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Les urgences écologiques actuelles, résultant des dérives de l'industrialisation et de la mondialisation, mènent la recherche fondamentale à se préoccuper hâtivement de la biologie de certains organismes comme les dinoflagellés. Ces organismes sont à la base de la chaîne alimentaire, et certaines espèces sont impliquées dans la formation des récifs coralliens. De plus, la prolifération incontrôlée de certaines espèces de dinoflagellés engendrée par l'eutrophisation industrielle est responsable des marées rouges qui menacent d'une part la flore et la faune aquatiques. Certaines des toxines produites par ces efflorescences algales ont un effet sur la santé publique, car elles peuvent rendre dangereuse la consommation alimentaire de poissons ou de fruits de mer contaminés. Nous avons examiné le comportement de l’espèce Lingulodinium polyedra à travers des cycles diurnes. Dans un premier projet, le protéome dans des extraits d'algues récoltés sur un cycle de 24 heures en conditions de 12 heures de jour suivies de 12 heures de nuit (un cycle LD) a été examiné. Nous avons identifié treize protéines clés qui ont montré des variations quantitatives synchronisées avec les temps de réalisation des rythmes biologiques les impliquant. Deux protéines déjà connues de varier faisait partie de ce groupe, tandis que les autres protéines sont impliquées dans des processus rythmiques nouveaux. Nous avançons l’hypothèse qu’une augmentation quantitative des protéines clés permettrait à l'accomplissement des différents processus cellulaires à différents moments de la journée. Dans un second projet, nous avons examiné la vitesse de synthèse des protéines qui pourrait expliquer ces variations quantitatives protéiques. En appliquant la technique du profilage ribosomal ( « ribosome profiling ») sur des échantillons algaux collectés d’abord à trois temps, puis ensuite sur tout le cycle LD, nous avons confirmé des variations de vitesse de synthèse des protéines identifiées dans notre étude protéomique et des protéines dont la vitesse de synthèse a déjà été mesurée par l’incorporation de méthionine radioactive in vivo. De plus, nous avons identifié plusieurs milliers d’autres séquences dont la vitesse de synthèse varie. Une classification des séquences dans les catégories GO nous a permis d’identifier un rythme diurne dans la synthèse des acides aminés qui pourrait aider à comprendre le métabolisme du nitrate. Nous proposons que des variations de vitesse de synthèse entraînent des augmentations quantitatives des protéines aux niveaux inférieurs à ce que l’on a pu détecter par la spectroscopie de masse. La variation dans les niveaux de protéines clés pourrait aider l'accomplissement des rythmes diurnes chez le dinoflagellé Lingulodinium. Ces avancées dans la compréhension de la régulation des rythmes biologiques du dinoflagellé Lingulodinium d'une part permettront de mieux penser la recherche concernant la lutte écologique contre les marées rouges et d'autre part ouvriront de nouvelles perspectives dans l'entendement de la régulation des rythmes biologiques des autres organismes y compris ceux de l'Homme dont les troubles impliquent de nombreuses maladies. / Industrialization and globalization has led to industrial eutrophication in many regions of the oceans resulting in different types of ecological emergencies. One of these is the uncontrolled proliferation of dinoflagellates which are responsible for the harmful algal blooms called “red tides”. Certain species release toxins which can harm aquatic flora and fauna and, through consumption of contaminated fish or seafood, can affect public health. Dinoflagellates are also at the base of the food chain in the marine environment, and certain species form symbioses with anthozoans thus allowing growth of coral reefs. There is thus a strong need for fundamental research on dinoflagellate biology. Using the dinoflagellate Lingulodinium polyedra as a model, we have examined how cells adapt to the daily changes in light and dark. In particular we have examined changes in protein amounts as well as changes in protein synthesis rates to gain insight into how cells differ during the day and night. In a first project, the daily proteome was examined by mass spectrometry using algae extracts harvested over a 24 hour cycle in conditions of 12 hours of day followed by 12 hours of night. Key proteins involved in biological rhythms have shown quantitative variations synchronized with the times of the biological rhythms involving them, ie a quantitative increase in key proteins is necessary for the accomplishment of the various cellular processes. Thirteen proteins were identified, of which two were previously documented to change in amount over the daily cycle. In a second project we addressed the origin of these quantitative protein variations. By applying the technique of ribosome profiling on algal samples, first collected in triplicate at three times and then at two hour intervals throughout the 24 h cycle, we have identified iv variations in the synthesis rate of thousands of proteins. These include the proteins found in the proteomic analysis as well as four proteins whose synthesis rate variations had already been observed using in vivo metabolic labeling. Interestingly, classification of the regulated proteins into GO categories also revealed a late night increase in the synthesis of many amino acid biosynthetic enzymes, potentially linking amino acid synthesis associated with the daily metabolism of nitrate. These advances in our understanding of the regulation of the daily rhythms of the dinoflagellate Lingulodinium will provide new tools in the ecological fight against red tides. They may also open new perspectives in understanding the daily rhythms of other organisms.

