La stéatose hépatique non alcoolique (SHNA) est maintenant une des principales causes de cancer du foie. Cependant, les mécanismes physiopathologiques contribuant à son développement ou à la progression de la maladie sont peu connus. Il a été démontré que le niveau d’expression du coactivateur transcriptionnel PGC-1α est inversement proportionnel avec la sévérité de la stéatose hépatique le stress oxydatif et la résistance à l’insuline dans les foies de souris. Chez l’humain, on observe aussi une diminution de PGC-1α dans les foies de patients atteints de SHNA. De plus, il a été démontré que les souris avec une réduction de 50% des niveaux hépatique de PGC-1α mène à une sensibilité à l’insuline et à une tolérance au glucose altérée dans les tissus périphériques. Ces découvertes suggèrent qu’en plus d’être associés au développement de la SHNA, les niveaux hépatiques de PGC-1α altèrent l’expression de facteurs sécrétoires du foie afin d’influencer la régulation métabolique de tout le corps. Nous proposons qu’une réduction de l’expression de PGC-1α dans le foie influence les protéines sécrétées par le foie en situation de stress métabolique, révélant l’importance de PGC-1α dans la réponse adaptative du foie. L’analyse du sécrétome hépatique effectuée par spectrométrie de masse sur le milieu conditionné d’hépatocytes primaires a identifié SERPINA3N, une protéine sécrétée, dont les niveaux corrèlent avec les niveaux hépatiques de PGC-1α et sont influencés par la diète obésogène. Dans ce projet, les niveaux sanguins de cette protéine ont été quantifiés par western blot chez des souris mâles et femelles, sauvages ou hétérozygotes pour PGC-1α dans le foie et nourris avec une diète control ou riche en gras et en fructose. Nos résultats démontrent que les niveaux circulatoires de SERPINA3N augmentent avec la diète et corrèlent avec les niveaux hépatiques de PGC-1α de manière dépendante à la diète et le sexe. De plus, les niveaux sanguins de SERPINA3N diminuent avec la progression de la maladie. L’expression hépatique de SERPINA3N est grandement influencée par les niveaux de PGC-1α, mais indépendamment du facteur transcriptionnel NF-κB. Nous avons montré que les glucocorticoïdes augmentent les niveaux protéiques et circulatoires de SERPINA3N dans les hépatocytes primaires. De plus, cette augmentation par les glucocorticoïdes est influencée par les niveaux de PGC-1α. Ces résultats révèlent une nouvelle interaction entre PGC-1α et le récepteur des glucocorticoïdes sur l’expression hépatique et la sécrétion de SERPINA3N. Pour conclure, l’identification de protéines circulatoires régulées par PGC-1α nous aidera à mieux comprendre comment la perte d’expression de PGC-1α dans le foie affecte le métabolisme de tout le corps dans le contexte de la SHNA. / Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) is becoming a serious public health problem and is now one of the leading causes of liver cancer. Although NAFLD is known to be associated with obesity, insulin resistance, metabolic syndrome and type II diabetes, the mechanisms contributing to its development are not fully understood. It is shown that hepatic PGC-1α levels correlate negatively with NAFLD development, oxidative liver damage and hepatic insulin resistance in murine models. In humans, decrease PGC-1α expression in NAFLD and NASH patients. Moreover, liver-specific PGC-1α reduction in mice also disrupts glucose tolerance and insulin sensitivity in muscle and adipose tissue, likely due to altered secretion of hepatic hormones. These findings suggest that in addition to contributing to NAFLD development, the hepatic disruption of PGC-1α alters the liver secretome, thereby influencing the whole-body energy metabolism. We hypothesize that decreased expression of PGC-1α in the liver alters the expression of hepatokines under metabolic challenges, revealing a potential novel role for PGC-1α in the adaptive response of the liver. The hepatocyte-specific secretome was analyzed by mass spectrometry (iTRAQ) in conditioned media from primary hepatocytes. We identified SERPINA3N, a secreted protein whose secreted levels correlated with hepatic PGC-1α levels in a diet-dependent manner. This hepatokine was measured in serum from male, female, wildtype and liver-specific PGC-1α heterozygote mice fed chow or high-fat, high-fructose diet using western blot. SERPINA3N circulating levels increased with the western diet and correlated with hepatic PGC-1α levels in a diet and sex-dependent manner. Its serum levels decreased with the progression of the disease. The hepatic SERPINA3N expression was greatly influenced by PGC-1α levels independently of NF-κB transcription factor. We showed that glucocorticoids increased SERPINA3N protein and secreted levels in primary hepatocytes. This increase was influenced by PGC-1α levels, revealing a novel interaction of PGC-1α and the glucocorticoid receptor on SERPINA3N expression and secretion. In conclusion, this project reveals a novel impact of hepatic PGC-1α levels on the liver secretome during NAFLD development. This work will provide insights on the role of hepatic PGC-1α levels on the regulation of hepatokines and how it influences the whole-body energy homeostasis in a context of NAFLD.

