Latexin es un gen de respuesta a ácido retinoico (RA) cuya función celular se conoce escasamente. Latexin se encuentra silenciada por un mecanismo de hipermetilación en numerosas líneas tumorales, sugiriendo que ésta podría estar ejerciendo una función como supresor tumoral. Con el objetivo de elucidar su potencial implicación en cáncer, empleamos líneas derivadas de neuroblastoma ya que representan modelos adecuados para estudiar tanto procesos de apoptosis como de diferenciación. En este estudio revelamos que la escasa expresión de latexin parece una característica común de las líneas de neuroblastoma y que dicha expresión puede ser modulada mediante el tratamiento con RA. La sobreexpresión estable de latexin no altera los procesos proliferación celular ni de muerte celular en la línea SH-SY5Y. Sin embargo, su sobreexpresión sí que tiene un efecto significativo promoviendo la aparición de células del tipo S (del linaje Schwanniano) cuando son tratadas con RA. Además, su expresión también facilita la emergencia del fenotipo S cuando las células se exponen al agente 5-bromo-2’-deoxyuridine (BrdU). De hecho, la inhibición del axis PI3K/Akt impide la activación de senescencia Estas evidencias sugieren que latexin podría ser un determinante en la decisión del destino celular entre apoptosis y senescencia en células de neuroblastoma, probablemente modulando dicha cascada de señalización. Estos resultados nos alentaron a tratar de desvelar el panorama de expresión génico que promovueve latexin con el objetivo de identificar piezas claves en los efectos previamente mencionados que promueve latexin. Interesantemente, latexin promueve la expresión de un gran número de genes, principalmente involucrados en procesos de adhesión celular, desarrollo y morfogénesis. Curiosamente, la mayoría de genes promovidos por latexin, ya sea en presencia o ausencia de RA, pertenecen a la matriz extracelular (ECM), sugiriendo una potencial asociación entre la ECM y los efectos favorecidos por latexin en células SH-SY5Y. Cuando extendimos nuestros resultados a otros modelos celulares, observamos que latexin también fomenta el proceso de senescencia en respuesta al estímulo adecuado en la línea de neuroblastoma SK-N-LP y en la línea derivada de Glioblastoma Multiforme (GBM) LN-18. Sorprendentemente, una bajada en la expresión de latexin en las células U87-MG resulta en diferenciación tipo astrocitario cuando las células son tratadas con el agente genotóxico doxorubicina. Cabe remarcar que las células U87-MG con una expresión disminuida de latexin tienen perturbada la activación del proceso de senescencia. De una manera general, estos descubrimientos revelan una nueva función de latexin en la regulación de la especificación celular hacia la adquisición de un fenotipo senescente en diferentes modelos celulares. / Latexin is a recently discovered and poorly known retinoic acid (RA)-responsive gene whose cellular function is scarcely known. Latexin expression appears downregulated through promoter hypermethylation in several types of cancer, suggesting it can function as a tumor suppressor. With the aim to elucidate its potential role in cancer, we employed neuroblastoma-derived cells since they represent canonical and well-established models of apoptosis and differentiation. We first reveal that the lack of latexin expression appears as a common hallmark in neuroblastoma-derived cells although it can be modulated by RA treatment. The stable overexpression of latexin does not significantly alter cell proliferation or cell death responses in SH-SY5Y cells. However, the overexpression of latexin remarkably favors the emergence of S-type cells (Schwannian lineage) upon RA treatment. Consistently, latexin overexpression also facilitates the appearance of the S-type phenotype upon exposure to 5-bromo-2’-deoxyuridine (BrdU). Moreover, latexin-overexpressing cells display enhanced Akt activation upon RA or BrdU stimuli, or even in basal growth conditions. This activation allows latexin-overexpressing cells to survive for long periods under unfavorable extracellular conditions and to undergo cellular senescence. Indeed, the inhibition of the PI3K/Akt axis impedes the activation of cellular senescence. These evidences suggest that latexin could be a critical determinant of cell fate choices between apoptosis or senescence in neuroblastoma cells likely by modulating this cascade. These results encouraged us to unveil the landscape of gene expression promoted by latexin to identify key targets involved in the aforementioned latexin-mediated effects. Interestingly, latexin upregulated a large number of genes, most of them involved in cell adhesion, cell development and morphogenesis processes. Surprisingly, the vast majority of genes upregulated by latexin either in the presence or in the absence of RA belong to the extracellular matrix (ECM), therefore suggesting the potential involvement of the ECM in latexin-promoted effects in SH-SY5Y cells. When extending our results to other cellular models, we observe that latexin also promotes cellular senescence upon the adequate stimuli in the neuroblastoma cell line SK-N-LP and in the Glioblastoma Multiforme (GBM)-derived cell line LN-18. Intriguingly, latexin knock down in U87-MG cells results in astrocytic-like differentiation upon treatment with the genotoxic drug doxorubicin. Remarkably, U87-MG cells with decreased levels of latexin expression remarkably impair the activation of cellular senescence. Altogether, these findings disclose a novel functional role of latexin in regulating cell specification towards the acquisition of a senescent phenotype in different cellular models.