La leucémie myéloïde aigüe (LMA) est la forme de leucémie la plus fréquente chez l’adulte au Canada. Bien que de nombreux réarrangements chromosomiques récurrents aient été identifiés chez les patients LMA, près de la moitié des cas présentent un caryotype normal (LMA-CN). L’étude de la LMA-CN in vitro est rendue difficile par le fait que la survie des cellules primaires de patients est défectueuse sur le long terme et que les lignées cellulaires leucémiques ont un caryotype hautement anormal. En 2009, Munker et son équipe ont établi une nouvelle lignée cellulaire, CG-SH, ayant la particularité d’avoir un caryotype normal. L’objectif principal de ce projet d’étude est de caractériser plus en détail ce nouveau modèle d’étude. Nous avons identifié l’ensemble des variants génétiques présents dans CG-SH grâce au séquençage du génome entier. Les variants susceptibles de participer à la leucémogénèse ont été isolés, tels que des insertions détectées dans EZH2 et GATA2, et de nombreux variants faux-sens détectés dans des gènes pertinents pour la LMA. Nous avons montré que les cellules CG-SH sont sensibles à l’effet prolifératif d’une combinaison de cytokines, qui agissent sur le comportement des cellules en modifiant l’expression des gènes associés à la régulation de la prolifération, de l’apoptose et de la différentiation. De plus, les cytokines diminuent le taux de nécrose des cellules en culture sur le court terme. La présente étude a permis d’approfondir notre connaissance sur les caractéristiques moléculaires de la lignée cellulaire CG-SH, un nouveau modèle d’étude in vitro de la LMA-CN. / Acute myeloid leukemia (AML) is the most frequent form of leukemia in the adult population in Canada. Although many recurrent chromosomal rearrangements have been identified in AML, almost half of all adult patients will present with a normal karyotype (NK-AML). The in vitro study of NK-AML is difficult because the long-term survival of primary patient samples is deficient and AML cell lines have a highly abnormal karyotype. In 2009, Munker and collegues established a new cell line, CG-SH, with the advantage of having a normal karyotype. The main goal of this research project is to further characterize this new model system. We identified all the genetic variants present in the CG-SH cells using whole genome sequencing. We also isolated the variants that are susceptible to participate to leukemogenesis, including the insertions detected in EZH2 and GATA2, and several missense mutations occurring in relevant genes for AML. We found that a combination of cytokines promotes the proliferation of CG-SH cells, and that cytokines act on the cells behavior through expression changes of the genes involved in the regulation of proliferation, apoptosis and differentiation. Moreover, cytokines trigger a decrease of the necrotic rate of CG-SH on the short-term. The current study allowed us to better appreciate molecular characteristics of the CG-SH cell line, a new model to study NK-AML in vitro.

La vision est considérée comme un des sens les plus importants, prenant en charge environ 80% des perceptions que nous recevons dans notre vie quotidienne. Les photorécepteurs de type cônes sont responsables de la vision centrale de haute résolution et en couleurs, et leur dégénérescence est souvent la cause de la perte de vision dans les maladies dégénératives rétiniennes (RDs). Les RDs sont un groupe hétérogène de maladies affectant des millions de personnes dans le monde, qui pour le moment sont pour la plupart sans aucune option thérapeutique. Les modèles animaux sont extrêmement utiles pour étudier le développement ou la dégénérescence de la rétine, ainsi que pour comprendre les mécanismes moléculaires des maladies génétiques héréditaires affectant les photorécepteurs. La modélisation des maladies dégénératives et du développement peut être particulièrement difficile, spécialement dans le cas de maladies humaines rares et complexes pour lesquelles aucun modèle animal exhaustif n'est disponible. De nos jours, la génération et le maintien de modèles de maladies humaines permettant une analyse approfondie du mécanisme moléculaire représente un grand défis . La technologie des cellules souches possède un grand potentiel dans la modélisation des maladies et représente un outil puissant pour générer des modèles évolutifs, sans l’utilisation d’animaux qui peuvent illustrer plus précisément les phénotypes cliniques de maladies humaines complexes. Nous avons développé un protocole pour différencier les cellules souches pluripotentes (PSCs) en feuillets rétiniens (RSs), qui sont des tissus polarisés et multicouches contenant des photorécepteurs cône et exprimant les marqueurs spécifiques du segment externe (OS), du cilium connecteur (CC) et du noyau. En utilisant à la fois des modèles de souris et des modèles humanisés à base de cellules souches, nous avons étudié le rôle de BMI1 dans les photorécepteurs matures. La protéine du groupe Polycomb Bmi1 est connue pour ses fonctions neuroprotectrices en contrôlant la sénescence et l'apoptose, et est exprimée à la fois dans le progéniteur rétinien et les neurones, mais on en sait peu sur son rôle spécifique dans la rétine adulte. Elle a été récemment associée à des troubles neurodégénératifs d'apparition tardive, et elle pourrait avoir un rôle dans la pathologie des RDs d'apparition tardive, comme la dégénérescence maculaire liée à l'âge (DMLA). Nous avons montré que les photorécepteurs cône et les neurones bipolaires sont générés normalement mais subissent ensuite une dégénérescence rapide chez les souris Bmi1-/- par nécroptose associée à Rip3. La dégénérescence était associée à des anomalies de compactage de la chromatine, à l'activation des répétitions en tandem et au stress oxydatif. De plus, nous montrons que BMI1 est préférentiellement exprimé dans les cônes au niveau des foyers hétérochromatiques dans la rétine humaine. Son inactivation dans les cellules souches embryonnaires humaines (hESCs) a altéré la différenciation terminale du cône et a entraîné des anomalies de compactage de la chromatine, l'activation des répétitions en tandem et l'induction de P53. Ces résultats fournissent