PPRH como agente terapéuticos se llevó a cabo con un PPRH dirigido al gen de la survivina el cual fue validado tanto in vitro como in vivo. En esta tesis se ha profundizado en el conocimiento de los PPRHs. Se ha establecido que estas moléculas son estables en diferentes tipos de suero, así como intracelularmente. Además se determinó que los PPRHs, no inducen la activación de la respuesta inmune innata, ya que su transfección a una línea monocítica no incrementó los niveles de expresión de los factores de transcripción IRF3 y NF-κB, y tampoco de las citoquinas proinflamatorias IL-6, TNF-α, IFN-α, IFN-β, IL-1β, y IL-18. Además, los PPRHs no indujeron la activación del inflamasoma. También se diseñaron dos estructuras nuevas de PPRH: PPRH circulares y PPRHs basados en RNA, y se estudiaron diversos parámetros como su capacidad de unión a la diana y su citotoxicidad. Para ampliar la aplicabilidad de estas moléculas, se validó el uso de los PPRHs sobre diversos genes relevantes en cáncer: BCL2, MDM2, MYC, TOP1 y MTOR. Esta validación se realizó en diversas líneas tumorales (PC3, MIA PaCa-2, HCT116, SKBR3, MCF7 y MDA-MB-468) observando que los PPRHs fueron capaces de disminuir la supervivencia de las células y la expresión de los genes diana, y de aumentar la apoptosis. Finalmente, se realizó una aproximación para incrementar la especificidad de los PPRHs, la cual incluye el uso de un aptámero de DNA dirigido a la proteína de membrana HER2.

Tesi realitzada a l'Institut de Química Avançada de Catalunya (IQAC-CSIC) / La introducción de la nanomedicina en el ámbito de la farmacología ha revolucionado la administración de fármacos, con la aparición de nuevos tratamientos con mayor especificidad, aumentando el rendimiento biológico y farmacológico, ofreciendo así alternativas interesantes para formular nuevas moléculas. El presente trabajo tiene como finalidad el diseño de NPs poliméricas y liposomas para su aplicación en la “Terapia Ocular” y el “Diseño de inhibidores del HIV-1”. En la primera parte de este estudio se desarrollaron formulaciones que contienen Flurbiprofeno, fármaco antiinflamatorio no esteroideo (AINE), que se utiliza en la cirugía de cataratas. Para ello se siguieron dos estrategias de preparación distintas: 1) NPs derivatizadas en la superficie con PEG y péptidos, abreviadas como PLGA-NPs-PEG-Péptido, 2) y la síntesis de copolímeros PLGA-PEG-Péptido con posterior preparación de las NPs, abreviadas como PLGA-PEG-Péptido-NPs. De todas las formulaciones desarrolladas, las PLGA-PEG-Péptido-NPs, en específico las PLGA-PEG-POD-NPs, han presentado los mejores resultados, obteniéndose una estrecha distribución de tamaño de partícula, una alta eficiencia de encapsulación del Flurbiprofeno y una liberación más sostenida. Asimismo, su morfología esférica se pudo comprobar mediante las técnicas de microscopía electrónica de barrido y microscopía de fuerza atómica. Estas presentaron un tamaño de partícula apropiado, y mejoraron la biodisponibilidad y el tiempo de residencia del Flurbiprofeno en el saco conjuntival. Su menor tamaño de partícula fue un aspecto importante que condujo a una óptima tolerancia ocular y una mayor respuesta antiinflamatoria. En la segunda parte de este proyecto se estudiaron péptidos derivados de las proteínas de envoltura (E1 y E2) del virus GBV-C. Con aras de aumentar la capacidad anti-HIV-1 del péptido P6-2 (perteneciente a la proteína E2) se realizaron diferentes modificaciones químicas de su estructura: incorporación de un ácido graso en el extremo amino terminal (Pal-P6-2), obtención de NPs poliméricas del tipo PLGA-PEG-NPs-P6-2 y liposomas con diferentes composiciones, del tipo LUV, que contienen los péptidos P6-2 y la molécula quimérica resultante de la unión de este último péptido y el péptido VIR, previamente reportado por su capacidad anti-HIV-1 (VIR-P6-2). Paralelamente se han obtenido nanopartículas de PLGA derivatizadas con el péptido de fusión del HIV-1 (NPs PLGA-PF-HIV-1). Este esfuerzo atendió al creciente interés del estudio de interacción de péptidos provenientes de la proteína E1 del GBV-C. El péptido E1P8 cíclico es un fragmento de la proteína E1 del GBV-C que ha mostrado tener una elevada capacidad inhibitoria. La técnica de Diferencia de la Transferencia de Saturación (RMN-STD) ha mostrado una gran utilidad para llevar a cabo estudio de interacción receptor-ligando. Este estudio nos permitió afirmar que existe una interacción entre el péptido E1P8 cíclico y las NPs PLGA-PF-HIV-1, obteniéndose mayor intensidad en las señales de STD. La intensidad de la señales se traduce como una escala de proximidad de las distintas zonas de la estructura peptídica (E1P8 cíclico) a las NPs PLGA-PF-HIV-1, manifestando que existe interacción a nivel atómico. / In this work, polymeric nanoparticles (NPs) and liposome were designed to be used in two lines of research: “Ocular delivery” and “Peptide inhibitors of HIV-1”. Peptide for ocular delivery (POD) and human immunodeficiency virus transactivator were conjugated with biodegradable poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA)–polyethylene glycol (PEG)-nanoparticles (NPs) in an attempt to improve ocular drug bioavailability. The NPs were prepared by the solvent displacement method following two different pathways. One involved preparation of PLGA NPs followed by PEG and peptide conjugation (PLGA-NPs-PEG-peptide); the other involved self-assembly of PLGA-PEG and the PLGA-PEG-peptide copolymer followed by NPs formulation. The conjugation of the PEG and the peptide was confirmed by a colorimetric test and proton nuclear magnetic resonance spectroscopy. Flur¬biprofen was used as an example of an anti-inflammatory drug. The physicochemical properties of the resulting NPs (morphology, in vitro release, cell viability, ocular tolerance and in vivo anti-inflammatory efficacy) were studied. Taken together, these data demonstrate that PLGA-PEG-POD NPs are promising vehicles for ocular drug delivery. GBV-C has the beneficial effect of retarding the progression of AIDS in people who are coinfected with both the GBV-C and HIV viruses. In previous works, peptides derived from the envelope proteins (E1 and E2) of GBV-C virus were studied. In order to increase the anti-HIV-1 activity of the peptide P6-2 (belonging to the E2 protein), different chemical modifications of its structure were made: addition of a fatty acid, conjugation to NPs and liposome containing P6-2 peptide and the chimeric molecule resulting from the binding of the latter peptide and VIR peptide (VIR-P6-2), previously reported by their anti-HIV-1 activity. Liposomes containing peptide VIR-P6-2 showed an increase inhibitory activity in the order of 3-6 times. On the other hand, E1P8 cyclic peptide (belonging to the E1 protein) has demonstrated a higher anti-HIV-1 activity. Saturation transfer difference (STD)-NMR is a method that allows to screen the binding of compounds to a receptor and to characterize the binding epitope. STD-NMR results indicate that E1P8 cyclic peptide is able to interact with the peptide fusion of HIV-1 and open new perspectives to design new GBV-C peptide based entry inhibitors.

