Tesi realitzada a l'Institut de Ciència de Materials de Barcelona (ICMAB-CSIC) / The focus of this thesis is the use of supramolecular chemistry to functionalize polymers to obtain organic-based materials with a control of their structure and properties. The non-covalent functionalization of polymers via supramolecular chemistry is a potentially efficient route to introduce a particular property with which a new functional molecular material can be originated. This strategy has specially been explored to incorporate conjugated structures in polymeric constructs for new semiconducting materials. Although important advances have been made in this field, the incorporation of -electron functional units to polymeric backbones with well-controlled arrangement between the donor and acceptor parts is still an area of huge interest for material science. Following this idea, the supramolecular functionalization of the homopolymer poly(4-vinyl pyridine) (P4VP) with an electron donating unit based on an tetrathiafulvalene (TTF) has been explored. Tetrathiafulvalenes (TTFs) are excellent -electron donor units that are widely studied in molecular electronic applications due to their p-type character and stable doped states. Through complementary hydrogen bonding components of a derivative TTF (TTFCOOH), uniform films incorporating the redox active components have been prepared. When the films were doped using different oxidising agents, Electrostatic Force Microscopy (EFM) studies indicated that a reorganisation at the surface of the films occurred and of charges in their surfaces appeared. Once the application of the P4VP-TTFCOOH films as charge-carrier hybrid material was demonstrated, the next step was to use the block copolymer poly(styrene-b-4-vinyl pyridine) (PS-b-P4VP) due to its amphiphilic behavior. Therefore, different molar ratios of PS and P4VP blocks have been used to prepare new PS-b-P4VP-TTFCOOH thin films. The influence of the phase segregation of the PS-b-P4VP-TTFCOOH film to the charge transportation upon oxidation was performed correlating the Small-Angle X-ray Scattering (SAXS) and EFM results. On the other hand, microfluidics is a microfabrication technique that relies on the manipulation of fluids, which can be used to control the final microstructure and self-assembly of compounds, by the simple adjusting of the values of the hydrodynamic flow focusing (confinement effect). Moreover, microfluidics offers respect to the bulk conditions important advantages such as larger relation surface-to-volume, lower consumption values and a better control of the concentration gradients. The improvement of the intermolecular contact of disk-shaped C3-symmetric tris(TTF) system has been studied using microfluidics. This molecule possesses three bonded derivative TTF units through a central aromatic ring that, under determined conditions, large coiled helical fibers could be obtained by their aggregation. A de-doping process of the C3-symmetric tris(TTF) molecule has been studied using microfluidics, towards the study of the influence of the technique on the organization of this compound. Afterwards, a new characterization methodology was suggested, based on bimodal-Atomic Force Microscopy (bimodal-AFM) in order to draw a distinction between electrostatic and mechanical contributions of the coiled fibers and, corroborating that the charge transportation phenomenon occurred. Furthermore, hydrogels have been in the spotlight due to their biocompatibility in, for instance, tissue engineering applications. Then, the structural enhancement of an ionically-driven coacervated hydrogel obtained via microfluidics platform by tuning flow focusing parameters was studied. In a further step, the functionalization of this hydrogel with TTFCOOH molecules under bulk and microfluidic conditions and its charge-carrier character were also analyzed. Additionally, with the objective to immobilize the hydrogel on surfaces, micro-contact printing, technique was tested. Finally, the organization and phase segregation of the PS-b-P4VP coordinated with a metalloporphyrin system has also been approached. Porphyrins, in general, possess exceptional inherent optical and electronic properties that make them suitable for application related with solar cells. Moreover, due to their electrochemical and photophysic characteristics they can easily be modified with other functional groups. Porphyrins can be found free or complexed with metals and in both states they have self-assembly properties. The coordination between PS-b-P4VP and chiral and an achiral zinc (II) metalloporphyrin has been explored in order to study the chirality transfer from the porphyrin to the hybrid materials. In the last instance, and in an exploratory attempt to use porphyrins as molecular rotors, different strategies of surface immobilization of the porphyrin-block copolymer system were also approached by micro-contact printing.

L’objectiu principal d’aquesta tesi doctoral ha estat estudiar el mecanisme de simport de la permeasa de melibiosa, MelB, un transportador secundari d’Escherichia coli, utilitzant mètodes experimentals (fluorescència, infraroig, assajos de transport) i computacionals (simulacions de dinàmica molecular). La MelB és un exemple de transportador versàtil, que pot utilitzar tant protons, com ions sodi o liti per a transportar una varietat de sucres α i β galactòsids. La MelB és una proteïna de 473 aminoàcids estructurats en forma de 12 hèlix transmembrana amb un 70% de residus hidrofòbics. Alguns estudis anteriors han demostrat que els bucles citoplasmàtics de la proteïna són importants per a la seva funció. Per tal d’avaluar la importància dels bucles perimplasmàtics, en el present treball hem analitzat el paper del bucle perimplasmàtic 5-6 (ric en glicines), juntament amb el paper d’uns pocs residus als extrems de les dues hèlix que connecta el bucle, la V i al VI, per mutagènesi dirigida. Els experiments de fluorescència (FRET) i d’infraroig (FTIR) han demostrat que les mutacions puntuals produeixen un efecte intermedi (50%) en la unió de substrats al transportador, exceptuant (i) els mutants Asp35 i Arg175/Asp35, que no uneixen substrat i (ii) els mutants Asn168 (bucle 5-6) i Phe177 (hèlix VI), que afecten en un grau elevat (més del 50%) la unió dels substrats. L’aproximació computacional ha permès concloure que alguns residus, com la Leu164 (hèlix V), l’Asn168 i la Phe177 juguen un paper important en el manteniment de la forma parcialment oclosa, interaccionant amb la meitat C-terminal de la proteïna. A més també s’han analitzat el paper de les interaccions iòniques. La informació obtinguda dels estudis de dinàmica molecular s’ha enriquit a partir de la troballa i descripció, per primera vegada, d’una forma de la proteïna oberta a l’exterior, resultat d’una trajectòria de 250 ns a partir de l’estructura cristal·logràfica. Els resultats indiquen que els residus Asp35, Asn168 i Phe177 tenen un paper important en el mecanisme de transport de la permeasa de melibiosa d’E. Coli. / The main aim of this doctoral thesis was to study the symport mechanism of the secondary transporter, melibiose permease (MelB) from Escherichia coli using experimental (Fluorescence, Infrared and transport assays) and computational (Molecular dynamics simulation) methods. This prokaryotic transporter is a versatile example of a cation-substrate cotransport carrier. A remarkable feature of this carrier is that, it uses different cations such as proton, Na+ or Li+ to transport variety of - and - galactosides. MelB is a protein of 473 amino acids arranged in 12 transmembrane helices with 70% of hydrophobic residues. Previous studies have shown the importance of cytoplasmic loops in MelB. Thus, in this study we analyzed the role of glycine rich periplasmic loop 5-6 along with few residues at the end and beginning of Helix V/VI, Asp-35 in Helix I by cysteine mutagenesis. Fluorescence (FRET) and infrared (FTIR) difference spectroscopy experiments have shown that the generated point mutations resulted in an intermediate (50%) effect on substrate binding, except for (i) the mutants Asp-35 and Arg-175/Asp-35, which did not exhibit any substrate binding, (ii) the mutants Asn-168 (loop 5-6) and Phe-177 (Helix VI), which had a high effect on substrate binding. The computational approach has pointed out that some of the residues, such as Leu-164 (Helix V), Asn-168, and Phe-177 play a significant role in maintaining the outward partially occluded conformation of MelB by interacting with the other half of the transmembrane helices, the C-terminal helical bundle. Furthermore, we also analyzed the role of ionic lock residues in MelB. The information derived from the molecular dynamics analysis has taken advantage of the description, for the first time, of an outward-open structure resulting from the crystallographic structure in a 250 ns trajectory. The results indicate that residues Asp-35, Asn-168 and Phe-177 have an important structural role in the transport mechanism of MelB.