un mécanisme expliquant comment une carence en Bmi1 conduit à la dégénérescence des cônes et révèlent des fonctions biologiques conservées et des différences pour Bmi1 dans la biologie des photorécepteurs entre la souris et l'homme. En utilisant un modèle humain basé sur les cellules souches pluripotentes induites (iPSCs), nous avons ensuite étudié le processus dégénératif chez les patients atteints de ciliopathies, un groupe de maladies génétiques hétérogènes affectant les protéines impliquées dans la structure et la fonction du cil primaire, qui sont fréquemment accompagnée d'une dégénérescence rétinienne. Nous générons des feuillets rétiniens dérivés d'iPSCs à partir de patients atteints de deux ciliopathies, les syndromes de Meckel-Gruber (MKS) et de Bardet-Biedl (BBS). Les photorécepteurs ciliopathiques présentaient des altérations communes significatives dans l'expression de centaines de gènes de développement. De plus, ils ont montré plusieurs anomalies dans la formation et le maintien du cilium interne, le positionnement du centriole mère, l'activation d'une réponse au stress aux protéines mal repliées, instabilités génomiques et l'accumulation de dommages à l'ADN. Cette étude révèle comment la combinaison des technologies de reprogrammation cellulaire et d'organogenèse avec le séquençage de nouvelle génération permet d'élucider les mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans les troubles dégénératifs et développementaux de la rétine humaine. La même approche, combinant la différenciation en RSs avec des techniques de séquençage du génome à large spectre, pourrait être appliquée pour modéliser de nombreuses maladies génétiques, développementales et dégénératives affectant les photorécepteurs. Il peut également aider à élucider les mécanismes moléculaires sous-jacents à ces maladies, au criblage de médicaments de composés ayant des effets thérapeutiques potentiels et à prédire les effets secondaires des médicaments. / Vision is considered the most important sense, taking on about 80% of the perceptions we receive in our everyday life. Cone-photoreceptors are responsible for high-resolution central vision and color discrimination, and their degeneration is frequently the cause of vision loss in retinal degenerative diseases (RDs). RDs are a heterogeneous group of diseases affecting millions of people worldwide, which at the moment are mostly without any therapeutic option. Animal models are extremely useful in studying the retina's development or degeneration and understanding the molecular mechanisms in inherited genetic disease affecting photoreceptors. Modeling human developmental and degenerative diseases can be particularly challenging, especially in the case of rare and complex diseases where no exhaustive animal models are available. Generation of sustainable human disease models that allow in-depth analysis of the molecular mechanism is one of the big challenges nowadays. Stem cell technology holds great potential in disease modeling and represents a new powerful tool for generating scalable and animal-free models that can more accurately illustrate clinical phenotypes of complex human diseases. We developed a protocol to differentiate pluripotent stem cells (PSCs) into retinal sheets (RSs), which are polarized, multi-layered tissues containing cone photoreceptors and expressing outer segment (OS), connecting cilium (CC), and nuclear specific markers. Using both mouse and stem cells-based humanized models, we first investigate the role of BMI1 in mature photoreceptors. The Polycomb group protein Bmi1 is known for its neuroprotective functions by controlling senescence and apoptosis and is expressed in both retinal progenitor and neurons, but little is known about its specific role in the adult retina. It has been recently linked to late-onset neurodegenerative disorders, and it could have a role in the pathology of late-onset RDs, such as Age-related Macular Degeneration (AMD). We showed that cone photoreceptors and bipolar neurons are generated normally but then undergo rapid degeneration in Bmi1-/- mice through Rip3-associated necroptosis. Degeneration was associated with chromatin compaction anomalies, activation of tandem-repeats, and oxidative stress. Furthermore, we show that BMI1 is preferentially expressed in cones at heterochromatic foci in the human retina. Its inactivation in human embryonic stem cells (hESCs) impaired cone terminal differentiation and resulted in chromatin compaction anomalies, activation of tandem-repeats, and P53 induction. These findings provide a mechanism explaining how Bmi1 deficiency leads to cone degeneration and reveal conserved biological functions and differences for Bmi1 in photoreceptor biology between mouse and man. Using an induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) based human model, we then investigate the degenerative process in patients with ciliopathies, a group of heterogeneous genetic diseases affecting proteins involved in primary cilium structure and function frequently accompanied by retinal degeneration. We generate iPSC-derived retinal sheets from patients affected by two ciliopathies, Meckel-Gruber (MKS) and Bardet-Biedl syndromes (BBS). Ciliopathic photoreceptors displayed significant common alterations in the expression of hundreds of developmental genes. Moreover, they showed several anomalies in the formation and maintenance of cilia, the mother centriole's positioning, the activation of a stress response to misfolded proteins, genomic instabilities, and DNA damage accumulation. This study reveals how combining cell reprogramming and organogenesis technologies with next-generation sequencing enables the elucidation of molecular and cellular mechanisms involved in human retinal degenerative and developmental disorders. The same approach, combining photoreceptor sheet differentiation and wide-genome expression profile, could be applied to model many genetic, developmental, and degenerative diseases affecting photoreceptors. It may help elucidate the molecular mechanisms underlining these diseases, drug screening of compounds with potential therapeutic effects, and predict drug side effects.