Tesi realitzada al Centre de Recerca en Agrigenòmica (CRAG) / En aquesta Tesi s'han estudiat tres gens a partir d'una llibreria de cDNA d'embrions de blat de moro de 10 DAP. Els tres cDNAs escollits van ser: MKA5, que codifica un pèptid antimicrobià de la família CYCLOTIDE; MMH3, que codifica una proteïna de la família de MAP65 associades a microtúbuls, i MIH1, que codifica la proteïna LICC1 involucrada en diferents processos biològics. La proteïna LICC1 conté els dominis LisH, CTLH i CRA. La funció del domini LisH és la d'interactuar amb els microtúbuls i altres proteïnes. Les funcions dels dominis CTLH i CRA sembla ser la d'interactuar amb d'altres proteïnes. Un estudi filogenètic mostra que LICC1 és homòleg a les proteïnes GID8 i TWA1 de llevat i mamífers, respectivament, que formen part del complex proteic GID/MRCTLH. Aquest complex sembla que participa en múltiples funcions cel•lulars, entre les que es troba la degradació de certes proteïnes via ubiquitinació. E1 gen liccl s'expressa més o menys a tots els teixits i la seva proteïna s'acumula també a molts teixits, tot i que presenta diferents formes probablement degudes a modificacions post-traduccionals. S'ha demostrat mitjançant la centrifugació diferencial que LICC1 està associada a complexos d'alt pes molecular. Experiments de cosedimentació demostren que LICC1 interactua amb els microtúbuls i experiments in vivo amb plantes i cèl•lules transformades de tabac i d'Arabidopsis amb fusions de LICC1 a YFP demostren que LICC1 colocalitza amb les tubulines com a mínim en certs teixits i condicions ambientals. Tractaments amb drogues que afecten als microtúbuls produeixen variacions en la localització de LICC1. La part de LICC1 responsable de la interacció amb els microtúbuls es la que conté els dominis LisH i CTLH. Davant d'un estrès hídric LICC1 passa a estar localitzat als cossos lipídics sent el domini CRA la part responsable de l'interacció amb proteïnes. En vaquestes condicions l'acumulació de LICC1-YFP s'incrementa a les cèl•lules de guarda dels estomes. A més a més, la sobreexpressió de LICC1-YFP produeix una reducció en el creixement però un increment en la resistència a l'estrès hídric. Experiments d'immunoprecipitació han demostrat que LICC1 es capaç també d'interactuar amb una polifenol oxidasa. Amb aquests resultats suggereix que LICC1 formaria part del complex GID/MRCTLH i participaria en múltiples funcions. Aquest complex podria associar-se als cossos lipídics en condicions d'estrès, a on podria actuar com scaffold i interactuar amb d'altres proteïnes, per exemple, promovent la seva ubiquitinació. Una d'elles podria ser la PPO detectada. / Transcriptomic analyses have identified the genes expressed during plant embryogenesis but the roles of may of them remain unknown. The present work describes the molecular studies of three genes expressed in maize embryos 10 days after pollination. The first gene encodes an antimicrobial peptide from the CYCLOTIDE family. The second gene encodes a MAP65 family protein associated with microtubules. The last gene encodes the protein LICC1 involved in several biological processes. Gene /icc/ encodes a protein with the LisH, CTLH and CRA domains, all three described as protein-protein interaction domains. LisH has been also involved in microtubule interactions. LICC1 is homologous to yeast GID8 and human TWA1, both components of the protein complex GID/MRCTLH, which act as an ubiquitin E3 ligase involved in several cell processes. Gene /icc/ is expressed in all plant organs and LICC1 protein accumulated in all them although it seems to suffer different postranslational modifications depending on the organ. The cellular distribution of LICC1 is complex. Differential centrifugation showed that part of the LICC1 is located in high molecular weight protein complexes, as expected for a GID/MRCTLH component. Cosedimentation experiments demonstrated that LICC1 interacts with microtubules, as expected for a LisH domain containing protein. This interaction was confirmed in vivo by the colocalization of LICC1-YFP with tubulins and the use of drugs altering microtubule stability. The fragment of LICC1 containing the LisH and CTLH domains is the responsible for the microtubule interaction. Under certain conditions LICC1 is located in the oil bodies, being the fragment containing the CRA domain the responsible for this localization. Immunoprecipitation demonstrated that LICC1 also interacts with a polyphenol oxidase. Overexpression of LICC1 fused to YFP produces a reduction in the growing rates but in Arabidopsis plants overexpression of LICC1-YFP increases the resistance to water stress. Under such stress conditions, LICC1-YFP accumulation is increased in the stomatal guard cells. In conclusion, LICC1 seems to be part of the GID/MRCTLH complex in plants and to be involved in several cellular processes, including growth, water stress response and ROS responses through the interaction with a polyphenol oxidase.