Tesi realitzada al Servei de Bioquímica i Genètica Molecular del Hospital Clínic / Los trastornos lisosomales y la aciduria glutárica tipo I son las enfermedades objeto de este estudio. Dichas enfermedades, pertenecen al numeroso grupo de enfermedades metabólicas hereditarias (EMH) y tienen en común la deficiencia de una enzima y la consiguiente acumulación del sustrato que al no poderse metabolizar resulta tóxico para la célula. En general, estas enfermedades presentan afectación neurológica, debutan en los primeros años de vida y son devastadoras, tanto para el paciente como para su entorno familiar. En la actualidad, la mayoría de tratamientos disponibles son paliativos o bien no tienen un efecto significativo sobre la afectación neurológica. En este trabajo nos hemos propuesto desarrollar y aplicar diferentes estrategias terapéuticas, bajo diferentes enfoques moleculares, para poder aportar nuevas herramientas en el tratamiento de estas enfermedades. Para ello se han cribado compuestos de bajo peso molecular capaces de atravesar la barrera hematoencefálica para poder, si procede, tratar la afectación neurológica. Nos hemos centrado en el desarrollo de tres aproximaciones diferentes: el uso de terapias con agentes antioxidantes, el uso de chaperonas farmacológicas y el uso de compuestos activadores de la sobrelectura de codones de terminación prematuros (PTCs). Hemos demostrado que el tratamiento con diferentes antioxidantes (coenzima Qio o un cóctel de tocoferol, ácido lipoico y N-acetilcisteina) es capaz de rescatar ciertos parámetros bioquímicos característicos del síndrome de Sanfilippo en fibroblastos de pacientes con esta enfermedad. Por lo tanto, esta aproximación terapéutica podría mejorar la sintomatología de dichos pacientes. Hemos desarrollado un método de cribado de chaperonas farmacológicas para la aciduria glutárica tipo I, que nos ha permitido identificar un posible hit. Se ha validado su efectividad mediante estudios in vitro y en fibroblastos de pacientes con esta enfermedad y se ha confirmado su eficacia en una de las mutaciones más prevalentes en población española (p.Val400Met). Además, hemos colaborado en la creación y validación de un modelo neuronal derivado de células iPS para la enfermedad de Gaucher tipo II (forma neuronopática) y se ha comprobado la efectividad del tratamiento con chaperonas farmacológicas en este nuevo modelo celular mediante el uso de análogos de Nojirimicina. La obtención de estas células iPS permitirá a la comunidad científica tener acceso a un modelo celular neuronal de la enfermedad de Gaucher. Hemos identificado diferentes líneas celulares de pacientes con distintas enfermedades lisosomales, causadas por mutaciones “nonsense”, que responden al tratamiento con compuestos que inducen la sobrelectura de PTCs. En colaboración con otros grupos, hemos puesto a punto un método de cribado de pequeñas moléculas capaces de promover la sobrelectura de PTCs y hemos probado los diferentes hits resultantes en las diferentes líneas celulares previamente seleccionadas. De los más de 62.000 compuestos cribados, únicamente uno demostró restaurar los parámetros bioquímicos alterados en las enfermedades lisosomales de estudio: Bicalutamide. Este compuesto es un anti-androgénico utilizado para el tratamiento de cáncer de próstata que se ha relacionado recientemente con el mecanismo de autofagia. El estudio molecular de su mecanismo de acción nos ha permitido determinar que la restauración de los parámetros bioquímicos alterados después del tratamiento con Bicalutamide era debida a un incremento del flujo autofágico y de la exocitosis lisosomal, determinado por la activación del factor de transcripción TFEB. Este descubrimiento nos ha conducido a la realización de una patente de uso del compuesto Bicalutamide y sus derivados para el tratamiento de enfermedades lisosomales (WO 2015/097088 A1). En resumen, en este trabajo se han desarrollado diferentes estrategias terapéuticas mediante diferentes enfoques moleculares que conforman una primera aproximación para el tratamiento de la afectación neurológica de distintas EMH. Se han identificado dos nuevos compuestos procedentes de librerías de reposicionamiento que han demostrado restaurar parcialmente los parámetros bioquímicos alterados. Estos compuestos podrían ser útiles para el tratamiento de las enfermedades objeto de este estudio, tanto a nivel sistémico como neurológico. Sin embargo, previamente se deberá validar la eficacia de los compuestos identificados en modelos animales. / Lysosomal storage disorders (LSDs) and glutaric aciduria type I (AG-I) are inherited metabolic disorders that arise from the deficiency of an enzyme and the subsequent accumulation of its substrate which is harmful for the cell. Most of these diseases present neurological involvement and start during the first years of life being devastating for both, patients and relatives. Nowadays, most of the available treatments are palliative or have no significant effect in the neurological involvement. In this study, we have developed and applied different therapeutic strategies in order to provide new tools for the treatment of these diseases, focusing particularly in targeting the neurological involvement: use of antioxidants, pharmacological chaperones (PCs) and readthrough compounds. We have demonstrated that treatment with antioxidants (coenzyme Qio or a cocktail with tocopherol, lipoic acid and N-acetylcystein) is able to restore the biochemical alterations in fibroblasts derived from Sanfilippo patients. Thus, this therapeutical approach could ameliorate Sanfilippo's patient phenotype. We have developed a high throughput screening methodology to identify possible PCs for the AG-I. We have validated hits effectiveness using in vitro and primary AG-I patient's cell models and confirmed the chaperone activity of one compound in the most prevalent missense mutation in the Spanish population. Moreover, we have validated a neuronal cell model for Gaucher disease created using iPS cells and proved the effectiveness of already described PCs in this cell type, providing a new neurological model for Gaucher disease to the scientific community. We have identified different cell lines derived from patients with nonsense mutations affected by different LSDs responsive to a readthrough treatment. These cell lines have allowed us to validate possible hits resulting from a HTS performed in collaboration with other groups. Only one compound, Bicalutamide, was able to restore the biochemical alterations observed in patients' fibroblasts. Bicalutamide is an anti-androgenic drug used for the treatment of prostate cancer that has been recently related to the autophagy mechanism. Studying its molecular role, we have elucidated that Bicalutamide acts through the activation of the transcription factor TFEB which in turn induces the autophagy and exocytosis fluxes, removing the lysosomal pathogenic accumulation. We have patented its use in LSDs (WO 2015/097088 Al). In conclusion we have developed different therapeutic strategies through different molecular approximations for the treatment of both, the systemic and neurological involvement of the studied diseases. The discovery of these new drugs has to be validated in animals' models.