La morphogenèse cellulaire représente l’ensemble des évènements qui dictent la forme et la structure d’une cellule. Ces changements morphologiques sont importants pour de nombreux mécanismes vitaux, comme le développement embryonnaire, la réaction inflammatoire ou encore la cicatrisation. Pour cela, la morphogénèse cellulaire dépend principalement du remodelage du cytosquelette cellulaire qui, une fois associé à la membrane plasmique, forme l’armature de la cellule. L’ezrine, la radixine et la moésine appartiennent à la famille de protéines ERM et lient la membrane plasmique au cytosquelette d’actine et aux microtubules. De ce fait, les protéines ERM sont impliquées dans différents processus fondamentaux nécessitant un remodelage du cortex cellulaire tels que la mitose et la migration. Dans un contexte pathologique, la surexpression et/ou la sur-activation des protéines ERM corrèlent avec un haut potentiel métastatique et un pauvre pronostic chez les patients. Une meilleure compréhension de la régulation de ces trois protéines pourrait ainsi aider au développement de nouvelles solutions thérapeutiques. L’objectif de mon doctorat portait sur l’identification et la caractérisation de nouvelles voies de signalisation régulant les protéines ERM. Dans un premier temps (i), j’ai participé au développement et la caractérisation de sondes BRET2 permettant de suivre l’activité de chaque protéine ERM en temps réel. Ces sondes BRET2 sont d’ailleurs compatibles avec des études à grande échelle ce qui nous permettra de réaliser des cribles génomiques et chimiques dans le but d’identifier, respectivement, de nouveaux régulateurs et inhibiteurs pharmacologiques des protéines ERM. Ensuite (ii), grâce aux sondes BRET2, nous avons identifié les microtubules en tant que nouveaux régulateurs négatifs des protéines ERM. Nous avons alors montré que la dépolymérisation des microtubules d’interphase à l’entrée en mitose participe à l’activation des protéines ERM et à l’arrondissement cellulaire. Enfin (iii), nous avons montré que le récepteur couplé aux protéines G TPα régule l’activité des protéines ERM dans des cellules de cancer du sein triple négatif. Cette régulation est d’ailleurs importante pour la motilité de ces cellules. Pour conclure, en plus d’avoir développé de nouveaux outils utiles pour des études à grande échelle, mon travail de doctorat a permis de mettre en lumière deux nouvelles voies de signalisation régulant les protéines ERM au cours de la mitose et la migration cellulaire. Sans compter l’apport de nouvelles informations sur un aspect fondamental, mon travail a apporté de nouvelles pistes de réflexion quant aux rôles des protéines ERM dans le développement des métastases. / Cell morphogenesis represents the set of events that dictate the shape and structure of a cell. These morphological changes are important for many vital mechanisms such as embryonic development, inflammatory response, or wound healing. Cell morphogenesis depends mainly on the remodeling of the cell cytoskeleton which forms the framework of the cell when associated with the plasma membrane. Ezrin, radixin and moesin belong to the ERM family and crosslink the plasma membrane to the actin cytoskeleton and microtubules. Therefore, ERMs are involved in various fundamental processes requiring remodeling of the cell cortex such as mitosis and migration. In a pathological context, overexpression and/or overactivation of ERMs correlate with high metastatic potential and poor prognosis in patients. Thus, a better understanding of the regulation of these three proteins could help in the development of new therapeutic solutions. The aim of my PhD work was to identify and characterize novel signaling pathways regulating ERMs. In a first step (i), I participated in the development and characterization of BRET2 biosensors allowing to follow the activity of each ERM protein in real time. These BRET2 biosensors are compatible with large-scale studies which will allow us to perform genomic and chemical screens to identify, respectively, new upstream regulators and pharmacological inhibitors of ERMs. Secondly (ii), based on BRET2-chemical screen, we identified microtubules as new negative regulators of ERMs. We then showed that depolymerization of interphase microtubules at mitosis entry triggers ERM activation and cell rounding. Finally (iii), we showed that the G protein-coupled receptor TPα regulates the activity of ERMs in triple negative breast cancer cells. This regulation is important for the motility of these cells. To conclude, in addition to having developed new tools useful for large-scale studies, my PhD work has uncovered two new signaling pathways regulating ERMs during mitosis and cell motility. In addition to providing new information on a fundamental aspect, my work has provided new insights into the roles of ERMs in the development of metastasis.

