La terapia génica consiste en la manipulación y utilización de material genético para el tratamiento de patologías. No obstante, esta estrategia requiere el uso de vectores de terapia génica para transportar el material genético al tejido diana de forma eficiente. Los vectores de terapia génica más comunes son los basados en el adenovirus humano de serotipo 5 (Ad5), porque, respecto a otros serotipos, el Ad5 tiene como ventaja su bioseguridad y facilidad de producción. Sin embargo, para que una célula sea transducida por el Ad5 ha de expresar un receptor reconocible por el Ad5, principalmente la proteína CAR, al que se une a través de su proteína fiber. El fiber de otros serotipos de adenovirus se une a receptores diferentes, permitiendo así la transducción de tipos celulares alternativos a los transducidos por el Ad5. De esta manera, una de las estrategias utilizadas para obtener un vector Ad5 con el tropismo de un serotipo diferente, es la pseudotipación del adenovirus, que consiste en substituir el fiber del Ad5 por el de otro serotipo. De entre los serotipos de adenovirus humanos, uno de los más recientemente descritos es el Ad52. Este serotipo contiene dos fiber de diferentes longitudes, lo cual es un rasgo compartido con los adenovirus humanos intestinales de la especie F. Como el Ad52 fue identificado a partir de muestras de heces de pacientes con gastroenteritis, se le atribuye también un tropismo intestinal, aunque no se ha podido demostrar. En el caso de los adenovirus de la especie F, su fiber largo reconoce el receptor CAR y, por lo tanto, se asume que su tropismo intestinal es mediado por el fiber corto. Dada la cercanía evolutiva entre el Ad52 y los adenovirus de la especie F, se asume que su fiber largo también reconocerá el receptor CAR, mientras que el fiber corto lo hará a otro receptor, dándole así al virus un tropismo independiente de CAR. Así pues, en esta tesis se ha generado un vector quimérico Ad5 pseudotipado con el fiber corto del Ad52 (Ad5/52s) con la finalidad de estudiar el rol específico de esta proteína fiber y, a la vez, caracterizar este adenovirus como vector de terapia génica. La primera parte de la tesis consiste en la generación del genoma del adenovirus Ad5/52s y la producción del vector, lo que incluye un estudio de su ciclo viral para optimizar la producción. El resultado del ciclo viral indica que éste se encuentra moderadamente retrasado respecto al del Ad5. Una vez producidos los vectores, se comparó su tropismo con el del Ad5 en cultivos in vitro, demostrando que la substitución del fiber comporta un cambio en el tropismo del Ad5 hacia líneas celulares, así como también aumenta su transducción en células de Schwann primarias, aunque no aumenta el tropismo del Ad5 en modelos intestinales in vitro. Ya caracterizado el virus in vitro, se demostró que el fiber corto del Ad52 no tiene afinidad por el receptor CAR, y su unión al receptor es dependiente del dominio knob del fiber. Posteriormente, el estudio comparativo de su distribución in vivo por administración intravenosa respecto al Ad5, mostró que el Ad5/52s tan solo transduce ligeramente pulmón a pesar de no ser secuestrado en hígado. Una vez descartados problemas de estabilidad, se observó que la baja eficiencia de infección del Ad5/52s se debe a una mayor inactivación de este virus en sangre, probablemente por la interacción con algún factor plasmático como la trombina. Finalmente, se modificó el fiber corto para limitar esta interacción, lo que permitió aumentar la supervivencia del Ad5/52s en sangre. / Gene therapy is a biomedical approach, which consists of manipulating and delivering genes to treat a wide range of diseases. Nevertheless, a successful treatment also requires a vector to carry the therapeutic gene towards the targeted tissue and thus to increase itstransduction efficiency. Human adenovirus 5 derived vectors (Ad5) are the most commonly usedin gene therapy strategies due totheir higher biosafety and productivity. However, the Ad5 mediated transduction is restricted to those cells expressing appropriate viral receptors (mainly the CAR protein), recognized by the fiber protein. The fiber of other adenovirus serotypes binds to different receptors, allowing transduction of alternative cell types of those transduced by Ad5. Thus, one strategy to modify the natural Ad5 tropism is adenovirus pseudotyping, which consists of Ad5 fiber replacement by the fiber protein of another serotype. Among the different human adenovirus serotypes, one of the most recently described is Ad52. This serotype contains two fiber of different lengths, which is a common trait shared with enteric Ad40 and Ad41 human adenovirus. The Ad52 was initially found in stool samples obtained from patients with gastroenteritis and, as a consequence, it is supposed to be also an enteric virus, although it has not been demonstrated yet. In the specie F adenoviruses the long fiber recognizes the CAR receptor, and therefore, their enteric tropism is assumed to be mediated by the short fiber. Given the evolutionary relationship between the Ad52 and the species F adenoviruses, it is assumed that its long fiber also recognizes the CAR receptor, while the short fiber will recognize a different receptor, thus giving the virus a CAR-independent tropism. So, in this thesis we have generated a chimeric Ad5 vector pseudotyped with the Ad52 short fiber (Ad5/52s) protein, in order to study the specific role of the fiber protein, in turn, characterize this adenovirus as a vector for gene therapy. The first part of the thesis consists in the generation of adenovirus Ad5/52s genome and its production, which includes a study of its viral cycle to optimize production. The results show that the Ad5/52s viral cycle is moderately delayed compared to Ad5. Once the vectors were produced, the tropism of Ad5/52s and Ad5 were compared in in vitro, demonstrating that fiber replacement induces a switch in the Ad5 tropism in different cell lines, as well as an increased transduction in primary Schwann cells, but not in intestinal models in vitro. Then, it was also demonstrated that short fiber from Ad52 doesn’t recognizes the CAR receptor, and also that its binding is mediated by the fiber knob domain. Further studies to compare Ad5 versus Ad5/52 in vivo biodistribution after intravenous administration showed only a slight transduction in lung with Ad5/52s, despite not being trapped in liver. Once discarded stability problems, it was observed that the low levels of transduction achieved by the Ad5/52s were caused by a faster inactivation in plasma, probably by an interaction with a plasmatic factor, such as thrombin. Finally, to minimize this interaction, the short fiber was mutated, which enhanced the Ad5/52s survival in blood.