El déficit hídrico se ha convertido un una gran amenaza hacia la producción agrícola en todo el mundo. La identificación de nuevos actores en la respuesta al estrés por sequía en plantas cultivables es vital para entender su adaptación a crecientes cambios ambientales. El ácido abscísico (ABA) es una hormona vegetal que media las respuestas adaptativas a la sequía, como la dormancia de semillas, el cierre estomático y la detención del crecimiento de la raíz. En el caso de la regulación estomática, el ABA activa la quinasa OST1, que a su vez fosforila diferentes sustratos, por ejemplo NADPH oxidasas, canales iónicos y factores de transcripción, lo que al final conducirá al cierre estomático. Aunque el cierre estomático en respuesta a ABA es esencial para evitar la desecación y, por lo tanto, la muerte de la planta, se debe mantener un cierto nivel de conductividad estomática para permitir el intercambio de gases y la transpiración, esencial para la captación de agua y solutos a través de las raíces. Hemos identificado y caracterizado un nuevo posible factor de transcripción dedo de zinc de tipo C2H2, homólogo a la proteína de Arabidopsis Sensitive to Proton Rhizotoxicity (STOP)1, la cual es crítica para la tolerancia a aluminio y protones en suelos ácidos. Hemos determinado que ZmSTOP1 es una proteína muy bien conservada entre especies, especialmente en sus cuatro dominios de tipo dedo de zinc, los cuales son característicos de las proteínas de tipo STOP1 en las plantas. ZmSTOP1 es miembro de una familia de cinco proteínas tipo STOP1 en maíz. Presenta localización nuclear y tiene la capacidad de unir ADN, aunque no se han podido identificar dianas específicas. En este trabajo mostramos cómo ZmSTOP1 complementa el fenotipo característico de AtSTOP1 en condiciones de pH ácido. Además, detectamos que la sobreexpresión de ZmSTOP1 promueve una respuesta diferencial a ABA en raíces y hojas. El crecimiento de raíces está sobre inhibido, mientras que los estomas presentan insensibilidad a la señal de ABA, permaneciendo más abiertos que el control tras un tratamiento con ABA. Utilizando un análisis por microarray hemos podido determinar que los genes afectados por ZmSTOP1 se clasifican principalmente en señalización, regulación de la transcripción y estrés. Su sobreexpresión promueve cambios en el patrón de expresión de varios genes importantes para la homeostasis iónica y la señalización celular, como el canal de potasio KT2/3, el transportador de calcio CAX7, la NADPH oxidasa RBOHD, o la ATPasa de protones de membrana plasmática HA2, y puede inducir la expresión ectópica de estos genes en raíces u hojas. La desregulación de estos genes puede afectar el comportamiento global de la planta ante condiciones de estrés por sequía, ya que los efectos del ABA dependen profundamente en la homeostasis iónica, pudiendo representar una posible explicación para los fenotipos observados. Adicionalmente, hemos establecido que esta proteína es interactor y sustrato de la quinasa OST1. La fosforilación por parte de esta quinasa modula el efecto de ZmSTOP1 en la regulación estomática. En resumen, con la caracterización de la proteína ZmSTOP1 hemos arrojado luz sobre la compleja red que regula la tolerancia a estrés en una planta crucial para el consumo humano y animal como es el maíz. Estos resultados pueden ser importantes para enfocar futuras mejoras genéticas de la planta, ya sea por ingeniería genética o mediante mejora clásica. / Water deficit has become a very important threat to agricultural yield worldwide. The identification of new players in drought stress response among crop plants is vital to understand their adaptation to increasing environmental challenges. Abscisic acid (ABA) is a plant hormone known to mediate drought adaptative responses such as seed dormancy, stomatal closure and root growth arrest. In the case of stomatal regulation, ABA drives the activation of OST1 kinase, which phosphorylates different substrates, for example NADPH oxidases, ionic channels and transcription factors, which will finally lead to stomatal closure. Although stomatal closure in response to ABA is essential to avoid desiccation, and thus, the death of the plant, a certain level of stomatal conductivity must be maintained to permit gas exchange and transpiration, essential to drive water and solutes uptake through the roots. We identified and characterized a new maize C2H2 zinc-finger putative transcription factor that presents homology to the Arabidopsis Sensitive to Proton Rhizotoxicity (STOP)1, which is critical for aluminum and proton tolerance in acidic soils. We determined that ZmSTOP1 is a well-conserved protein between plant species, especially in its four zinc-finger domains, which are characteristic of the STOP1-like proteins in plants. ZmSTOP1 is one of a five-members family of STOP1-like proteins in maize. It localizes in the nucleus, and has the ability to bind DNA, though no specific DNA targets were identified. In this work we show how ZmSTOP1 can complement AtSTOP1 phenotype in low pH conditions. Moreover, we detected that ZmSTOP1 overexpression promotes a differential response to ABA in roots and shoots. Root growth is over-inhibited whereas stomata present insensitivity to the ABA signal, remaining more open than the wild type after ABA treatment. Through microarray analyses we determine that the genes affected by ZmSTOP1 are classified mainly in signaling, regulation of transcription and stress. Its overexpression promotes changes in the expression pattern of several genes that are important for ionic homeostasis and signaling in cells, like the potassium channel KT2/3, the calcium transporter CAX7, the NADPH oxidase RBOHD, or the plasma membrane proton pump ATPase HA2, and it can induce ectopic expression of these genes in roots or shoots. The deregulation of these genes can affect the global behavior of the plant before drought stress conditions, as ABA effects depend deeply on ionic homeostasis, and could represent a possible explanation for the phenotypes observed. Additionally, we established that this protein is an interactor and a substrate of OST1 kinase. The phosphorylation by this kinase modulates ZmSTOP1 effect on stomatal regulation. In summary, by characterizing ZmSTOP1 protein we have shed light into the complex network regulating drought tolerance in a crucial plant for human and animal consumption like maize. These results can be important for focusing further genetic improvement of the plant, by either genetic engineering or classic breeding.

Mycoplasma genitalium és un patogen de transmissió sexual emergent. Aquest bacteri sense paret cel·lular causa uretritis, a més d’altres malalties inflamatòries genitals. Aquest microorganisme utilitza adhesines especialitzades i localitzades a l’organela terminal per adherir-se a cèl·lules hoste i altres superfícies. L’organela terminal, que també es troba involucrada en la motilitat cel·lular, és una estructura polar sostinguda internament per un citosquelet. Al primer capítol, s’ha dissenyat una soca mutant de M. genitalium deficient per a la proteïna MG491 que mostra una desestabilització general de les proteïnes involucrades en l’organització de l’organela terminal. Aquest mutant exhibeix sorprenents similituds amb el mutant defectiu per a la proteïna MG218, aïllat prèviament. Després de la introducció d’una còpia extra d’MG_318 a les dues soques, la quantitat d’adhesines va augmentar considerablement. Aquestes soques es van caracteritzar per microcinematografia, microscòpia de fluorescència i criomicroscòpia electrònica, revelant la presència de cèl·lules i filaments mòtils en absència de diverses proteïnes que s’havien considerat essencials per a l’adhesió i el moviment. Aquests resultats indiquen que els complexes d’adhesines juguen un paper important en la maquinària mòtil de M. genitalium i demostren que el fragment central del citosquelet no és el motor molecular que propulsa les cèl·lules de micoplasma. Aquestes soques contenen una versió minimitzada de la maquinària mòtil aportant un valuós model per investigar les característiques d’adhesió i motilitat d’aquest patogen humà. L’estructura cristal·lina de la proteïna MG491 ha sigut recentment determinada. La molècula de MG491 és un tetràmer que presenta una organització única com a dímer d’heterodímers estructurals. Aquest ordenament asimètric resulta en dos interfases molt diferents, aspecte que explica la formació de només el 50% dels ponts disulfur entre els residus Cys87 de les diferents subunitats. A més, s’ha caracteritzat in vitro la interacció entre el C-terminal de MG491 i el domini EAGR de la proteïna MG200. Al segon capítol, s’han dissenyat soques de M. genitalium amb mutacions en residus clau en l’organització de MG491. Aquestes soques mutants preserven nivells normals de totes les proteïnes de l’organela terminal, però mostren greus alteracions en la motilitat. Els resultats d’aquest treball indiquen que la proteïna MG491 està involucrada en l’estabilitat i ancoratge de l’organela terminal de M. genitalium i juga un paper important en la motilitat cel·lular. Al tercer capítol, s’ha desenvolupat un nou mètode per quantificar la capacitat d’hemadsorció de soques de micoplasma. Aquesta capacitat tradicionalment s’ha investigat determinant la capacitat d’unió d’aquestes