L’Aneurisma Aòrtic Abdominal (AAA) és una malaltia vascular que afecta amb rellevància la població dels països industrialitzats. És una malaltia que té pocs símptomes i en cas de ruptura de l’artèria aorta té una taxa de mortalitat molt alta per dessagnació interna. Les principals característiques d’aquesta alteració vascular són la dilatació de les parets del vas aòrtic com a conseqüència de la degradació de les diferents capes del mur vascular i una hipervascularització de l’artèria. Aquests dos processos estan estretament relacionats amb el procés inflamatori que es desenvolupa a la paret de l’artèria. Hem investigat la via de la PGE2 en l’AAA i la seva relació amb la hipervascularització associada a aquesta malaltia. Hem analitzat mostres de pacients d’AAA sotmesos a intervenció quirúrgica i les hem comparat amb les mostres de donants multiorgànics. Els pacients havien estat estratificats en funció del diàmetre màxim de l’aorta: low diameter (LD) (>55mm), moderate diameter (MD) (55-69,9mm), i high diameter (HD) (≥70mm). L’AAA es caracteritza per una abundant microvasculatura en la capa mitjana i adventícia amb una infiltració perivascular de cèl·lules CD45 positives. Els nivells d’mRNA de la ciclooxigenasa (COX)-2 i de la isoforma microsomal de la prostaglandin E sintasa (mPGES-1) estan incrementats en les mostres d’AAA (4,4 i 1,4 vegades respectivament). Els dos enzims estan localitzats en les cèl·lules endotelials (EC), en les cèl·lules vasculars llises (VSMC) i en els leucòcits. Aquests enzims, així com els marcadors d’EC, tenen una expressió màxima en el grup LD de pacients d’AAA, mentre que l’expressió dels marcadors de leucòcits mostren un màxim en el grup MD de pacients d’AAA. Aquests resultats indiquen que la hipervascularització i la up-regulation de la COX-2/mPGES-1 precedeixen al màxim d’infiltració leucocitària. Els nivells de metabòlits de PGE2 circulants i secretats pel teixit d’aneurisma in vitro són més alts en les mostres d’AAA que no pas en les mostres control (plasma-controls, 19.9±2.2 pg/ml; plasma-AAA, 38,8±5,5 pg/ml; teixit aòrtic-control 16,5±6,4 pg/mg; teixit aòrtic-AAA, 72,9±6,4 pg/mg). Els receptors de la PGE2 EP2 i EP4 estan sobreexpressats en les mostres d’AAA, sent el receptor EP4 l’únic receptor substancialment expressat en les cèl·lules endotelials i colocalitzat amb l’mPGES-1 en la microvasculatura. A més, el receptor EP4 media l’angiogènesi in vitro activada per la PGE2. Amb aquest estudi aportem de novo dades de l’expressió de l’mPGES-1 en mostres d’AAA humanes. Tots els nostres resultats suggereixen que l’eix COX-2/mPGES-1/EP4 en la microvasculatura pot tenir una especial rellevància en la hipervascularització associada a l’AAA. / The Abdominal Aortic Aneurysm (AAA) is a vascular disease that affects with relevance to the population of industrialized countries. It is usually an asymptomatic disease and in case of rupture of the aorta it has a very high mortality rate by internal hemorrhage. The main features of this disorder are vascular dilation of the aortic vessel walls as a result of the degradation of the different layers of the vascular wall and arterial hypervascularization. These two processes are closely related to the inflammatory process that develops in the wall of the artery. We investigated the PGE2 pathway in the AAA and its relationship with hypervascularization associated with this disease. We analyzed samples of AAA patients undergoing surgery in comparison with samples from multi-organ donors. Patients were stratified according to the maximum diameter of the aorta: low diameter (LD) (> 55mm) moderate diameter (MD) (55-69,9mm) and high diameter (HD) (≥70mm). The AAA is characterized by abundant microvasculature in the middle layer and adventitia with perivascular infiltration of CD45 positive cells. mRNA levels of cyclooxygenase (COX)-2 and the microsomal isoform of prostaglandin E synthase (mPGES-1) are increased in samples of AAA (4.4 and 1.4 times respectively). The two enzymes are located in endothelial cells (EC), vascular smooth muscle cells (VSMC) and leukocytes. These enzymes and markers of EC have maximum expression in the LD group of AAA patients, whereas the expression of leukocyte markers show a maximum in the MD group of AAA patients. These results indicate that hypervascularization and up-regulation of COX-2 / mPGES-1 precedes the maximum leukocyte infiltration. The levels of circulating metabolites PGE2 secreted by in vitro aneurysm tissue are higher in samples AAA than in control samples (plasma-controls, 19.9 ± 2.2 pg / ml, plasma-AAA, 38 8 ± 5.5 pg / ml; aortic tissue-control 16.5 ± 6.4 pg / mg; aortic tissue-AAA, 72.9 ± 6.4 pg / mg). PGE2 receptors EP2 and EP4 were overexpressed in samples AAA, EP4 being the only receptor expressed substantially in EC and colocalizes with mPGES-1 in the microvasculature. In addition, the EP4 receptor mediates in vitro angiogenesis activated by PGE2. This study provides de novo data of the mPGES-1 expression in samples of human AAA and, taken together, our results suggest that the axis COX-2/mPGES-1/EP4 in the microvasculature could have a key role in AAA-associated hypervascularization.

Hepatic cirrhosis is a largely diffused pathology caused by alcohol abuse and hepatitis C in developed countries, whereas hepatitis B is the cause in most parts of Asia and sub-Saharan Africa. It's characterized by development of regenerative nodules delimited by fibrous septa. Regenerative nodules are composed by proliferating hepatocytes, entrapped by deposition of extracellular matrix, and have been shown to be involved in growth factor production, in particular VEGF, which is responsible of angiogenic induction that culminates with formation of a dense network of blood vessels into fibrous septa. The newly formed blood vessels of fibrous septa connect the vessels of the portal region with terminal hepatic veins, determining an alternative route of the blood flow that, in this way, is redirected into the systemic circulation bypassing the liver. At pre-hepatic level, the cirrhosisrelated portal hypertension induces development of new blood vessels that shunt the portal blood into the systemic circulation. As consequence of both intrahepatic and pre-hepatic angiogenesis, the liver cannot metabolize several blood components such as drugs, nutrients, toxins, and bacteria, with obvious deleterious effects. Despite angiogenesis is one of the main complications of liver cirrhosis and VEGF has a pivotal role in the control of blood vessels formation, the molecular mechanisms that govern VEGF expression during angiogenesis and hepatic cirrhosis are poorly understood. In order to address whether CPEB family of proteins may have a function in the regulation of angiogenesis in liver diseases, we analysed the expression of CPEBl and CPEB4 in liver of patients affected by hepatic cirrhosis. The expression of CPEBl and CPEB4 was increased in regenerative nodules, compared with basal levels of expression detected in healthy hepatic parenchyma. Interestingly, also VEGF expression was higher in regenerative nodules. The numerous fibrous septa that characterized cirrhotic livers resulted highly vascularized, and the endothelium of newly formed blood vessels expressed high levels of CPEB1, CPEB4 and VEGF. The description of CPEB1, CPEB4 and VEGF expression in healthy and cirrhotic conditions represented a first cue of CPEB-mediated translational regulation of VEGF mRNA during angiogenesis. To prove the accuracy of this hypothesis we implemented two animal models that allowed the study of intrahepatic and prehepatic angiogenesis correlated with liver cirrhosis. CBDL experiments performed in rats enabled to recapitulate the histopathological conditions observed in human hepatic cirrhosis. Cirrhotic rat livers showed deep