Le vieillissement est l'un premier facteur de risque pour plusieurs maladies telles que l’athérosclérose, la fibrose, l’Alzheimer, le diabète de type 2 et le cancer. L'accumulation de cellules sénescentes avec l'âge contribue au développement de maladies liées à l'âge en induisant une inflammation chronique causée par le phénotype sécrétoire associé à la sénescence (SASP). Il y a également une augmentation de la sécrétion de vésicules extracellulaires (EV) lors de la sénescence. Les EV sont des structures à bicouche lipidique permettant le transport de molécules actives vers des cellules réceptrices. De plus, les EV participent aux effets pathologiques des cellules sénescentes. Ainsi, nous proposons que les macrophages sénescents participent au développement de maladies liées à l’âge en induisant l'inflammation par l’action combinée des facteurs solubles du SASP et des EV. Tout d'abord, nous avons établi un modèle de macrophages sénescents induit par l’oncogène Raf-1. Une analyse transcriptionnelle de notre modèle a démontré un profil inflammatoire régulé par Nf-κB. La sécrétion d'EV est également augmentée par les macrophages sénescents. En outre, les EV dérivées de macrophages sénescents sont enrichies en miARN, tels que miR-21, miR-155 et miR-132, ainsi qu'en protéines ribosomiques, qu'en protéine Alix et qu'en protéine Mvp. Les sécrétions des macrophages sénescents induisent un échappement de la sénescence chez les cellules MEF, probablement par l'action combinée des molécules solubles du SASP et des EV. Nous concluons que les macrophages sénescents sécrètent des signaux prolifératifs et inflammatoires dans les cellules réceptrices, ce qui suggère leur rôle potentiel dans le développement de cancer. Le traitement avec le navitoclax élimine les macrophages sénescents et pourrait prévenir leurs effets pathologiques. / Aging is the first risk factor for several diseases such as atherosclerosis, fibrosis, Alzheimer’s, type 2 diabetes and cancer. The accumulation of senescent cells with age contributes to development of age-related diseases by inducing chronic inflammation. This inflammation is induced by the senescence-associated secretory phenotype (SASP). During senescence, there is also an increase of extracellular vesicles (EV) secretion. EVs are lipid bilayer structures that allow the transport of active molecules to recipient cells. In addition, EVs participate in pathologic effects of senescent cells. Thus, we propose that senescent macrophages participate in development of age-related diseases by inducing inflammation through the combined effect of SASP soluble factors and EV. First, we established a model of senescent macrophages induced by the oncogene Raf-1. Transcriptional analysis of our model demonstrated an Nf-κB-regulated inflammatory profile. EV secretion is also increased by senescent macrophages. Moreover, EVs derived from senescent macrophages are enriched in miRNA, such as miR-21, miR-155 and miR-132, as well as ribosomal proteins, Alix protein an Mvp protein. Secretion of senescent macrophages induce senescence escape in MEF cell, probably through the combined action of SASP soluble factor and EV. We conclude that senescent macrophages secrete proliferative and inflammatory signals in recipient cell, suggesting their potential role in cancer development. Treatment with navitoclax eliminates senescent macrophages and may prevent their pathological effects.

Le récepteur nucléaire orphelin facteur stéroïdogénique 1 (SF-1 ou NR5A1) est un modulateur indispensable du développement surrénal et gonadique et qui joue un rôle dans la détermination du sexe, le développent hypothalamique, la fonction hypophysaire et la stéroïdogénèse. Toutefois, les études sur SF-1 dans le milieu de la biologie de la reproduction portent majoritairement sur des modèles embryonnaires ou de mammifères immatures. L’objectif principal de cette thèse était de déterminer le rôle de SF-1 dans les évènements clés de la fonction reproductrice chez les mâles et femelles matures. Ce facteur de transcription est exprimé dans différents organes, principalement ceux de l’axe hypothalamo-hypophyso-gonadique, et dans divers types cellulaires des gonades. Nous avons donc généré 4 modèles de souris knockout conditionnels (cKO) en utilisant les allèles Cre-recombinase et flox de SF-1 (SF-1f/f) afin d’identifier son rôle dans les différentes populations cellulaires des testicules et ovaires de souris matures. Dans la première étude, nous avons présenté une analyse des souris femelles du modèle cKO du récepteur de la progestérone (PRCre/+;Nr5a1f/f), où la suppression de SF-1 est spécifique aux cellules gonadotropes de l’hypophyse et aux cellules ovariennes de type granulosa suite au déclenchement du signal ovulatoire ainsi que les cellules lutéales du corps jaune. Cette étude a révélé de nouveaux rôles in vivo de SF-1 durant l’ovulation et la lutéinisation, tout en suggérant que SF-1 est un médiateur de la synthèse et sécrétion des gonadotrophines. Les femelles PRCre/+;Nr5a1f/f cKO étaient infertiles principalement en raison de l’importante réduction de FSH et LH sécrété dans la circulation, causé par le phénotype hypophysaire. Afin de contourner cette dysfonction hypophysaire, des traitements de gonadotrophines exogènes ainsi que des transplantations d’ovaires nous ont permis de démontrer que SF-1 régule la transcription de gènes impliqués dans l’expansion du cumulus ainsi que la rupture de follicules pour induire l’ovulation. De plus, nous avons montré que l’absence de SF-1 dans les ovaires de souris matures peut mener à l’infertilité, indépendamment du phénotype hypophysaire. D’autre part, nos trouvailles indiquent que, malgré la basse expression de SF-1 dans le corpus luteum chez la souris, sa déplétion dans les cellules lutéales conditionnée par recombinase Cre inhibe la production de progestérone. Aucun phénotype reproductif a été observé chez les souris PRCre/+;Nr5a1f/f