cèl·lules a eritròcits i és un tret distintiu àmpliament examinat quan s’estudien soques de micoplasma. Tot i que els protocols per determinar qualitativament l’hemadsorció o hemaglutinació de micoplasmes són molt directes, els mètodes actuals per mesurar de forma quantitativa l’hemadsorció són cars i poc reproduïbles. Utilitzant citometria de flux, s’ha desenvolupat un procediment per quantificar ràpidament i de forma acurada l’activitat d’hemadsorció de soques de micoplasma en presència de SYBR Green I, un fluorocrom vital que tenyeix els àcids nucleics, permetent resoldre els eritròcits i els micoplasmes per mida i fluorescència. Aquest mètode és reproduïble, permet l’anàlisi cinètica de les dades obtingudes i la quantificació precisa de l’hemadsorció basada en paràmetres d’unió estàndards com la constant de dissociació Kd. Aquest procediment pot ser implementat fàcilment en un assaig estàndard per testar l’activitat d’hemadsorció del creixent número d’aïllats clínics i soques mutants de diferents espècies de micoplasma, proporcionant dades valuoses sobre la virulència d’aquests microorganismes. / Mycoplasma genitalium is an emerging human sexually transmitted pathogen. This cell-wall less bacterium causes urethritis and other genital inflammatory diseases. This microorganism uses specialized adhesins located at the terminal organelle to adhere to host cells and surfaces. The terminal organelle is a polar structure protruding from the main cell body that is internally supported by a cytoskeleton and also has an important role in cell motility. In the first chapter, we have engineered a M. genitalium null mutant for MG491 protein showing a massive downstream destabilization of proteins involved in the terminal organelle organization. This mutant strain exhibited striking similarities with the previously isolated MG_218 null mutant strain. Upon introduction of an extra copy of MG_318 in both strains, the amount of main adhesins dramatically increased. These strains were characterized by microcinematography, fluorescent microscopy and cryo-electron microcopy, revealing the presence of motile cells and filaments in the absence of many proteins previously considered essential for cell adhesion and motility. These results indicate that adhesin complexes play a major role in the motile machinery of M. genitalium and demonstrate that the rod element of the cytoskeleton core is not the molecular motor propelling mycoplasma cells. These strains containing a minimized version of the motile machinery also provide a valuable cell model to investigate the adhesion and gliding properties of this human pathogen. The crystal structure of M. genitalium MG491 protein has been recently determined. The MG491 molecule is a tetramer presenting a unique organization as a dimer of structural heterodimers. The asymmetric arrangement results in two very different intersubunit interfaces, which can explain the formation of only 50% of the disulphide bridges between Cys87 residues. Furthermore, it has been characterized the in vitro interaction between MG491 C-terminal and the EAGR domain from MG200 protein. In the second chapter, we have engineered M. genitalium cells with mutations in key residues for MG491 organization. These mutants present drastic alterations in motility, while preserving normal levels of terminal organelle proteins. The results in this work indicate that MG491 protein is involved in the stability and anchoring of the M. genitalium terminal organelle and plays a particular role in gliding motility. In the third chapter, we have developed a new method to quantify the hemadsorption activity of mycoplasma strains. Attachment activity of mycoplasma cells has been traditionally investigated by determining their hemadsorption ability to red blood cells and it is a distinctive trait widely examined when characterizing the different mycoplasma species. Despite the fact that protocols to qualitatively determine the hemadsorption or hemagglutination of mycoplasmas are straightforward, current methods when investigating hemadsorption at the quantitative level are expensive and poorly reproducible. By using flow cytometry, we have developed a procedure to quantify rapidly and accurately the hemadsorption activity of mycoplasmas in the presence of SYBR Green I, a vital fluorochrome that stains nucleic acids, allowing resolving erythrocyte and mycoplasma cells by their different size and fluorescence. This method is very reproducible and permits the kinetic analysis of the obtained data and a precise hemadsorption quantification based on standard binding parameters such as the dissociation constant Kd. The procedure we developed could be easily implemented in a standardized assay to test the hemadsorption activity of the growing number of clinical isolates and mutant strains of different mycoplasma species, providing valuable data about the virulence of these microorganisms.

La Mucopolisacaridosi tipus IIIB (MPSIIIB) és una malaltia minoritària d’acumulació lisosòmica, d’herència autosòmica recessiva, causada per la deficiència de l’enzim α-N-acetilglucosaminidasa (NAGLU), implicat en la via de degradació del glicosaminoglicà (GAG) Heparan Sulfat (HS). Aquesta pèrdua d’activitat comporta una acumulació progressiva de HS intralisosòmic que finalment dóna lloc a la disfunció i mort cel·lular. La MPSIIIB és principalment una malaltia neurodegenerativa amb una lleu afectació somàtica, en comparació amb d’altres malalties d’acumulació lisosòmica. Després d’un primer període asimptomàtic durant els primers mesos de vida, la malaltia es caracteritza per una fase inicial entre el primer i quart any de vida amb alentiment del desenvolupament mental. Aquesta fase és seguida per l’aparició de problemes de comportament severs conjuntament amb un deteriorament intel·lectual que s’inicia al voltant del tercer o quart any de vida. Finalment, amb l’aparició de demència severa, els problemes de comportament comencen a desaparèixer i les funcions motores inicien un alentiment progressiu, que finalment resulta en una pèrdua total de locomoció, disfàgia i lesions en el sistema piramidal. La mort se sol produir entre la segona i tercera dècada de vida, tot i que formes més lleus de la malaltia presenten una evolució més lenta amb esperances de vida més llargues. Actualment no hi ha cap tractament específic ni efectiu per la MPSIIIB. Totes les teràpies i tractaments actuals estan basats en el control simptomàtic i en la millora de la qualitat de vida dels pacients i de l’entorn familiar. Per aquesta raó, i degut a l’absència de teràpies eficaces, es fa necessari el desenvolupament de noves estratègies terapèutiques per al tractament de la malaltia. La teràpia gènica in vivo basada en l’administració de vectors virals derivats dels virus adenoassociats (AAV) ofereix una alternativa atractiva per al tractament de malalties minoritàries d’origen genètic com la MPSIIIB. D’una banda, les estratègies de teràpia gènica basades en vectors virals AAV han mostrat resultats prometedors com a eina per a la transferència gènica in vivo. D’altra banda, aquestes estratègies també han mostrat expressió a llarg termini en models animals de malalties així com també en pacients afectats de malalties genètiques després d’una única administració del vector. Per tant, i degut a la seva baixa immunogenicitat, a la seva expressió a llarg termini i al fet que poden transduir cèl·lules quiescents, els vectors virals AAV es presenten com a bons candidats per al tractament de malalties genètiques amb afectació del Sistema Nerviós Central (SNC). Entre tots els vectors AAV identificats i caracteritzats, aquells derivats del serotip 9 (AAV9) es caracteritzen per presentar un ampli tropisme. L’administració d’aquest serotip directament al Líquid Cefaloraquidi (LCR) ha demostrat ser eficaç en transduir diferents tipus cel·lulars del SNC juntament amb una àmplia distribució. A més, part del vector administrat al LCR pot passar a circulació sanguínia i transduir el fetge, entre d’altres teixits, donant lloc a l’expressió del transgèn no només al SNC, sinó que també a nivell somàtic. Per tant, en la present tesi doctoral s’ha desenvolupat una estratègia de teràpia gènica centrada en l’administració al LCR d’un AAV9 codificant per la proteïna NAGLU murina (AAV9-mNAGLU), amb la finalitat de tractar la patologia neurològica i somàtica característiques de la MPSIIIB. Una única administració del vector viral AAV9-mNAGLU a la cisterna magna de ratolins models de la MPSIIIB, va donar lloc a una àmplia transducció del SNC i del fetge, que alhora es va traduir en un augment en els nivells d’activitat NAGLU en aquest òrgans i en la correcció de la patologia neuronal i somàtica. A nivell del SNC, l’augment d’activitat enzimàtica NAGLU en els ratolins MPSIIIB tractats va donar lloc a la normalització del contingut de GAGs del cervell. També es van corregir els signes de neuroinflamació característics d’aquest model animal, amb la desaparició de l’astrocitosi i la microgliosi al cervell dels ratolins MPSIIIB tractats. També es va dur a terme un estudi d’expressió gènica del cervell, el qual va permetre observar una desregulació en l’expressió gènica de gens implicats en la immunitat innata, l’estrès oxidatiu i la funció lisosòmica, entre d’altres, al cervell dels ratolins