histological perturbations, with high proliferation of blood vessels and biliary ducts. Compared with control healthy samples, the expression of CPEB1, CPEB4 and VEGF in pathological liver was strongly increased. These proteins localized at level of both, blood vessels and biliary ducts. Partial portal vein ligation (PPVL) experiments performed in rats enabled to show an important correlation between CPEBl and CPEB4 expression with VEGF synthesis and consequent high vascularization of mesentery. In angiogenic condition, both pre-existing and newly formed blood vessels expressed CPEB1, CPEB4 and VEGF at level of endothelium, smooth muscle and adventitia, tissues that playa pivotal role in the development of the vascular net. To better define the mechanistic relevance of these correlations, we characterized the endothelial cell line HSV. In this in vitro model we modulated the levels of CPEBl and CPEB4, and showed a direct involvement of this two proteins in the translational regulation of VEGF mRNA. Taking advance of the ability of HSV cells to form blood vessel like structure in an in vitro angiogenesis assay, we were able to show that CPEBl and CPEB4 are required for VEGF synthesis and secretion, which in turn are essential to create the correct microenvironment necessary to activate the cells and induce the formation of a dense network of vascular structures on Matrigel. Our results suggest that CPEBl drives the nuclear cleavage of VEGF 3'UTR while CPEB4 is responsible of its cytoplasmic polyadenylation. / "Regulación de la angiogénesis a través del control traduccional mediato par las proteínas CPEB " En muchas enfermedades hepáticas cr6nicas, la angiogénesis es una importante característica patológica y juega un papel crucial en la progresión de la fibrogénesis hepática a cirrosis, y en la aparición y agravamiento de la hipertensión portal, la cual determina las principales complicaciones de la enfermedad. A pesar de que es evidente que VEGF es el principal efector de la angiogénesis patológica, los mecanismos moleculares que gobiernan la activación post-transcripcional de su síntesis durante la cirrosis hepática son en gran parte desconocidos. En este trabajo se muestra que la síntesis de VEGF está regulada a través de funciones secuenciales y no redundantes de dos miembros de la familia de las proteínas CPEB:. CPEB1 y CPEB4. Por 10 tanto, CPEB1 promueve el procesamiento alternativo de ambos los pre-ARNm de CPEB4 y VEGF, acortando las 3'UTRs y excluyendo elementos de inhibición de la traducción de los transcritos maduros. Como resultado de este procesamiento alternativo, CPEB4 se sobreexpresa, y polyadenyla el ARNm de VEGF, aumentando aún más su traducción. Entonces, se requieren tanto CPEB1 como CPEB4 para la síntesis de VEGF y la consecuente angiogénesis. Por tanto, todas las proteínas se sobreexpresan de forma secuencial en pacientes y en modelos animales de cirrosis hepática e hipertensión portal, y ambos ratones knock-out para CPEB1 y CPEB4 no lograron activar la angiogénesis tras la inducción de hipertensión portal. A través del análisis de la angiogénesis en ensayos in vitro, las muestras de humanos y modelos animales, nuestros resultados ponen de relieve el papel crucial de CPEBs en la neovascularización patol6gica, en el marco de la hipertensión portal y cirrosis, e identifican CPEBs como potenciales nuevas dianas moleculares para el tratamiento de la enfermedad hepática cr6nica y otras enfermedades dependientes de la neovascularización, como el cáncer.

Les mitocòndries generen la major part de l’energia necessària per a la funció cel·lular mitjançant la respiració i la fosforilació oxidativa. Quan els mioblasts diferencien a miotubs, la biogènesi mitocondrial i l’activitat enzimàtica mitocondrial augmenta. A més, la regeneració muscular també està acompanyada d’un augment en l’activitat enzimàtica mitocondrial. I la dinàmica mitocondrial és essencial per mantenir les funcions bioenergètiques mitocondrials. Opa1 i la Mitofusina 1 (Mfn1) són dues proteïnes de fusió mitocondrial involucrades en la dinàmica mitocondrial. Els meus resultats mostren que la pèrdua de funció de Opa1 i Mfn1 redueix dràsticament la diferenciació miogènica en les cèl·lules C2C12. Per una banda, s'observa una gran disminució en l'expressió dels marcadors finals de la diferenciació com la Caveolina 3 o la cadena pesada de miosina (MHC). A més, hi ha una disminució prou marcada en l'expressió de la Miogenina, causada per una disminució en l'activitat de MyoD. En canvi, la pèrdua de funció de mitofusina 2 (Mfn2), una altra proteïna de fusió mitocondrial, no mostra aquests canvis durant el procés de diferenciació. La respiració mitocondrial es veu fortament afectada per deficiència en Opa1 o en Mfn1, de manera que es detecta, un major “leak”, una menor capacitat respiratòria màxima, i una augmentada producció mitocondrial de peròxid d'hidrogen. L'observació que els defectes en la miogènesi estan parcialment normalitzats mitjançant l’ús d’antioxidants en les cèl·lules amb silenciament de Opa1 o Mfn1, indica que la disfunció mitocondrial pot ser important en algunes de les alteracions detectades durant la miogènesi. A més, la deficiència de Opa1 o Mfn1 en múscul esquelètic, provoca un alentiment en la regeneració muscular de ratolins i la repressió total de Opa1 en el múscul esquelètic de ratolí condueix a una miopatia, una reducció en el creixement del múscul i una disminuïda longevitat. En resum, les nostres dades indiquen que Opa1 i Mfn1 regulen miogènesi i que la pèrdua de funció de Opa1 o Mfn1 provoca estrès oxidatiu, que podria ser clau reduint la diferenciació muscular. En resum, he demostrat que Opa1 i Mfn1 regulen la diferenciació de les cèl·lules musculars en cultiu i la regeneració muscular en ratolins. Així mateix, aquestes proteïnes podrien participar en la formació normal del múscul esquelètic. / Mitochondria generate most of the energy necessary for cellular function via respiration and oxidative phosphorylation (OXPHOS). When myoblasts differentiate into myotubes, mitochondrial biogenesis is increased. Likewise, muscle regeneration is also accompanied by an increased mitochondrial biogenesis. Mitochondrial dynamics is essential for the maintenance of mitochondrial bioenergetic functions. Optic atrophy 1 (Opa1) and Mitofusin 1 (Mfn1) are two mitochondrial fusion proteins involved in mitochondrial dynamics. Here I show that Opa1 and Mfn1 loss of function impairs myogenic differentiation in C2C12 cells. On the one hand, we detect a reduced expression of late differentiation markers as Caveolin 3 or MHC. In addition, a reduced expression of Myogenin and reduced activity of MyoD is documented. In contrast, Mitofusin 2 (Mfn2) loss of function, another mitochondrial fusion protein, does not show these changes during the differentiation process. We find that mitochondrial respiration is heavily impaired, showing a higher leak, a lower ETS capacity, and increased mitochondrial hydrogen peroxide levels in living Opa1 and Mfn1 knocked-down C2C12 myoblasts. The observation that defects in myogenic differentiation are partly normalized by antioxidants in Opa1 or Mfn1 silenced cells indicates that mitochondrial dysfunction may be relevant in some of the alterations we detected during myogenesis. In addition, upon Opa1 or Mfn1 silencing, muscle regeneration is disrupted in adult mice and Opa1 depletion in skeletal muscle leads to a myopatic condition, reduced growth and reduced lifespan. In summary, our data indicate that Opa1 and Mfn1 regulate myogenesis and that Opa1 or Mfn1 loss-of-function causes oxidative stress, which may be key for dysregulation of muscle differentiation. As conclusion, we propose Opa1 and Mfn1 as potential regulators of muscle cell differentiation, muscle regeneration and muscle formation.