cKO mâles. La deuxième étude a démontré le rôle essentiel de SF-1 dans la fonction du testicule mature. La souris mâle P450 17α-hydroxylase (Cyp17Cre/+;Nr5a1f/f) cKO, où la suppression de SF-1 est spécifique aux cellules de Leydig, était fertile malgré la taille réduite de ses testicules, la malformation de ses tubes séminifères, la perturbation de la spermiogénèse, ainsi que la réduction d’expression de gènes de la stéroïdogénèse. Bien que les mâles aromatase (Cyp19Cre/+;Nr5a1f/f) cKO, supprimant SF-1 dans les cellules de Sertoli, étaient fertiles et démontraient des capacités reproductives similaires aux mâles contrôle, les souris Cyp17Cre/++Cyp19Cre/+; Nr5a1f/f cKO (dKO) étaient soit infertiles ou montrait une fertilité affaiblie. La dysgénésie sévère du cordon testiculaire ainsi que la spermatogénèse perturbée chez la souris dKO étaient causées par la déplétion simultanée de SF-1 chez les cellules de Leydig et Sertoli, suggérant que les cellules de Sertoli peuvent compenser pour l’absence de SF-1 dans les cellules de Leydig et vice versa. Ces données démontrent que SF-1 est requis pour une stéroïdogénèse testiculaire et une spermatogénèse ainsi qu’une fertilité normale, bien que savoir si la régulation de ces fonctions par SF-1 est directe ou indirecte reste à élucider. De façon intéressante, les femelles des trois lignées cKO étudié dans ce deuxième article étaient fertiles et la sous expression de SF-1 dans les cellules ovariennes de type granulosa ou de la thèque a produit des effets mineurs sur leur fonction reproductive. En somme, la recherche présentée dans cette thèse contribue à l’avancement des connaissances sur SF-1 et son rôle dans la régulation d’événements reproductifs cruciaux dans l’hypophyse, l’ovaire et le testicule de souris matures. Les lignes de souris produites dans ce projet vont servir d’outil indispensable pour élucider les mécanismes de régulation de SF-1 sur la fonction gonadique and présenter de nouvelles avenues de recherches pour ce récepteur orphelin. / The orphan nuclear receptor steroidogenic factor-1 (SF-1 or NR5A1) is an indispensable modulator of adrenal and gonadal development, playing key roles in sex determination, hypothalamic development, pituitary function and steroidogenesis. Yet, studies to date of SF-1 in reproductive biology mostly focus on embryonic and immature mammalian models. The overall objective of this thesis was to determine the role of SF-1 in key events of mature male and female mouse reproductive function. This transcription factor is expressed in a variety of organs, mainly those of the hypothalamic-pituitary-gonadal axis, as well as in multiple cell types of the gonads. Therefore, we generated four conditional KO (cKO) mouse models employing Cre-recombinase and floxed alleles of SF-1 (SF-1f/f) to identify its role in different cell types of the testes and ovaries of mature mice. Our first study presents an analysis of female mice from the progesterone receptor (PRCre/+;Nr5a1f/f) cKO model, where SF-1 depletion is specific to gonadotropes in the pituitary gland as well as granulosa cells of the peri-ovulatory follicle and luteal cells of the corpus luteum. This research highlighted new in vivo roles for SF-1 in ovulation and luteinization, and provided further evidence that SF-1 is a mediator of gonadotropin synthesis and secretion. PRCre/+;Nr5a1f/f cKO females were infertile, due in large part to the reduced secretion of FSH and LH, caused by the pituitary phenotype. Exogenous gonadotropin treatments and ovarian transplantation experiments allowed us to circumvent the pituitary dysfunction to demonstrate that SF-1 in granulosa cells regulates the transcription of cumulus expansion and follicle rupture genes to induce ovulation. In addition, we showed that the absence of SF-1 in ovaries of mature mice can lead to female infertility, independent of the pituitary phenotype. Moreover, the data showed that, though SF-1 expression is reduced in mouse corpus luteum, its Cre-mediated depletion in luteal cells abrogates progesterone production. No reproductive phenotype was observed in PRCre/+;Nr5a1f/f cKO males. Results from our second study demonstrated that SF-1 plays an essential role in mature testicular function. The P450 17α-hydroxylase (Cyp17Cre/+;Nr5a1f/f) cKO male mouse, where the SF-1 depletion is specific to Leydig cells, were fertile, though showed reduced testis size with disrupted seminiferous tubules and impaired spermiogenesis, in addition to reduced expression of steroidogenic genes. While the aromatase (Cyp19Cre/+;Nr5a1f/f) cKO males were fertile and showed reproductive capacities comparable to control males, the Cyp17Cre/++Cyp19Cre/+; Nr5a1f/f cKO (dKO) model were either infertile or showed significantly impaired fertility. The dKO males displayed severe testis cord dysgenesis and impaired spermatogenesis caused by the depletion of SF-1 in both Leydig and Sertoli cells, suggesting that Sertoli cells can compensate for the absence of SF-1 in Leydig cells and vice versa. These data provide strong evidence that SF-1 is required for normal testicular steroidogenesis, spermatogenesis and male fertility, though whether the regulation of these functions is direct or indirect remains to be elucidated. Interestingly, the females of the three cKO mouse lines studied in this second article were fertile and the depletion of SF-1 in granulosa cells of antral follicles or in theca cells produced minor effects on their steroidogenic capacities. Collectively, the research presented in this thesis contributes to advance our understanding of the role of SF-1 in the regulation of essential reproductive events in the pituitary, ovary and testis of mature mouse gonads. The mouse lines generated for this project will serve as valuable tools to elucidate the mechanisms underlying SF-1 regulation of gonad function and present novel directions for the investigation of this nuclear receptor.