MPSIIIB no tractats. El tractament amb AAV9-mNAGLU va donar lloc a la normalització de l’expressió de la majoria dels gens diferencialment expressats, fent similars els perfils d’expressió gènica entre ratolins MPSIIIB tractats i ratolins control sans (ratolins WT). Aquests resultats van proporcionar una prova més de l’eficàcia terapèutica d’aquesta aproximació de teràpia gènica. A nivell somàtic, l’enzim NAGLU produït al fetge de ratolins MPSIIIB tractats va donar lloc a un augment de l’activitat NAGLU circulant, fent accessible l’enzim a la resta d’òrgans i teixits somàtics. Alhora, aquest augment d’activitat NAGLU circulant va permetre la normalització del contingut en GAGs de la majoria d’òrgans i teixits analitzats. A banda d’aquest efecte, el tractament amb el vector viral AAV9-mNAGLU també va comportar una normalització de les alteracions de comportament característiques de la malaltia així com també un augment significatiu de la supervivència dels ratolins MPSIIIB tractats d’ambdós sexes. Demostrada l’eficàcia del tractament en ratolins MPSIIIB, es va avaluar la translacionabilitat de l’aproximació terapèutica en models animals més grans. Gossos Beagle adults van ser utilitzats per a aquesta finalitat, ja que la mida del cervell d’aquests és molt similar a la mida dels pacients humans en edat pediàtrica a qui aniria destinada una possible teràpia. Es va administrar el vector viral AAV9 codificant per la proteïna NAGLU canina (AAV9-cNAGLU) al LCR de 4 gossos sans, de tal manera que es va poder observar una producció i secreció elevada i estable de l’enzim NAGLU actiu al LCR, sense signes de toxicitat associada. Un percentatge elevat de la població humana és seropositiva per anticossos neutralitzants (NAbs) contra la càpsida proteica dels vectors virals AAV9. La presència de NAbs circulants podria suposar l’eliminació del vector viral de la circulació sanguínia abans de transduir cap tipus cel·lular, limitant així l’eficàcia terapèutica del tractament proposat. Degut a aquest fet, també es va utilitzar el model caní per tal d’avaluar l’efecte de la immunitat preexistent sobre els nivells d’activitat NAGLU mesurats al LCR. Els resultats van mostrar com després de l’administració intracisterna del vector AAV9-cNAGLU, els nivells d’activitat en LCR es mantenien elevats i constants a llarg termini independentment de la presència d’elevats títols circulants de NAbs. Conjuntament, els resultats van mostrar l’eficàcia terapèutica de l’administració al LCR de vectors AAV9 codificants per la proteïna NAGLU i la translacionabilitat d’aquesta aproximació cap a models animals de major mida, així com també la persistència d’activitat al LCR independentment de la presència de NAbs circulants contra la càpsida del vector viral. Per tant, l’aproximació de teràpia gènica descrita en aquest treball pot esdevenir un possible tractament, no només per a la MPSIIIB, sinó que també per a altres malalties d’acumulació lisosòmica amb afectació del SNC. / Mucopolysaccharidosis type IIIB (MPSIIIB) is a rare Lysosomal Storage Disease (LSD) caused by the lack of the α-N-acetylglucosaminidase (NAGLU) activity, an enzyme involved in the stepwise degradation of the Glycosaminoglycan (GAG) Heparan Sulfate (HS). This leads to a pathological accumulation of HS in the lysosomes of cells that ultimately results in cell dysfunction and/or death. MPSIIIB is mainly a neurodegenerative disease, and has a mild somatic involvement compared with other LSDs. After an initial asymptomatic period during the first few months of life, the disease manifests between the first and fourth year with slowing of mental development. This is followed by severe behavioral problems along with intellectual impairment during the second phase, which starts around the third or fourth year of life. Finally, with the onset of severe dementia, behavioral alterations begin to disappear and a progressive impairment of motor functions starts, which ultimately results in a total loss of locomotion, dysphagia and pyramidal system lesions. Death usually occurs between the second and third decades of life, although milder forms of the disease with slower progression and longer life expectancies have been described. There is currently no effective treatment for MPSIIIB. All available therapies and treatments are symptomatic and aimed at improving the quality of life of patients and their families. For this reason, it is necessary to develop new therapeutic strategies for this disease. In this regard, in vivo gene therapy based on the administration of adeno-associated viral vectors (AAV) offers an attractive alternative for the treatment of rare genetic diseases such as MPSIIIB. On the one hand, strategies based on AAV gene therapy have shown promising results as a tool for gene transfer in vivo. On the other hand, these strategies have showed long term expression in animal models as well as in patients affected of genetic diseases after a single vector administration. In addition, and due to their low immunogenicity, their long-term expression and their ability to transduce different cell types in the brain, AAV vectors are good candidates for the treatment of genetic diseases with CNS involvement. Among all the AAV serotypes described and characterized so far, those derived from serotype 9 (AAV9) show a broad tropism. Administration of AAV9 directly to the cerebrospinal fluid (CSF) results in transduction of different cell types in the CNS with a widespread distribution. Moreover, after its passage through the CNS, part of the vector reaches the bloodstream, resulting in transduction of the liver and other somatic tissues, allowing transgene expression not only in the CNS but also in the periphery. Therefore, the aim of the present Doctoral Thesis was to develop a therapeutic strategy based on the intra-CSF delivery of an AAV9 vector coding for murine NAGLU (mNAGLU) to treat both CNS and somatic MPSIIIB pathology. A single intra-CSF administration of AAV9-mNAGLU viral vector to MPSIIIB male and female mice resulted in a broad transduction of CNS and liver which led to an increase of NAGLU activity above normal levels in those organs and correction of neurologic and somatic pathology. At a CNS level, the restoration of NAGLU activity in MPSIIIB-treated mice lead to normalization of the content of GAGs in the brain. AAV9-mNAGLU administration also completely corrected all signs of neuroinflamation characteristic of this animal model, with disappearance of astrocytosis and microgliosis in MPSIIIB-treated mice. Moreover, the AAV9 treatment also normalized brain lisosomal homeostasis as reflected by the normalization of the activities of other lisosomal enzymes. Gene expression analysis were performed on whole brain and revealed a dysregulation of gene expression of genes related to innate immunity, lisosomal functions and oxidative stress in untreated MPSIIIB. Interestingly, a representative group of up-regulated genes (~50%) were related to microglia, indicating the critical role of this cellular type in the development of the disease. Treatment with AAV9-mNAGLU normalized gene expression of the majority of these deregulated genes, so that the expression profile of AAV9-treated MPSIIIB mice resembled that of healthy WT littermates, providing further evidence of the therapeutic efficacy of the approach. At a somatic level, the NAGLU enzyme produced by the liver led to increased NAGLU circulating activity, making the enzyme available for all the affected organs and tissues. This led to the normalization of GAG content in most of the somatic organs and tissues analyzed. Intra-CSF AAV9-mNAGLU administration also normalized typical behavioral deficits observed in MPSIIIB untreated mice and increased survival both in males and females. Once the efficacy of the AAV9 treatment was demonstrated in the mouse model, we evaluated the feasibility of the approach in a larger animal model. Healthy adult Beagle dogs were used for this purpose, since the brain of dogs is closer in size to that of the human pediatric patients who are the target of this therapy. A high and stable production and secretion of active NAGLU was documented in the CSF of dogs that received an intracisternal administration of AAV9 vectors coding for the canine NAGLU, in the absence of any signs of toxicity. In addition, due to the fact that a high percentage of the human population is seropositive for neutralizing antibodies (NAbs) against the AAV9 capsid proteins, which could potentially limit the efficacy of the treatment by clearing the vector from the circulation before it enters any cell, we also evaluated the effect of pre-existing immunity on the levels of NAGLU activity measured in the CSF. The results showed that the levels of enzymatic activity achieved in the CSF were the same regardless of the presence of high NAbs titers in serum prior to the treatment. Together, these results demonstrate the efficacy of intra-CSF AAV9-mNAGLU delivery in correcting MPSIIIB disease and the scalability of the approach to larger animal models, as well as the lack of effect of pre-exiting immunity on CNS efficacy when the vector is delivered directly to the CSF. Thus, the therapeutic approach described herein may become a possible treatment not only for MPSIIIB, but also for other LSDs with CNS involvement.