La diabetis tipus 2 és la malaltia metabòlica més freqüent a tot el món. Malgrat que els tractaments farmacològics són útils en les primeres etapes de la malaltia, no han sigut capaços prevenir la pèrdua de control de la glucèmia a llarg termini. A més, aquests tractaments presenten efectes secundaris indesitjables. Per tant, el desenvolupament de nous tractaments per a la diabetis tipus 2 és avui en dia un gran repte per a la investigació científica. El desenvolupament de la teràpia gènica ha proporcionat una nova eina per al tractament de malalties humanes. No obstant això, no s'han desenvolupat fins ara tractaments de teràpia gènica per a la diabetis tipus 2. Un 90% de la diabetis tipus 2 és conseqüència d'un excés de pes. L'acumulació de triglicèrids en els teixits perifèrics està vinculada a l'aparició de resistència a la insulina i la reducció de la captació de glucosa, conduint a un disfunció de la cèl·lula β i a la diabetis tipus 2. Per tant, promoure la captació de glucosa o l'oxidació d'àcids grassos podria prevenir el desenvolupament de la diabetis tipus 2. El múscul esquelètic juga un paper clau en l'homeòstasi de la glucosa i posseeix una gran capacitat d'utilitzar els àcids grassos per a la producció d'energia. És també un teixit ideal per a la transferència de gens, ja que és fàcilment accessible i permet ser transduït per una diversitat de vectors de teràpia gènica. En aquest estudi, per trobar una nova aproximació de teràpia gènica per a la diabetis tipus 2, vam transferir diversos gens amb la capacitat d'augmentar la captació de glucosa o la capacitat oxidativa del múscul esquelètic en un model de diabetis induïda per la dieta, mitjançant l'ús de vectors AAV. Els vectors AAV són segurs i permeten una expressió a llarg termini del transgen en el múscul esquelètic. En estudis previs hem demostrat en ratolins transgènics que l'augment de la fosforilació de la glucosa per la sobreexpressió muscular del Glucoquinasa (GCK) prevé l’obesitat induïda per dieta alta en lípids i la resistència a la insulina. En una primera aproximació, la sobreexpressió de GCK en els músculs esquelètics de ratolins adults alimentats en dieta alta en lípids, ha permès una reducció del 10% en el guany de pes corporal, juntament amb normoinsulinemia i una prevenció de la resistència a la insulina. El PGC1 α és un regulador de la biogènesi mitocondrial i de la funció oxidativa en el múscul esquelètic. La seva expressió muscular està disminuïda en pacients diabètics tipus 2, el que suggereix la seva implicació en la patogènesis de la resistència a la insulina en aquest teixit. A més, la seva expressió incrementa la captació de glucosa en les cèl·lules del múscul esquelètic. Així, en la segona part d'aquest estudi, es sobreexpressa el PGC1α en els músculs esquelètics de ratolins adults alimentats en dieta alta en lípids, sol o en combinació amb GCK. La sobreexpressió de PGC1α ha conduït a una reducció del 10% del pes corporal. No obstant això, no ha evitat el desenvolupament de la resistència a la insulina. La co-sobreexpressió de PGC1α i GCK no ha previngut l'obesitat ni el desenvolupament de resistència a la insulina, abolint així els efectes beneficiosos observats amb la sobreexpressió de la GCK sola. En el múscul esquelètic, PPARδ és un factor de transcripció induïble per lligand, que promou l'oxidació d'àcids grassos. Després de la unió del lligand, PPARδ recluta coactivadors que permeten la transcripció dels seus gens diana. PGC1α és un d'aquests coactivadors. Així, en la tercera part d'aquest estudi, es sobreexpressa PPARδ sol o en combinació amb PGC1α en els músculs esquelètics de ratolins adults alimentats en dieta alta en lípids. La sobreexpressió de PPARδ no ha evitat el desenvolupament de l'obesitat o la resistència a la insulina. Per contra, la co-expressió de PPARδ i PGC1α ha comportat una reducció del 10% en el guany de pes corporal i una prevenció del desenvolupament de resistència a la insulina. A més, els músculs que sobreexpressen els dos gens presenten una major sensibilitat a la insulina i una reducció en l'acumulació d'àcids grassos. Per tant, la sobreexpressió muscular GCK o la co-sobreexpressió de PPARδ i PGC1α, podrien representar noves aproximacions potencials de teràpia gènica pel tractament de la diabetis tipus 2. / Type 2 diabetes is the most common metabolic disease worldwide. Despite drug treatments are useful in the first stages of the disease, none of them have proven to prevent the glycaemic control loss in a long-term basis. Furthermore, all treatments present undesirable secondary effects. Thus, the development of new treatments for type 2 diabetes is nowadays an important cornerstone in scientific research. The development of Gene Therapy has provided a new tool to treat human diseases. However, successful gene therapy approaches for the treatment of type 2 diabetes have not been developed to date. About 90% of type 2 diabetes is attributable to excessive body weight. The accumulation of triglycerides in peripheral tissues is linked to the appearance of insulin resistance and reduced glucose uptake. This leads to β-cell failure and to type 2 diabetes. Thus, promoting glucose uptake or fatty acid oxidation may prevent the development of type 2 diabetes. The skeletal muscle plays a key role in glucose homeostasis and possesses a big capacity to use fatty acids for energy production. It is also an ideal tissue for gene transfer since it is easily accessible and can be transduced by a diversity of gene therapy vectors. In this study, to find a new gene therapy approach for type 2 diabetes, we transferred several genes with the ability to increase glucose uptake or bust the oxidative capacity of the skeletal muscle in a model of diet-induced diabetes by using AAV vectors. These vectors are safe and allow a long-term expression of the transgene in the skeletal muscle. We previously demonstrated in transgenic mice that increasing glucose phosphorylation by the muscular overexpression of Glucokinasse (Gck) prevents high fat diet-induced obesity and insulin resistance. Here, as a first approach, we overexpressed Gck in the skeletal muscles of high fat diet-fed adult mice, leading to a 10% reduction in body weight gain along with normoinsulinemia and a prevention of high fat diet-induced insulin resistance. PGC1α is a master regulator of mitochondrial biogenesis and the oxidative function in the skeletal muscle. The muscular expression of this gene is reduced in type 2 diabetic patients, suggesting its involvement in the pathogenesis of insulin resistance in this tissue. Additionally, the expression of PGC1α increased glucose uptake in skeletal muscle cells. Thus, in the second part of this study, we overexpressed Pgc1α in the skeletal muscles of high fat diet-fed adult mice alone or in combination with Gck. The overexpression of Pgc1α led to a 10% reduction of the body weight gained during the diet. However, it didn’t prevent the development of insulin resistance. The co-overexpression of Pgc1α and Gck didn’t prevent obesity or the development of insulin resistance, thus abolishing the beneficial effects observed when Gck was overexpressed alone. In the skeletal muscle, PPARδ is a ligand-inducible transcription factor that promotes fatty acid oxidation. Upon ligand binding, PPARδ recruits coactivators which allow the transcription of its target genes. PGC1α is one of these coactivators. Thus, in the third part of this study, we overexpressed Pparδ alone or in combination with Pgc1α in the skeletal muscles of high fat diet-fed adult mice. The overexpression of Pparδ during the diet didn’t prevent the development of obesity or insulin resistance. In contrast, the co-overexpression of Pparδ and Pgc1α led to a 10% reduction in body weight gain along and with a prevention of the development of insulin resistance. Furthermore, muscles overexpressing both genes presented increased insulin sensitivity and reduced accumulation of fatty acids. Therefore, the muscular overexpression of Gck or the co-overexpression of Pparδ and Pgc1α, might represent potential new gene transfer approaches to treat type 2 diabetes.