Le resvératrol (RV/RSV) est un composé chimique organique connu pour ses effets anticancéreux mais aussi pour son effet rajeunissant sur les cellules et les organismes. Afin d’étudier le ou les multiples mécanismes à l’origine de ces effets, Y. Benslimane du laboratoire Harrington a étudié l’effet du resvératrol in vitro, à des concentrations de l’ordre de 12,5 μM à 25 μM, sur plusieurs lignées de cellules cancéreuses humaines, notamment NALM6 et JURKAT. Ses recherches ont démontré que le traitement par resvératrol conduit à l’activation de la voie de signalisation ATR/CHK1, qui maintient les cellules mitotiques en phase S afin d'induire la réparation de l'ADN. Dans ces cellules, le resvératrol présente spécifiquement une signature similaire à celle de l’hydroxyurée, un composé anticancéreux connu pour l’induction de stress réplicatif. Cette induction de stress réplicatif semble complémentaire aux mécanismes de la littérature existante, qui présente le resvératrol comme un activateur de sirtuines, une famille d’histones désacétylases hautement conservées entre les espèces et impliquées dans la réparation de l'ADN et la réponse métabolique. Cependant, alors que plusieurs articles démontrent une activation de la sirtuine 1 (SIRT1) comme conséquence notable du traitement par le resvératrol, les études de Benslimane et al. ont démontré quant à elles que le knock-out de la sirtuine 1 dans les cellules NALM6 et Jurkat n’affectait pas le phénotype de stress réplicatif observé. Or les concentrations de resvératrol employées dans l’ensemble de la littérature scientifique varient de 0,5 μM à 100 μM in vitro, laissant supposer une variance dans les conditions expérimentales qui pourrait expliquer la variance de résultats observés. Dans ce contexte, nous avons émis l’hypothèse que l’effet du resvératrol était dépendant de la concentration utilisée, autrement dit, que son effet était biphasé. Plus spécifiquement, dans les cellules NALM6 cancéreuses, nous avons supposé que les stress réplicatif causé par des concentrations élevées (>12,5 μM) de resvératrol pouvait masquer l’activation des sirtuines et spécifiquement celle de la sirtuine 1, tandis que des concentrations plus faibles (<5 μM) 4 permettraient l’observation potentielle de mécanismes parallèles à l’activation de la voie ATR/CHK1. Nous avons également émis l’hypothèse que l’échelle temporelle d’observation jouait un rôle dans la mesure des résultats et leur observabilité. Afin d’examiner nos hypothèses, nous avons dans un premier temps fixé le temps d’observation à 72h après traitement, et évalué l'effet du resvératrol et de l'inhibiteur de l'ATR VE-821 sur la viabilité cellulaire relative dans les cellules NALM6 WT, p53 KO et SIRT1 KO. La lignée p53 KO fut choisie, car p53 est en aval des voies de signalisation ATR/CHK1 et SIRT1. Cette expérience a montré une augmentation légère et non significative de la viabilité relative dans les trois lignées à des concentrations de resvératrol d'environ 2,5 μM, et une réduction significative de la viabilité à des concentrations supérieures à 10 μM. En outre, le score de synergie Bliss a révélé un effet additif entre le resvératrol et VE-821. Dans un second temps, nous avons quantifié l’effet de différentes concentrations de resvératrol sur le cycle cellulaire. Dans les trois lignées cellulaires, on trouve un pourcentage significatif de cellules arrêtées en phase S après un traitement de 24 heures avec 12,5 μM de resvératrol, mais aucune différence significative entre les conditions DMSO et 2,5 μM de resvératrol. On n’observe pas de différence significative entre les lignées. Enfin, une expérience temporelle révèle que les effets du resvératrol pourraient s'estomper après 16h, et montre une légère augmentation des cellules arrêtées en phase S après un traitement à 2,5 μM de resvératrol à 16h, par rapport au contrôle DMSO, suggérant un temps d’observation intéressant en deçà de 16h et un potentiel effet du resvératrol à faible dose. Ces résultats semblent confirmer l'action du resvératrol sur la voie ATR/CHK1, avec un arrêt du cycle cellulaire en phase S après traitement par 12,5 μM de resvératrol, dans les trois lignées WT, SIRT1 KO et p53 KO. Ils suggèrent également un effet potentiellement bénéfique du resvératrol à faibles doses par le biais d'un stress réplicatif de faible intensité, sans démontrer de dépendance à SIRT1 ou p53. Enfin, ils soulignent la nécessité d’une observation à différentes échelles temporelles. / Resveratrol (RV/RSV) is an organic chemical compound known for its anti-cancer and rejuvenating effects on cells and organisms. To investigate the multiple mechanisms behind these effects, Y. Benslimane of the Harrington laboratory studied the effect of resveratrol in vitro, at concentrations ranging from 12.5 μM to 25 μM, on several human cancer cell lines, including NALM6 and JURKAT. His research has shown that treatment with resveratrol leads to activation of the ATR/CHK1 signaling pathway, which keeps mitotic cells in S phase to induce DNA repair. Resveratrol specifically displays a signature similar to that of hydroxyurea, an anti-cancer compound known to induce replicative stress. This induction of replicative stress seems complementary to the mechanisms exposed in the literature, which presents resveratrol as an activator of sirtuins, a family of histone deacetylases highly conserved across species and involved in DNA repair and metabolic response. However, while several articles demonstrate activation of sirtuin 1 (SIRT1) as a notable consequence of resveratrol treatment, studies by Benslimane et al. showed that sirtuin 1 knockout in NALM6 and Jurkat cells did not affect the observed phenotype of replicative stress. Because concentrations of resveratrol used in the literature vary from 0.5 μM to 100 μM in vitro, we hypothesized that this variance in experimental conditions might explain the variety of results observed. More specifically, in NALM6 cancer cells, we hypothesized that replicative stress caused by high concentrations (>12.5 μM) of resveratrol could mask activation of sirtuins and specifically sirtuin 1, while lower concentrations (<5 μM) would allow the potential observation of mechanisms parallel to activation of the ATR/CHK1 pathway. We also hypothesized that the time scale of observation played a role in the measurement of results and their observability. To examine our hypotheses, we first set the observation time at 72h post-treatment, and assessed the effect of resveratrol and the ATR inhibitor VE-821 on relative cell viability in NALM6 WT, p53 KO and SIRT1 KO cells. The p53 KO line was chosen, as p53 is downstream of the 6 ATR/CHK1 and SIRT1 signaling pathways. This experiment showed a slight, non-significant increase in relative viability in all three lines at resveratrol concentrations of around 2.5 μM, and a significant reduction in viability at concentrations above 10 μM. In addition, the Bliss synergy score revealed an additive effect between resveratrol and VE-821. In a second step, we quantified the effect of different resveratrol concentrations on the cell cycle. In all three cell lines, we found a significant percentage of cells arrested in S phase after 24h treatment with 12.5 μM resveratrol, but no significant difference between DMSO and 2.5 μM resveratrol conditions. No significant difference was observed between lines. Finally, a time-course experiment revealed that the effects of resveratrol might fade after 16h, and showed a slight increase in S-phase arrested cells after treatment with 2.5 μM RSV at 16h, compared with the DMSO control, suggesting an interesting observation time below 16h and a potential effect of resveratrol at low doses. These results seem to confirm the action of resveratrol on the ATR/CHK1 pathway, with cell cycle arrest in S phase after treatment with 12.5 μM resveratrol, in the three lines WT, SIRT1 KO and p53 KO. They also suggest a potentially beneficial effect of low-dose resveratrol via low-intensity replicative stress, without demonstrating dependence on SIRT1 or p53. Finally, they emphasize the need for observation on different time scales.