L'obesitat augmenta el risc i empitjora el pronòstic de moltes malalties. No obstant això, l'obesitat en sí no condueix necessàriament a aquestes comorbiditats. La disfunció del teixit adipós, l'acumulació de greix ectòpic i la desregulació del metabolisme dels àcids grassos (AG) en l’adipòcit semblen jugar un paper important en la determinació del risc d'un individu de desenvolupar comorbiditats. És per això que seria de gran interès estudiar els mecanismes relacionats amb la desregulació del metabolisme dels AG en el teixit adipós durant el desenvolupament de l'obesitat per tal de millorar el coneixement de la fisiopatologia de l'obesitat. Per tant, es va proposar la hipòtesi que l'expressió de gens i factors de transcripció implicats en la regulació del metabolisme d'AG podria estar alterada en pacients obesos, i que aquesta alteració podria estar relacionada amb la disfunció del teixit adipós. En conseqüència, l'objectiu principal va ser investigar les vies relacionades amb el metabolisme dels AG en el teixit adipós subcutani (SBC) i visceral (VSC) de dones obeses. Amb aquesta finalitat, es va avaluar l'expressió de gens clau involucrats en el metabolisme dels AG en mostres de SBC i VSC en una extensa cohort de dones obeses (145 obeses mòrbides (IMC>40 kg/m2) i 55 obeses moderades (IMC 30-38 kg/m2)) i en 35 dones controls (IMC<25 kg/m2) mitjançant RT-qPCR i Western Blot. La troballa més rellevant va ser que l'expressió dels principals gens involucrats en la lipogènesi va ser significativament menor en les dones obeses comparat amb les controls en el teixit SBC, mentre que en el VSC l'expressió va ser similar. A més, els nostres resultats indiquen que, durant el desenvolupament de l'obesitat, hi ha una disminució progressiva en la lipogènesi en el SBC, suggerint que aquest teixit podria tenir un mecanisme de defensa contra l'excés d'acumulació d'AG. / La obesidad aumenta el riesgo y empeora el pronóstico de muchas enfermedades. Sin embargo, la obesidad en sí no conduce necesariamente a estas comorbilidades. La disfunción del tejido adiposo, la acumulación de grasa ectópica y la desregulación del metabolismo de los ácidos grasos (AG) en el adipocito parecen jugar un papel importante en la determinación del riesgo de un individuo de desarrollar comorbilidades. Es por ello que sería de gran interés estudiar los mecanismos relacionados con la desregulación del metabolismo de los AG en el tejido adiposo durante el desarrollo de la obesidad con el fin de tener un mejor conocimiento de la fisiopatología de la obesidad. Por lo tanto, se propuso la hipótesis de que la expresión de genes y factores de transcripción implicados en la regulación del metabolismo de AG podría estar alterada en pacientes obesos, y que esta alteración podría estar relacionada con la disfunción del tejido adiposo. En consecuencia, el objetivo principal fue investigar las vías relacionadas con el metabolismo de los AG en el tejido adiposo subcutáneo (SBC) y visceral (VSC) de mujeres obesas. Con ese fin, se evaluó la expresión de genes clave involucrados en el metabolismo de los AG en muestras de SBC y VSC en una extensa cohorte de obesas (145 obesas mórbidas (IMC>40 kg/m2) y 55 obesas moderadas (IMC 30-38 kg/m2)) y en 35 mujeres controles (IMC<25kg/m2) mediante RT-qPCR y Western Blot. El hallazgo más relevante fue que la expresión de los principales genes involucrados en la lipogénesis fue significativamente menor en las mujeres obesas comparado con las controles en el tejido SBC, mientras que en el VSC la expresión fue similar. Además, nuestros resultados indican que, durante el desarrollo de la obesidad, existe una disminución progresiva en la lipogénesis en el SBC, sugiriendo que este tejido podría tener un mecanismo de defensa contra el exceso de acumulación de AG. / Obesity significantly increases the risk and worsens the prognosis of many diseases. However, obesity itself does not necessarily lead to these comorbidities. Adipose tissue dysfunction and ectopic fat accumulation seem to play an important role in determining an individual’s risk of developing the metabolic and cardiovascular comorbidities of obesity. Likewise, deregulation of adipocyte fatty acid (FA) metabolism also contributes to the development of metabolic diseases. Based on previous data, a better understanding of the underlying mechanism of the deregulation of FA metabolism in adipose tissue during the development of obesity could be of great interest and could provide a better understanding of the physiopathology of obesity. We therefore hypothesized that in obese patients, the expression of genes and transcription factors involved in the regulation of FA metabolism could be altered; and this alteration may be related to adipose tissue dysfunction. Consequently, the main objective was to further investigate the pathways related to FA metabolism in the subcutaneous (SAT) and visceral (VAT) adipose tissue of obese women. To that end, we evaluated the expression of key genes involved in FA metabolism in SAT and VAT by RT-qPCR and Western Blot in an extensive obese cohort (145 morbidly obese (BMI>40 kg/m2) and 55 moderately obese (BMI 30-38 kg/m2) women) and 35 normal-weight women (BMI<25 kg/m2). The main finding was that the expression of the key genes involved in lipogenesis was significantly lower in the SAT depot of obese women than in those of the control, whereas in VAT had similar expression. Moreover, our results indicate that there is a progressive downregulation in lipogenesis in SAT during the development of obesity, suggesting that, in obese individuals, SAT has a defensive mechanism against an excess of FA accumulation that prevents the subcutaneous fat mass from developing further by decreasing the expression of lipogenic genes, whereas VAT may have lost this mechanism.