La vía de señalización celular MEK5-ERK5 se activa en respuesta a un amplio rango de factores de crecimiento y diferentes tipos de estrés. Fosforila los factores de transcripción de la familia MEF2 y juega un relevante papel en el control de la proliferación celular inducida por factores como el EGF, además de controlar la supervivencia celular y la angiogénesis. ERK5 difiere estructuralmente de otras MAP quinasas en presentar una larga y única cola C-terminal. Esta cola tiene un efecto autoinhibitorio sobre la actividad quinasa y presenta un motivo de localización nuclear NLS (sólo accesible en la conformación activa/abierta de la quinasa), además de un dominio de activación transcripcional que interacciona con MEF2D y potencia la actividad transactivadora del factor de transcripción AP-1. Así, ERK5 activa la transcripción de ciertos genes no sólo por la fosforilación directa de factores de transcripción, sino también actuando como coactivador transcripcional de, por ejemplo, el factor AP-1. Previamente en nuestro laboratorio, utilizando la técnica del Tandem Affinity Purification (TAP), se identificó a la chaperona Hsp90β como una putativa proteína que interacciona con ERK5. En este trabajo, mediante ensayos de co-inmunoprecipitación de las proteínas endógenas y sobre-expresadas, demostramos que ERK5 forma un complejo trimérico con las chaperonas Hsp90β y Cdc37, y que la inhibición farmacológica de Hsp90β o Cdc37 induce la ubiquitinación y degradación proteosomal de ERK5. Estos resultados proponen a ERK5 como una nueva proteína cliente de la chaperonas Hsp90/Cdc37, necesarias para el correcto plegamiento y mantenimiento de la estructura de la quinasa. Por primera vez se muestra que la activación canónica de ERK5 (por MEK5) induce la disociación de Hsp90 del complejo ERK5-Cdc37, como paso previo a la translocación nuclear de ERK5 y la consiguiente activación de la transcripción, por un mecanismo que requiere la autofosforilación de la cola C-terminal de la quinasa. Por otra parte, se ha establecido que la expresión de Cdc37 en exceso (como ocurre en algunos tipos de cáncer) promueve la disociación de Hsp90 del complejo y la translocación nuclear de una forma inactiva de ERK5 capaz de potenciar la actividad transcripcional del factor AP-1. Este resultado constituye la primera evidencia de un mecanismo no canónico de translocación que implica la entrada en el núcleo de una ERK5 inactiva que retiene la capacidad de activar la transcripción mediada por el factor AP-1. También se propone a Hsp90 como una proteína que serviría de anclaje citosólico de ERK5. Por otra parte, se han obtenido evidencias que muestran que tanto la activación canónica (MEK5) como no canónica (Cdc37) inducen la SUMOilación de ERK5 en el extremo N-terminal de la proteína. Mediante ensayos bioquímicos y de inmunofluorescencia aportamos evidencias que apuntan a que tanto la disociación de Hsp90 como la SUMOliación son eventos necesarios pero no suficientes per se para que ocurra la translocación nuclear de ERK5. Se han generado líneas celulares que sobre-expresan establemente ERK5 y/o Cdc37, que muestran que ambas proteínas cooperan en promover un drástico incremento en la proliferación y la migración celular. Este resultado es relevante dado que la sobreexpresión de ERK5 como Cdc37 son eventos que ocurren en ciertos tipos de cáncer, como el adenocarcinoma prostático. Por último, mostramos que ERK5 interacciona con el receptor de andrógenos (AR) en el citosol de las células en reposo, y que la activación de este receptor con ligandos induce la translocación de AR y ERK5 inactiva al núcleo, donde siguen interaccionando y colaboran en la promoción de la actividad transcripcional del AR sobre la proteína antígeno prostático (PSA, biomarcador clínico especifico del cáncer de próstata). Se ha observado otro link funcional entre ambas proteínas, ya que la activación de ERK5 por MEK5 o la sobre-expresión de Cdc37 incrementan la actividad ligandodependiente del receptor de andrógenos, mientras que el silenciamiento de la ERK5 celular bloquea dicha activación transcripcional. / The MEK5-ERK5 signaling pathway is activated in response to growth factors and different forms of stress. ERK5 phosphorylates the transcription factors, members of the myocyte enhancer factor family, MEF2 and plays an important role in the control of cell proliferation induced by factors such as EGF, as well as control of cell survival and angiogenesis. In contrast with other MAPKs, ERK5 has a unique C-terminal tail. This domain auto-inhibits the kinase activity and has a nuclear localization signal (NLS) (only available in the active/open conformation), moreover contains a transcriptional activation domain that interacts with MEF2D and enhances the activity of the AP-1 transcriptional complex. Thus, ERK5 is able to activate transcription not only by direct phosphorylation of transcription factors but by acting itself as a transcriptional coactivator, as, for example, in the case for the activator protein 1 (AP-1) transcription factor. Previously in our laboratory using the technique of Tandem Affinity Purification (TAP), we identified the chaperone Hsp90β as a putative interacting protein ERK5. In this study, using co-immunoprecipitation assays of endogenous and recombinant proteins, we demonstrated that ERK5 forms a trimeric complex with Hsp90β and Cdc37, and the pharmacological inhibition of Hsp90 and Cdc37 induces ubiquitination of ERK5 prior to degradation at the proteasome. These results suggest that ERK5 is a novel client protein of the chaperone Hsp90/Cdc37, and these chaperones are necessary to maintain the proper folding and structure of the kinase. For the first time we show that the canonical activation of ERK5 (by MEK5) induces the Hsp90 dissociation from the ERK5-Cdc37 complex, leading to ERK5 nuclear translocation and activation of transcription, by a mechanism which requires the autophosphorylation at its C-terminal tail. Moreover, the overexpression of Cdc37 (as in some types of cancer) promotes Hsp90 dissociation and the nuclear translocation of a kinase-inactive form of ERK5 which retains transcriptional activity. This is the first example showing that ERK5 transcriptional activity does not require kinase activity. We propose that Hsp90 might be the cytosolic anchor of ERK5. Moreover, we show that both the canonical activation canonical (MEK5) as noncanonical (Cdc37) induce the ERK5 SUMOylation at its Nterminal half. The biochemical and immunofluorescence assays provided evidence that both the Hsp90 dissociation as the ERK5 SUMOylation are necessary but not sufficient per se to induce ERK5 nuclear translocation. We generated stable cell lines that over-express ERK5 and/or Cdc37, we showed that both proteins cooperate to promote a dramatic increase in cell proliferation and migration. This result is important because overexpession of ERK5 and Cdc37 are events that occur in certain types of cancer, including prostate adenocarcinoma. Finally, we show that ERK5 interacts with the androgen receptor (AR) in the cytosol of resting cells, and that activation of this receptor with ligands induces the nuclear translocation of AR and inactive ERK5, and in this cellular compartment they continue interacting and promoting the transcriptional activity of AR through PSA (PSA specific clinical biomarker for prostate cancer). It has been observed another functional link between these proteins, and that activation of ERK5 by MEK5 or overexpression of Cdc37 increase ligand-dependent activity of the androgen receptor, whereas the silencing of ERK5 inhibits this transcriptional activation.