Dans l’hypophyse, Pax7 spécifie l’état du lobe intermédiaire grâce à son action pionnière. Cette action implique dans un premier temps une liaison de cette protéine à certains sites d’hétérochromatine et, par la suite, le remodelage de cette hétérochromatine en euchromatine. Le remodelage de l’épigénome par Pax7 permet au facteur de transcription Tpit d’entrainer l’activation du transcriptome mélanotrope par opposition au destin hypophysaire corticotrope entraîné par Tpit en l’absence de Pax7. Pour étudier l’action pionnière de Pax7, différents membres du laboratoire Drouin ont utilisé un modèle de cellules corticotropes. L’expression ectopique du facteur pionnier Pax7 dans ces cellules permet leur transition d’un phénotype corticotrope à mélanotrope. En plus de l’isoforme prédominante de Pax7 exprimée dans hypophyse avec lequel les travaux de Budry et Mayran ont étaient faits, il existe trois autres isoformes de Pax7 qui diffèrent par quelques acides aminés (Q et GL) dans le domaine PAIRED liant l’ADN. Nous voulions savoir quels étaient les domaines protéiques de Pax7 impliqués pour son activité pionnière. Nous avons d’abord étudié les propriétés des différents isoformes naturelles de Pax7 présentant des variations dans le domaine PAIRED que ce soient pour leurs capacités de facteur transcription ou de facteur pionnier dans un modèle de cellules de corticotrope. Nous avons constaté que les quatre isoformes de Pax7, ainsi que Pax3, le facteur le plus homologue à Pax7 dans la famille Pax, présentent une capacité similaire à lier la chromatine fermée. Cependant, Pax3 et les isoformes de Pax7 (GL+) sont incapables d’ouvrir la chromatine sur un sous-groupe d’enhancers pionniers nécessaire à l’activation du transcriptome mélanotrope. Par la suite, par analyse structure-fonction, nous avons identifié une région de Pax7 importante pour sa liaison à soixante pour cent des sites présents dans l’hétérochromatine qui sont ciblés par l’action pionnière et une région importante pour l’ouverture de chromatine aux sites des pionniers sensibles à la variation GL. Collectivement, nos données ont montré que les acides aminés GL dans le domaine PAIRED en N-terminal et la partie C-terminale de la protéine Pax7 sont critiques pour l’ouverture de la chromatine à des enhancers spécifiques présents dans l’hétérochromatine dont l’activation est nécessaire au destin mélanotrope. D’autre part, les analyses de structure-fonctions nous ont permis d’identifier une région critique de Pax7 nécessaire à son interaction avec l’hétérochromatine sur ces même enhancers. / In the pituitary, Pax7 specifies the intermediate lobe state through a pioneer factor action that involves the binding of this protein to certain heterochromatin sites and, subsequently, the remodeling of this heterochromatin into euchromatin. Epigenome remodeling by Pax7 thus allows the transcription factor Tpit to determine the melanotrope fate as opposed to the corticotrope pituitary fate that is driven by Tpit in absence of Pax7. To study the pioneering action of Pax7, Budry et al, and Mayran et al, used a model of corticotrope cells which, following the expression of Pax7, transit from a corticotrope phenotype to melanotic phenotype thanks to its pioneering action. In addition to the predominant Pax7 isoform expressed in pituitary with which the work of Budry and Mayran were done, there are three other Pax7 isoforms that differ by a few amino acids (Q and GL) in the DNA-binding paired domain. We wanted to know what protein domains of Pax7 was involved in its pioneering activity. We have investigated the properties of the different Pax7 isoforms with respect to their transcriptional and pioneer capabilities in a model of corticotrope cells. We found that all four Pax7 isoforms together with the closely related factor Pax3, exhibit a similar ability to bind closed chromatin. However, Pax3 and the isoforms of Pax7 (GL+) failed to open the chromatin at a subset of enhancer necessary to activate the melanotrope transcriptome. In addition, we have identified by structure-function analysis a region of Pax7 that appears important for Pax7 binding at 60 percent of heterochromatin sites that are targeted for pioneering and one region important for chromatin opening to the pioneer sites GL-sensible. Collectively, our data suggest that the amino acids GL in the paired domain and the C-terminal part are critical for the chromatin opening to heterochromatin sites necessary to melanotrope transcriptome. On the other hand, structure-functions analyses allowed us to identify a critical region of Pax7 required for the interaction with heterochromatin on these same enhancers.

Chez les cellules eucaryotes, la mitochondrie est une organelle impliquée dans plusieurs fonctions cellulaires (production d’énergie, apoptose, production de ROS, prolifération, signalisation cellulaire, vieillissement, immunité et plus encore) et possédant son propre génome, soit l’ADN mitochondrial (ADNmt). Chez l’humain, on croyait que l’ADNmt ne codait que pour 37 gènes impliqués dans la production d’énergie et la traduction mitochondriale. Cependant, le potentiel codant du génome mitochondrial aurait été sous-estimé. Il a récemment été démontré qu’à l’intérieur de ces principaux gènes connus pouvaient se cacher plusieurs petits gènes alternatifs. Ceux-ci se retrouvent au sein de régions non codantes ou possèdent des séquences d’initiation ou de terminaison de la traduction distinctes de celles du gène de référence dans lequel ils se retrouvent. Ils codent pour des micropeptides dérivés des mitochondries qui possèdent un large éventail de fonctions, s’ajoutant à la longue liste de fonctions dans lesquelles la mitochondrie est déjà impliquée. Parmi ces peptides, on retrouve l’Humanine, MOTS-c, SHLP1-6, Gau et SHMOOSE. Nous avons précédemment découvert un nouveau gène alternatif situé dans le gène nd4, nommé mtaltnd4. Dans cette étude, nous visions à clarifier les fonctions du peptide alternatif correspondant MTALTND4 en étudiant son patron d’expression dans les tissus humains, l’impact de plusieurs stress sur son expression, l’impact du peptide sur la transcription des gènes, et ses partenaires d’interaction. Nous avons découvert que MTALTND4 pourrait être une molécule de signalisation sécrétée par les cellules en réponse au stress et affectant la physiologie pour induire un état de dépression bioénergétique en réduisant les processus de production et de demande en ATP. Plusieurs autres indices révélés par nos expériences suggèrent que MTALTND4 pourrait être une protéine multifonctionnelle impliquée dans de nombreuses voies de régulation. / In eukaryotic cells, mitochondria are organelles involved in many cellular functions (energy production, apoptosis, ROS production, proliferation, cell signaling aging, immunity and more) and that possess their own genome, namely mitochondrial DNA (mtDNA). In humans, mtDNA was believed to encode only 37 genes involved in energy production and mitochondrial translation. However, the coding potential of the mitochondrial genome has been underestimated. It has recently been shown that within these main genes could hide several small alternative genes (i.e., genes withing non-coding regions or with translation initiation/termination sequences that are distinct from the reference gene sequences in which they are found). They code for mitochondrial-derived micropeptides (MDPs) that have a broad spectrum of functions, adding to the extensive list of functions in which mitochondria are already involved. These peptides include Humanine, MOTS-c, SHLP1-6, Gau and SHMOOSE. We have previously discovered a new alternative gene located in the nd4 gene, termed mtaltnd4. In this study, we aim to clarify the functions of the corresponding alternative peptide MTALTND4 by studying its expression pattern in human tissues, the impact of several stresses on its expression, the impact of the peptide on gene transcription, and its interaction partners. We have found that MTALTND4 could be a signaling molecule secreted by cells in response to stress and would affect physiology to induce a state of bioenergetic depression by reducing ATP-producing and ATP-demanding processes. Several other clues revealed by our experiments suggest that MTALTND4 could be a multifunctional protein involved in numerous regulatory pathways.