The export of mRNAs from the nucleus to the cytoplasm is one of many steps along the gene expression pathway and is fundamental for mRNAs to meet with ribosomes for translation in the cytoplasm. Exchanges between nucleus and cytoplasm occur through the nuclear pore complex (NPC), which is a large multi-protein complex embedded in the nuclear membrane and assembled by 30 different proteins the nucleoporins. The nucleoplasmic side of the pore is believed to orchestrate many fundamental nuclear processes. Indeed, a growing body of evidence suggests that the nuclear pore is involved in a broad range of activities including modulation of DNA topology, DNA repair, epigenetic regulation of gene expression, and selective access to exporting molecules. The structural component required for orchestrating those nucleoplasmic functions is the basket, a ∼60- to 80-nm-long structure protruding into the nucleoplasm. The consensus view depicts the basket as a structure assembled by filamentous proteins, TPR (Translocated Promoter Region protein) in humans and by its two paralogues Mlp1 and Mlp2 (myosin-like proteins) in yeast, converging into a distal ring. In the first part of this thesis, we characterized the motion of specific mRNAs at the vicinity of the nuclear periphery. We observed that transcripts scan along the nuclear envelope, likely to find a nuclear pore to be exported. We also showed the scanning behavior was affected upon Mlp1 deletion or truncation as well as upon mutation of the nuclear poly(A) binding protein Nab2. These observations indicated that Mlp1 and hence baskets, as well as specific RNA binding proteins, facilitate the interaction of mRNA with the nuclear periphery. While the canonical structure of the NPC is well established, our understanding of the conditions and factors contributing to the assembly of a basket, as well as the stoichiometry of its components, remains incomplete. Although basket proteins have been implicated in the regulation of gene expression through gene anchoring to the nuclear periphery and in mRNA scanning before export, how this is mediated by Mlp1/2 is poorly understood. Moreover, the dynamics of basket proteins in yeast seem to obey different rules than those of other nucleoporins as their turnover at the pore is faster than any other NPC components. Furthermore, it has been observed that during heat shock Mlp1 and Mlp2 dissociate from nuclear pores and form intra-nuclear granules, sequestering mRNAs and RNA export factors. Yet the mechanism for the formation of these granules or their role during heat shock is poorly understood. In yeast, the nuclear baskets are not associated with all NPCs, as no baskets assemble on the pores adjacent to the nucleolus. Yet, how cells establish these basket-less pores and whether they represent specialized nuclear pores with different functions from basket-containing pores is still unknown. To understand the dynamics of basket assembly and the biological relevance of establishing distinct sets of pores, we dissected the biological processes leading to the formation of baskets. In addition, to highlight potential functional differences between the two types of pores, we identified the interactors of nuclear basket-containing and nucleolar basket-less pores. We showed that assembling a basket is not a default mode for a pore in the nucleoplasm and that active mRNA processing is required to maintain baskets integrity. While mRNA can be found associated with both types of pores, our results suggest that export kinetics may be different on basket-containing and basket-less pores. The eukaryotes organize their nucleus in discrete functional regions and the nuclear envelope has been envisioned as an organelle by and of itself. Our analyzes indicate that mRNAs and Mlp1 participate in an additional degree of nuclear compartmentalization by enabling the formation of a dynamic structure: the basket. Overall my project sheds new light on the nuclear organization and highlights the surprising entanglement between mRNA export and NPC plasticity. / L'exportation des ARN messagers du noyau vers le cytoplasme est l'une des nombreuses étapes de la voie d'expression des gènes et est fondamentale pour que les ARNm rencontrent les ribosomes pour être traduits dans le cytoplasme. Les échanges entre le noyau et le cytoplasme se font par l'intermédiaire du complexe du pore nucléaire, qui est un grand complexe multiprotéique enchâssé dans la membrane nucléaire et assemblé par 30 protéines différentes, les nucléoporines. Le versant nucléoplasmique du pore orchestre de nombreux processus nucléaires fondamentaux. En effet, un nombre croissant d’études suggère que le pore nucléaire est impliqué dans un large éventail d'activités, notamment la modulation de la topologie de l'ADN, la réparation de l'ADN, la régulation épigénétique de l'expression des gènes et l'accès sélectif aux molécules candidates à l’export. Le composant structurel nécessaire pour orchestrer ces fonctions nucléoplasmiques est appelé le panier une structure de ∼60 à 80 nm de long faisant saillie dans le nucléoplasme. Une vision consensuelle dépeint le panier comme une structure assemblée par des protéines filamenteuses convergeant en un anneau distal, TPR (Translocated Promoter Region protein) chez l'homme et par ses deux paralogues Mlp1 et Mlp2 (myosin-like proteins) chez la levure. Dans la première partie de cette thèse, nous avons caractérisé le mouvement d'ARNm spécifiques au voisinage de la périphérie nucléaire. Nous avons observé que les transcrits scannent l'enveloppe nucléaire, probablement pour trouver un pore nucléaire afin d'être exportés. Nous avons également montré que ce comportement était affecté par la délétion ou la troncation de Mlp1 ainsi que par la mutation de la protéine de liaison aux queues poly(A) Nab2. Ces observations indiquent que Mlp1 et donc les paniers, ainsi que des protéines liant l’ARN, facilitent l'interaction des ARNm avec la périphérie nucléaire. Alors que la structure canonique du pore nucléaire est bien établie, notre compréhension des conditions et des facteurs contribuant à l'assemblage du panier, ainsi que de la stoechiométrie de ses composants, reste incomplète. Bien que les protéines du panier soient impliquées dans la régulation de l'expression des gènes par l'ancrage des gènes à la périphérie nucléaire et dans le recrutement des ARNm avant leur export, la manière dont le panier intervient dans ce processus est mal comprise. De plus, la dynamique des protéines du panier chez la levure semble obéir à des 6 règles différentes de celles des autres nucléoporines, car leur renouvellement (turn over) au niveau du pore est plus rapide que celui des autres composants du NPC. De plus, il a été observé que lors d'un