Resum Mutacions en els gens de les presenilines (PS: PS1 i PS2), el component catalític del complex γ-secretasa, són la principal causa d'Alzheimer familiar hereditari (FAD). Evidències recents demostren que mutacions associades a FAD produeixen una reducció del processament per PS/γ-secretasa de diversos substrats, suggerint un mecanisme de pèrdua de funció d´aquestes mutacions. De fet, la inactivació genètica d'ambdues PS en el cervell adult causa dèficits en la plasticitat sinàptica i memòria, i neurodegeneració. Durant el desenvolupament embrionari, la inactivació de PS1 indueix canvis en la neurogènesi i la mort prematura probablement degut, almenys en part, a alteracions en la via de senyalització de Notch. Malgrat això, el paper de la PS1 i/o l´activitat γ-secretasa i els mecanismes moleculars regulats per aquests durant els processos de diferenciació neuronal, tals com el creixement axonal i dendritic i la formació de sinapsis, en gran part es desconeixen. Un dels principals esdeveniments durant la maduració neuronal és el creixement de l´axò, un procés necessari per establir connexions sinàptiques adequades pel funcionament dels circuits neuronals. La família de proteïnes Rho GTPases regulen la polarització neuronal i el creixement de l'axó. Per altra banda, els receptors tirosina quinasa d´efrina (Eph) regulen el creixement i la guia axonal durant la maduració neuronal. L'activació dels receptors Eph indueix el col·lapse del con de creixement i la retracció axonal a través de l'activitat RhoA. L´objectiu d´aquesta tesi doctoral ha sigut investigar el paper de PS1/γ-secretasa durant el creixement axonal, així com els mecanismes moleculars implicats en aquesta regulació. Els resultats obtinguts demostren que la inactivació genètica de PS1 en ratolins indueix una reducció del creixement axonal en la regió ventricular i en l'hipocamp. En el mateix sentit, la inactivació genètica o farmacològica de l'activitat PS1/γ-secretasa indueix una reducció significativa del creixement axonal en neurones hipocampals en cultiu. De fet, la inactivació de PS/γ-secretasa incrementa l'activitat de RhoA GTPasa causant defectes en l'elongació de l'axó, un efecte que és revertit a l´inhibir RhoA o la seva proteïna efectora ROCK. A més, en aquest treball descrivim per primera vegada que PS1 col·localitza amb el receptor EphA3 en els axons de neurones hipocampals, i que PS1/γ-secretasa regula el processament d´EphA3 de forma constitutiva i independent de lligand, essent aquest processament necessari per al creixement axonal. A més, demostrem que la generació del fragment intracel·lular EphA3 ICD per PS/γ-secretasa, és clau per al creixement axonal, de manera que un mutant de EphA3 que perd la capacitat de ser proteolitzat no reverteix els defectes del creixement axonal causats per la inactivació de PS1. Per contra, l'expressió d'EphA3 ICD rescata el creixement axonal en neurones hipocampals deficients en PS/γ-secretasa o EphA3. A més, l'expressió d'EphA3 ICD disminueix l'activitat RhoA GTPasa, a la vegada que interacciona amb les miosines Ib i IIa, proteïnes que són clau en la regulació de l´organització del citoesquelet axonal en el con de creixement. Per tant, els nostres resultats demostren que la PS1/γ-secretasa juga un paper essencial durant creixement axonal en neurones hipocampals a través de la regulació de les vies de senyalització d´EphA3 i RhoA. / Mutations in the Presenilin genes (PS: PS1 and PS2), the catalytic component of the γ-secretase complex, are the main cause of familial Alzheimer’s disease (FAD). Recent evidences show that FAD-linked mutations induce a reduction of PS/γ-secretase processing of several substrates, suggesting a loss-of-function mechanism in this mutations. In fact, the genetic inactivation of both PS in adult brain induces synaptic plasticity and memory deficits, and neurodegeneration. In developmental stages, inactivation of PS1 induces alterations in neurogenesis and premature death of the embryos, partially, due to alterations in the Notch signaling pathway. However, the role of PS1 or the γ-secretase activity and the molecular mechanisms regulated during the neuronal differentiation, such as axonal and dendritic elongation and synapse formation, are widely unknown. Axon elongation, a process necessary for the establishment of functional synaptic connections in the neural circuitry, is one of the main events during neuronal differentiation. Rho GTPase family proteins regulate neuronal polarization and axon elongation. On the other hand, ephrin tyrosine kinase receptors (Eph) regulate the elongation and axon growth during neuronal differentiation. Activation of Eph receptors induces the growth cone collapse and axonal retraction through the RhoA activity. The objective in this doctoral thesis has been to investigate the role of PS1/γ-secretase during the axonal elongation, and the molecular mechanisms involved in this pathway. Our results show that genetic inactivation of PS1 in mice induces a significant reductions of the axon growth in primary hippocampal neurons. In fact, the inhibition of PS/γ-secretase induces an increase in RhoA GTPase activity, which in turn causes elongation defects in the axon, an effect reverted by RhoA or ROCK effector protein inhibition. Moreover, in this thesis we describe for the first time the colocalization of PS1 and EphA3 receptor in the axons of hippocampal neurons, where PS1/γ-secretase regulates the constitutive and ligand-independent processing of EphA3, a mechanism necessary for axonal growth. Furthermore, we demonstrate that generation of the intracellular fragment of EphA3 (EphA3 ICD) is a key event for axonal growth, where processing-defective EphA3 mutants are not able to rescue axonal growth defects caused by PS1 inactivation. Otherwise, expression of EphA3 ICD induces a decrease of RhoA GTPase activity, which in turn interacts with myosin-IB and myosin-IIA key proteins for the reorganization of the axon cytoskeleton in the growth cone. Therefore, our results indicate that PS1/γ-secretase has an essential role during axonal growth in hippocampal neurons by regulating EphA3 and RhoA signaling pathways.