The aim of this PhD study was to gain new insights into the evolutionary history of the Central African rainforests, which are among the most complex and diverse ecosystems on earth. Even today, many questions regarding the underlying dynamics and evolutionary processes shaping that remarkable diversity remain unanswered, since relatively few studies have focused on the vast tropical forests growing in the Congo Basin. Therefore, we applied various molecular approaches to study the levels of genetic diversity and patterns of differentiation within and between population of the tropical tree species Scorodophloeus zenkeri, Staudtia kamerunensis and Prioria balsamifera. In Chapter 2, we conducted a phylogeographic study on the widespread tropical tree Scorodophloeus zenkeri to assess the impact of past forest fragmentation in Central African lowland forests. By applying Bayesian clustering methods, we revealed six intraspecific genetic clusters within the species. The observed genetic discontinuities most likely result from forest fragmentation during the glacial periods of the Pleistocene. Populations in Lower Guinea appeared differentiated from those in Congolia, and both bioregions harboured distinct genetic clusters.In Chapter 3, we developed 16 highly polymorphic microsatellite primers (SSRs) for Staudtia kamerunensis, a timber species for which species-specific genetic markers were lacking. By validating the developed markers in three populations, we demonstrated their usefulness to study gene flow, population structure and spatial distribution of genetic diversity in S. kamerunensis.In Chapter 4, we applied the newly developed SSRs, two nuclear gene markers and a chloroplast marker to search for evolutionary lineages in Staudtia kamerunensis, a species with a complex taxonomical history. Our analyses reveal multiple genetic discontinuities among populations throughout Central Africa, probably resulting from ancient rainforest fragmentation during cold and dry periods in the Pliocene and/or Pleistocene. However, the clear genetic disjunction observed between northern and southern populations in Lower Guinea could correspond to a genetic break between the kamerunensis and gabonensis varieties described in Staudtia kamerunensis.In Chapter 5, we developed two new sets of microsatellite primers (SSRs); 16 primer pairs for Prioria balsamifera and 15 primer pairs for Prioria oxyphylla. Validation of the primers in two populations of each species, as well as the cross-amplification tests, demonstrated the usefulness of the SSRs to study gene flow and spatial genetic structure in African Prioria species, which is needed to prevent genetic erosion and to set up proper conservation guidelines.In Chapter 6, the 16 newly developed microsatellite loci were amplified in individuals of P. balsamifera from Gabon and the Democratic Republic of the Congo, to assess the levels of genetic diversity and intraspecific differentiation. Our analyses show that the genetic diversity in P. balsamifera populations is relatively low, so efforts should be made to prevent further depletion of the gene pool. Bayesian clustering analyses revealed multiple genetic discontinuities throughout the Congo Basin, probably caused by ancient forest fragmentation. The inferred intraspecific clusters show a parapatric distribution, so they can potentially be used to determine the origin of individuals at a regional scale. Additionally, various genetic assignment methods show that the SSR dataset generated in this study can be used as a reference database for Gabon and DR Congo. The general discussion allows us to show similarities in the genetic structures of species that can be interpreted in terms of forest cover history in Central Africa. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Contexte: La physiopathologie de la fibrillation auriculaire (FA) a été caractérisée par des changements de concentration cellulaire de Ca2+ et des processus connexes menant à l'apparition et au maintien de la maladie. Les récepteurs de trisphosphate d'inositol (IP3R) sont des canaux calciques ligand-dépendants pour lesquels la surexpression dans la FA a été liée à un remodelage cardiaque. Les microARN (miR, miARN), petits ARN non codants, sont d'une longueur d'environ 22 nucléotides et régulent l'expression des gènes par déstabilisation de l'ARN ou inhibition de sa traduction. De plus en plus de preuves ont été apportées sur le rôle des miARN dans la physiopathologie des troubles cardiaques, y compris le remodelage défavorable induit par la FA. Objectif: Notre laboratoire a montré que le niveau nucléaire IP3R1 est régulé à la hausse dans le modèle canin de FA, ce qui produit une augmentation de la charge nucléaire en calcium. Cette étude vise donc à étudier le rôle des miARN dans la régulation d'IP3R1 qui initie et/ou perpétue la FA dans les cardiomyocytes auriculaires du modèle de FA chez le chien. Méthodes: Nous avons utilisé un modèle canin de AF établi par méta-cardiographie auriculaire pendant 600 bpm × une semaine; des cœurs perfusés par Langendorff pour isoler les cardiomyocytes auriculaires pour des expériences moléculaires; le criblage des miRs qui ciblent le gène ITPR1, codant IP3R1, en utilisant des bases de données en ligne; RT-qPCR pour mesurer l'expression de l'ARNm de ITPR1 et confirmer le niveau d'expression des miARN criblés; l'analyse Western Blot pour évaluer le niveau de protéine