choc thermique, Mlp1 et Mlp2 se dissocient des pores nucléaires et forment des granules intra-nucléaires, séquestrant les ARNm et les facteurs d'exportation d'ARN. Pourtant, le mécanisme de formation de ces granules ou leur rôle pendant le choc thermique est mal compris. Chez la levure, le panier nucléaire n'est pas associé à tous les pores nucléaires, et les paniers sont absents des pores adjacents au nucléole. La manière dont les cellules établissent ces pores sans paniers et s'ils représentent des pores nucléaires spécialisés ayant des fonctions différentes des pores contenant des corbeilles n’est pas connue. Pour comprendre la dynamique de l'assemblage des paniers et la pertinence biologique de former de deux types de pores distincts, nous avons disséqué les processus biologiques menant à la formation des paniers. De plus, afin de mettre en évidence les différences fonctionnelles potentielles entre les deux types de pores nous avons étudié les protéines associées aux pores contenant un panier nucléaire et des pores sans panier. Nous avons montré que l'assemblage d'un panier n'est pas un mode par défaut pour un pore dans le nucléoplasme et que la formation et la maturation des ARNm est nécessaire pour maintenir l'intégrité des paniers. Alors que l'ARNm peut être trouvé associé aux deux types de pores, nos résultats suggèrent que la cinétique d’export peut être différente sur les pores avec et sans panier. Les eucaryotes organisent leur noyau en régions fonctionnelles discrètes et l'enveloppe nucléaire a été envisagée comme pouvant être une organelle à part entière. Nos analyses indiquent que les ARNm et Mlp1 participent à un degré supplémentaire de compartimentation nucléaire en permettant la formation d'une structure dynamique : le panier. Mon projet apporte un nouvel éclairage sur l'organisation des compartiments nucléaire et met en évidence l'intrication surprenante entre l'export des ARNm et la plasticité des pores nucléaires.

Le Phosphatidylinositol(4,5)P2 (PtdIns(4,5)P2) est essentiel pour réguler divers processus cellulaires, y compris la signalisation cellulaire, le trafic intracellulaire et la cytocinèse. Le contrôle strict de son homéostasie est donc crucial et la dérégulation des kinases, des phosphatases et des phospholipases qui la contrôlent conduit à de multiples pathologies. Parmi elles, le syndrome de Lowe est une maladie rare et incurable causée par des mutations du gène OCRL qui code pour la PtdIns(4,5)P2 phosphatase OCRL1. La déplétion de dOCRL, l’orthologue d’OCRL1 chez la drosophile altère l’homéostasie du PtdIns(4,5)P2 avec (i) une accumulation anormale de PtdIns(4,5)P2 sur les endomembranes conduisant (ii) à des défauts de cytocinèse et à de la multinucléation. L’objectif de cette thèse était de comprendre comment le PtdIns(4,5)P2 est régulé sur les endomembranes. Dans les cellules de drosophile, nous avons découvert une fonction nouvelle et inattendue pour le suppresseur de tumeur PTEN, indépendante de son activité phosphatase. En effet, nous avons constaté que PTEN réduit les niveaux de PtdIns(4,5)P2 sur les endosomes grâce à l’action enzymatique de dPLCXD, une phospholipase C (PLC) atypique. Ainsi la voie de signalisation PTEN/dPLCXD peut compenser pour les défauts de cytocinèse dus à la perte de dOCRL. Enfin, nous avons identifié un activateur chimique des PLC qui restaure la perte fonctionnelle d’OCRL dans trois modèles de syndrome de Lowe distincts. Par la suite, nous avons étudié le rôle de la PTEN/PLCXD pendant l’autophagie, mécanisme d’autodigestion du matériel cellulaire. En effet, l’homéostasie du PtdIns(4,5)P2 lysosomale est essentielle pour l’étape autophagique de fusion des autophagosomes avec lysosomes. Nous avons observé que la déplétion de PLCXD et la surexpression d’un mutant catalytiquement inactif de PTEN altèrent l’autophagie chez les cellules de drosophile et de mammifère. Ces données suggèrent que la voie PTEN/PLCXD nouvellement identifiée régule le flux autophagique. Dans cette thèse, nous avons mis en lumière une nouvelle voie de signalisation PTEN/dPLCXD qui contrôle les niveaux de PtdIns(4,5)P2 sur les endolysosomes. Cette voie peut réguler l’autophagie et compenser la perte de dOCRL. Il s’agit d’une nouvelle fonction de PTEN indépendante de son activité phosphatase et c’est une première fonction biologique connue pour PLCXD. Cette découverte a conduit à l’identification d’une stratégie thérapeutique potentielle pour traiter les patients atteints du syndrome de Lowe. / Phosphatidylinositol(4,5)P2 (PtdIns(4,5)P2) is essential for various cellular processes, including cell signaling, intracellular traffic and cytokinesis. Therefore, strict control of its homeostasis is crucial. Indeed, the deregulation of the kinases, phosphatases and phospholipases which controls PtdIns(4,5)P2 leads to multiple pathologies. Among them, the Lowe syndrome is a rare and incurable disease caused by mutations in the OCRL gene which codes for PtdIns(4,5)P2 phosphatase OCRL1. Depletion of dOCRL, the orthologue of OCRL1 in drosophila, alters the homeostasis of PtdIns(4,5)P2 with (i) an abnormal accumulation of PtdIns(4,5)P2 on the endomembranes leading (ii) to cytokinesis defects and multinucleation. The objective of this thesis was to understand how PtdIns(4,5)P2 is regulated on endomembranes. In drosophila cells, we have discovered a new and unexpected function for the tumor suppressor PTEN independent of its phosphatase activity. Indeed, we have found that PTEN reduces the levels of PtdIns(4,5)P2 on endolysosomes thanks to the enzymatic action of dPLCXD, an atypical phospholipase C (PLC). Thus, the PTEN/dPLCXD signaling pathway can compensate for cytokinesis defects due to the loss of dOCRL. Finally, we identified a chemical activator of PLC that restores the functional loss of OCRL in three distinct Lowe syndrome models. Next, we studied the role of this newly identified PTEN/PLCXD pathway during autophagy, a self-digestion mechanism. Indeed, the homeostasis of lysosomal PtdIns(4,5)P2 is essential for the fusion of autophagosomes with lysosomes during autophagy. We have observed that depletion of PLCXD and overexpression of a catalytically inactive mutant of PTEN both alter autophagy in Drosophila and mammalian cells. These data suggest that this newly identified PTEN/PLCXD pathway regulates the autophagic flux. In this thesis, we have highlighted a new PTEN/dPLCXD signaling pathway which controls the levels of PtdIns(4,5)P2 on endolysosomes. This new PTEN function is independent of its phosphatase activity and the first biological function for PLCXD can regulate autophagy and compensate for the loss of dOCRL. This discovery led to the identification of a potential therapeutic strategy for treating patients with Lowe’s syndrome.