El meu projecte de doctorat s’enmarca en l’estudi de l’estructura i la funció de les ribonucleases antimicrobianes humanes. Actualment, es coneixen vuit ribonucleases humanes funcionals pertanyents a la superfamília de ribonucleases secretades per vertebrats. Cal remarcar, que alhora de la seva activitat per a hidrolitzar àcids ribonucleics, també presenten altres propietats biològiques com l’activitat antimicrobiana, que suggereixen una possible funció ancestral relacionada amb el sistema immunitari. La proteïna catiònica d’eosinòfils (ECP) és un dels components majoritaris dels grànuls secundaris dels eosinòfils. Degut al seu gran nombre d’arginines l’ECP és una proteïna molt catiònica i presenta una elevada activitat antimicrobiana vers una gran diversitat de patògens, com bacteris, helmints i protozous. En el nostre laboratori hem estudiat extensament el mecanisme antimicrobià de diverses ribonucleases. Concretament, el treball desenvolupat en aquesta tesi ha permès: i. Identificar el farmacòfor de l’ECP mitjançant eines de minimització racional de l’estructura. ii. Analitzar els canvis que es produeixen a la superfície bacteriana com a conseqüència de l’acció de l’ECP i dels seus pèptids derivats. Principalment, en detallar com aquests interaccionen amb els lipopolisacàrids de la paret bacteriana. iii. Descobrir que l’agregació amiloid de l’ECP a la superfície de les bactèries és fonamental per a la seva acció antimicrobiana i, en concret, per la seva activitat d’aglutinació. iv. Identificar factors estructurals i de seqüencia en el domini N-terminal necessaris per l’acció antimicrobiana de les ribonucleases conservats durant l’evolució. v. Caracteritzar els elements seqüencials de les ribonucleases que determinen les propietats antimicrobianes i d’aglutinació mitjançant el disseny de proteïnes híbrides entre les ribonucleases 2 i 3 (EDN i ECP respectivament). vi. Descobrir que tant l’ECP com la ribonucleasa 7 presenten activitat vers micobacteris a través d’un mecanisme similar a l’exibit enfront de bacteris gram negatius. En conclusió, els resultats obtinguts en aquesta tesi ens permeten conèixer millor com les ribonucleases contribueixen a l’eliminació de diferents patògens del nostre organisme i ens obren noves vies pel disseny de nous agents terapèutics per combatre microorganismes patògens. / My PhD project focuses on the structure-function analysis of human antimicrobial RNases, Currently eight functional members have been ascribed to the vertebrate secreted RNase superfamily. Together with their catalytic activity towards RNA substrates, other biological properties have been reported such as the antimicrobial activity of diverse members of the family, therefore suggesting that RNases could have an ancestral host-defence function. The eosinophil cationic protein (ECP) is one of the major components of the secondary granules of human eosinophils. ECP is a highly cationic arginine-rich protein, which displays a high antimicrobial activity against pathogens, such as bacteria, helminths and protozoa. In our laboratory the antimicrobial mechanism of action of several RNases has been extensively studied. In particular, this work enables us to determine: i. Identify the protein pharmacophore by rational structure minimization. ii. Explore the effects that take place at the bacterial cell wall upon protein-interaction. Concretely, highlight the crucial role of the lipopolysaccharide molecule in the mechanism of action of ECP, and their N-terminal peptides. iii. Determine that the amyloid formation at the bacterial surface is crucial for the antimicrobial activity of the protein, and in particular, due to the agglutinating activity. iv. Prove that the sequence and structural determinants of RNases are evolutionary conserved at the N-terminal domain. v. Characterize the sequence and structural determinants required for antimicrobial and agglutinating activities Through RNase rational mutagenesis of the homologous RNases 2 and 3 (EDN and ECP respectively) vi. Discover that either ECP or RNase 7 present antimycobacterial activity trough a similar mechanism as proved against Gram-negative bacteria. In conclusion, the results presented in this thesis work enable us to better understanding of how RNases contribute on the host pathogen clearance and open a new window in order to the design and develop new therapeutic agents as alternative antibiotics.

Aquesta tesi s’emmarca dins d’un projecte d’investigació més general que té per objectiu caracteritzar i estudiar la funció de la proteïna quinasa CK2 de sistemes vegetals. La CK2 és una Ser/Thr quinasa present a tots els eucariotes estudiats fins al moment. Estudis fets en diversos eucariotes han evidenciat la importància d’aquesta quinasa en el creixement i en el control del cicle cel·lular, no obstant, les vies de senyalització en que participa aquesta quinasa encara no estan caracteritzades per complet. Al primer capítol d’aquesta tesi es descriu per primera vegada la involucració de la proteïna quinasa CK2 d’Arabidopsis en la via de senyalització de les auxines, en particular, del transport d’auxina. En plantes, la fitohormona auxina és la principal reguladora del creixement cel·lular. Recentment s’ha demostrat que la distribució asimètrica de l’auxina en els diferents òrgans de la planta és essencial per al desenvolupament vegetal i, aquesta distribució depèn principalment del transport polar de l’auxina. Per dur a terme aquesta investigació hem utilitzat un mutant dominant negatiu de la proteïna quinasa CK2 d’Arabidopsis thaliana (la línia CK2mut); aquest mutant té uns trets fenotípics que estan lligats a alteracions en processos dependents d’auxina, com són la inhibició del creixement de l’arrel principal, l’absència d’arrels laterals i el fenotip wavy. No obstant, s’ha comprovat que la percepció de l’auxina no està afectada ja que les plantes CK2mut responen al tractament exogen amb aquesta hormona. Hem demostrat que aquest mutant no té defectes en la síntesi de l’auxina, però si en el transport d’aquesta hormona. Eliminant l’activitat CK2 utilitzant eines genètiques (línia CK2mut) i eines farmacològiques (tractament amb TBB, un inhibidor específic de la CK2) hem demostrat que hi ha anomalies en la formació dels gradients d’auxina i canvis en l’expressió de gens relacionats amb les auxines; en particular, en membres de la família de transportadors de sortida d’aquesta hormona cap a l’exterior cel·lular (PINs) i en la proteïna quinasa PINOID (PID). Aquestes proteïnes són reguladores dels fluxos d’auxina. Estudis fets amb plàntules PIN4::PIN4-GFP i PIN7::PIN7-GFP han permès detectar que l’eliminació de l’activitat CK2 provoca l’acumulació d’aquestes proteïnes en vesícules endosomals. La formació de vesícules endosomals va fer pensar que la CK2 tenia algun paper en la via de tràfic vesicular d’aquests transportadors, i aquest ha estat el tema d’estudi del segon capítol d’aquesta tesi. S’han emprat