L’activació de la via extrínseca de l’apoptosi és promoguda per l’activació dels anomenats “receptors de mort”. En aquest treball demostrem que l’expressió d’un súper-repressor d’NF-κB (SR-IκBα) sensibilitza a les cèl·lules HeLa a l’apoptosi, però no a la necroptosi, induïda per TNFα. Aquest procés involucra l’activació de les caspasses i l’alliberament del citocrom c de la mitocòndria. El silenciament específic de cada un dels membres anti-apoptòtics de la família de Bcl-2 indica que Bcl-xL te un rol específic i no redundant en la regulació de l’activació de la via de supervivència o de mort induïda per TNFα, sense alterar l’activació d’NF-κB. En aquest context, es mostra que el silenciament de Bcl-xL no impedeix la regulació a l’alça, induïda per TNFα, de cIAP2, un gen diana d’NF-κB. A més a més, el silenciament de Bcl-xL no incrementa el percentatge de nuclis apoptòtics en front a l’estímul de TNFα en cèl·lules que sobre-expressen el SR-IκBα. A més, aquest resultats han estat corroborats en altres línies tumorals, com les cèl·lules RD i DU-145, demostrant que esdevenen sensibles a l’apoptosi induïda per TNFα quan Bcl-xL està silenciat, sense afectar a l’activació d’NF-κB. En conjunt, aquests resultats suggereixen quan Bcl-xL no és funcional, NF-κB no pot exercir el seu rol protector encara que la seva activitat transcripcional no es vegi alterada. D’altra banda, estimulant un panell més estens de línies cel·lulars amb TNFα, també s’ha pogut establir que algunes d’elles són resistents a l’acció de la citoquina malgrat el silenciament de l’expressió de Bcl-xL com, per exemple, la majoria de les línies cel·lulars derivades de glioblastoma multiforme humà (GBM). En canvi, utilitzant com a model cel·lular de GBM les cèl·lules U87MG, s’ha demostrat que aquestes esdevenen sensibles a l’acció de TRAIL quan l’expressió de Bcl-xL, però no de Bcl-2, Bcl-w o Mcl-1, es troben silenciada. Aquesta mort cel·lular és de tipus apoptòtic i involucra, tant l’activació de caspasses com l’alliberament de citocrom c i Smac / DIABLO de la motocòndria. El silenciament d’Smac / DIABLO és capaç de revertir la sensibilització provocada per la disminució en els nivells de Bcl-xL en front a l’estímul citotòxic de TRAIL, malgrat les caspasses esdevenent processades en els seus fragments d’activació. En conjunt, els resultats presentats en aquesta tesi demostren que la proteïna anti-apoptòtica Bcl-xL juga un paper clau no redundant en l’apoptosi induïda per via extrínseca i que la funció de protecció exercida per Bcl-xL recau en la inhibició de l’alliberament d’Smac / DIABLO cap al citosol. / The activation of the extrinsic pathway is promoted when the death receptors are triggered. In the present study we demonstrate that the expression of a super-repressor of NF-κB (SR-IκBα) sensitizes HeLa cells towards apoptosis, but not necroptosis, induced by TNFα. This process involves both the activation of caspases and the release of cytocrome c from the mitochondria. The specific knockdown of each anti-apoptotic member of the Bcl-2 family unravels a specific and non-redundant role of Bcl-xL, which regulates the TNFα-mediated switch between cell survival and cell death without affecting NF-κB activation. In this context, we show that the silencing of Bcl-xL does not impair TNFα-mediated cIAP2 upregulation, a well-known NF-κB gene target. Furthermore, Bcl-xL knockdown does not raise the number of apoptotic nuclei in SR-IκBα-transformed cells after TNFα challenge. Finally, we corroborate these results to other kinds of tumoral cells such as RD and DU-145, showing that both become sensitive to TNFα when Bcl-xL is downregulated without affecting NF-κB activation. Altogether, these results suggest that when Bcl-xL function is impaired, NF-κB cannot exert its protective role, even though its transcriptional function remains unaltered. Otherwise, the use of a more extensive panel of cell lines cultured in the presence of TNFα, allowed us to stablish that some of them are resistant to the citotoxic effect of the citoquine, even when Bcl-xL is downregulated. However, we wanted to ascertain whether these Bcl-xL-silenced TNFα-resistant cells were also insensitive to other death ligands, such as TRAIL. Among those cells, we were interested in human glioblastoma multiforme (GBM)-derived cell lines. By using U87MG cells as a cellular model of GBM-derived cells, we show that the specific knockdown of Bcl-xL, but not that of Bcl-2, Bcl-w or Mcl-1, renders cells sensitive to TRAIL-induced apoptosis. This cell death is apoptotic and involves the activation of caspases and the cytosolic release of both cytocrome c and Smac / DIABLO from the mitochondria. The downregulation of Smac / DIABLO is able to prevent the sensibilization afforded by Bcl-xL knockdown towards TRAIL-mediated cytotoxicity, even though the caspases become processed into their active fragments. Overall, the results presented in this dissertation demonstrate that, first, the anti-apoptotic protein Bcl-xL plays a key and non-redundant role in the execution of the apoptotic program induced by the activation of the death receptors and, second, that the protective function exerted by Bcl-xL relies on the prevention of Smac / DIABLO release to the cytosol.

Tesi realitzada a l'Institut de Recerca Biomèdica de Barcelona (IRBB) / Spinal bulbar muscular atrophy (SBMA) is a rare hereditary neuromuscular disease caused by the elongation of a polymorphic polyglutamine (polyQ) tract in the N-terminal region of the transactivation domain (NTD) of androgen receptor (AR). Although the molecular basis of SBMA is not yet fully understood, the observation of nuclear inclusions containing AR fragments in specific tissues of SBMA patients has led to the suggestion that it is linked to AR aggregation. To characterize the molecular mechanism of this process we have investigated the structural properties of the polyQ tract present in AR as well as the early stages of its oligomerization in vitro by nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy in solution. To study the structural property of the AR aggregates in tissue, the Seprion ligand was used for quantification of AR aggregate load in a SBMA mouse model. A combination of atomic force microscopy (AFM), transmission electron microscopy (TEM) and high-resolution microscopy was used to investigate the Seprion ligand captured aggregates from muscle and spinal cord tissue. The results indicated that aggregated structures from spinal cord extract differ remarkably from the fibrillar species isolated from muscle tissue. We found that the AR fibrils in the muscles accumulate and increase their length as the animals age. Our results indicate that there are differences between the androgen receptor variants in muscle and spinal cord, with more N-terminally truncated AR found in muscle compared to spinal cord. We propose that truncated AR forms aggregates and leads to AR fibrillar species in muscles and that mutant AR97Q plays a role in the recruitment of partner interacting proteins in an age-related fashion. Our studies into the elucidation of the early stages of oligomerization indicated that the polyQ tract is partially alpha-helical, a propensity that increases with its length. In addition, a specific region of the N-terminus of the NTD, distinct from the polyQ tract, appears to be responsible for the inter-molecular interactions that nucleate AR aggregation. Studying the interactions between AR and the molecular chaperones Hsp40 and Hsp72 respectively, by solution NMR spectroscopy we found that the Hsp72 and Hsp40 both bind to (23)FQNLF(27) motif, whereas the Hsp40 binds additionally to (54)LLLQQQQ(61). These findings provide a simple mechanism for the disassembly of the complex between AR and molecular chaperones required for androgen receptor function and emphasize the therapeutic potential of allosteric regulators of Hsp72 and Hsp40 and provide new insights into the role of the chaperone machinery in protein quality control in neurodegenerative diseases. / L'atròfia muscular espinobulbar (SBMA) és una malaltia neuromuscular hereditària causada per una elongació d'una regió de poliglutamines localitzada en el domini de transactivació del receptor d'andrògens (AR). Malgrat que la base molecular