d’IP3R1; le test de la double luciférase reporter, la surexpression et l'abattement des miARN en culture primaire de cardiomyocytes isolées ou de lignées cellulaires appropriées; et l'imagerie par fluorescence calcique Fluo-4 AM pour évaluer le rôle potentiel des miARN sur la manipulation du Ca2+. Pour les expériences de manipulation des miARN, les cellules ont été transfectées avec 1) un miARN non codant (miR-NC, groupe témoin), 2) un miARN mimétique et 3) un inhibiteur du miARN (AMO). La signification statistique est calculée avec le test t de Student ou l'analyse unidirectionnelle de variance (ANOVA) suivie par le test de Tukey à comparaisons multiples en utilisant le logiciel GraphPad Prism version 6.00. Résultats: Nos données indiquent une augmentation du niveau de la protéine IP3R1 sans changement apparent de l'expression du gène ITPR1 dans les cardiomyocytes de l'oreillette gauche par rapport à notre modèle canin de FA. Sur la base de l'analyse informatique, il a été prédit que miR-26a ciblerait l'ARNm de l'ITPR1. La FA a considérablement réduit la régulation du miR-26a dans les cardiomyocytes de l'oreillette gauche. Le dosage de la double luciférase reporté dans les cellules H9C2 a montré que le miR-26a agissait directement sur la région non traduite 3′ (3′UTR) de l'ARNm ITPR1. De plus, la surexpression de miR-26a a réduit le niveau de la protéine IP3R1 et a diminué le taux diastolique [Ca2+] dans le noyau et le cytosol des cardiomyocytes de chien, des transistors de Ca2+ stimulés électriquement; tandis que le knockdown de miR-26a a inversé ces effets. L'expression de l'ARNm de l'ITPR1 est restée inchangée dans les cardiomyocytes de chien isolées après la transfection avec l'imitateur et l'inhibiteur de l'ARNm. Conclusion: La régulation à la hausse d'IP3R1 dans la FA est due à l'inhibition de la traduction par le miR-26a, qui est régulé à la baisse dans les cardiomyocytes auriculaires du modèle canin de FA. Ce changement est associé à une altération de la manipulation du Ca2+, qui se traduit par une augmentation des taux de Ca2+ diastolique nucléaire. Nos résultats suggèrent que la régulation à la baisse de miR-26a augmente l'expression de l’IP3R1, contribuant au remodelage pro-arythmique dans la FA. / Background: The pathophysiology of atrial fibrillation (AF) has been characterized by changes in the cellular concentration of Ca2+ and related processes leading to the initiation and maintenance of the condition. Inositol trisphosphate-receptors (IP3Rs) are ligand-gated calcium channels for which overexpression in AF has been linked to cardiac remodeling. microRNA (miR, miRNA)s, small non-coding RNAs, are around 22 nucleotides in length and regulate gene expression by mRNA destabilization or inhibition of its translation. A growing body of evidence has emerged about miRNA's role in the pathophysiology of cardiac disorders, including AF-induced adverse remodeling. Objective: Our laboratory has shown that nuclear IP3R1 level is upregulated in the dog AF model, producing increased nuclear calcium loading. Hence, this study aims to investigate the role of miRNAs in the regulation of IP3R1 initiating and/or perpetuating AF in atrial cardiomyocytes of the dog AF model. Methods: We used AF dog model established by atrial-tachypacing for 600 bpm × one week; Langendorff-perfused hearts to isolate atrial cardiomyocytes for molecular experiments; screening miRs that target ITPR1 gene, encoding IP3R1, using online databases; RT-qPCR to measure ITPR1 mRNA expression and confirm the expression level of the screened miRNAs; western blot analysis to evaluate the protein level of IP3R1; dual-luciferase reporter assay, overexpression and knockdown of miRNAs in primary culture of isolated cardiomyocytes or appropriate cell lines; and Fluo-4 AM calcium fluorescence imaging to assess the potential role of the miRNA on Ca2+ handling. For miRNA manipulation experiments, cells were transfected with 1) non-coding miRNA (miR-NC, control group), 2) miRNA mimic, and 3) inhibitor of the miRNA (AMO). Statistical significance is calculated with Student's t-test or one-way analysis of variance (ANOVA) followed by Tukey's multiple comparisons test using GraphPad Prism software version 6.00. Results: Our data indicated a rise in IP3R1 protein level with no apparent change in ITPR1 gene expression in left atrial cardiomyocytes from our dog AF model. Based on the computational analysis, miR-26a was predicted to target the ITPR1 mRNA. AF significantly downregulated miR-26a in left atrial cardiomyocytes. The dual-luciferase reporter assay in H9C2 cells showed that miR-26a directly acted on the 3′ untranslated region (3′UTR) of ITPR1 mRNA. In addition, miR-26a overexpression reduced the IP3R1 protein level and decreased the diastolic [Ca2+] in both nucleus and cytosol of the electrically-stimulated Ca2+ -transients, dog cardiomyocytes, while miR-26a knockdown reversed these effects. ITPR1 mRNA expression remained unaltered in isolated dog cardiomyocytes after transfection with the miRNA mimic and inhibitor. Conclusion: IP3R1 upregulation in AF is due to translation inhibition by miR-26a, which is downregulated in the atrial cardiomyocytes of the dog AF model. This change is associated with altered Ca2+ handling, reflected as enhanced nuclear diastolic Ca2+ levels. Our results suggest that miR-26a downregulation enhances the IP3R1 expression, contributing to pro-arrhythmic remodeling in AF.