diversos inhibidors de diferents punts de la via de tràfic vesicular per tal de poder discriminar a quin punt d’aquesta via actua la CK2. Aquests experiments s’han realitzat utilitzant plantes PIN7::PIN7-GFP i utilitzant com a model les plantes PIN1::PIN1-GFP, ja que PIN1 és el transportador d’auxina més ben caracteritzat. Amb el tractament amb tyrphostin A23 hem observat que les vesícules endosomals que es formen per eliminació de l’activitat CK2 estan revestides de clatrina. Amb els tractaments amb brefeldin A (BFA) i wortmannin hem determinat que la CK2 actua en algun punt de la via d’endocitosi diferent al d’aquests inhibidors. S’ha detectat que aquests endosomes no es tenyeixen amb el colorant específic de lípids FM4-64 i que són més grans que els endosomes obtinguts pel tractament amb BFA. Per últim, el tractament amb cicloheximida ens ha permès observar dos efectes: el primer és que la formació d’endosomes no depèn de la síntesi de proteïnes de novo i el segon, és que la inhibició de la CK2 no compromet la degradació al vacúol d’aquestes proteïnes. Així doncs, amb els resultats obtinguts podria ser que l’eliminació de la CK2 provoqués la formació d’endosomes sorting nexin aberrants, indicant així, que aquesta quinasa estaria intervenint en la via del retròmer. / This thesis is involved in a more general project that aims to characterise and study the protein kinase CK2 in vegetal systems. Protein kinase CK2 is a pleiotropic Ser/Thr kinase and evolutionary conserved in eukaryotes. Studies performed in different organisms, from yeast to humans, have highlighted the importance of CK2 in cell growth and cell-cycle control. However, the signalling pathways in which CK2 is involved have not been fully identified. The first chapter of this thesis involves for first time the protein kinase CK2 in the auxin signaling pathway. In plants, the phytohormone auxin is a major regulator of auxin cell growth. Recent discoveries have demonstrated that differential distribution of within plant tissues is essential for developmental processes, and that this distribution is dependent on polar auxin transport. We report here that a dominant-negative mutant of CK2 (CK2mut) in Arabidopsis thaliana shows phenotypic traits that are typically linked to alterations in auxin-dependent processes. However, CK2mut plants exhibit normal responses to exogenous indole-3-acetic acid (IAA) indicating that they are not affected in the perception of the hormone, but upstream in the pathway. We demonstrate that mutant plants are not deficient in IAA but are impaired in its transport. Using genetic and pharmacological tools we show that CK2 activity depletion hinders correct formation of auxin gradients and leads to widespread changes in the expression of auxin-related genes. In particular, members of the auxin efflux carrier family (PINs), and the protein kinase PINOID, both key regulators of auxin fluxes, were misexpressed. PIN4 and PIN7 were also found mislocalized, with accumulation in endosomal bodies. The endosomal bodies formation lead to think that CK2 has a role in vesicular traffic pathway of these carriers and this was the topic of the study of the second chapter of this thesis. We have used several inhibitors in order to identify the point of the pathway in which acts the CK2. We performed these experiments using both PIN7::PIN7-GFP and PIN1::PIN1-GFP as a model, because PIN1 is the carrier more characterized. The tyrphostin A23 treatment reveals that these endosomal vesicles formed by the CK2 inhibition are clathrin coated. The brefeldin A and wortmannin treatments have determined that CK2 acts in a different point of the pathway than these inhibitors. We have detected that the endosomal bodies obtained by CK2 inhibition are not stained by FM4-64 dye and are enlarged compared with the endosomes obtained by the BFA treatment. Finally, the cicloheximide treatment has allowed observing two effects. The first is that the formation of endosomes does not depend on de novo protein synthesis. The second one is that CK2 inhibition does not compromise the degradation of the PIN proteins in the vacuole. Therefore, our results seem to indicate that inhibition of CK2 entails the formation of aberrant sorting nexin endosomes, which may lead to think that this kinase would be involved in the retromer complex.

En l’actualitat, la industria farmacèutica utilitza la tecnologia basada en el cultiu in vitro de cèl·lules animals per a la producció de compostos d’elevat interès terapèutic i també, com a model biològic per assajar l’activitat de nous fàrmacs. Moltes empreses fan ús d’aquesta tecnologia ja que es tracta del sistema biològic més apropiat per obtenir proteïnes complexes. Tot i així, pel que fa a l’ús de cèl·lules animals, existeixen una sèrie de limitacions importants, entre les que es troba la pèrdua de viabilitat de les cèl·lules en cultiu, degut a l’activació del procés de mort cel·lular programada o apoptosi. La principal causa de l’activació d’aquest tipus de mort cel·lular és l’esgotament de determinats nutrients essencials o factors de creixement i l’acumulació de metabòlits tòxics per a la cèl·lula al llarg del cultiu. L’apoptosi representa un greu inconvenient a nivell del cultiu in vitro en bioreactors, ja que disminueix dràsticament la viabilitat del cultiu i, en conseqüència, la productivitat del bioreactor. En aquest treball, s’han utilitzat cèl·lules murines d’hibridoma KB26.5 productores de la immunoglobulina IgG3, transfectades amb el gen bhrf1 i s’ha comprovat com aquesta modificació és capaç de reduir el nivell de mort per apoptosi, i garantir la supervivència de les cèl·lules durant un període on hi ha una situació d’inducció a l’apoptosi. Aquesta capacitat s’ha observat en dos sistemes de cultiu cel·lular com són el discontinu i la perfusió. Aquest últim sistema de cultiu s’ha posat en evidència que, a més de conferir una major resistència a la mort cel·lular, BHRF1 afecta al cicle cel·lular tant sols en els moments de limitació de nutrients. Aquestes observacions han portat a estudiar els efectes intracel·lulars de BHRF1 per entendre com l’expressió d’aquest gen víric era capaç de produir aquests efectes fenotípics. S’ha determinat que BHRF1 no es limita tant sols a l’aturada de l’apoptosi a nivell mitocondrial, sinó que és capaç d’influir en diverses rutes que intervenen en processos vitals per la cèl·lula. Les anàlisi realitzades amb microarrays de DNA han revelat la capacitat de BHRF1 d’induir de forma diferencial l’expressió de gens relacionats amb l’apoptosi, el cicle cel·lular, la ruta Akt/mTOR i la via de JNK. A més, estudis realitzats mitjançant PCR en temps real han indicat que, tant sols en condicions inductores de l’apoptosi, es produeix una sobreexpressió de bcl2 en les cèl·lules KB26.5 transfectades amb el gen bhrf1, indicant que hi ha una relació entre les dues proteïnes codificades per aquests gens. Per tal de veure els efectes de la sobreexpressió