L’escalfament global i la contaminació medioambiental han promogut la recerca científica i polítiques governamentals per tal de desenvolupar i aplicar processos de producció més sostenibles, un ús més racional de l’energia i la implenetació de sistemes de reciclatge. En aquest sentit, els alquil èsters d’àcids grassos – coneguts com a biodièsel – suposen una alterntaiva sostenible i renovable al dièsel convencional, i en l’actualitat ja s’usa mesclat amb dièsel. El biodièsel s’obté per transesterificació d’olis vegetals o grasses animals amb un alcohol – normalment metanol. Després de la seva combustió, el diòxid de carboni resultant és fixat per les plantes mitajançant la seva fotosíntesi, i convertit a biomassa a partir de la qual es torna a obtenir oli per fabricar-ne biodièsel. Així, l’avantatge principal del biodièsel respecte el dièsel convencional és que el seu ús és un cicle tancat de carboni, fet que evita l’augment del carboni ambiental, i a més a més no presenta els futurs problemes d’esgotament dels combustibles fòssils. En un altre ordre de coses, l’ús d’enzims s’ha estès dins la indústria, principalment perquè els processos enzimàtics són més sostenibles i tenen menys consum energètic que els processos convencionals. Malgrat tot, l’elevat preu dels enzims limita encara el seu ús i per tant és necessària més recerca. La utilització de lipases per generar biodièsel és un exemple de l’ús d’enzims per substituir mètodes convencionals. A la natura, les lipases es troben als éssers vius i la seva funció és la hidròlisi dels greixos – és a dir, triacilglicerols –, obtenint àcids grassos lliures. Recentment, l’ús de les lipases s’ha explorat com a alternativa a l’actual mètode d’obtenció de biodièsel, degut a que té un consum d’energia inferior i també perquè les lipases poden sintetitzar biodièsel a partir d’un rang de matèries primeres més ampli. Aquesta tesi s’ha focalitzat a l’estudi de la lipasa de Rhizopus oryzae, expressada recombinantment a partir de Pichia pastoris, com a biocatalitzador d’alquil èsters d’àcids grassos. En primer lloc es va estudiar la inactivació de la lipasa causada pel metanol, fet el qual és un dels principals inconvenients en l’ús de les lipases, així com també l’efecte de l’aigua en aquesta inactivació; d’aquest primer estudi, se’n va concloure que l’aigua contrarresta l’efecte negatiu del metanol, encara que la seva presència incrementa la hidròlisi dels greixos en lloc de la seva transesterificació. La presència d’àcids grassos lliures a les matèries primeres és un inconvenient important pels mètodes químics actuals d’obtenció de biodièsel, mentre que les lipases poden dur a terme sense problemes la transesterificació amb presència d’àcids lliures, convertint-los també a biodièsel. Així, la segona part de la tesi va ser centrada en estudiar si aquests àcids grassos lliures poden tenir algun efecte sobre les lipases, concloent que no només no perjudiquen l’enzim, sinó que la seva presència redeix l’efecte negatiu del metanol. Degut a la varietat de components implicats a la transesterificació enzimàtica – tri-, di-, monoacilglicerols, àcids grassos lliures, alcohol, aigua i biodièsel –, es varen realitzar experiments per determinar el mecanisme de reacció de la transesterificació. Es va concloure, que el biodièsel s’obté enzimàticament per combinació de l’alcohòlisi directa dels greixos i l’hidròlisi dels greixos i la posterior esterificació dels àcids grassos alliberats. També és va determinar que la lipasa de Rhizopus oryzae no necessita l’activació interfacial, fenomen característic de les lipases. Finalment, es va fer un estudi comparatiu de l’especificitat de la lipasa respecte acilglicerols i alcohols, demostrant que l’enzim és molt més específic per 1-monooleïna que per trioleïna, i presenta més tolerància a l’etanol que el metanol. / Global warming and environmental pollution have fostered scientific research and encouraged governmental policies to develop and implement greener production processes, a more rational energy usage and recycling life cycles. In that sense, fatty acid alkyl esters – commonly known as biodiesel – have emerged as a green and renewable alternative to conventional diesel and currently it is commercially used in blends with diesel. Biodiesel is obtained by transesterification of vegetable oils or animal fats with an alcohol – most often methanol. After its combustion, carbon dioxide is fixed and converted to new biomass by photosynthesis, from which biodiesel is again produced. Thus, the main advantage of biodiesel over diesel is that its production and utilisation is a closed carbon cycle, which does not contribute to increasing atmospheric carbon levels, and overcomes the future depletion of fossil fuels. Moreover, the employment of enzymes has become widespread within the industrial sector, especially because enzymatic procedures are greener and have less energy demand compared to traditional chemical ones. However, the high price of enzymes still limits their utilisation and further scientific research is needed. The use of lipases to produce biodiesel constitutes one example of the employment of enzymes to replace an existing chemical production process. In nature, lipases are found in living organisms, which use them to catalyse the hydrolysis of triacylglycerols – i.e. lipids –, obtaining free fatty acids after breaking ester bonds. In recent years, their employment in the synthesis of biodiesel has been explored as a suitable alternative to the present chemical catalysis processes, due to its lower energy consumption and also because lipases can produce biodiesel from a larger variety of initial raw materials, compared to conventional process. This dissertation has been focused on the study of the Rhizopus oryzae lipase, expressed recombinantly by Pichia pastoris, as biocatalyst to synthesise fatty acid alkyl esters – Rhizopus oryzae lipase and recombinant Rhizopus oryzae lipase are referred to in the present booklet as ROL and rROL, respectively. Initially, methanol inactivation of the lipase, which remains the main drawback for the employment of lipases in biodiesel production, and the effect of water on this inactivation were investigated, concluding that water can buffer methanol’s negative effect on lipase, although it increases the hydrolysis of triacylglycerols. The presence of free fatty acids in the initial raw material is a major obstacle in conventional chemical biodiesel production, whereas lipases can handle perfectly free fatty acids, esterifying them to biodiesel. Thus, in the second part of the thesis the effect of free fatty acids on the lipase was also studied, concluding that not only do they not represent a problem for enzymatic biodiesel production, but also their presence reduces lipase inactivation by methanol. Due to the variety of compounds present throughout the lipase catalysis – tri-, di-, monoacylglycerols, free fatty acids, alcohol, water and biodiesel –, experiments to elucidate the whole transesterification reaction pathway were carried out. It was found that biodiesel was obtained by a combination of reactions, namely, direct triacylglycerol alcoholysis, triacylglycerol hydrolysis and free fatty acids esterification. It was also determined that rROL does not need the so-called interfacial activation, widely attributed to lipases. Finally, a comparative study of alcohol type and lipase specificity towards acylglycerols was also performed, demonstrating that rROL exhibits better tolerance to ethanol compared to methanol, and higher specificity towards 1-monoolein than triolein.

Aquesta tesi s'emmarca dins les investigacions realitzades en el Departament d'En-ginyeria Química de la Universitat Autònoma de Barcelona en col·laboració amb la Unitat de Química i Bioquímica de Proteïnes del CID-CSIC, en el camp de la síntesi enzimàtica de pèptids.El treball es centra en desenvolupar un procés per a la síntesi enzimàtica de l'octapèptid C-terminal de la CCK (CCK-8). L'interès més rellevant d'aquesta molècula és que presenta un ampli espectre d'activitat biològica i un elevat potencial terapèutic.- La introducció de la memòria s'ha distribuït en tres parts:- Diferents aspectes cabdals en la síntesi enzimàtica de pèptids.- Característiques i funcions de la CCK i CCK-8.- Un resum dels estudis previs realitzats sobre la síntesi enzimàtica del penta-pèp-tid C-terminal de la CCK-8, els quals han servit de punt de par-tida per aquest treball.- El capítol de resultats i discussió s'ha subdividit en diferents apartats.- Inicialment es presenten les investigacions de N-a protecció/desprotecció realitzades amb penicil·lina G acilasa (PGA) d'E. coli. Aquests estudis es van començar amb la N-a protecció de diferents derivats d'aminoàcids a escala analítica amb els grups protectors fenilacetil i mandelil (PhAc, Mand). Segui-da-ment aquestes reaccions es van realitzar a escala pre-pa-ra-tiva.En segon terme es presenta l'estudi de l'enllaç peptídic R-Gly-Trp-OBzl (dipèptid 4-5 de la CCK-8, on R: PhAc, Mand) amb l'objectiu d'investigar i comparar la influència dels grups protectors PhAc i Mand sobre la reactivitat del donador d'acil. Al mateix temps s'intenta optimitzar la reacció amb una finalitat de procés.Aquest estudi es tanca amb l'aplicació de la PGA en una reacció de despro-tecció del grup N-a protector. Concretament es tria desprotegir el grup PhAc del pentapèptid PhAc-Gly-Trp-Met-Asp(OBut)-Phe-NH2, etapa necessària per tal de poder abordar la síntesi de l'octapèptid.