d'aquesta malaltia encara no es coneix del tot, l'observació d'inclusions nuclears que contenen fragments del receptor dóna suport a la hipòtesi que està associada a l'agregació de l'AR. Per tal de caracteritzar el mecanisme molecular d'aquest procés hem investigat les propietats estructurals de la regió de poliglutamines del receptor així com els primers estadis de la seva oligomerització in vitro mitjançant espectroscòpia de ressonància magnètica nuclear (NMR) en solució. Per tal d'estudiar les propietats estructurals dels agregats que es formen en els teixits hem fet servir el lligand Seprion per aïllar els agregats que es formen en un model animal de SBMA. Mitjançant una combinació de microscòpia de força atòmica (AFM), microscòpia electrònica de transmissió (TEM) i microscòpia d'alta resolució hem caracteritzat els agregats formats tant en el múscul com en la medul·la espinal en aquest model animal. Els resultats indiquen que els agregats de l'AR que es formen en el múscul son clarament diferents d'aquells que es formen en la medul·la i, a més, que el fenotip dels animals empitjora a mesura que s'acumulen agregats en el primer d'aquests teixits. Els nostres resultats indiquen que les diferències que observem entre els agregats que es formen en el múscul i aquells que es formen en la medul·la estan associades a la presència de fragments d'AR en el primer d'aquest teixits. Proposem doncs, que formes truncades d'AR agreguen per formar espècies fibril·lars en el múscul del model animal i que aquestes provoquen el fenotip, que empitjora amb l'edat, perquè, en agregar, recluten proteïnes nuclears que altrament serien solubles. El nostre estudi dels primers estadis del mecanisme d'oligomerització indica clarament que la regió de poliglutamines és parcialment helicoïdal i que aquesta propensitat augmenta amb la seva longitud. A més hem identificat una regió del domini de transactivació, allunyada de la regió de poliglutamines, com a responsable de les primeres interaccions intermoleculars que tenen lloc durant el mecanisme d'oligomerització. En el nostre estudi de la interacció entre AR i les xaperones moleculars Hsp40 i Hsp72 hem descobert, mitjançant NMR, que totes dues proteïnes s'uneixen al motiu (23)FQNLF(27) del domini N-terminal i que l'Hsp40 s'uneix, a la vegada també al motiu (54)LLLLQQQQ(61) que hi ha a l'inici de la regió de poliglutamines. Aquestes descobertes suggereixen un senzill mecanisme per a desensamblatge del complex entre l'AR i les xaperones moleculars que té lloc durant l'activació del receptor per l'hormona testosterona, emfatitzen el potencial terapèutic de reguladors al·lostèrics de Hsp40 i Hsp72 i contribueixen a una millor comprensió del paper que les xaperones moleculars tenen en el control de qualitat de proteïnes en malalties neurodegeneratives.

Las alteraciones mitocondriales están vinculadas a la mayor vulnerabilidad de padecer enfermedades durante el envejecimiento. La edad avanzada es un factor determinante de la incidencia y gravedad de la cardiopatía isquémica. Estudios preclínicos sugieren la existencia de un daño celular intrínseco, por mecanismos no del todo establecidos, que contribuye a un incremento de la susceptibilidad del miocardio senescente al daño isquémico. Esta tesis investiga el papel de la comunicación mitocondria-retículo sarcoplásmico (RS) en el deterioro funcional de los cardiomiocitos durante el envejecimiento. El estudio ecocardiográfico ha demostrado que la función cardiaca en el reposo se mantiene preservada en los animales viejos. No se han observado cambios debidos a la edad en el potencial de membrana mitocondrial ni en el consumo de oxígeno en condiciones de reposo en mitocondrias aisladas de corazones de ratón. El consumo de oxígeno inducido por ADP ha revelado que las mitocondrias interfibrilares de corazones viejos no alcanzan el nivel respiratorio máximo. Análisis proteómicos de segunda generación han demostrado un aumento de la oxidación de proteínas mitocondriales relacionado con el envejecimiento. Esta tesis ha investigado el posible efecto de la edad sobre la capacidad de las mitocondrias para captar calcio. En cardiomiocitos la captación mitocondrial del calcio procedente del RS se ha visto reducida de forma significativa en el envejecimiento. Esta disminución de la captación de calcio mitocondrial se asoció a una reducida capacidad de regeneración de NAD(P)H y a un incremento de la producción de ROS mitocondriales en cardiomiocitos viejos. Ensayos de inmunofluorescencia y de ligación por proximidad han revelado una comunicación defectuosa entre la mitocondria y el RS en cardiomiocitos de corazones senescentes. La desestructuración de las uniones entre el RS y la mitocondria con colchicina fue capaz de reproducir el efecto de la edad sobre las alteraciones en el manejo/transferencia de calcio entre ambos orgánulos en cardiomiocitos jóvenes. La segunda parte de este trabajo investiga el impacto potencial de las alteraciones mitocondriales sobre los efectos adversos del envejecimiento en el daño por isquemia y reperfusión (IR). Los corazones aislados y perfundidos de ratones viejos sometidos a IR desarrollaron mayor rotura sarcolemal y tamaño de infarto, junto con un retraso significativo del desarrollo del rigor isquémico. Los cardiomiocitos viejos sometidos a isquemia, desarrollaron una caída más rápida del potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm) junto con un retraso paradójico en la aparición del rigor. La tasa de recuperación transitoria del ΔΨm durante los primeros minutos de isquemia, debida a la actividad reversa de la FoF1-ATPsintasa, se encontró significativamente disminuida en cardiomiocitos viejos. El análisis proteómico ha demostrado un aumento de la oxidación de diferentes subunidades de la FoF1-ATPsintasa asociado al envejecimiento. La alteración del ΔΨm observado en los cardiomiocitos viejos se asoció a una menor captación de calcio mitocondrial durante la IR. A pesar de esto, el desarrollo de permeabilidad transitoria (mPT) fue mayor en los cardiomiocitos senescentes y este efecto se correlacionó con una mayor hipercontractura y muerte celular en reperfusión. Por lo tanto, el desarrollo de una comunicación defectuosa entre el RS y la mitocondria durante el envejecimiento produce un intercambio ineficiente de calcio entre ambos orgánulos, que contribuye al desajuste en la demanda/aporte de energía y a un aumento consiguiente del estrés oxidativo. La oxidación de la FoF1-ATPsintasa se asocia a una alteración de su funcionamiento y a un incremento de la sensibilidad de la mitocondria para desarrollar mPT. Debido al modelo recientemente propuesto según el cual la FoF1-ATPsintasa forma parte del mPTP, es posible especular que la oxidación de esta enzima está asociada al aumento del daño por IR en el miocardio senescente. / Mitochondrial alterations are critically involved in the increased vulnerability to disease during aging. On the other hand, aging is a major determinant of the incidence and severity of ischemic heart disease. Preclinical information suggests the existence of intrinsic cellular alterations that contribute to ischemic susceptibility in senescent myocardium, by mechanisms not well established. The first part of this thesis investigates the contribution of mitochondria-sarcoplasmic reticulum (SR) communication in the functional decline of cardiomyocyte during aging. Echochardiographic analysis of aging mice (>20 months) showed a rather preserved cardiac contractile function in resting conditions respect to young mice (5-6 months). ATP/phosphocreatine were preserved in hearts from old mice as quantified by RMN spectroscopy. In isolated mitochondria from young and old mouse hearts, mitochondrial membrane potential and resting O2 consumption were similar in both groups. However, stimulation of O2 consumption after the addition of ADP resulted in a partial failure of interfibrillar mitochondria from aged hearts to achieve maximal respiratory rate. Second generation proteomics disclosed an increase of mitochondrial protein oxidation in advanced age. Because both energy production and oxidative status are regulated by mitochondrial calcium, this work further investigated the effect of age on mitochondrial calcium uptake. While no age-dependent