de bcl2 s’han utilitzat inhibidors químics específics per la proteïna Bcl-2. Com a resultat s’ha anul·lat la resistència a l’apoptosi per part d’aquelles cèl·lules amb expressió de BHRF1. La sobreexpressió de bcl2 es pot relacionar, a més, amb l’aturada observada del cicle cel·lular en la fase G1. La relació entre BHRF1 i Bcl-2 no s’ha constatat a través d’una interacció directa, ja que tant sols s’han vist interaccions de BHRF1 amb la proteïna proapoptòtica Bim i amb VRK2, relacionada amb la ruta JNK. Aquestes interaccions proteiques poden explicar la conservació de la integritat mitocondrial que s’ha observat en aquelles cèl·lules amb presència de BHRF1 i la resistència a l’apoptosi en condicions d’estrès. En aquest treball s’ha determinat també que BHRF1 és una proteïna exclusivament mitocondrial, ja que aquesta no varia la seva localització cel·lular tant en un context d’alta viabilitat cel·lular com d’apoptosi, per tant les interaccions proteiques s’han de donar a nivell del mitocondri. / Now a day the pharmaceutical industry uses the in vitro animal cell culture technology for the production of elevated therapeutic interest products as well as biological model for the assay of novel drugs. Many corporations use this technology as the best approach to obtain complex molecules. Notwithstanding there are several important drawbacks on the animal cell culture. Among them there is the loose of viability in cultured cells due to the activation of the programed cell death or apoptosis. The main origin of the apoptosis triggering is the essential nutrient or growth factors deprivation and the accumulation of harmful metabolites during the cell culture. Apoptosis represents a major inconvenient for the in vitro cell culture in bioreactors as is responsible for the dramatic cell viability reduction and consequently a decrease in productivity. The IgG3 producing murine hybridoma cells KB26.5 have been used in this thesis. These cells have been transfected with bhrf1 gene and it was checked that this particular modification was able to reduce the number of apoptotic cells and ensure cell survival in proapoptotic conditions. This ability was observed in two cell culture systems such as batch and perfusion. The later culture system clearly showed that BHRF1 directly affects to the cell cycle only in a nutrient limitation situations. These observations led to a deep study of the BHRF1 intracellular effects to understand how the expression of this gene was able to generate those phenotypical effects. It was determined that the cellular effect of BHRF1 was not only constricted to prevent the apoptosis by itself at a mitochondrial level, but also was able to influence on several essential pathways. Microarray analysis unveiled the BHRF1 capability to differentially induce gene expression related to apoptosis, cell cycle, Akt/mTOR and JNK pathways. Moreover studies using real time PCR showed, only under apoptotic conditions, an over expression of bcl2 in KB26.5 transfected cells with bhrf1 gene. This indicates that exist a relationship between both proteins. In order to see the effect of the bcl2 overexpression two chemical inhibitors for Bcl-2 were used; BHRF1 expressing cells did not exhibit apoptosis resistance. The overexpression of bcl2 can be related with G1 arrest observed under apoptotic conditions in BHRF1 expressing cells in the cell culture systems used. It was not determined a direct interaction between BHRF1 and Bcl-2, even though a direct interaction between BHRF1 and the proapoptotic protein Bim and the JNK pathway related protein VRK2 were observed. Those interactions must take place in the mitochondria as it was observed that BHRF1 was a fully mitochondrial protein.

La presente Tesis Doctoral se centra en el desarrollo de metodologías analíticas de carácter innovador para el estudio de diferentes rutas de regulación genética. Éstas nuevas técnicas de análisis se presentan como una atractiva alternativa para conseguir un diagnóstico y seguimiento de terapia del cáncer más precisos e informativos. Se propone el uso de un nuevo biosensor basado en tecnología nanofotónica como una plataforma ideal para el análisis rápido, directo y altamente sensible de dichas rutas, evitando el uso de marcadores o procesos de amplificación. Diferentes trastornos genéticos y epigenéticos asociados con la aparición y el progreso de cáncer han sido estudiados empleando ácidos nucleicos como marcadores biológicos. Para ello, se han empleado dos tipos de biosensores ópticos: (i) el conocido biosensor basado en Resonancia de Plasmón Superficial (SPR), y (ii) una nueva plataforma nanotecnológica altamente sensible basada en señales interferométricas producidas en guías de onda bimodal (biosensor BiMW). En primer lugar se ha llevado a cabo un estudio en profundidad de diversos procesos de biofuncionalización en ambas plataformas biosensoras. Se han optimizado diferentes procedimientos químicos de funcionalización de superficie de tal forma que aseguren una eficiente inmovilización de oligonucleótidos como elementos de biorreconocimiento. Esto ha permitido la detección de las secuencias diana de forma muy selectiva, ofreciendo la máxima sensibilidad y reproducibilidad posibles, especialmente para el análisis de muestras humanas complejas como son la orina o el suero. Una vez optimizadas las estrategias de biofuncionalización, se han evaluado diferentes rutas de regulación genéticas clínicamente relevantes como son los procesos de splicing alternativo, la regulación de micro-ARNs o los procesos de metilación de ADN. Todas las metodologías desarrolladas han sido evaluadas en términos de selectividad, sensibilidad y reproducibilidad, siendo validadas finalmente con el análisis de muestras reales. Las metodologías desarrolladas eluden inconvenientes críticos a los que se enfrentan normalmente las tecnologías convencionales empleadas para el estudio de estos procesos, ofreciendo protocolos más estandarizados que permiten una detección muy sensible, selectiva y con una mínima manipulación de la muestra. Este trabajo constituye el nacimiento de una nueva línea de investigación en nuestro grupo de investigación y combina nuestro amplio conocimiento en el desarrollo de innovadoras tecnologías biosensoras con nuestra gran experiencia en bioanalítica, ofreciendo finalmente herramientas de análisis muy avanzadas para la evaluación directa y efectiva de rutas de regulación genética como nuevas soluciones en el diagnóstico de cáncer y seguimiento de terapias. / This Doctoral Thesis focuses on the development of innovative biosensor devices as alternative analytical techniques for the evaluation of different gene regulating pathways in order to obtain a more informative and accurate diagnosis and follow-up therapy of cancer. We propose the use of a novel nanophotonic biosensor for a rapid, highly sensitive and direct analysis of these regulating routes without the need of labeling or