Les plaquettes sont la principale source de CD40L soluble (sCD40L), une molécule thrombo-inflammatoire dont les taux élevés chez les patients atteints des maladies coronariennes (CAD) prédisent des événements athérothrombotiques. Nous avons déjà démontré que le sCD40L active deux voies de signalisation dans les plaquettes, la p38 MAPK et le facteur nucléaire-κB (NF-κB), non affectées par l’activité antiplaquettaire de l'aspirine (ASA). Nous avons montré aussi que le sCD40L, en réponse à des doses sous-optimales d'agonistes plaquettaires comme la thrombine et le collagène, potentialise l'agrégation des plaquettes via le récepteur CD40 et son effecteur cible présent en aval le NF-κB. En effet, le NF-κB appartient à une famille de dimères cytoplasmiques inactivés par l'inhibiteur IκB et régulés par l’IκB kinase (IKK). Suite à des signaux immunologiques, l’IKK phosphoryle l’IκB, ce qui entraîne sa dégradation par le protéasome. Par conséquent, le NF-κB, une fois libre, se déplace vers les noyaux des cellules immunitaires où il agit sur le génome pour maintenir la survie et la prolifération cellulaires. Contrairement aux cellules immunitaires, la régulation et les fonctions de NF-κB dans les plaquettes, fragments cellulaires dépourvus de génome, sont moins bien comprises. Dans ce projet, nous proposons l'hypothèse que l’axe sCD40L/NF-κB/protéasome amorce les plaquettes en les prédisposant à une activation et une agrégation prononcées. Nos objectifs seront donc (i) d'étudier l'interaction entre le NF-κB et le protéasome en réponse au sCD40L et (ii) d'examiner les rôles de cet axe sur les fonctions plaquettaires. Pour cela, des plaquettes ont été fraîchement isolées à partir du sang des donneurs humains sains qui ne prennent pas des médicaments antiplaquettaires ou anti-inflammatoires. Ces plaquettes ont été par la suite stimulées par le sCD40L. En étudiant l'activation de NF-κB, l'analyse par Western blot a montré que le sCD40L induit la phosphorylation d’IκB et la dégradation de sa forme phosphorylée (p-IκB) dans un délai de 30 minutes, d'une manière similaire à l’action de la thrombine, l’agoniste plaquettaire le plus puissant. Le prétraitement des plaquettes avec deux classes d'inhibiteurs de NF-κB, le répresseur d’IKK (BAY 11-7082) et l’antagoniste du protéasome (MG132), a montré que l'activation du NF-κB dans les plaquettes est régulée par l’IKK et le protéasome, identiquement aux cellules nucléées. L'examen des événements de signalisation induits par le sCD40L a montré que l'inhibition du NF-κB plaquettaire n'affecte pas la phosphorylation de p38 MAPK ou le clivage protéasomique de la Taline-1 qui est impliquée dans le changement de la forme des plaquettes. Concernant les effets sur les fonctions plaquettaires, l'inhibition de NF-κB ou du protéasome n'a pas influencé l'agrégation des plaquettes induite par des doses élevées de collagène ou de thrombine. Cependant, elle a considérablement réduit l'agrégation plaquettaire suite à un amorçage avec le sCD40L, suivie d'une stimulation avec des doses sous-optimales de collagène ou de thrombine. Nous avons également constaté que le sCD40L exacerbe la rétraction des caillots fibrino-plaquettaire formés par de faibles doses de thrombine. Cet effet d'amorçage est régulé par l’axe NF-κB/protéasome. En bref, l’axe sCD40L/NF-κB/protéasome fonctionne de manière non génomique, en amorçant les plaquettes, induisant ainsi la potentialisation de l'agrégation plaquettaire et l'augmentation de la rétraction des caillots fibrino-plaquettaire. Par conséquent, le ciblage de cet axe dans les plaquettes pourrait avoir un rôle thérapeutique chez les patients atteints de CAD et dont les plaquettes ne répondent pas ou sont moins sensibles aux traitements antiplaquettaires conventionnels. / Platelets are the principal source of soluble CD40L (sCD40L), a thrombo-inflammatory molecule whose high levels in coronary artery disease (CAD) patients predict atherothrombotic events. We have previously demonstrated that sCD40L activates two signaling pathways in platelets, p38 MAPK and the nuclear factor-κB (NF-κB), both of which were unaffected by the anti-platelet activity of aspirin (ASA). We have also shown that sCD40L, in response to suboptimal doses of platelet agonists like thrombin and collagen, potentiates platelet aggregation through CD40 receptor and its downstream effector target NF-κB. Indeed, NF-κB belongs to a family of cytoplasmic dimers that are inactivated by the inhibitor IκB and regulated by IκB kinase (IKK). Following immunological signals, IKK