differences were found in calcium uptake kinetics in isolated mitochondria, in which the contribution of other organelles and sarcolemma is absent, mitochondrial calcium uptake secondary to SR calcium release was significantly reduced in cardiomyocytes from old hearts. Reduced mitochondrial calcium uptake in aging cardiomyocytes was associated with decreased NAD(P)H regeneration and a concomitant increase of mitochondrial ROS production manifested only when cells were exposed to high frequency electrical stimulation. Immunofluorescence and proximity ligation assay identified defective communication between mitochondria and SR in cardiomyocytes from aged hearts. Functional analysis of calcium handling in fluo-4 loaded cardiomyocytes disclosed an altered pattern of RyR gating properties. The observed defects in SR calcium transfer and in calcium handling could be reproduced in young cardiomyocytes after interorganelle disruption with colchicine, at concentrations that had no significant effect in aged cardiomyocytes or isolated mitochondria. The second part of this work investigates the potential impact of the altered mitochondrial function in the adverse effect of aging on myocardial ischemia and reperfusion (IR) injury. Isolated perfused hearts from old mice submitted to transient IR displayed an increase in hypercontracture, sarcolemmal rupture and infarct size, as compared to hearts from young mice, despite a paradoxical delay ischemic rigor contracture onset. In isolated cardiomyocytes from aging hearts submitted to IR there was a faster decline of mitochondrial membrane potential (ΔΨm) in comparison with young ones, but ischemic rigor shortening was also delayed. Transient recovery of ΔΨm observed during ischemia, secondary to the reversal of mitochondrial FoF1-ATPsynthase to ATPase mode, was markedly reduced in aging cardiomyocytes. Proteomic analysis demonstrated an increased oxidation of different subunits of FoF1-ATPsynthase. Altered bionergetics in aging cells was associated with reduced mitochondrial calcium uptake and more severe cytosolic calcium overload during both ischemia and reperfusion. Despite attenuated mitochondrial calcium overload, the occurrence of mitochondrial permeability transition pore (mPTP) opening, hypercontracture and cell death were increased during reperfusion in cardiomyocytes from old mice. In vitro studies demonstrated a significantly reduced calcium retention capacity in interfibrillar mitochondria from aging hearts. Thus, defective SR-mitochondria communication underlies inefficient interorganelle calcium exchange that contributes to energy demand/supply mismatch and oxidative stress in the aged heart. This may spread on an altered FoF1-ATPsynthase and increased sensitivity of mitochondria to undergo mPTP opening as important determinants of the reduced tolerance to ischemia-reperfusion in senescent myocardium. Because ATPsynthase has been proposed to conform mPTP, it is tempting to hypothesize that oxidation of ATPsynthase underlie both phenomena.

Les vaques de llet sofreixen pèrdues de calci (Ca) quan comença la lactació i poden veure’s afectades per la hipocalcèmia clínica (sèrum Ca < 6mg/dL) o subclínica (Ca < 8.5mg/dL). Donat que la incidència clínica és del 5%, el problema més rellevant es troba en els casos subclínics (SCHC) perquè tenen una prevalença més elevada. Aquests casos no poden ser tractats degut a la falta d’eines de diagnosi. Per tal d’estudiar l’impacte, les conseqüències i la regulació de SCHC, i per desenvolupar estratègies de diagnòstic i de prevenció, es van dur a terme quatre estudis. Al primer estudi, es va avaluar l’associació de SCHC amb vàries malalties del peripart. El 75% de les vaques tenien SCHC. El desplaçament d’abomàs, la ketosi, la retenció de placenta i la metritis van ser més propenses a trobar-se en vaques amb SCHC. Les vaques afectades tenien una producció de llet més elevada. El zel apareix abans en vaques normocalcèmiques. A més, la gravetat de les diferents malalties està relacionada amb la intensitat de la SCHC. Per entendre els mecanismes involucrats, un segon estudi es va dur a terme per clarificar els papers de la calcitonina a l’inici de la malaltia i a la prevenció de la hipocalcèmia sota acidosi metabòlica. Una pujada de calcitonina en vaques amb SCHC greu després de parir perjudica la recuperació del Ca sanguini perquè la resposta del receptor de la PTH (PTHR) no és suficient com per activar la vitamina D i compensar l’efecte de la calcitonina. L’acidosi metabòlica prevé la hipocalcèmia perquè l’expressió de PTHR s’incrementa al ronyó. A més, l’activitat de la calcitonina es veu perjudicada a pHs baixos i això incrementa el rol hipercalcèmic de la PTH. Basat en aquest fet, al tercer estudi es va intentar una estratègia per prevenir la hipocalcèmia basada en immunització passiva contra calcitonina. Anticossos policlonals van neutralitzar la calcitonina in vitro i a un model de rata, augmentant la concentració de Ca en sang. Un mètode assequible per produir en massa va ser derivat d’una naïve phage library de ScFv. El ScFv B10 va reconèixer i neutralitzar la calcitonina in vitro, però no va afectar els nivells de Ca en sang quan es va administrar en vedells o vaques. Més estudis seran necessaris per entendre les dificultats de l’estratègia proposada. Un sistema de diagnòstic seria molt útil per identificar i tractar vaques hipocalcèmiques. En el quart i últim estudi, es va desenvolupar un sistema analític semiautomàtic i portable basat en transistors de camp ió-selectius amb membranes fotocurables selectives per ions de Ca2+. Aquest sensor determina concentracions de Ca en sang de boví de forma ràpida i fiable i pot ser aplicat en mesures en vaques al camp. / Dairy cows suffer blood calcium (Ca) losses as lactation begins and might be affected by hypocalcemia in its clinical (serum Ca < 6mg/dL) or subclinical state (serum Ca < 8.5mg/dL). Since clinical incidence is only about 5%, the most relevant problem concerns subclinical cases (SCHC) because of a higher prevalence. These cases cannot be treated due to the lack of diagnostic tools. In order to study the impact, consequences and regulation of SCHC and to develop preventive and diagnostic strategies, four studies were conducted. In the first study, the association of SCHC with several periparturient diseases was evaluated. Seventy five percent of cows incurred SCHC. Displaced abomasum, ketosis, retained placenta, and metritis were more likely to happen in cows with SCHC. Affected cows had a greater milk production. Normocalcemic cows showed their first heat sooner. Also, the severity of SCHC is related to the severity of the different periparturient diseases. In order to understand the exact mechanisms involved, a second study was performed to clarify the potential roles of calcitonin in the onset of SCHC and in the prevention of hypocalcemia under metabolic acidosis. A calcitonin rise in severe SHCH cows after calving impairs the recovery of blood Ca because PTH receptor (PTHR) response is not sufficient to activate vitamin D and compensate the calcitonin effect. Metabolic acidosis prevents hypocalcemia because the expression of PTHR is up-regulated in kidney. Moreover, an impairment of calcitonin activity at low pH enhances the hypercalcemic role of PTH. Based on this calcitonin role, in the third study an approach to prevent hypocalcemia through passive immunization against calcitonin was tested. Polyclonal antibodies neutralized calcitonin in vitro and in a rat model, raising the blood Ca concentration. An affordable method of mass-production was designed from a naïve ScFv phage library. The ScFv B10 recognized and neutralized calcitonin in vitro, but it did not affect blood Ca levels when administered to cattle requiring further research to understand the main difficulties of the proposed strategy. A diagnostic system would be very useful to identify and treat hypocalcemic cows. In the fourth and last study we developed a portable semiautomatic analytical system based on ion-selective field effect transistors with Ca2+ ion selective photocurable membranes. This sensor determines bovine serum calcium concentration in a reliable and fast way and can be applied in the field in cow-side measurements.