Le cycle cellulaire eucaryote se divise en une série de phases ordonnées qui ont pour finalité la division cellulaire. Ce processus est primordial dans la prolifération des cellules normales et le développement, mais il est aussi très fortement dérégulé dans les cellules cancéreuses. Les phases de cycle cellulaire sont différenciées par les tâches effectuées au cours de celles-ci et requièrent l’expression de gènes spécifiques à chacune des phases. Chez l’humain, il existe environ 1000 gènes dont l’expression est dépendante de la phase du cycle cellulaire. Les mécanismes impliqués dans le contrôle de l’expression périodique de ces gènes ont principalement été étudié aux niveaux transcriptionnels et post-traductionnels. Cependant, la régulation post-transcriptionnelle demeure encore peu étudiée dans le contexte du cycle cellulaire, malgré son importance dans le contrôle de l’expression génique. Afin d’identifier des régulateurs post-transcriptionnels du cycle cellulaire, nous avons analysé la corrélation existante entre l’expression des gènes périodiques du cycle cellulaire et celle de 687 protéines liant l’ARN (RNA-binding protein; RBP) sur plus de 1000 spécimens de cancer du sein. Cette analyse nous a permis d’identifier 39 RBP dont les protéines Nuclear Factor 45 (NF45) et Nuclear Factor 90 (NF90). NF45 et NF90 forment un hétérodimère qui lie des structures d’ARN double brin et qui contrôle l’expression génique à différents niveaux de l’épissage à la stabilisation des ARNm. La déplétion de NF45 ou NF90 inhibe la prolifération des cellules en induisant de nombreux défauts mitotiques qui résultent d’une baisse d’expression de plusieurs gènes essentiels à la mitose. D’autre part, à l’aide d’une méthode de protéomique nous avons réalisé l’interactome du complexe NF45-NF90 afin de déterminer à quels niveaux ce mécanisme de régulation prend place et avons identifié une interaction avec le complexe Staufen1/2-UPF1 responsable de la dégradation des ARNm. Ainsi, les niveaux d’expression de certains ARNm importants à la mitose sont conditionnés par une compétition entre NF45-NF90 et Staufen1/2 pour la liaison à ces ARNm. Dans une seconde étude, nous avons recherché les régulations potentielles sur NF45 et NF90 au cours du cycle cellulaire et avons i découvert des évènements de phosphorylation sur NF90 prenant place en phase G2/M. Nous avons montré que cette phosphorylation est médiée par CDK1, et l’activation de CDK1 provoque la translocation de NF90 du noyau vers le cytoplasme. Enfin, au vu de l’implication du complexe NF45-NF90 dans la prolifération des cellules cancéreuses, nous avons réalisé un essai de criblage à haut débit de 120 000 molécules sur l’interaction entre NF45 et NF90. Cet essai nous as permis d’identifier plus de plus 1000 molécules pouvant potentiellement interférer avec le complexe NF45-NF90. Parmi celles-ci, nous avons retrouvé 14 molécules de la famille des glycosides cardiaques, qui sont des composés antiarythmiques mais qui par ailleurs possèdent des effets anticancéreux décrits depuis plusieurs décennies. De façon intéressante, le traitement des cellules à ces composés mène à un phénotype mitotique très similaire à la déplétion de NF45 ou NF90, suggérant une implication du complexe NF45-NF90 dans les effets antimitotiques induits par les glycosides cardiaques. En conclusion, ces études nous ont permis d’éclairer le rôle du complexe NF45-NF90 dans la prolifération cellulaire, mais aussi d’approfondir la compréhension des différents mécanismes impliqués dans le contrôle du cycle cellulaire. / The eukaryotic cell cycle is divided into a series of ordered phases leading to cell division. This process is essential in normal cell proliferation and development, but it is also largely deregulated in cancer cells. Cell cycle phases are differentiated by the different molecular processes performed and expression of specific genes at each phase is determinant. In humans, there are approximately 1000 genes that are periodically expressed throughout the cell cycle. Control of this periodic expression has been well characterized at the transcriptional and post-translational levels. However, post-transcriptional regulation remains little studied in the context of the cell cycle, despite its importance in the control of gene expression. In order to identify post-transcriptional cell cycle regulators, we have correlated the expression of cell cycle genes with the expression of 687 RNA-binding proteins (RBP) in more than 1000 breast cancer specimens. This analysis allowed us to identify 39 RBPs, including Nuclear Factor 45 (NF45) and Nuclear Factor 90 (NF90). NF45 and NF90 form a heterodimer that binds double-stranded RNA structures and controls gene expression at various levels, from splicing to stabilization of mRNAs. Depletion of NF45 or NF90 inhibits cell proliferation by inducing several mitotic defects resulting from decreased