La voie de signalisation Hippo est composée classiquement des kinases mammalian sterile twenty-like 1 et 2 (MST1/2) et des kinases large tumor suppressor 1 et 2 (LATS1/2) qui régulent les effecteurs transcriptionnels Yes-associated protein (YAP) et transcriptional coactivator with PDZ-binding motif (TAZ). Elle est impliquée dans plusieurs mécanismes cellulaires tels que la prolifération, la différenciation et l’apoptose ainsi que dans le maintien de l’homéostasie de différents tissus. Cependant, bien qu’il ait été démontré que YAP/TAZ contribuent au maintien de la glande surrénale, le rôle joué par les principales kinases de la voie Hippo dans ce tissu n’a jamais encore été évalué. L’objectif de ce projet de thèse est donc d’identifier les rôles des différentes kinases de la voie Hippo dans le développement et le maintien du cortex surrénalien par la création de cinq modèles de souris transgéniques. Grâce au modèle d’inactivation des kinases Mst1/2 dans le cortex surrénalien (Mst1flox/flox;Mst2flox/flox;Nr5a1-cre), nous avons démontré que Mst1/2 empêchent l’apparition prématurée de cellules ressemblant aux cellules du primordium adrénogonadique (AGP-like) dans la couche sous-capsulaire. Les analyses du transcriptome de ce modèle ont de plus démontré que les kinases MST1/2 régulent finement l’activité de YAP et des cellules de la zone glomérulée (zG) du cortex surrénalien à l’âge adulte mais pas l’activité des cellules de la zone fasciculée (zF). Ceci suggère que MST1/2 sont surtout impliqués dans la régulation de la fonction et de la différenciation des cellules de la zG. Contrairement à l’inactivation de Mst1/2, l’inactivation des kinases Lats1/2 dans tout le cortex en utilisant la même lignée Cre (Lats1flox/flox;Lats2flox/flox;Nr5a1-cre), a démontré que LATS1/2 empêchent la transdifférenciation des cellules du cortex en cellules ressemblant à des myofibroblastes et à la formation de fibrose durant le développement embryonnaire. De plus, l’inactivation de LATS1/2 spécifiquement dans les cellules de la zG (Lats1flox/flox;Lats2flox/flox;AS-cre) a démontré que LATS1/2 empêchent la transdifférenciation des cellules de la zG en cellules partageant des caractéristiques avec des ostéoblastes et des cellules de Sertoli. Cette inactivation est également responsable de l’induction d’une importante réponse immuno-inflammatoire chez les animaux juvéniles. De plus, l’inactivation de Yap/Taz simultanément à l’inactivation de Lats1/2 dans les cellules de la zG (Yapflox/flox;Tazflox/flox;Lats1flox/flox; Lats2flox/flox;AS-cre) a permis de confirmer que l’augmentation de l’activité transcriptionnelle de YAP et de TAZ était responsable du phénotype observé à la suite de l’inactivation de Lats1/2. Finalement, l’utilisation d’un modèle exprimant une forme constitutivement active de YAP humain dans les cellules de la zG (Rosa26YAP5SA/+;AScre/+) nous a permis de démontrer que l’augmentation de l’activité transcriptionnelle de YAP seule ne pouvait reproduire pleinement le phénotype observé suite à l’inactivation de Lats1/2 mais conduit plutôt à l’hyperplasie de la glande surrénale. Ensemble, nos modèles murins démontrent un rôle important pour la voie Hippo, et particulièrement les kinases LATS1/2 et les effecteurs YAP/TAZ, dans la différenciation des cellules stéroïdogéniques du cortex surrénalien et le maintien de l’homéostasie de la glande surrénale chez la souris. Ces travaux ouvrent non seulement la voie à l’étude plus poussée de cette voie dans des pathologies de la glande surrénale, comme les tumeurs surrénaliennes, mais mettent également en évidence la voie Hippo en tant que cible thérapeutique pour les troubles surrénaliens. / The Hippo pathway canonical signaling is composed of the mammalian kinases sterile twenty-like 1 and 2 (MST1/2) and large tumor suppressor 1 and 2 (LATS1/2) which ultimately regulate the transcriptional co-activators Yes-associated protein (YAP) and the transcriptional coactivator with PDZ-binding motif (TAZ). This pathway plays critical roles in maintaining the homeostasis of various tissues and regulating biological processes such as cellular proliferation, differentiation, and apoptosis in a tissue-specific manner. Although previous studies have shown that the effectors YAP/TAZ are involved in the maintenance of the adrenal gland, the roles played by their main upstream kinases in this tissue have not yet been evaluated. The objective of this thesis project is therefore to identify the importance of these distinct Hippo pathway kinases in the development and maintenance of the adrenal cortex by generating five different conditional transgenic mouse models. Using a Mst1/2 inactivation model (Mst1flox/flox;Mst2flox/flox;Nr5a1-cre), we first demonstrated that loss of Mst1/2 in the entire cortex leads to premature appearance of spindle-shaped cells resembling adrenogonadal primordium “AGP-like” cells in the sub-capsular region of the adrenal cortex. Further transcriptomic analyses performed on this model showed that MST1/2 can regulate the activity of YAP and of cells forming the zona glomerulosa (zG) in adult mice but not the activity of cells of the zona fasciculata (zF). This finding suggested that kinases MST1/2 are mainly involved in the regulation of zG cell function or differentiation. The inactivation of Lats1/2 using the same