La acuicultura constituye una de las actividades productivas de mayor desarrollo en las últimas décadas. Entre los peces de origen marino, la dorada (Sparus aurata) es la especie de mayor producción en España y en Europa. Sin embargo, a pesar del interés en la producción, los recursos genómicos para estudiar el impacto de los nutrientes de la dieta en el metabolismo son limitados. Actualmente, el análisis de expresión génica a nivel de mRNA es una de las principales herramientas utilizadas en estudios de genómica funcional. En este sentido, el estudio del transcriptoma mediante tecnologías de pirosecuenciación de última generación y el desarrollo de microarrays, que determinan perfiles de expresión de decenas de miles de genes, representan un avance para los estudios de la funcionalidad génica. El objetivo de esta tesis doctoral fue realizar un análisis transcriptómico del músculo esquelético de dorada con aplicación para estudios nutricionales, e identificar mediante microarrays, genes biomarcadores de la utilización de nutrientes. Cinco grupos de doradas fueron alimentadas durante 23 días con dietas de diferente composición: HPLLLC, MPHLLC, LPLLHC, MPLLHC, LPHLLC (letras mayúsculas representan niveles de nutrientes [High, Medium and Low], letras en superíndice representan el tipo de nutriente [Protein, Lipid and Carbohydrate]). Adicionalmente, durante un periodo similar, un grupo de doradas se mantuvo en ayuno. Se llevaron a cabo dos diseños experimentales: el experimento 1 fue diseñado para estudiar el transcriptoma del músculo esquelético de dorada y el experimento 2 tuvo como finalidad estudiar el aprovechamiento de los nutrientes de la dieta y el efecto de la composición sobre la digestibilidad, ingesta, parámetros somáticos y metabolismo intermediario. El análisis transcriptómico realizado con RNA de músculo esquelético de doradas, permitió obtener 691433 secuencias de alta calidad, correspondientes a 275,9 megabases. 4799 anotaciones fueron asignadas a categorías de ontología génica (GO). El análisis GO mostró que los procesos biológicos más representados correspondieron a oxidación-reducción, ciclo celular y división celular. Las funciones moleculares más abundantes fueron: unión a proteínas, unión a nucleótidos y actividad transferasa. La información transcriptómica se utilizó para analizar, mediante RT-qPCR, el efecto del estado nutricional sobre la expresión de genes relacionados con la cadena de transporte electrónico, fosforilación oxidativa y translocación de ATP al espacio intermembrana. De los genes analizados, la expresión de citocromo C oxidasa subunidad 5B y la caja de unión a ATP subfamilia G mostró una fuerte dependencia de la composición de la dieta, incrementando la expresión de dichos genes en peces alimentados con la dieta de menor contenido proteico y mayor contenido de carbohidratos. La información transcriptómica se utilizó, asimismo, para estudiar el efecto del estado nutricional y la composición de la dieta sobre el patrón global de expresión en músculo mediante microarrays. El análisis GO indicó que el ayuno se asocia a expresión diferencial disminuida en genes con funciones moleculares de actividad antioxidante y de unión a proteínas. Al realizar la comparación entre peces alimentados con dietas de diferente composición, se observó que las dietas de alto/medio contenido en proteína y bajo contenido de carbohidratos promovieron un incremento en la expresión de genes implicados en funciones de crecimiento, regulación y organización del citoesqueleto. Adicionalmente, mediante RT-qPCR, se analizó la expresión de genes implicados en procesos como: regulación de la miogénesis, regulación del crecimiento y vía de señalización Akt/TOR. En esta tesis doctoral, podemos concluir que la expresión de citocromo C oxidasa subunidad 5B, caja de unión a ATP subfamilia G, GHRs y MyoD2 podrían resultar de utilidad en estudios biotecnológicos encaminados a optimizar la utilización de los nutrientes en las dietas de doradas en cultivo. / [eng] The aquaculture production system is the worldwide fastest growing animal food-producing sector. Gilthead seabream (Sparus aurata) is the leading species for aquaculture production in Spain and, among the marine fish, in Europe. Despite the commercial interest in improving aquaculture production, at present the genomic resources to study the impact of dietary nutrients in fish metabolism and growth are limited.Currently, gene expression analysis at mRNA level represents one of the main tools for functional genomic studies. In this sense, the transcriptomic analysis through pyrosequencing reaction with the 454 sequencing platform and the study of changes in the global pattern of gene expression by means of microarrays, represent a huge progress to determine the control of gene expression and their functions.The aim of this PhD thesis was to perform a transcriptomic analysis in skeletal muscle from gilthead seabream fed submitted to different nutritional conditions in order to identify, using microarrays, potential biomarker genes of interest to improve the use of dietary nutrients. To this end, 5 groups of S. aurata were fed for 23 days the following diets: HPLLLC, MPHLLC, LPLLHC, MPLLHC and LPHLLC. The 5 diets differ in the nutrient composition; capital letters represent macronutrient levels (High, Medium or Low), and superscript letters represent macronutrient (Protein, Carbohydrate or Lipid). Additionally, during the same time period, a group of fish was deprived of food. Two experimental procedures were carried out: experiment 1 was designed to determine the transcriptome in skeletal muscle of gilthead seabream; and experiment 2 allowed us to analyze the metabolic effects of the diet composition on the digestibility, food intake, somatic parameters and expression of key genes related to growth and fish intermediary metabolism.Transcriptomic analysis performed with RNA isolated from S. aurata skeletal muscle, yielded 691433 sequences of high quality, that corresponded to 275.9 megabases. 4799 entries were assigned to different categories of Gene Ontology (GO). GO analysis showed that the most represented biological processes corresponded to oxidation-reduction, cell cycle and cell division processes. Among the most abundant molecular functions were found: protein binding, nucleotide binding and those involving transferase activity. Transcriptomic information was used to design specific primers to analyze, by RT-qPCR, the effects of nutritional status on the expression of genes related to the electron transport chain, oxidative phosphorylation and translocation of ATP to the mitochondrial intermembrane space. From the analyzed genes, the expression of cytochrome C oxidase subunit 5B and ATP binding cassette subfamily G showed a strong dependence on the diet composition; the expression of both genes is upregulated in the fish fed low protein/high carbohydrate diets.In addition, transcriptomic data was used to design oligonucleotide microarrays to allow analysis of changes in gene expression profiling in muscle of fish under different nutritional conditions. GO analysis indicated a decreased expression of genes associated with antioxidant activity and protein binding in muscle of starved fish. Feeding with diets of high/medium protein and low carbohydrate content increased the expression of genes involved in growth and the regulation and organization of the cytoskeleton. Furthemore, RT-qPCR was performed to determined the expressional changes of genes involved in regulation of myogenesis, growth and the Akt/TOR signaling pathway.The results presented in this thesis allowed us to conclude that changes in the expression of cytochrome C oxidase subunit 5B, ATP binding cassette subfamily G, growth hormone receptors and MyoD2 could be useful to develop biotechnological studies to optimize the use of dietary nutrients supplied to gilthead seabream in culture.