phosphorylates IκB, driving the degradation of its phosphorylated form (p-IκB) by the proteasome. Consequently, NF-κB becomes free to translocate to the nuclei of immune cells where it acts genomically to maintain survival and proliferation. That is the case in immune cells, but in platelets which are devoid of genome, the regulation and functions of NF-κB are less understood. Herein, we hypothesized that sCD40L/NF-κB/proteasome axis primes platelets, predisposing them to pronounced activation and aggregation. We thus aimed to (i) assess the interplay between NF-κB and proteasome in response to sCD40L and (ii) investigate the roles of this axis at the level of platelet functions. For this purpose, platelets were freshly isolated from the blood of healthy human donors who are not on anti-platelet or anti-inflammatory medication and then stimulated with sCD40L. In monitoring the activation of NF-κB, western blot analysis showed that sCD40L induces the phosphorylation of IκB and the degradation of p-IκB during a 30-mins time window, in a similar fashion to the most potent platelet agonist thrombin. The pre-treatment of platelets with two classes of NF-κB inhibitors, an IKK repressor (BAY 11-7082) and a proteasome antagonist (MG132), showed that the activation of platelet NF-κB is regulated by IKK and the proteasome as in nucleated cells. The examination of the functional signaling events induced by sCD40L showed that NF-κB inhibition does not affect the phosphorylation of p38 MAPK or the proteasomal cleavage of shape change-involved Talin-1. In functional studies, NF-κB or proteasomal inhibition did not influence the aggregation of platelets induced by high doses of collagen or thrombin; however, it markedly reduced platelet aggregation primed with sCD40L followed by stimulation with sub-optimal doses of collagen or thrombin. We also found that sCD40L exacerbates the retraction of fibrin-platelet clots formed by low doses of thrombin. This priming effect was regulated by NF-κB/proteasome dyad. In brief, sCD40L/NF-κB/proteasome axis primes platelets and functions non-genomically, inducing the potentiation of platelet aggregation and augmenting the retraction of fibrin-platelet clots. Hence, targeting this axis in platelets might have a therapeutic potential in CAD patients whose platelets are not or less responsive to conventional antiplatelet therapies.

Le dysfonctionnement mitochondrial est associé à de nombreuses maladies neurodégénératives. En effet, plusieurs protéines impliquées dans ces maladies, telles que les protéines PINK1 et Parkin dans la maladie de Parkinson, interviennent dans le recrutement de protéines nécessaires à l’homéostasie mitochondriale. En absence de ces protéines, un nouveau mécanisme se met en place : la formation de vésicules dérivées des mitochondries (MDVs). Notre équipe a démontré que ce mécanisme est responsable de la présentation antigénique mitochondriale (MitAP) et que les protéines PINK1 et Parkin ont un rôle répresseur sur cette voie et que cette nouvelle voie de présentation était capable d’activer des lymphocytes T CD8+ in vivo. Ces découvertes font entrer le système immunitaire comme nouvel acteur des maladies neurodégénératives. Cependant, les protéines impliquées dans MitAP restent à être identifiées. Deux projets ont été initiés afin de pouvoir mieux caractériser MitAP. La première a consisté à mettre au point un protocole d’isolation mitochondrial afin d’identifier de nouveaux partenaires moléculaires à la formation des MDVs au niveau des mitochondries. Le deuxième projet initie l’étude de l’immunopeptidome de cellules présentatrices d’antigène afin d’identifier les peptides mitochondriaux présentés à la surface des cellules. L’identification de protéines par l’isolation des mitochondries et celles générant les peptides mitochondriaux présentés à la surface des cellules sont essentielles pour comprendre le mécanisme des MDVs et le fonctionnement de la MitAP impliquée dans la maladie de Parkinson. Les protéines partenaires de cette voie moléculaire pourraient avoir un rôle dans les maladies neurodégénératives et être des cibles thérapeutiques ou des biomarqueurs. / Mitochondrial dysfunction is associated with many neurodegenerative diseases. Indeed, several proteins involved in these diseases, such as PINK1 and Parkin proteins in Parkinson's disease, are involved in the protein recruitment required for mitochondrial homoeostasis. In the absence of these proteins, a new mechanism is set up: the formation of vesicles derived from