El carcinoma Escamoso de Cabeza y Cuello (CECC) es el sexto cáncer con mayor incidencia en países desarrollados. Dos terceras partes de los pacientes con Carcinoma Escamoso de Cabeza y Cuello (CECC) se diagnostican en estadios avanzados y no siempre responden al tratamiento habitual de quimioterapia combinada con cirugía o radioterapia. El objetivo principal de este proyecto de tesis es desarrollar marcadores pronóstico y predictivos en pacientes con CECC localmente avanzado tratados con quimioradioterapia (QRT) concomitante o quimioterapia de inducción seguida de QRT/radioterapia o cirugía. Con este objetivo, hemos analizado por PCR cuantitativa o inmunohistoquímica, el nivel de expresión de una serie de genes candidatos, identificados en un estudio previo de microrrays, y la asociación de estos con la recidiva tumoral y la supervivencia de los pacientes. Estos análisis se realizaron en biopsias tumorales pre-tratamiento de cuatro cohortes de pacientes con CECC localmente avanzado. Los resultados muestran que el nivel de expresión de SERPINA-1 y RAB25 se asocia con la recidiva local, supervivencia libre de enfermedad y la supervivencia global de los pacientes. Además, mediante un estudio de microarrays, hemos identificado una firma de 16 genes cuya expresion se asocia con el pronóstico de los pacientes. Posteriormente la firma genética ha sido validada utilizando los datos obtenidos en dos estudios independientes previamente publicados. Por último, una vez caracterizado un panel de líneas celulares, hemos analizado funcionalmente el efecto de la manipulación de genes con capacidad pronóstica en células de CECC. En este sentido, la sobreexpresión exógena de Rab25 aumenta la proliferación, disminuye la capacidad de migración e invasión y potencia la citotoxicidad inducida por cisplatino en líneas de CECC. Los resultados confirman que el nivel de expresión de Rab25 es un factor de buen pronóstico en pacientes con CECC localmente avanzado. Aquellos pacientes cuyos tumores tienen una expresión elevada de Rab25 presentan un pronóstico más favorable que los pacientes con tumores que expresan niveles bajos. En cambio, el nivel de expresión de SERPINA-1 es un factor de mal pronóstico, aumenta el riesgo de sufrir recidivas tumorales y disminuye la supervivencia de los pacientes. La determinación de ambos marcadores podría ayudar, en un futuro, a identificar antes de iniciar el tratamiento, aquellos pacientes que presentan una mayor probabilidad de responder al tratamiento genotóxico y distinguirlos de los pacientes que no se benefician del tratamiento actual. La firma genética desarrollada podría predecir de una manera más precisa la supervivencia de los pacientes a partir de la determinación del nivel de expresión de un número mínimo de genes. / Head and Neck Carcinoma (HNSCC) is the sixth most common cancer in develop worldwide. Two thirds of head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) patients are diagnosed at an advanced stage and they do not always respond to the standard treatment protocols based on radiotherapy and/or chemotherapy. The main objective of this project is to develop prognostic and predictive markers of response to treatment in patients with locally advanced HNSCC treated with concomitant chemoradiotherapy (CRT) or induction chemotherapy followed by CRT/radiotherapy or surgery. Based in this objective, we have analyzed by quantitative PCR or immunohistochemistry, the expression level of a gene subset, identified in a previous microarray study, and their association with tumor recurrence and patient survival. These analyses were done in pre-treatment tumor biopsies of four cohorts of locally advanced HNSCC patients. Results showed that RAB25 and SERPINE-1 expression is associated with local recurrence, progression free survival and overall survival of patients. Even more, we identified a 16 gene signature associated with clinical outcome of patients. This gene signature has been validated in two independent microarray studies, previously published. Finally, we characterized a set of cell lines and we analyzed the effect of the manipulation of prognostic genes in HNSCC cell lines. We observed that the exogenous Rab25 overexpression increases cell proliferation, reduces migration and invasion, and promotes cisplatin cytotoxicity in CECC cell lines. These results confirm that RAB25 expression is a good prognostic marker in locally advanced HNSCC patients. Those patients with tumors bearing high expression levels of RAB25 have better prognostic than those patients with low expressing RAB25 tumors. In contrast, the expression level of SERPINE-1 is a bad prognostic marker, because increases the risk of tumor recurrence and diminish patient survival. The determination of both markers could be useful, in the future, to identify before treatment, those patients who have a higher probability to respond to genotoxic treatment and distinguish them from patients who won’t obtain benefit from current treatment. The developed genetic signature could predict with high accuracy patient survival, determining gene expression of minimum number of genes included in our genetic signatures.