amplification steps. Different genetic and epigenetic disorders associated with cancer appearance and progression are studied taking advantage of circulating nucleic acids as target biomarkers. For the label-free detection and evaluation of these biomarkers, we have employed two different optical biosensors: (i) the well-known Surface Plasmon Resonance (SPR) biosensor, and (ii) a novel nanotechnology-based interferometric device, the Bimodal Waveguide (BiMW) biosensor. First, an in-depth study of different biofunctionalization strategies on both platforms is presented. Several surface chemistry procedures have been optimized for an efficient immobilization of nucleic acids as biorecognition elements that ensure a highly sensitive target detection with maximum selectivity and reproducibility, especially for the direct analysis of complex human samples such as urine or serum. The optimized strategies were applied for the evaluation of specific and clinically relevant gene regulation pathways, such as RNA alternative splicing events, micro-RNA regulation, or DNA methylation processes. All the developed methodologies have been assessed in terms of selectivity, sensitivity and reproducibility, and in some cases, they have been validated with real samples. The obtained results overcome some of the critical drawbacks of the current methodologies employed for the analysis of such processes and offer standardized protocols for a highly sensitive and selective detection with minimal sample manipulation. The work in this Thesis has opened a new Research line in our Group and combines our wide knowledge in the development of powerful photonic biosensor technology with our bioanalytical expertise in order to offer advanced analytical tools for the direct and effective evaluation of gene regulating pathways as new solutions for cancer diagnosis and follow-up therapy

Tesi realitzada a l'Institut de Recerca Biomèdica de Barcelona (IRBB) / Cytoplasmic polyadenylation element binding proteins (CPEBs) are a family of RNA-binding proteins essential for the translational regulation of mRNAs in various biological contexts. CPEBs recognize CPE elements in the 3’ untranslated region of target mRNAs and regulate their translational fate through cytoplasmic polyadenylation. This process is especially important during meiosis, since its progression relies on the translational activation of stored maternal mRNAs. CPEB1 and CPEB4 are the two members of the family required for meiotic progression. While CPEB1 mediates the translational activation of mRNAs until metaphase I (MI), CPEB4 activates mRNAs from interkinesis to metaphase II (MII). CPEBs share a conserved RNA-binding domain and regulate overlapping mRNA subpopulations. Hence, the requirement of two distinct CPEBs to complete meiosis leans on their differential post-translational regulation. In fact, the N-terminal domain of the CPEBs is highly variable and harbours different regulatory motifs. While CPEB1 is activated by Aurora A kinase and is targeted for degradation by Cdc2 and Plk1-mediated phosphorylation, CPEB3 is controlled by monoubiquitination and SUMOylation, which regulate the transition from an inactive monomeric CPEB3 form to an active beta-amyloid-like aggregate. How the other CPEBs are post-translationally regulated is unknown. Nevertheless, unveiling how the different CPEBs are differentially regulated is crucial for understanding how they respond to different stimuli and how they are interconnected in particular scenarios of co-existence. We found that CPEB4 activity is regulated by hyperphosphorylation during the meiotic cell cycle. Specifically, CPEB4 is phosphorylated in twelve residues by two different kinases and in a phase-specific manner. All phosphorylated residues are located in the intrinsically disordered N-terminal half of CPEB4 and are required for cytoplasmic polyadenylation of target mRNAs. Accordingly, these twelve phosphorylation sites are essential for meiotic progression. Furthermore, we have shown that hyperphosphorylation of CPEB4 disordered domain modulates its aggregation properties. Hence, non-phosphorylated CPEB4 forms non-amyloid aggregates that specifically recruit and repress CPE-containing mRNAs, whereas hyperphosphorylated CPEB4 remains monomeric and is active in cytoplasmic polyadenylation. Importantly, CPEB4 aggregates are dynamic and reversible upon phosphorylation on the identified phosphosites. These results contribute greatly to the understanding of how the CPEBs are differentially regulated and how they would differentially respond in a given cellular environment. / Les CPEBs (cytoplasmic polyadenylation element binding proteins) són una família de proteïnes d’unió a ARNm essencials per a la regulació traduccional d'ARNm en diversos escenaris biològics. Les CPEBs uneixen CPEs en el 3’ UTR (untranslated region) dels l'ARNm diana i regulen la seva traducció mitjançant la poliadenilació citoplasmàtica. Aquest procés és especialment important durant la meiosi, ja que la seva progressió necessita l'activació traduccional d’ARNm materns. La CPEB1 regula la traducció d’un grup d’ARNm durant la primera divisió meiòtica, mentre que la CPEB4 ho fa durant la segona divisió. Les CPEBs comparteixen el domini d'unió a l'ARN i regulen subpoblacions d’ARNm solapants. Per tant, el fet de que es necessitin dues CPEBs durant la meiosi es deu a que es regulen diferent a nivell post-traduccional. De fet, el domini N-terminal de la CPEBs no està conservat i conté diferents motius reguladors. Mentre que la CPEB1 s’activa per Aurora A quinasa i es degrada com a conseqüència de la seva fosforilació per Cdc2 i Plk1, CPEB3 es regula per mono-ubiquitinació i SUMOilació, dues modificacions que controlen la formació d’un agregat beta-amiloide actiu en poliadenilació. Com es regula l’activitat de les altres CPEBs és desconegut. No obstant, determinar com es regulen les CPEBs és crucial per a entendre com responen a diferents estímuls i com estan interconnectades. Aquest estudi demostra que l'activitat de la CPEB4 està regulada per hiper-fosforilació. Específicament, dues quinases fosforilen la CPEB4 en dotze residus localitzats en la regió N-terminal desordenada de la CPEB4. Aquestes fosforilacions són necessàries per a l’activitat de la CPEB4 en poliadenilació citoplasmàtica i són essencials per a la progressió meiòtica. Tanmateix, hem demostrat que la hiper-fosforilació de CPEB4 modula les seves propietats d'agregació. Així, la CPEB4 no fosforilada forma agregats no amiloides que recluten i reprimeixen ARNm diana, mentre que la CPEB4 hiper-fosforilada roman monomèrica i promou la poliadenilació citoplasmàtica d’aquests ARNm. És important destacar que els agregats de CPEB4 són dinàmics i reversibles mitjançant la fosforilació dels aminoàcids identificats. Aquests resultats contribueixen a la comprensió de com es regulen les CPEBs i com respondrien diferencialment en un entorn cel·lular determinat.