La proteïna quinasa CK2 és una Serina/Treonina quinasa àmpliament expressada en tots els organismes eucariotes. Fins el dia d’avui, més de 300 substrats per aquesta quinasa han estat descoberts, essent molts d’ells essencials per la viabilitat cel·lular. Per aquest motiu, CK2 ha estat considerada com una quinasa decisiva per la viabilitat de totes les cèl·lules eucariotes. CK2 juga un paper clau en la supervivència cel·lular, proliferació i mecanismes antiapoptòtics, observant-se que la seva desregulació es troba associada a diferents malignitats humanes. A més a més, els efectes pleiotròpics d’aquesta proteïna han connectat CK2 amb altres vies que són crucials en diferents processos involucrats en la tumorigenesis. Malgrat tot, poc es coneix sobre la implicació de CK2 i les vies de senyalització en el carcinoma renal de cèl·lules clares (ccRCC). En aquest treball s’ha volgut estudiar la implicació de CK2 en les bases moleculars del ccRCC, analitzant l’efecte de la inhibició de CK2 sobre les vies de senyalització de Akt i ERK1/2 davant la resposta a heparin-binding EGF-like growth factor (HB-EGF), així com la connexió entre CK2 i ErbB4, proteïnes que s’han trobat disminuïdes en ccRCC. Per tal d’assolir aquest objectiu, l’activitat de CK2 ha estat inhibida mitjançant l’ús de diferents inhibidors farmacològics, i les subunitats reguladores i catalítiques de CK2 han estat silenciades de forma independent mitjançant short hairpin RNA (shRNA) en cèl·lules de túbul proximal derivades d’un ronyó sa (HK-2) i cèl·lules derivades d’un adenocarcinoma primari de cèl·lules clares (786-O). El resultat més impactant és que la inhibició de CK2, tant per inhibidors químics com per shRNA, perjudica l’activació de Akt i ERK1/2 en resposta a HB-EGF, que són vies de senyalització decisives involucrades en el procés de mort cel·lular, proliferació i autofàgia. De la mateixa forma, la disminució de la subunitat reguladora CK2β ve acompanyada de canvis en l’expressió de marcadors de transició epiteli-mesènquima (EMT), tals com E-caderina i Snail1. És interessant assenyalar que els resultats d’aquests estudi suggereixen que la disminució de CK2β indueixen l’expressió de HIF-α i la fosforilació de STAT3, contribuint a la regulació de E-caderina i Snail1 en les cèl·lules derivades de ccRCC. Per altra banda, la sobre-expressió de ErbB4 en 786-O altera la proliferació cel·lular, així com potencia l’activació de Akt i ERK1/2 davant de l’estimulació amb HB-EGF. A més a més, la inhibició de CK2 per CX-4945 i el silenciament de CK2β per siRNAs causa una reducció significativa dels nivells de ErbB4. Els resultats d’aquesta cerca mostren que CK2 afecta a components claus de les vies de senyalització, tals com ErbB4, Akt, ERK1/2, HIF-α, Snail 1 i STAT3 en cèl·lules renals, recolzant la implicació de CK2 en el ccRCC. / Protein kinase CK2 is a Serine/Threonine kinase widely expressed in all eukaryotic organisms. To date, more than 300 substrates for this kinase have been discovered, most of them essential for cell viability. For that reason, CK2 has been considered as a protein kinase decisive for the viability of all eukaryotic cells. CK2 plays pivotal roles in cell survival, proliferation and anti-apoptotic mechanisms, and its dysregulation is associated with human malignancies. Furthermore, the pleiotropic effects of this protein have connected CK2 with other pathways that are crucial in several processes involved in tumorigenesis. However, little is known on the potential cross-talk between CK2 and these signalling pathways in clear cell renal cell carcinoma (ccRCC) cells. The purpose of this work has been to study the involvement of CK2 in the molecular basis of ccRCC, analysing the effect of CK2 inhibition on Akt and ERK1/2 signalling pathways in response to heparin-binding EGF-like growth factor (HB-EGF), as well as the connection between CK2 and ErbB4, which has been found downregulated in ccRCC. In order to assess this gkoal, CK2 activity has been targeted by pharmacological inhibitors, and the regulatory and catalytic CK2 subunits have been independently silenced by short hairpin RNA (shRNA), in tubular proximal cells derived from normal kidney (HK-2), and cells derived from a primary clear cell adenocarcinoma (786-O). The most striking result is that CK2 inhibition, either by chemical inhibitors or shRNA downregulation, impairs the activation of Akt and ERK1/2 in response to HB-EGF, which are decisive signalling pathways involved in the process of cell death, proliferation and autophagy. Likewise, downregulation of regulatory subunit CK2β is accompanied by changes in the expression of Epithelial-Mesenchymal-Transition (EMT) markers, such as E-cadherin and Snail1. Interestingly, the results of this study suggest that CK2β downregulation induces HIF-α expression and STAT3 phosphorylation which may contribute to E-cadherin and Snail1 regulation in ccRCC cells. On the other hand, overexpression of ErbB4 in 786-O cells alters cell proliferation as well as enhances HB-EGF-induced Akt and ERK1/2 activation. In addition, CK2 inhibition by CX-4945 and downregulation of CK2β by siRNAs results in a significant reduction of ErbB4 levels.The results of this research show that CK2 affects key components of signalling pathways, such as ErbB4, Akt, ERK1/2, HIF-α, Snail 1 and STAT3 in renal cells, supporting the potential involvement of CK2 in ccRCC.