Les quinases dependents de ciclina (CDKs) dirigeixen la progressió del cicle cel·lular a les cèl·lules eucariotes. A l’organisme eucariota model Saccharomyces cerevisiae (llevat de gemmació) una sola quinasa dependent de ciclina, Cdk1, és essencial i suficient per dirigir el cicle cel·lular. Unida alternativament a ciclines de fase G1, S i G2/M, Cdk1 regula els programes transcripcionals del cicle cel·lular, la replicació i segregació dels cromosomes, la dinàmica del fus mitòtic, el creixement cel·lular polar, la morfogènesi, etc. La desregulació de l’activitat CDK promou la proliferació descontrolada i la inestabilitat genòmica. Donada la seva funció essencial en la progressió del cicle cel·lular, Cdk1 és estretament regulada per proteïnes associades (les ciclines, Cks1, i inhibidors de les CDKs –CKIs) i per modificacions post-traduccionals. Tanmateix, molts detalls de la regulació de Cdk1 romanen desconeguts, com és el cas de com les activitats CDK de fase G1 o de fase M són inhibides en resposta a determinats estressos cel·lulars. Quan la progressió del cicle cel·lular és amenaçada per la presència d’estressos genotòxics tals com l’estrès replicatiu o la presència de dany al DNA, un mecanisme de vigilància, l’anomenat checkpoint de la fase S, s’activa per tal de protegir la integritat del genoma. Al llevat de gemmació, el checkpoint de la fase S és mediat per la quinasa Mec1 (ATR/ATM a humans) i la seva quinasa efectora Rad53 (Chk2 a humans). Per explorar si la quinasa efectora Rad53 regula Cdk1 en resposta a estrès genotòxic, hem explorat dues qüestions principals: (1) la fosforilació de Cdk1 per Rad53 i (2) la regulació per Rad53 de proteïnes associades a Cdk1. Pel que fa a la primera qüestió, aprofitant un assaig quinasa in vitro amb Rad53, mostrem que Cdk1 és fosforilat directament per Rad53. Hem identificat proteòmicament dos llocs de Cdk1 (Ser46, Ser258) fosforilats per Rad53 in vitro. Les cèl·lules dirigides per l’al·lel no-fosforilable (Cdk1-2A) mostren un fenotip wee, compatible amb una activitat CDK incrementada/desregulada. Les cèl·lules dirigides per l’al·lel fosfomimètic (Cdk1-2E) són allargades i més grans que les cèl·lules silvestres, compatible amb una activitat CDK reduïda. A més, assignem i quantifiquem les diferents formes fosforilades de Cdk1 in vivo mitjançant electroforesi Phos-tag. Respecte la segona qüestió, hem identificat proteòmicament proteïnes associades a Cdk1 en presència d’estrès replicatiu en forma dependent de Rad53. Hem estudiat en detall el producte del gen de funció desconeguda YPL014W, que bategem Cip1 (per Cdk1 Interacting Protein 1), que obté la puntuació més alta en l’anàlisi. Les nostres dades mostren que Cip1 és una proteïna regulada al llarg del cicle cel·lular. A més, l’abundància de Cip1 s’incrementa en forma dependent de Rad53 en presència d’estrès replicatiu. La sobre-expressió de Cip1 bloqueja les cèl·lules a fase G1 i estabilitza el CKI de fase S Sic1 in vivo. A més, Cip1 interacciona específicament amb el complex de fase G1 Cln2-Cdk1, però no amb el complex de fase S Clb5-Cdk1 or el de fase M Clb2-Cdk1. Cip1 inhibeix l’activitat Cln2-CDK tant in vivo com in vitro. Els nostres resultats suggereixen que Cip1 pot ser un nou CKI de l’activitat CDK de fase G1. / Cyclin dependent kinases are drive cell division cycle progression in eukaryotic cells. In the model eukaryotic organism Saccharomyces cerevisiae (budding yeast) a single Cyclin Dependent Kinase, Cdk1, is essential and sufficient to drive the cell cycle. Alternately bound to G1, S and G2/M phase cyclins, Cdk1 regulates cell cycle transcriptional programs, chromosome replication and segregation, spindle dynamics, polarized cell growth, morphogenesis, etc. Misregulated CDK activity induces unscheduled proliferation as well as genomic instability. Given its essential function in cell cycle progression, Cdk1 is tightly regulated by binding partners (cyclins, Cks1 and Cyclin dependent Kinase Inhibitors -CKIs) and post-translational modifications. However, many details on Cdk1 regulation remain unknown, such as how G1 or mitotic CDK activities are inhibited in response to challenging conditions. When the cell cycle progression is challenged by genotoxic stress such as DNA replication stress or DNA damage, a surveillance mechanism, the S phase checkpoint is activated to protect the integrity of the genome. In the budding yeast the S phase checkpoint is mediated by the Mec1 kinase (ATR/ATM in humans) and its downstream effector kinase Rad53 (Chk2 in humans). To explore whether the effector kinase Rad53 regulates Cdk1 in response to genotoxic stress, we have been exploring two main avenues: (1) Cdk1 phosphorylation by the S phase checkpoint effector kinase Rad53 and (2) Rad53 dependent regulation of Cdk1 associated factors. With respect to the first question, taking advantage of a Rad53 in vitro kinase assay, we show that recombinant Cdk1 is directly phosphorylated by Rad53. We also proteomically identified two sites of Cdk1 (Ser46, Ser258) phosphorylated by Rad53 in vitro. Cells carrying the non-phosphorylatable Cdk1 allele (Cdk1-2A) display a wee phenotype, compatible with increased/unrestrained CDK activity. Cells carrying the phosphomimetic Cdk1 allele (Cdk1-2E) are elongated and larger in size than wild type cells. Moreover, we also assign and quantify the different phosphorylation forms of Cdk1 in vivo using Phos-tag electrophoresis technology. With respect to the second question, we have proteomically identified proteins associated with Cdk1 in the presence of replication stress in a Rad53 dependent manner. The product of the unknown function gene YPL014W, which we name Cip1 (for Cdk1 Interacting Protein 1), with the highest score, is further studied. Our data shows that Cip1 is a cell cycle regulated protein. In addition, the abundance of Cip1 increases in a Rad53 dependent manner upon DNA replication stress. Overexpression of Cip1 blocks cells in G1 and stabilizes the S-phase-Cdk1 inhibitor Sic1 in vivo. Moreover, Cip1 specifically interacts with G1 phase Cln2-Cdk1 but not with S phase Clb5-Cdk1 or M phase Clb2-Cdk1. Cip1 inhibits Cln2-CDK activity both in vivo and in vitro. Our finding suggests that Cip1 may be a novel CKI of G1 phase CDK activity.