mitochondria (MDVs). Our team has demonstrated that this mechanism is responsible for the mitochondrial antigen presentation (MitAP) and that the PINK1 and Parkin proteins play a repressor role on this pathway and that this new presentation pathway is capable of activating CD8 + T cells in vivo. These discoveries bring the immune system as a new player in neurodegenerative diseases. However, the proteins involved in MitAP remain to be identified. Two projects have been initiated to better characterize MitAP. The first was to develop a mitochondrial isolation protocol to identify new molecular partners for MDV formation at the mitochondrial level. The second project initiates the study of the immunopeptidoma of antigen presenting cells to identify the mitochondrial peptides presented on the cell surface. The identification of these proteins is essential to understand the mechanism of MDVs and the functioning of MitAP involved in Parkinson's disease. The protein partners of this molecular pathway may have a role in neurodegenerative diseases and may be therapeutic targets or biomarkers.

La première phase pour la fibrose réparatrice après un infarctus du myocarde (IM) est la réponse inflammatoire. Sans inflammation, la cicatrisation est perturbée ce qui provoquerait la rupture du myocarde. Une forte réponse inflammatoire peut mener à une rupture en raison d’une dégradation excessive de la matrice extracellulaire. Afin d’améliorer le pronostic des patients, des techniques pour contrôler la réponse inflammatoire sont recherchées. En réponse au stress, MK2 (MAP kinase-activated protein kinase-2) est activée par p38α et β. Cette kinase régule l’inflammation en stabilisant l’ARNm de cytokines. Les souris où MK2 est inactivée (MK2-/-) présentent une diminution de l’expression des cytokines après l’injection de lipopolysaccharides. L’objectif de l’étude était de déterminer si l’absence de MK2 altérerait l’inflammation post-IM provoqué par la ligature permanente de l’artère interventriculaire antérieure chez des souris mâles MK2+/+ et MK2-/-. Cette étude démontre une réduction significative de mortalité chez les souris MK2-/-. Les échocardiographies ont révélé une altération similaire des fonctions cardiaques chez les souris MK2+/+ et MK2-/-, mais la structure était moins affectée chez les souris MK2-/-. La coloration au trichrome de Masson n’a démontré aucune différence pour la taille de la cicatrice ou la quantité de collagène. Aucune différence n’a été remarquée dans le recrutement des leucocytes. L’utilisation d’un RT2 Profiler PCR Array spécifique aux cytokines a démontré que l’abondance d’ARNm tend à être réduite dans les tissus sains MK2-/-, mais l’inflammation n’était pas réduite comparativement aux souris MK2+/+. En conclusion, MK2 ne semble pas essentielle à la réponse inflammatoire post-IM dans le coeur des souris. / The first phase of reparative fibrosis following a myocardial infarct (MI) is an inflammatory response. Without inflammation, scar formation is impaired, which leads to heart rupture. A strong response can also lead to heart rupture due to excessive ECM degradation. Efficient ways of controlling inflammation are constantly being explored to improve the prognosis in patients. In response to cellular stress, MAP kinase-activated protein kinase-2 (MK2) is activated by p38α and β. This protein serine/threonine kinase mediates the inflammatory process by stabilising pro-inflammatory cytokine mRNA. MK2-deficent mice (MK2-/-) show an impaired expression of cytokines, such as IL-1β and IL-6, in response to lipopolysaccharide injection. The objective of this study was to determine if the absence of MK2 impaired the inflammatory phase following an MI induced by permanent ligation of the left anterior descending artery (LADL) in 12-week-old male MK2+/+ and MK2-/- litter mate mice. This study shows that mortality was significantly reduced in MK2-/- mice. Echocardiographic imaging showed that heart function was affected in similar ways in MK2+/+ and MK2-/- mice whereas heart structure was less affected MK2-/- mice. Masson's trichrome staining revealed no difference in scar size and collagen content. No differences were observed in neutrophil and macrophage recruitment. The use of a RT2 Profiler PCR Array specific to cytokines showed that mRNA fold expression appeared to be reduced in MK2-/- healthy tissues but that the inflammatory response was not impaired. In conclusion, MK2 was not essential for the inflammatory phase of post-MI wound repair in the male mouse heart.