Cre line (Lats1flox/flox;Lats2flox/flox;Nr5a1-cre) demonstrated that LATS1/2 prevent the transdifferentiation of cortical cells into myofibroblast-like cells and the onset of fibrosis during embryonic development. Moreover, the inactivation of Lats1/2 specifically in the zG cells (Lats1flox/flox;Lats2flox/flox;AS-cre) demonstrated that LATS1/2 prevent the transdifferentiation of zG cells into cells sharing characteristics with osteoblast and Sertoli cells. This inactivation is also responsible for the induction of an immune-inflammatory response in juvenile mice. Most importantly, the concomitant inactivation of Yap/Taz with Lats1/2 in zG cells (Yapflox/flox;Tazflox/flox;Lats1flox/flox;Lats2flox/flox;AS-cre) demonstrated that the increase in the transcriptional activity of YAP/TAZ was responsible for the phenotype observed following the loss of Lats1/2. To complete our studies, we employed a mouse model expressing a constitutively active human form of YAP in zG cells (Rosa26YAP5SA/+;AScre/+) which demonstrated that increased transcriptional activity of YAP alone is not sufficient to recapitulate the phenotype observed following the loss of Lats1/2 but induces adrenal gland hyperplasia. Together, these findings indicate an important role for the Hippo signaling pathway, particularly LATS1/2 kinases and YAP/TAZ effectors, in the differentiation of steroidogenic cells of the adrenal cortex and the maintenance of adrenal gland homeostasis in mice. These findings not only pave the way for further studies of this pathway in important adrenal gland pathologies, such as adrenal tumors, but also highlight the Hippo pathway as a potential target for therapeutic treatments of adrenal disorders.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / Le cancer épithélial sporadique des ovaires se situe en quatrième position des causes de décès par cancer chez la femme après ceux du sein, du poumon et du côlon. Nous avons initié et mis au point un modèle pour déterminer les altérations moléculaires dans les cancers ovariens et corréler les résultats aux différentes étapes de la progression clinique de la maladie. Nous avons établi et caractérisé des cultures primaires dérivées d'ovaires normaux et de différentes tumeurs ovariennes qui couvrent différents types histologiques et différentes étapes de la maladie. Plusieurs analyses morphologiques, immunohistochimiques et moléculaires ont démontré que ces cellules sont représentatives des populations cellulaires du matériel clinique initial. Ces cultures représentent un système unique pour mener des analyses de détection de changements du point de vue génétique ou biologique qui jouent un rôle important dans la progression tumorale du cancer épithélial de l'ovaire. De plus nous avons obtenu à partir des cultures primaires des lignées cellulaires immortalisées de façon spontanée en culture. Ces lignées possèdent plusieurs avantages à savoir qu'elles ont été dérivées de tumeurs de patientes n'ayant pas subi de traitements de chimiothérapie et proviennent dans trois cas (TOV21G, TOV-81D et TOV112D) de tumeurs primaires solides et dans un cas (OV-90) d'ascite malin. Ces lignées représentent différents types histologiques du cancer épithélial de l'ovaire. Ce système nous a permis de faire quelques corrélations entre le comportement des cellules in vitro et les paramètres cliniques de la maladie et nous a fourni un indice sur la croissance in vitro qui semble épouser les paramètres cliniques de ces tumeurs. En premier lieu le modèle a été utilisé pour étudier et caractériser les altérations géniques au niveau du bras court du chromosome 3. Nous avons choisi d'étudier ce chromosome en particulier car c'est le plus fréquemment touché dans les cancers d'origine épithéliale, suggérant la présence de gènes suppresseurs de tumeurs dans les régions délétées dont l'inactivation fonctionnelle peut être impliquée dans le cancer épithélial de l'ovaire. Dans cette étude nous avons utilisé 33 biopsies tumorales et 47 cultures primaires ovariennes. Ce large répertoire d'échantillons contient des tumeurs ovariennes bénignes, des tumeurs épithéliales de l'ovaire de faible potentiel de malignité ainsi que des cancers épithéliaux de l'ovaire ou de l'ascite. En utilisant 15 marqueurs polymorphiques nous avons observé des LOH dans 25 (31%) des échantillons analysés: 21 sur 58 échantillons malins, 2 sur 12 de faible potentiel de malignité et 2 sur 10 tumeurs bénignes. Le profil de délétion affiché par ces 25 échantillons a permis la détermination d'au moins deux régions distinctes de délétions communes sur le bras court du chromosome 3 qui s'étendent du marqueur D3S1270 à D3S1597 (Région l) et du marqueur D3S1293 à D3S1283 (Région II). De plus une autre région proximale au marqueur D3S1300 (Région Ill) est délétée dans certains échantillons. Bien que parmi les tumeurs bénignes et malignes des délétions ont été observées dans les trois régions de délétion (Région I, Région II et Région Ill) les tumeurs de faible potentiel de malignité ne démontrent de délétions que seulement dans la région III. D'autre part, ces régions minimales de délétions semblent, à l'exception de RARB et THRB contenus dans la Région II, exclure les gènes VHL, TGFBR2, PTPasey et FHIT comme gènes suppresseurs candidats dans la tumorigénèse du cancer épithélial de l'ovaire.