La malaltia de McArdle (glicogenosis tipus V), és la glicogenosis muscular més freqüent i està causada per la manca de la isoforma muscular de la glicogen fosforilasa. Els pacients són incapaços d’obtenir l’energia de les seves reserves de glicogen al múscul, i com a conseqüència, presenten intolerància a l’exercici amb fatiga prematura i contractures, a vegades acompanyada per rabdomiolisis i mioglobinuria. Actualment, no hi ha cap teràpia capaç de restaurar l’activitat de l’enzim en pacients, però el recent desenvolupat model murí de la malaltia de McArdle obre les portes a l’estudi de les conseqüències fenotípiques de la indisponibilitat del glicogen muscular, així com, a l’estudi de noves aproximacions terapèutiques per a aquest trastorn. Aquesta tesi doctoral s’ha basat en la caracterització fenotípica del model murí de la malaltia de McArdle, centrant tots els esforços en l’estudi de la regulació del metabolisme del glicogen pel que fa a la manca de la glicogen fosforilasa i la subsequent acumulació de glicogen, així com en el desenvolupament d’un model in vitro de la malaltia que imita l’abscència de la isoforma muscular de la glicogen fosforilasa i l’acumulacio de glicogen observada en el múscul esquelètic dels pacients amb la malaltia de McArdle. Utilitzant aquest model, hem demostrat l’eficiència del valproat de sodi, un inhibidor de les histones desacetilases, com a possible teràpia per a la malatia de McArdle, ja que hem observat la reexpressió de la isoforma cerebral de la glicogen fosforilasa i una reducció dosi-depenent en l’acumulació de glicogen després del tractament amb aquest fàrmac. A més, hem desenvolupat un test no invasiu, funcional i complementari per al diagnòstic de la malaltia de McArdle mitjançant la citometria de flux, que permet la detecció de l’expressió de la isoforma muscular de la glicogen fosforilasa en limfòcits T, sense necessitat de dur a terme una biòpsia muscular. / McArdle disease (glycogenosis type V), the most common muscle glycogenosis, is caused by inherited deficiency of the muscle isoform of glycogen phosphorylase. Patients are unable to obtain energy from their muscle glycogen, thus typically experience exercise intolerance with premature fatigue and contractures, sometimes accompanied by rhabdomyolysis and myoglobinuria. Currently, there is no therapy to restore the enzyme activity in patients, but the recently developed p.R50X/p.R50X knock-in McArdle mice opens the door to the study of the phenotypic consequences of muscle glycogen unavailability, as well as, to the evaluation and testing of new therapeutic approaches for this disorder. The main goal of this PhD thesis was to deepen into the phenotypic characterization of the murine model of McArdle disease, focusing our efforts on the study of the regulation of glycogen metabolism from a glycogen phosphorylase deficiency and the subsequent high glycogen content in the skeletal muscle cell, as well as, the development of an in vitro model of the disease that mimics the absence of the muscular isoform of glycogen phosphorylase, and subsequent glycogen accumulation observed in skeletal muscle from McArdle patients. Using the in vitro model, we demonstrated the efficacy of sodium valproate, an inhibitor of histone deacetylase, as a potential therapy for McArdle disease, thus we observed the re-expression of the brain isoform of glycogen phosphorylase and a dose-dependent reduction in glycogen accumulation. In addition, we developed a non-invasive, functional and complementary test for the diagnosis of McArdle disease by flow cytometry, which allows the detection of muscle isoform of glycogen phosphorylase expression in T lymphocytes, without the need to perform a muscular biopsy.

El transportador de melibiosa d'Escherichia coli (MelB) pot utilitzar l'energia electroquímica tant de H+, Na+ o Li+ per transportar la melibiosa a l'interior de les cèl·lules en contra del seu gradient de concentració. La MelB és una proteïna de 473 aminoàcids disposats en 12 hèlices transmembrana, amb els extrems N- i C-terminal situats al costat citoplàsmic. Mitjançant l'ús de mètodes espectroscòpics i bioquímics, hem analitzat el paper d'alguns aminoàcids en el bucle 7-8/final d'hèlix VII, que conté diversos aminoàcids aromàtics altament conservats, així com dos residus carregats negativament. Aplicant tècniques de mutagènesi, es van obtenir mutants individuals en què cada aminoàcid s'ha canviat a cisteïna excepte Ser-259, que també es va canviar a alanina. L'espectroscòpia de fluorescència va mostrar que els mutants dels aminoàcids conservats Tyr-256, Tyr-257, Phe-258 i Tyr-260 no uneixen substrats, i els espectres de diferència d'infrarojos de Y256C i Y260C van confirmar l’absència d’unió al substrat. Simulacions de dinàmica molecular van mostrar que aquests residus aromàtics formen part d'un bloc d’interaccions hidrofòbiques que jugaria un paper destacat en el mecanisme de transport. D'altra banda, els espectres de fluorescència i de diferència d’infraroig van demostrar que el mutant Cys del residu Asp-266 i del restant aminoàcid aromàtic del bucle 7-8 Phe-268 són capaços d'unir sodi i melibiosa en una forma semblant a la MelB nativa (Cless). Altres mutants de cisteïna (S259C, S259A, V261C, G263C, D264C, A265C i L267C) del bucle 7-8/final d'hèlix VII mostren una capacitat d'unió similar a Cless. Aquests resultats suggereixen que els aminoàcids conservats Tyr-256, Tyr-257, Phe-Tyr-258 i 260 tenen un paper estructural important en el mecanisme de transport de la MelB. / The melibiose transporter from Escherichia coli (MelB) can use the electrochemical energy of either H+, Na+ or Li+ to transport the melibiose to the cell interior against its concentration gradient. MelB is a protein of 473 amino acids arranged in 12 transmembrane helices, with the N- and C-terminus located in the cytoplasmic side. By using spectroscopic and biochemical methods, we have analyzed the role of some amino acids in the loop 7-8/end of helix VII, which contains several highly conserved aromatic amino acids as well as two negatively charged residues. Applying mutagenesis techniques, we obtained single mutants in which each amino acid has been changed to cysteine except Ser-259 also changed to alanine. Fluorescence spectroscopy showed that mutants of the conserved amino acids Tyr-256, Tyr-257, Phe-258 and Tyr-260 did not exhibit substrate binding, and the infrared difference spectra of Y256C and Y260C also showed no substrate binding. Molecular dynamics simulation experiments pointed out that these aromatic residues make part of a hydrophobic lock that would play a significant role in the transport mechanism. On the other hand, infrared difference and fluorescence spectra demonstrated that the Cys mutant of Asp-266 and the remaining aromatic amino acid of loop 7-8 Phe-268 are able to bind sodium and melibiose in a similar way as the wild type MelB (Cless). Other cysteine mutants (S259C, S259A, V261C, G263C, D264C, A265C and L267C) of the loop 7-8/end of helix VII show similar binding capacity as Cless. These results suggest that the conserved amino acids Tyr-256, Tyr-257, Phe-258 and Tyr-260 have an important structural role in the MelB transport mechanism.