Il a été suggéré que l’autophagie pouvait participer au processus fibrotique en favorisant la différenciation du fibroblaste en myofibroblaste. La sénescence cellulaire a aussi été montrée comme impliquée dans la réparation tissulaire et la fibrose. Des liens ont été établis entre autophagie et sénescence. Cette étude a pour but d’investiguer les liens possibles entre autophagie, sénescence et différenciation myofibroblastique afin de mieux comprendre les mécanismes moléculaires régulant la réparation tissulaire et la fibrose. Les fibroblastes carencés en sérum pendant quatre jours montrent des ratios LC3B-II/-I élevés et des niveaux de SQSTM1/p62 diminués. L’augmentation de l’autophagie est accompagnée d’une augmentation de l’expression des marqueurs de différenciation myofibroblastique ACTA2/αSMA et collagènes de type 1 et 3 et de la formation de fibres de stress. Les fibroblastes autophagiques expriment les marqueurs de sénescence CDKN1A (p21) et p16INK4a (p16) et montrent une augmentation de l’activité beta-galactosidase associée à la sénescence. L’inhibition de l’autophagie à l’aide de différents inhibiteurs de phosphoinositide 3-kinase de classe I et de phosphatidylinositol 3-kinase de classe III (PtdIns3K) ou par inhibition génique à l’aide d’ARN interférant ATG7 bloquent l’expression des marqueurs de différenciation et de sénescence. L’expression et la sécrétion de CTGF (connective tissue growth factor) sont augmentées chez les fibroblastes autophagiques. L’inhibition de l’expression du CTGF par interférence génique prévient la différenciation myofibroblastique, démontrant l’importance de ce facteur pro-fibrotique pour la différenciation induite par l’autophagie. La phosphorylation de la kinase RPS6KB1/p70S6K, cible du complexe MTORC1, est abolie dans les fibroblastes autophagiques. La phosphorylation d’AKT à la Ser473, une cible du complexe MTORC2, diminue lors de la carence en sérum des fibroblastes mais est suivie d’une rephosphorylation après 2 jours. Ce résultat suggère la réactivation de MTORC2 lors d’une autophagie prolongée. Ceci a été vérifié par inhibition de l’autophagie dans les fibroblastes carencés en sérum. Les inhibiteurs de PtdIns3K et le siRNA ATG7 bloquent la rephosphorylation d’AKT. L’inhibition de la réactivation de MTORC2, et donc de la rephosphorylation d’AKT, est aussi obtenue par exposition des fibroblastes à la rapamycine, le Torin 1 ou par inhibition génique de RICTOR. Ces traitements inhibent l’augmentation de l’expression du CTGF ainsi que des marqueurs de différenciation et de sénescence, démontrant le rôle central joué par MTORC2 dans ces processus. Le stress oxydant peut induire la sénescence et la carence en sérum est connue pour augmenter la quantité de ROS (reactive oxygen species) dans les cellules. Afin d’investiguer le rôle des ROS dans la différenciation et la sénescence induites par l’autophagie, nous avons incubés les fibroblastes carencés en sérum en présence de N-acetyl-L-cysteine (NAC). Le NAC diminue la production de ROS, diminue les marqueurs d’autophagie, de sénescence et de différenciation myofibroblastique. Le NAC inhibe aussi la phosphorylation d’AKT Ser473. L’ensemble de ces résultats identifient les ROS en association avec une autophagie prolongée comme des nouveaux activateurs du complexe MTORC2. MTORC2 est central pour l’activation subséquente de la sénescence et de la différenciation myofibroblastique. / Recent evidence suggests that autophagy may favor fibrosis through enhanced differentiation of fibroblasts in myofibroblasts. Cellular senescence is also involved in tissue repair and fibrosis. Autophagy has been linked with senescence. This study focuses on understanding the molecular mechanisms linking autophagy, senescence and myofibroblast differentiation and the roles they could play in wound healing and fibrosis. Fibroblasts, serum starved for up to 4 days, showed increased LC3B-II/-I ratios and decreased SQSTM1/p62 levels. Autophagy was associated with acquisition of markers of myofibroblast differentiation including increased protein levels of ACTA2/αSMA (actin, α 2, smooth muscle, aorta), enhanced gene and protein levels of COL1A1 (collagen, type I, α 1) and COL3A1, and the formation of stress fibers. Autophagic fibroblasts showed expression of the senescence markers CDKN1A (p21) and p16INK4a (p16) and also exhibit increase in Senescence Associated-beta-galactosidase activity. Inhibiting autophagy with different class I phosphoinositide 3-kinase and class III phosphatidylinositol 3-kinase (PtdIns3K) inhibitors or through ATG7 silencing prevented myofibroblast differentiation and senescence markers expression. Autophagic fibroblasts showed increased expression and secretion of CTGF (connective tissue growth