Els glucocorticoides s'utilitzen comunament com a tractament adjuvant per tractar efectes secundaris i tenen una activitat antiproliferativa en diversos tumors però, d'altra banda, el seu efecte proliferatiu s’ha documentat en diversos estudis i en alguns d'ells implica la propagació del càncer. Aquestes paradoxes són comuns en l’investigació del càncer. Molt sobint, els mateixos gens semblen ser a l’hora promotors i inhibidors del càncer. Amb el present treball pretenem conciliar aquestes incongruències des de la perspectiva de la genética i de la fisiologia del teixit amb els nostres procediments i troballes. Un anàlisi precís dels fenotips presents a les dades d'expressió gènica pot ajudar a resoldre múltiples paradoxes derivades dels models de progressió de tumors. En aquest sentit hem desenvolupat diverses estratègies, eines i bases de dades, per facilitar l'estudi de les interdependències entre els fenotips ocults dins de les dades d'expressió. Aquests fenotips poden ser identificats pels grups de mostres obtinguts mitjançant mètodes comuns d'agrupament (HC, SOTA, SOM, PAM), però els mètodes d'agrupament no proporcionen informació sobre la seva interdependència. Nosaltres estudiem aquestes interdependències per la detecció de relacions d'expressió no lineals, on cada fluctuació en la relació implica un canvi fenotípic i cada tipolologia de la relació diferent implica una interdependència fenotípica específica. D'aquesta manera, s'han desenvolupat diferents estratègies i eines per estudiar els canvis fenotípics i les paradoxes sotmeses a ells. Utilitzant les eines desenvolupades s'han estudiat les relacions d'expressió no lineals relacionades amb l'activitat dels glucocorticoides. Estudiant-les, hem trobat la possible raó dels efectes oposats d'alguns agents estressants com la dexametasona sobre la progressió tumoral, com ha estat confirmat per la literatura. Aquesta raó oculta ha resultat estar vinculada amb el tipus de progressió del tumor en cada teixit. En el primer tipus de progressió tumoral trobat, les noves cèl·lules poden ser estressades durant la proliferació i els agents estressants augmenten la proliferació tumoral. En el segon tipus, l'estrès cel·lular i la proliferació del tumor són antagonistes així, per tant, els agents estressants aturen la proliferació tumoral amb la finalitat d’estressar les cèl·lules. / Glucocorticoids are commonly used as an adjuvant treatment for side-effects and have anti-proliferative activity in several tumours. Inspite of this fact, there has been reported a proliferative effect in several studies, that some of them involving the spread of cancer. These paradoxes are common in cancer research. Usually the same genes seem to be promoter and inhibitor of cancer. We shall attempt to reconcile these incongruities from the transcriptomic and tissue-physiology perspectives with our procedures and findings. An accurate phenotype analysis of expression data can help to solve multiple paradoxes derived from tumour-progression models. We have developed several strategies, tools and databases to facilitate the study of interdependences among the phenotypes hidden inside expression data. These phenotypes can be identified by the sample clusters obtained by common clustering methods (HC, SOTA, SOM, PAM), but clustering methods do not provide information about their interdependence. We study these interdependences by the detection of non-linear expression-relationships where each fluctuation in the relationship implies a phenotype change and each relationship typology implies specific phenotype interdependence. In this way different strategies and tools have been developed to study phenotypic changes and the paradoxes subjected to them. Using the tools developed we have studied the non-linear expression relationships related to glucocorticoid activity. The result is that we have found the possible reason for opposite effects of some stressor agents like dexamethasone on tumour progression as it has been confirmed by literature. This hidden reason has resulted in being linked with the type of tumour progression of the tissues. In the first type of tumour progression found, new cells can be stressed during proliferation and stressor agents increase tumour proliferation. In the second type, cell stress and tumour proliferation are antagonists so, therefore, stressor agents stop tumour proliferation in order to stress the cells.

Moonlighting es la capacidad de algunas proteínas para ejecutar dos o más funciones bioquímicas. En general, las proteínas multifuncionales se identifican experimentalmente por casualidad (serendipia). Por esta razón, sería útil que la Bioinformática pudiera predecir esta multifuncionalidad, sobre todo debido a la gran cantidad de secuencias de proteínas provinientes de los proyectos genoma. En el presente trabajo, analizamos y describimos varios enfoques que utilizan secuencias, estructuras, interactómica y algoritmos y programas bioinformáticos corrientes para tratar de superar este problema. Entre estos enfoques están: a) la búsqueda de homología remota utilizando Psi-Blast, b) la detección de motivos y dominios funcionales, c) utilizar la información contenida en las bases de datos de interactómica (PPIs), d) el análisis de correlación de mutaciones de aminoácidos mediante algoritmos como MISTIC. Los programas diseñados para identificar un motivo o dominio funcional detectan principalmente la función canónica pero generalmente fallan en la detección de la función moonlighting, en todo caso Pfam y ProDom son los mejores métodos. La búsqueda de homología remota por Psi-Blast combinado con los datos de las bases de datos interactómica (PPIs) presentan el mejor rendimiento. La información estructural y análisis de correlación de mutación nos pueden ayudar a mapar los sitios funcionales. El análisis de correlación de mutación sólo se puede utilizar en situaciones muy específicas dado que se requiere la existencia de un multialineamiento de numerosas secuencias de proteínas de una familia funcional, pero esta estrategia puede sugerir cómo tuvo el proceso evolutivo de adquisición de la segunda función. En los análisis del presente trabajo se ha utilizado la base de datos de proteínas multifuncionales MultitaskProtDB (http://wallace.uab.es/multitask/), publicada anteriormente por nuestro grupo. Finalmente, indicar que un gran porcentaje (76%) de las proteínas multifuncionales humanas están implicadas en enfermedades y que el 47% son dianas de fármacos existentes. Esto aumenta el interés por los métodos para la predicción de proteínas moonlighting. / Multitasking or moonlighting is the capability of some proteins to execute two or more biochemical functions. Usually, moonlighting proteins are experimentally revealed by serendipity. For this reason, it would be helpful that Bioinformatics could predict this multifunctionality, especially because of the large amounts of sequences from genome projects. In the present work, we analyse and describe several approaches that use sequences, structures, interactomics and current bioinformatics algorithms and programs to try to overcome this problem. Among these approaches are: a) remote homology searches using Psi-Blast, b) detection of functional motifs and domains, c) analysis of data from protein-protein interaction databases (PPIs), d) mutation correlation analysis between amino acids by algorithms as MISTIC. Programs designed to identify functional motif/domains detect mainly the canonical function but usually fail in the detection of the moonlighting one, Pfam and ProDom being the best methods. Remote homology search by Psi-Blast combined with data from interactomics databases (PPIs) have the best performance. Structural information and mutation correlation analysis can help us to map the functional sites. Mutation correlation analysis can only be used in very specific situations –it requires the existence of multialigned family protein sequences - but can suggest how the evolutionary process of second function acquisition took place. The multitasking protein database MultitaskProtDB (http://wallace.uab.es/multitask/), previously published by our group, has been used as a benchmark for the all of the analyses. Finally, a large percentage (76%) of the human moonlighting proteins are involved in human diseases and 47% are targets of current drugs. This augments the interest in methods for predicting moonlighting proteins.