L'utérus est un organe hautement dynamique, qui subit des changements morphologiques durant le cycle œstral sous l'influence des hormones sexuelles. Ces adaptations sont essentielles à l’homéostasie utérine et résultent d’une régulation minutieuse de la prolifération, de la différenciation et de la survie cellulaire par de nombreuses voies de signalisation. Nous avons émis l'hypothèse que la voie Hippo est impliquée dans l'homéostasie utérine chez l’espèce bovine, et nous avons tenté de déterminer les variations de ses constituants. Des biopsies de l'endomètre et des échantillons de sang ont été obtenus aux jours 0, 3 et 10 du cycle chez 14 vaches. Les concentrations sanguines de progestérone et d’œstrogène ont confirmé la progression du cycle œstral chez cinq vaches. Des analyses immunohistochimiques, Western Blot et RT-PCR ont été réalisées sur les biopsies afin d’évaluer la variation des composantes de la voie Hippo et de ses gènes cibles. Nous avons démontré la présence de YAP et de TAZ dans l'endomètre bovin à tous les moments du cycle œstral. Elles présentaient une expression cytoplasmique dans l'épithélium glandulaire, et présentaient une expression nucléaire dans le stroma à J0 et J10 et dans l'épithélium luminal à J3. Nous avons également noté une tendance à l'augmentation des concentrations de la forme phosphorylée de YAP au jour 3 du cycle œstral par rapport aux jours 0 et 10. Cette augmentation a été corrélée à une diminution de l'expression du gène CTGF au jour 3 par rapport aux autres jours du cycle œstral. En conclusion, nous avons démontré que la voie Hippo est exprimée différentiellement dans l'utérus bovin au cours du cycle œstral. / The uterus is a highly dynamic organ that changes morphologically under the influence of sexual hormones during the estrous cycle. These adaptations are essential for the proper function of the uterus and are due to the careful regulation of cell proliferation, differentiation, and apoptosis by numerous signaling pathways. We hypothesized that the Hippo pathway is implicated in uterine homeostasis in cattle, and we aimed to determine the variation of its canonical constituents during the bovine cycle. Endometrial biopsies and blood samples were obtained on days 0, 3, and 10 of the cycle in 14 cows. Progesterone and estrogens blood concentrations were measured and confirmed the status of the oestrus cycle in five cows. Immunohistochemistry, western blot, and RT-PCR were then performed on their endometrial biopsies to evaluate the Hippo components and targeted genes. Our results showed the presence of YAP and TAZ in the bovine endometrium at all time point. Both proteins displayed cytoplasmic expression in the glandular epithelium while exhibiting nuclear expression in the stroma on D0 and D10 and in the luminal epithelium on D3. We also noted a tendency for an increased amount of phosphorylated YAP during day 3 of the estrous cycle compared to days 0 and 10. It was correlated with a decreased expression of CTGF (Hippo target gene) on day 3 compared to the other day of the cycle. In conclusion, we can confirm that Hippo is differentially expressed in the bovine uterus during the estrous cycle.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l’Université de Montréal / Notre système hématopoïétique est un système de développement dynamique dont le rôle est de maintenir un niveau suffisant de cellules sanguines fonctionnelles afin d'assurer la survie de notre organisme. C'est ainsi que le système hématopoïétique donne lieu aux huit différentes lignées cellulaires connues. Les cellules sanguines différenciées incluent les erythrocytes ou globules rouges, les mégakaryocytes qui donneront lieu aux plaquettes, les granulocytes et macrophages, les basophiles et eosinophiles, ainsi que les cellules lymphoïdes B et T. Tous trouvent leur origine à partir d'une population de cellules souches hématopoïétiques. La différenciation de cellules hématopoïétiques primitives en granulocytes et monocytes matures constitue un processus de développement complex appelé la myélopoïèse. Le développement de ces cellules primitives en monocytes et granulocytes fonctionnels est en partie contrôlé par une myriade de facteurs de transcription dont le rôle est d'activer l'expression de gènes essentiels à une ou plusieurs lignées. Ces facteurs de transcription peuvent agir de façon positive ou négative à la régulation de gènes codant entre autres pour des facteurs de croissance, leurs récepteurs, pour des molécules d'adhésion, pour des enzymes ou bien pour d'autres facteurs de transcription. 0 Le développement de cellules myéloïdes primitives et de leur différenciation subséquente en cellules myéloïdes matures est également contrôlé par un vaste réseau de facteurs de croissance hématopoïétiques. Tout comme les facteurs de transcription, ces facteurs de croissance, ou cytokines, peuvent être spécifiques à une lignée particulière ou bien peuvent avoir une x n contribution plus générale. Par exemple, le G-CSF (granulocyte-colonystimulating factor) est un facteur de croissance essentiel au développement granulocytaire alors que l'IL-3 (interleukin-3) soutient la prolifération et la survie de plusieurs lignées. Quelle est l'importance d'étudier un processus tel que la myélopoïèse? Environ 120 millions de nouveaux neutrophiles sont générés chaque jour chez l'adulte normal. Ces neutrophiles jouent un rôle fondamental dans notre système de défense. En effet, les neutrophiles agissent comme première ligne de défense face à l'invasion de particules étrangères. Ils participent à notre système immunitaire inné principalement par leur action phagocytaire. Les macrophages quant à eux, jouent un rôle similaire c'est-à-dire qu'ils participent également à notre système immunitaire inné en éliminant toutes particules étrangères par phagocytose. Cependant, ils possèdent une caractéristique additionnelle. Ils jouent également un rôle dans notre système immunitaire adaptif en agissant comme cellules présentatrices d'antigènes aux différentes cellules lymphoïdes T. Chaque cellule est exposée à une multitude de signaux présents dans son environnement. La cellule se doit d'être en mesure de reconnaître et de répondre de façon spécifique à cette panoplie de signaux externes. Elle accompli ceci de plusieurs façons. Premièrement, afin de répondre à un signal particulier, la cellule se doit d'exprimer le récepteur spécifique au signal reçu. Ensuite, elle doit être en mesure d'intégrer et d'interpréter ce signal afin de le transformer en une réponse biologique concrète. Pour cela, la cellule doit posséder la machinerie interne nécessaire à la traduction et la transformation du signal. Les facteurs de croissance sont un exemple de signal externe présent dans l'environnement d'une cellule hématopoïétique. Ces facteurs de croissance sont connus pour être impliqués dans la régulation de la prolifération et de la survie cellulaire. Ces facteurs se lient à leurs récepteurs appropriés exprimés à la surface de certaines cellules. Généralement, cette liaison induit l'activité catalytique du récepteur qui donne suite à l'activation de plusieurs voies de signalisation. Ces différentes voies de signalisation ciblent différents facteurs de transcription qui sont associés à différentes réponses biologiques correspondantes. Ces facteurs de transcription, dont l'activité est induite par l'induction de voies de signalisation spécifique, vont être responsables du contrôle de 1'expression de gènes essentiels à la détermination du destin cellulaire. Vu l'importance de réguler de façon étroite l'expression de tels gènes, l'activité des facteurs de transcription se doit d'être sous haute surveillance. Le temps d'expression ainsi que l'endroit d'activation des facteurs de transcription deviennent donc des variables importantes. Un facteur de transcription responsable de la destinée d'une cellule se doit d'être exprimé dans la bonne cellule