factor), and CTGF silencing prevented myofibroblast differentiation. Phosphorylation of the MTORC1 target RPS6KB1/p70S6K kinase was abolished in starved fibroblasts. Phosphorylation of AKT at Ser473, a MTORC2 target, was reduced after initiation of starvation but was followed by spontaneous rephosphorylation after 2 d of starvation, suggesting the reactivation of MTORC2 with sustained autophagy. Importantly, inhibition of autophagy with PtdIns3K inhibitors or ATG7 silencing blocked AKT rephosphorylation. Inhibiting MTORC2 activation with long-term exposure to rapamycin, Torin 1 or by silencing RICTOR, a central component of the MTORC2 complex, abolished AKT rephosphorylation. RICTOR silencing, Torin 1 and rapamycin treatments prevented CTGF and ACTA2 upregulation and induction of senescence markers demonstrating the central role of MTORC2 activation in CTGF and senescence induction for myofibroblast differentiation. Since oxidative stress is a known inducer of senescence, we investigated the role of reactive oxygen species (ROS) in autophagy-induced myofibroblast differentiation and senescence markers induction. Exposing fibroblasts to N-acetyl-L-cysteine (NAC) decreased production of ROS during serum starvation, inhibited autophagy and significantly decreased the expression of senescence and myofibroblast differentiation markers. NAC also inhibited the phosphorylation of AKT Ser473, establishing the importance of ROS in fuelling MTORC2 activation. Collectively, these results identify ROS production in association with sustained autophagy as novel inducers of MTORC2 signaling which in turn concomitantly activate senescence and myofibroblast differentiation.

La voie de signalisation Ras/mitogen-activated protein kinase (Ras/MAPK) occupe un rôle central dans la régulation de différents processus biologiques tels que la croissance, la survie mais aussi la prolifération cellulaire. En réponse à des signaux extracellulaires, cette voie de signalisation mène à l’activation des protéines ERK1/2, impliquées dans l’activation de nombreux substrats cellulaires dont les protéines kinases RSK (p90 ribosomal S6 kinase). Ces protéines kinases sont, entre autres, impliquées dans l’invasion et la migration cellulaire mais les mécanismes responsables de ces phénomènes biologiques restent inconnus à ce jour. Dans mon mémoire, je développe tout d’abord les travaux précédemment réalisés dans notre laboratoire, et identifie la protéine p120-Catenin (p120ctn), un composant majeur des jonctions adhérentes (AJ), comme un nouveau substrat de la voie Ras/MAPK. En utilisant notamment un anticorps phospho-spécificique, nous avons pu démontrer que p120ctn est phosphorylée sur la sérine 320, un nouveau site de phosphorylation, d’une manière dépendante des kinases RSK. D’autre part, nous avons trouvé que la signalisation Ras/MAPK réduit l’interaction entre les protéines p120ctn et N-cadhérine. Ainsi, nos observations suggèrent que l’activation de la voie Ras/MAPK est impliquée dans la diminution de l’adhérence entre cellules par la déstabilisation des AJ. Compte tenu du rôle primordial de la voie de signalisation Ras/MAPK dans le cancer, ce mécanisme nouvellement décrit pourrait contribuer à l’avancement des connaissances sur le développement des cancers dépendents de cette voie de signalisation. / The Ras/MAPK (mitogen-activated protein kinase) signalling pathway is vital in regulating cell growth, survival and proliferation in response to extracellular signals. Positioned downstream in the pathway, the p90 ribosomal S6 kinase (RSK) family regulates cell invasion by weakening cell-cell adhesion, but the mechanisms involved remain elusive. In this thesis, I expand upon previous work performed in our lab and identify p120ctn, a major component of adherens junctions (AJ), as a new substrate of the Ras/MAPK pathway. Using a phospho-specific antibody, we demonstrate that p120ctn is phosphorylated on a new phosphorylation site on S320 upon activation of MAPK signalling in a RSK-dependent manner. Furthermore, we show that Ras/MAPK signaling reduces p120ctn binding to N-cadherin, suggesting a new mechanism by which MAPK activity decreases cell-cell adhesion by destabilizing AJs. Finally, we designed and optimized two individual assays to be used in future experiments examining the effects of Ras/MAPK signalling on AJ function. Taken together, our data identifies RSK as a regulator of p120ctn phosphorylation, and also implicates Ras/MAPK signalling in regulating cell-cell adhesion by destabilizing AJ through p120ctn. Given the role of Ras/MAPK signalling in cancer, this new mechanism may play a role in the development and progression of Ras-driven cancers.

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