Cambios en la transcripción de genes en el cerebro están asociados a alteraciones sinápticas y deterioro cognitivo tanto durante el envejecimiento normal como en trastornos cognitivos relacionados a la edad. Sin embargo, poco se sabe acerca de los mecanismos moleculares que subyacen alteraciones de la expresión génica durante la enfermedad de Alzheimer. El factor de transcripción CREB regula la expresión de genes esenciales para los mecanismos de plasticidad sináptica a largo plazo y consolidación de la memoria. La transcripción de genes dependientes de CREB está regulada por coactivadores transcripcionales como CBP, p300 y la familia de coactivadores CRTC. CRTC1 es la isoforma más abundante en neuronas y se ha implicado en la regulación del crecimiento dendrítico, la plasticidad sináptica a largo plazo y la memoria. Las funciones específicas de CRTC1 sobre las alteraciones transcripcionales, disfunción sináptica y pérdida de memoria durante la enfermedad de Alzheimer son desconocidas. En esta tesis doctoral se ha investigado el papel de la transcripción regulada por CREB/CRTC1 durante procesos de memoria dependiente del hipocampo en dos modelos murinos bien establecidos de patología amiloide y neurodegeneración: 1) el modelo de ratón transgénico APPsw,Ind que expresa el gen APP humano con las mutaciones sueca e Indiana asociadas a la enfermedad de Alzheimer de tipo hereditario, y 2) un ratón doble knockout condicional (PS cDKO) que carece de los genes de la presenilina (PS1 y PS2) en neuronas excitatorias del cerebro adulto. Hemos observado que la inducción de actividad neuronal así como el entrenamiento en paradigmas de memoria espacial y asociativa induce la defosforilación de CRTC1 en Ser151, lo que promueve la translocación de CRTC1 al núcleo de neuronas hipocampales de ratones adultos. Curiosamente, durante estadíos patológicos iniciales ambos modelos muestran una disminución significativa en la expresión de genes diana de CREB/CRTC1 durante tareas de memoria dependiente de hipocampo. Cabe destacar que la desfosforilación en Ser151 y la translocación nuclear de CRTC1 se ven alteradas en las neuronas del hipocampo en ambos modelos, coincidiendo con déficits iniciales de memoria dependiente de hipocampo. Estos resultados indican que la función de CRTC1 se ve comprometida en ambos modelos de ratones, lo que sugiere que la transcripción dependiente de CRTC1 puede verse afectada por diferentes vías patogénicas. Es importante destacar que también hemos observado alteración en la expresión génica regulada por CRTC1 en muestras de hipocampo humano con patología de enfermedad de Alzheimer. Además, hemos determinado que la sobreexpresión de CRTC1 en el hipocampo mejora los déficits de transcripción y de memoria en etapas patológicas tempranas en ambos modelos experimentales, lo que sugiere que CRTC1 puede ser una valiosa diana terapéutica para la enfermedad de Alzheimer y otras demencias neurodegenerativas. En resumen, estos resultados apoyan un modelo en el que distintos mecanismos patogénicos comprometen la transcripción regulada por CRTC1 necesaria para la plasticidad sináptica y la memoria, lo que contribuyendo a la neurodegeneración y demencia durante la enfermedad de Alzheimer. Estos resultados revelan un papel crítico de la señalización de CRTC1 en el hipocampo durante memoria espacial y asociativa, y sugieren que la modulación de CRTC1 puede ser una importante estrategia terapéutica para la enfermedad de Alzheimer y trastornos neurodegenerativos relacionados. / Altered gene transcription in the brain is associated with impaired synaptic function and cognitive decline during normal aging and age-related cognitive disorders. However, the molecular mechanisms underlying deregulation of gene expression during Alzheimer’s disease remain largely unknown. Activity-dependent gene expression regulated by the transcription factor cAMP-response element binding protein (CREB) is essential for long-term synaptic plasticity and memory consolidation. CREB-dependent transcription is regulated by transcriptional coactivators including CREB binding protein (CBP), p300 and the CREB-regulated transcription coactivators (CRTCs). CRTC1 is the most abundant isoform in neurons and has been implicated in the regulation of dendritic growth, long-term synaptic plasticity and memory. Importantly, the specific roles of CRTC1 on transcriptional changes, synaptic dysfunction and memory loss during Alzheimer´s disease-related pathology are unknown. In this doctoral thesis I have investigated the role of CREB/CRTC1-regulated transcription during hippocampal-dependent memory in two well-established mouse models of amyloid pathology and neurodegeneration: 1) the APPSw,Ind transgenic mouse model of amyloidosis expressing the human APP gene harboring the familial-AD linked Swedish and Indiana mutations, and 2) a Presenilin conditional double knockout (PS cDKO) mouse model lacking the presenilin genes (PS1 and PS2) in forebrain neurons of the adult brain. We found that induction of neuronal activity as well as spatial and associative memory training induce CRTC1 dephosphorylation at Ser151, which leads to a time-dependent CRTC1 translocation to the nucleus in hippocampal neurons of the adult mouse brain. Interestingly, during early pathological stages both APPSw,Ind and PS cDKO mice show significant decreased expression of CRTC1-dependent CREB target genes induced by hippocampal-dependent memory tasks. Notably, CRTC1 dephosphorylation at Ser151 and nuclear translocation are altered in hippocampal neurons of both mouse models coinciding with early hippocampal-dependent memory deficits. These results indicate that CRTC1 function is compromised in both mouse models, suggesting that CRTC1-dependent transcription may be affected by different pathogenic pathways. Importantly, we provide evidence that CRTC1-regulated transcription is also altered in the human hippocampus during Alzheimer’s disease pathology. Furthermore, we show that increasing CRTC1 function in the hippocampus ameliorates transcriptional and memory deficits at early pathological stages in both mouse models, suggesting that targeting CRTC1 signaling may be a valuable therapeutic strategy for Alzheimer’s disease and related neurodegenerative dementias. Taken together, our results support a model in which distinct pathogenic mechanisms compromise CREB/CRTC1-dependent transcription required for synaptic plasticity and memory, which contributes to neurodegeneration and dementia during Alzheimer’s disease-related pathology. These findings reveal a critical role of CRTC1 signaling in the hippocampus during spatial and contextual associative memory, and provide evidence that targeting CRTC1 signaling may be a valuable therapeutic strategy for Alzheimer’s disease and related neurodegenerative disorders.