et d'être actif au bon moment dans le processus de développement de cette cellule. Souvent, l'activité et l'expression de ces facteurs de transcription sont contrôlés par des facteurs externes tels que les facteurs de croissance. Un modèle qui se veut de plus en plus populaire, malgré qu'aucun exemple définitif n'ait été encore démontré, suggérerait qu'un signal externe serait en mesure d'affecter directement l'activité d'un facteur de transcription qui lui se voudrait essentiel à la détermination de la destinée cellulaire. Le facteur de transcription myélo-spécifique PU.1 est un membre de la famille Ets. Il fût découvert simultanément de deux façons différentes. D'un xii n côté, il fût identifié à partir d'une librairie de cDNA de macrophages comme étant un facteur pouvant lier avec haute affinité, le promoteur du gène MHC classe II 1-Ab. D'autre part, il fût identifié comme site d'intégration préféré du provirus SFFV (Spleen Focus Forming Vims), un provirus associé à une érythroleucémie induite par le virus Friend. Cependant, il est important de mentionner que PU. l n'a pas été impliqué dans l'induction de leucémies humaines en partie dû au fait que son locus ne correspond pas à un site fréquent de translocation chromosomique. La famille de facteurs de transcription Ets est caractérisée par son domaine de liaison à l'ADN (domaine Ets). Ce domaine basique situé en C-terminal lie des séquences riches en purines GGAA/T dénommées boîtes PU. Ets-1, Ets-2 et Spi-B sont d'autres exemples de facteurs appartenant à cette grande famille. PU.1 est un facteur de transcription exclusif au système hématopoïétique. Son rôle dans le développement hématopoïétique semble assez bien décrit. La suppression complète du gène est associée à une absence complète de macrophages et de cellules B matures. Par contre, des monocytes et des précurseurs de cellules B sont présents mais en nombre réduit. Il y a également présence de granulocytes mais au développement et au fonctionnement anormal. Les cellules érythrocytaires ne sont, quant à elles, pas affectées. Ces résultats démontrent bien le rôle primordial de PU.1 dans le développement des cellules B ainsi que dans le développement myéloïde. Cela en fait un excellent candidat comme déterminant génétique dans rengagement du destin cellulaire. Le GM-CSF (granulocyte-macrophage colony-stimulating factor) est un facteur de croissance hématopoïétique impliqué dans la prolifération, la survie et le développement de cellules primitives hématopoïétiques avec des effets additionnels importants sur le développement myéloïde. C'est justement par son implication déterminante dans le développement des cellules granulocytaires et monocytaires que le GM-CSF est de plus en plus utilisé à des fins cliniques. Le GM-CSF fait partie de la grande famille des cytokines qui comprend entre autres l'Epo, Steel Factor, l'IL-3 et le G-CFS. Le GMCSF lie son récepteur qui est exprimé spécifiquement à la surface de certaines cellules et cette liaison active différentes voies de signalisation qui se traduisent par différentes réponses biologiques. Le récepteur du GM-CSF appartient à la super famille des récepteurs de cytokines. Il est composé d'une chaîne a et d'une chaîne p. La chaîne a est spécifique au récepteur et lui confère une basse affinité de liaison à son ligand. La chaîne P est commune à d'autres récepteurs tels les récepteurs de l'IL-3 et de l'IL-5. Elle ne possède aucune capacité de liaison. Par contre, en s'associant à la chaîne a, elle confère à celle-ci, une haute affinité de liaison au GM-CSF. De plus, c'est la chaîne R qui est principalement responsable d'activer les différentes voies de signalisation. En effet, son domaine cytoplasmique comporte de nombreux résidus de tyrosines responsables du recrutement de différents facteurs, ainsi que de deux boîtes situées à proximité du domaine membranaire qui sont responsables du recrutement de Jak2, le facteur actif dans le complexe. Les voies de signalisation qui découlent de l'activation du récepteur par son ligand sont bien décrites. Il est connu que certaines voies conservées, telles les voies MAPK, Jak-STAT et PI3K, sont activées suite à l'activation du récepteur et que ces voies sont impliquées dans des réponses de survie et de prolifération myéloïde. Par centre, rien n'est bien établi en ce qui concerne la différenciation myéloïde. Aucun facteur de transcription impliqué directement dans la détermination du destin cellulaire n'a été identifié clairement. Bien que l'on connaisse des exemples de facteurs responsables d'activer des gènes qui eux, sont spécifiques à une lignée, très peu d'informations concernant les événements transcriptionnels conduisant à la détermination du destin cellulaire sont connues. Le rôle de PU.1 dans le développement myéloïde est bien établi. Cependant, jusqu'à quel point PU.1 est-il déterminant pour qu'une cellule primitive prenne la décision de s'engager de façon irréversible vers une destinée myéloïde? L'importance de PU.1 et du GM-CSF dans le développement myéloïde a été clairement, mais indépendamment démontrée. Cependant, il n'existe aucune documentation démontrant le lien possible entre ces deux facteurs dans le développement myéloïde. Dans cette étude, nous démontrons clairement que le facteur de transcription myélo-spécifique PU. l agit comme effecteur du signal par le GM-CSF dans le développement myéloïde. En d'autres mots, l'activation de PU. l et son effet déterminant dans le développement myéloïde sont directement liés à l'activation du récepteur du GM-CSF par son ligand.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / Le transport des molécules à travers les membranes est un processus cellulaire fondamental. Les transporteurs ABC (pour ATP-binding cassette) sont des protéines transmembranaires médiant le transport actif de substrats variés (peptides, ions, acides aminés, antibiotiques, etc). Le gène ATMI de Saccharomyces cerevisiae code pour un transporteur ABC de 690 acides aminés localisé dans la membrane interne de la mitochondrie. La protéine Atml est une proche homologue de la P-glycoprotéine impliquée dans la résistance aux agents anticancéreux. Il a été démontré qu'Atml est essentielle pour la croissance des cellules, procurant ainsi un phénotype idéal pour l'analyse fonctionnelle de ce transporteur. Nous utilisons une technique, appelée plasmid shuffling', basée sur l'échange de plasmides par contre-sélection d'un plasmide portant le marqueur de sélection URA3 en présence d'acide 5-fluoroorotique (5-F0A) pour étudier Atml. Nous avons construit une souche haploïde de S. cerevisiae dans laquelle la copie chromosomique du gène ATMI est excisée mais qui est viable grâce à la présence d'un plasmide URA3 portant une copie fonctionnelle du gène ATMI. Cette souche a été transformée avec une banque d'allèles mutés d'ATM1 portés par un plasmide LEU2 et criblée pour des mutants thermosensibles (ts) d'Atml après contre-sélection du plasmide URA3 sur 5-F0A. Trois mutants ts d'Atml ont été isolés et les mutations causant le phénotype ts ont été identifiées par séquençage de l'ADN. Des courbes de croissance de ces mutants ont été tracées, démontrant une croissance normale à température permissive mais un arrêt de croissance après quelques divisions à température restrictive. Nous avons produit des anticorps polyclonaux anti-Atml qui nous ont permis d'étudier la protéine de type sauvage et celle des trois mutants ts. Ces études ont révélé l'absence d'Atml seulement dans les mitochondries des mutants ts à température restrictive. D'autre part, des expériences de coimmunoprécipitation ont démontré qu'Atml forme des homodimères et que cette interaction est médiée par la partie C-terminale d'Atml, qui contient le domaine de liaison à l'ATP. Nos expériences ont donc permis d'identifier des acides aminés importants pour la fonction d'Atml ainsi qu'un domaine impliqué dans la structure quaternaire de ce transporteur.