- En un segon bloc, s'inicia l'estudi de la síntesi del tripèptid N-terminal de la CCK-8 a escala analítica, a partir de les dues estratègies de síntesi possibles (Asp+Tyr)+Met i Asp+(Tyr+Met).- Seguidament es presenta un apartat dedicat a trobar unes bones condicions per a la síntesi de l'octapèptid i tot seguit s'introdueixen les modificacions necessàries per a l'obtenció de la PhAc-CCK-8.- L'últim bloc del capítol es destina a presentar el procés global per a la síntesi enzimàtica de la PhAc-CCK-8 a escala preparativa.Tenint com a base l'esquema de síntesi del pentapèptid dels estudis previs, es proposa un nou esquema amb la idea de definir un procés global per a la síntesi d'aquesta molècula. La viabilitat d'aquest esquema es comprova a escala analítica. Posteriorment es realitza la síntesi del pentapèptid i la desprotecció del grup PhAc, amb PGA, a escala de grams.A continuació es planteja el procés per a la síntesi del tripèptid N-terminal a partir de les condicions trobades anteriorment a escala analítica. Finalment es du a terme la síntesi de la PhAc-CCK-8 a escala preparativa. / This PhD dissertation is included in the research performed in the Chemical En-gi-neering Dept. of the UAB in collaboration with the Unitat de Química i Bio-quí-mica de Proteïnes of CSIC, in the field of enzymatic peptide synthesis.The main goal of this work is to develop a process for the enzymatic syn-thesis of the C-terminal octapeptide of CCK (CCK-8).The main interest of this molecule is its wide spectrum of biological activity and a great therapeutic po-tential.- The introductory chapter has consists of three parts:- Several capital aspects in the enzymatic peptide synthesis.- Features and functions of CCK and CCK-8.- An abstract of previous studies on the enzymatic synthesis of the C-terminal pen-ta-peptide of CCK-8. This work was the starting point of the present one.- The results and discussion chapter has been subdivided into several sections.- Firstable is showed the N-a protection/deprotection studies performed with pe-ni-cillin G acylase (PGA) from E. coli. These studies started with N-a pro-tec--tion of different aminoacid derivatives at anlytical scale using phenylacetil and mandelil (PhAc, Mand) as protecting groups. After that this reactions were carried out at preparative scale.Secondly the study of peptidic bond R-Gly-Trp-OBzl (dipeptide 4-5 of CCK-8 sequence, where R: PhAc, Mand) is shown, having in mind to compare the influence of PhAc and Mand protecting groups on the acyl donor reactivity. At the same time we optimize the reaction from a process approach.This study is closed applying PGA in a deprotection reaction of the N-a group. In particular it has been chosen the deprotection of the pentapeptide PhAc-Gly-Trp-Met-Asp(OBut)-Phe-NH2, because this stage is needed to achieve the octapeptide synthesis.- A second block covers the N-terminal tripeptide synthesis of CCK-8 at analytical scale, from the only two synthetic strategies (Asp+Tyr)+Met and Asp+(Tyr+Met).- The next block is devoted to find the best reaction conditions for the octapeptide synthesis and, afterwards, the introduction of the modifications required to obtain the PhAc-CCK-8.- The last block is focused on the global process for the enzymatic synthesis of PhAc-CCK-8 at preparative scale.Taking into account previous pentapeptide synthesis studies, a novel scheme is proposed to define a global process for the syn-thesis of this molecule. The feasibility of this scheme has been tested at analytical scale. Afterwards the pentapeptide synthesis and PhAc depro-tection (using PGA as a catalyst) have been performed at gram scale.Afterwards, the N-terminal tripeptide synthesis process is studied, taking into consideration the conditions at analytical scale previously stated. Finally the synthesis of PhAc-CCK-8 at preparative scale has been achieved.

Las lipasas son enzima con numerosas aplicaciones en biocatálisis debido a su reacción natural, hidrólisis de enlaces éster, como a su utilización en reacciones de transesterificación y síntesis orgánica. Se destaca como productor de lipasas la levadura Candida rugosa. Existen lipasas comerciales de este microorganismo, pero tienen el inconveniente de ser una mezcla de isoenzimas que hace inviable el proceso de purificación. La alternativa es la producción heteróloga de la lipasa 2 en otro microorganismo. No obstante, esta vía topa con la peculiaridad de que C. rugosa no sigue el código genético universal para el amino ácido serina. Con objeto de obtener el gen sintético, se diseñó y optimizó la secuencia nucleotídica de rLip2 para su expresión en Pichia pastoris, su inserción en el vector de expresión pPICZ&#945; bajo el control transcripcional del promotor de la alcohol oxidasa, su transformación en P. pastoris y la selección de clones productores de rLip2 activa. Comprobada la obtención de clones productores de rLip2 funcional, se determinó el pH óptimo de producción mediante estrategias de operación en discontinuo, paso previo a la optimización de la operación en discontinuo alimentado. Al trabajar con fermentaciones en discontinuo alimentado no se detectó presencia de actividad lipásica. Análisis por Western blot revelaron que estábamos en presencia se de agregados de rLip2, que no tenían actividad lipásica. La hipótesis que se planteó para justificar la formación de los agregados de rLip2 fue la elevada salinidad del medio de cultivo. Mediante la disminución de la fuerza iónica del medio mediante ultra y diafiltración se recupero la actividad enzimática, detectando el monómero de rLip2. La producción del producto heterólogo fue 10 veces superior a del microorganismo natural. Se realizó una caracterización bioquímica y funcional determinándose el óptimo de temperatura y pH, su especificidad frente a p-nitrofenoles y triglicéridos. El estudio de estabilidad demostró que la enzima recombinante en solución era menos estable que la nativa. No obstante, al inmovilizar la rLip2 se consiguió obtener una isoenzima más estable con el valor añadido de poder ser reutilizada. Finalmente, se realizaron aplicaciones biocatáliticas de rLip2 en reacciones de síntesis enantioméricas para la resolución de mezclas rácemicas de compuestos de interés farmacéutico. Si bien para la resolución racémica del trans-2-fenil-1-ciclohexanol, la rLip2 no fue tan efectiva como la isoenzima nativa, para la resolución del ibuprofeno, se obtuvieron mejores resultados en términos de conversión, exceso y factor enantiomérico que con la nativa. / Lipases are enzymes with a wide range of applications in biocatalysis due to its natural reaction, hydrolysis of ester bounds, as well as to their use in transesterification and synthesis reactions. The yeast Candida rugosa is a well known lipase producer; there are several C. rugosa lipase preparations commercially available, but they have the inconvenience of being a mixture of several lipase isoenzymes with similar physicochemical properties, i.e. hampering the efficiency of their separation process. Thus, the recombinant production of C. rugosa lipases, particularly of the lipase 2 isoenzyme (Lip2), in another host microorganism is an attractive alternative. However, this strategy is hampered by the fact that C. rugosa may use a non-universal codon for Serine. We designed and synthesised a codon-optimised lip2 gene for its expression in Pichia pastoris. The synthetic gene was inserted into the pPICZ&#945; expression vector under the transcriptional control of the alcohol oxidase promoter, and cloned into P. pastoris. Transformants were selected in small scale cultivations for active rLip2 expression. In the following step, we determined the optimum pH for lipase production in preliminary bioreactor batch cultivations. However, when the producing strain was tested in fed-batch bioreactor cultivations, no lipolytic activity was detected in culture supernatants. Nevertheless, Western Blot analyses revealed that rLip2 was being produced as aggregates, with no apparent lipolytic activity. This observation suggested that the formation of rLip2 aggregates was related to the high ionic strength of the culture medium. Thus, cleared culture supernatants were subjected to ultra/diafiltration. By reducing the ionic strength of the cleared supernatant, the enzymatic activity could be recovered, also detecting the monomeric rLip2 form. Notably, the recovered lipase activity was 10-fold higher to that recovered from a cultivation process at the same scale with the native enzyme producer. The recombinant enzyme was biochemically and functionally characterized. In particular, we determined its optimum temperature and pH for activity, as well as its specificity towards p-nitrophenols and tryglycerides. Also, the stability study revealed that the recombinant enzyme is less stable than the native enzyme preparation. Nevertheless, when the rLip2 was immobilized on a solid support, stability was substantially improved, having the possibility of reuse as an additional advantage. Finally, the potential of rLip2 as a biocatalyst was tested in two different reactions of enantiomeric synthesis, for the resolution of racemic mixtures of compounds of pharmaceutical interest. Although rLip2 resulted to be less efficient than the native lipase preparation for the racemic resolution of trans-2-phenyl-1-ciclohexanol, the recombinant enzyme showed an improved performance (in terms of conversion, enantiomeric excess and enantiomeric factor) in relation to the native enzyme preparation for the resolution of ibuprofen.