expression of many genes essential for mitosis. In order to determine at which levels this regulatory mechanism takes place, we performed a proteomic method to identifyNF45-NF90 proximal interactors and identified an interaction with the Staufen1/2-UPF1 complex responsible for the degradation of mRNAs. Thus, it appears that the expression of some mitotic mRNAs is controlled by a competition between NF45-NF90 and Staufen1/2 for binding to these mRNAs. In a second study, we looked for potential regulations on NF45 and NF90 during the cell cycle and found phosphorylation events on NF90 taking place in the G2/M phase of the cell cycle. We have shown that this phosphorylation is CDK1-dependent, and that CDK1 activation leads to the translocation of NF90 from the nucleus to the cytoplasm. Finally, based on the involvement of the NF45-NF90 complex in cancer cell proliferation, we carried out a high-throughput screening assay of 120,000 ii. Abstract ii molecules on the interaction between NF45 and NF90. This assay allowed us to identify more than 1000 molecules that could potentially interfere with the NF45-NF90 complex. Amongst them, we found 14 molecules belonging to the cardiac glycoside family, which are antiarrhythmic drugs that also display anticancer effects. Interestingly, treatment with cardiac glycosides leads to a mitotic phenotype very similar to the depletion of NF45 or NF90, suggesting an involvement of the NF45-NF90 complex in the antimitotic effects induced by cardiac glycosides. In conclusion, these studies have shed light on the role of the NF45-NF90 complex in cell proliferation, but also deepened our understanding of the different mechanisms involved in cell cycle control.

Déterminer le régime alimentaire des gastéropodes terrestres est important étant donné leurs impacts écologiques et économiques. L’observation en nature est difficile, car les gastéropodes sont principalement actifs la nuit et sont de petite taille. De plus, l’analyse visuelle des contenus digestifs est compliquée car les gastéropodes broient leurs aliments, ne permettant pas une identification précise. L’objectif est de produire une méthode fiable et peu onéreuse pour déterminer le régime alimentaire des gastéropodes en milieu naturel. Le modèle, Arion fuscus, a été échantillonné au printemps dans quatre érablières anciennes du sud du Québec (Canada). Une approche basée sur l’ADN a été utilisée avec amplification par PCR d’un segment d’un gène chloroplastique. La diversité a été déterminée par électrophorèse sur gel non-dénaturant suivie d’un séquençage des variants d’intérêts pour identifier les plantes consommées. Pour les 52 limaces analysées, les PCR ont fonctionné avec succès et les extractions d’ADN de mêmes individus traités indépendamment ont montré les mêmes résultats sur les gels SSCP. Des résultats fiables ont été produits en quelques semaines et le nombre d’échantillons à séquencer a été limité, réduisant ainsi les coûts. Les résultats montrent une faible diversité végétale consommée (6 haplotypes) par A. fuscus; 78,8% des limaces ont uniquement consommé la même espèce de plante. Cette méthode peut permettre de meilleurs suivis des espèces consommées par les gastéropodes dans un contexte d’écologie de la conservation ou de contrôle des espèces nuisibles. / The diet of terrestrial gastropods is difficult to assess in nature because of their often-nocturnal activity and their small size. Moreover, visual analyzes of digestive contents are problematic because gastropods grind food into small particles, making visual identification unexploitable. Determining the gastropods ‘diet is nevertheless highly relevant because gastropods may have strong ecological and economic impacts. On the one hand, several species are listed endangered or critically endangered. On the opposite, numerous species are considered agricultural pests. The objective is to produce an accurate and inexpensive method to determine the diet of gastropods. More specifically, by using an approach based on PCR-amplified DNA followed by SSCP gels, it was possible to determine taxa diversity before Sanger sequencing, and thus reduce costs. We used Arion fuscus from four old maple forests sites in southern Quebec (Canada) as model to test the method. The 52 individuals’ digestive contents analyzed resulted in a successful PCR amplification and independent DNA extractions from a given individual gave the same SSCP pattern. This method produced reliable results in a few weeks and at a low cost, making it possible to sequence only a few samples to know the plant species consumed by all individuals in the study. Results revealed a low diversity of plants consumed (6 haplotypes). 78.8% of the slugs harvested in spring consumed one and the same species of plant. This method enables the monitoring of plant species consumed by gastropods in conservation and agricultural pest control.