This work is focused on the study of Polypurine Reverse Hoogsteen (PPRH) hairpins and their ability as gene correction tools. The repair of a point mutation at its endogenous gene locus has been the focus of many researchers during the past decades by using various approaches such as gene replacement, gene augmentation therapy (GAT) and different repair oligonucleotides. Cystic fibrosis, sickle-cell anemia and Tay-Sachs disease are some examples of the high number of disorders caused by a single-point mutation. In this work we present an alternative repair methodology using PPRH molecules, that although first developed in our laboratory as a gene-silencing tool, we hypothesized that they could also be applied as a gene correction tool. PPRHs are double-stranded DNA molecules formed by two antiparallel homopurine domains linked by a 5-thymidine loop, which form intramolecular reverse Hoogsteen bonds. PPRHs have been described to effectively bind to the dsDNA forming a triplex structure (Coma et al., 2005), and have been designed against either the template or the coding strand of the dsDNA (de Almagro et al., 2009, de Almagro et al., 2011a). Taking advantage of the ability of PPRHs to form a triplex structure with the pyrimidine strand of the dsDNA, in the present work we wanted to explore the ability of PPRHs to correct point mutations. First of all, we studied the in vitro conditions for PPRHs to bind to dsDNA and to maintain it in an open conformation by binding assays. Then, we designed different repair-PPRHs by adding to the PPRH core a repair tail complementary to the mutated region of the DNA except for the nucleotide to be corrected. These repair-PPRHs were used in mammalian cells to repair a point mutation in a dihydrofolate reductase (dhfr) plasmid. Finally, those results led us to further demonstrate the correction capability of repair-PPRHs in different mutant cell lines containing single point mutations in the endogenous dhfr gene. In addition, we developed improved Long-distance-repair¬PPRHs (LDR-PPRHs) to correct mutations that are very distant with respect to the DNA target where the PPRH core binds. Considering the possible high proportion of guanines in a PPRH sequence, an in vitro characterization of these molecules was carried out to study the effect of these guanines in the formation of secondary structures, such as G-quadruplex. The triplex conformation formed by repair-PPRHs with their pyrimidine target sequences was also studied even when repair-PPRHs folded in a G-quadruplex structure instead of a hairpin. As a second part of this thesis, we developed a new application of the electrophoretic mobility shift assay (EMSA) technique, to demonstrate the binding between miRNAs and their target sequences. For over two decades, research in our laboratory has been focused on the pharmacogenomic study of methotrexate (MTX) resistance in cancer chemotherapy upon inhibition of DHFR. Beside gene amplification, our research group has shown that many genes are involved in this mechanism. In this direction, cellular genes and micro-RNAs such as miR-224 and its target genes SLC4A4, CDS2 and HSPC159 were identified to play an important role in the resistance to MTX in colon cancer cells (Mencia et al., 2011). For this reason, miR-224 was chosen to show in a direct and specific manner, its ability to bind to the SLC4A4 target gene, thus setting up the EMSA as a simple and useful method to validate the interaction between a miRNA and a specific mRNA target. / Aquest treball es centra en l'estudi de pinces de polipurines "polypurine reverse Hoogsteen (PPRH)", i la seva capacitat com eina en la correcció de gens. La reparació d'una mutació puntual en el seu locus endogen ha sigut el principal tema de molts investigadors en les últimes dècades, utilitzant diverses estratègies com per exemple la teràpia de substitució de gens (GAT) i diferents oligonucleòtids de reparació. La fibrosi quística, anèmia de cèl.lules falciformes i la malaltia de Tay-Sachs son alguns exemples de la gran quantitat de trastorns causats per una mutació puntual. En aquest treball, presentem una metodologia de reparació alternativa que utilitza molècules PPRH, desenvolupades en el nostre laboratori inicialment com a eina de silenciament gènic, amb la hipòtesi que també es podrien aplicar com a eina de correcció de gens. Els PPRH son unes molècules d'ADN de doble cadena, formades per dos dominis de homopurines antiparal•eles, connectades per un bucle de 5 timidines, que formen enllaços de Hoogsteen reversos i intramoleculars. Els PPRHs s'han descrit per unir-se eficaçment a la doble cadena d'ADN formant una estructura de tríplex, i han sigut dissenyats tant contra la cadena motlle com contra la cadena codificant de l'ADN. Tenint en compte la capacitat dels PPRHs per formar una estructura de tríplex amb la cadena de pirimidines de l'ADN, en l'estudi presentat aquí volíem explorar la capacitat dels PPRHs per corregir mutacions puntuals. En primer lloc, es van estudiar les condicions in vitro en les que els PPRHs s'unien a la doble cadena de l'ADN i la mantenien oberta, mitjançant assajos d'unió. Tot seguit, hem dissenyat diferents PPRHs reparadors, tot afegint, al nucli del PPRH, una cua reparadora, complementaria a la regió mutada de l'ADN excepte pel nucleòtid que ha de ser corregit. Aquests PPRHs reparadors s'han utilitzat en cèl.lules de mamífer per reparar una mutació puntual en un plàsmid de la dihydrofolate reductasa (dhfr). Per últim, els resultats positius ens van portar a estudiar la capacitat dels PPRHs reparadors per reparar diferents línies cel.lulars que contenien diferents tipus de mutacions puntuals en el gen endogen de la dhfr. A més, també hem desenvolupat un PPRH millorat, anomenat LDR-PPRH, per "Long-Distance-Repair-PPRH", per reparar mutacions puntuals molt distants respecte la seqüència diana del nucli del PPRH. Tenint en compte la possible alta proporció de guanines en una seqüència de PPRH, es va dur a terme una caracterització in vitro d'aquestes molècules per estudiar l'efecte de les guanines en la formació d'estructures secundàries, com per exemple els G-quàdruplex. També es va estudiar la conformació de triple hèlix formada pels PPRH reparadors amb les seves seqüències diana de pirimidines, fins i tot quan el PPRH reparador es plega en una estructura de G-quàdruplex enlloc de en forma de pinça. Com a segona part de la tesi, hem desenvolupat una nova aplicació de la tècnica d'assaig de canvi de mobilitat electroforètica (EMSA), per demostrar la unció entre els miRNAs i les seves seqüències diana. Durant més de dues dècades, la investigació en el nostre laboratori s'ha centrat en l'estudi farmacogenòmic de la resistència al metotrexat (MTX) en la quimioteràpia contra el càncer, per la inhibició del gen de la dhfr. A més de l'amplificació gènica, el nostre grup ha demostrat que molts gens estan involucrats en el mecanisme, així com també hi estan involucrats els micro-RNAs. El miR-224 i els seus gens diana, SLC4A4, CDS2 i HSPC159 van ser identificats per jugar un paper important en la resistència al MTX en cèl.lules de càncer de colon. Per aquesta raó, el miR-224 va ser l'escollit per mostrar d'una manera directa i específica, la seva habilitat per unir-se al gen diana SLC4A4, establint així la tècnica d'EMSA com un mètode senzill i útil per validar la interacció entre un miRNA i la seva diana específica de mRNA.