Le cœur des vertébrés est un organe modulaire qui requiert le " patterning " complexe des champs morphogénétiques cardiogènes et la convergence coordonnée des diverses sous-populations de progéniteurs cardiogéniques. Au moins 7 facteurs de transcription de la famille T-box coopèrent au sein de ces nombreuses sous-populations de progéniteurs cardiogéniques afin de réguler la morphogenèse et l’agencement de multiples structures le long de l’ébauche cardiaque, ce qui explique que les mutations humaines de ces gènes engendrent diverses malformations congénitales cardiaques (MCCs). L’un de ces gènes T-box, Tbx5, dont l’haploinsuffisance génère le syndrome de Holt-Oram (SHO), intervient dans une grande variété de réseaux de régulation géniques (RRGs) qui orchestrent la morphogenèse des oreillettes, du ventricule gauche, de la valve mitrale, des septums inter-auriculaire et inter-ventriculaire, ainsi que du système de conduction cardiaque. La diversité des RRGs impliqués dans la formation de ces structures cardiaques suggère que Tbx5 détient une profusion de fonctions qui ne seront identifiables qu’en répertoriant ses activités moléculaires dans chaque lignée cardiaque examinée isolément. Afin d’aborder cette problématique, une ablation génétique de Tbx5 dans l’endocarde a été réalisée. Cette expérience a démontré le rôle crucial de Tbx5 dans la survie des cellules endocardiques bordant le septum primum et des cardiomyocytes au sein de cette structure embryonnaire qui contribuera à la morphogenèse du septum inter-auriculaire. En outre, cette étude a révélé l’existence d’une communication croisée entre la sous-population de cellules endocardiques Tbx5+ et le myocarde au niveau du septum primum, afin d’assurer la survie des cardiomyocytes, et ultimement de garantir la maturation du septum inter-auriculaire. Nos résultats confirment aussi l’importance de l’interdépendance génétique (Tbx5 et Gata4 ainsi que Tbx5 et Nos3) entre différents loci dans la morphogenèse de la cloison inter-auriculaire, et particulièrement de l’influence que peut avoir l’environnement sur la pénétrance et l’expressivité des communications inter-auriculaires (CIAs) dans le SHO. En outre, puisque les fonctions d’un gène dépendent ordinairement des différents isoformes qu’il peut générer, une deuxième étude a focalisé davantage sur l’aspect transcriptionnel de Tbx5. Cette approche a mené à la découverte de 6 transcrits alternatifs exhibant des fonctions à la fois communes et divergentes. La caractérisation de 2 de ces isoformes a révélé le rôle de l’isoforme long (Tbx5_v1) dans la régulation de la croissance des cardiomyocytes durant la cardiogénèse, tandis que l’isoforme court (Tbx5_v2), préférentiellement exprimé dans le cœur mature, réprime la croissance cellulaire. Il est donc entièrement concevable que les mutations de TBX5 entraînant une troncation de la région C-terminale accroissent la concentration d’une protéine mutée qui, à l’instar de Tbx5_v2, interfère avec la croissance de certaines structures cardiaques. En revanche, la divergence de fonctions de ces isoformes, caractérisée par les disparités de localisation subcellulaire et de d’interaction avec d’autres cofacteurs cardiaques, suggère que les mutations affectant davantage un isoforme favoriseraient l’émergence d’un type particulier de MCC. Finalement, un dernier objectif était d’identifier le ou les mécanisme(s) moléculaire(s) par le(s)quel(s) Tbx5 régule son principal gène cible, Nppa, et d’en extraire les indices qui éclairciraient sa fonction transcriptionnelle. Cet objectif nécessitait dans un premier lieu d’identifier les différents modules cis-régulateurs (MCRs) coordonnant la régulation transcriptionnelle de Nppa et Nppb, deux gènes natriurétiques dont l’organisation en tandem et le profil d’expression durant la cardiogénèse sont conservés dans la majorité des vertébrés. L’approche d’empreinte phylogénétique employée pour scanner le locus Nppb/Nppa a permis d’identifier trois MCRs conservés entre diverses espèces de mammifères, dont un (US3) est spécifique aux euthériens. Cette étude a corroboré que la régulation de l’expression du tandem génique Nppb/Nppa requérait l’activité transcriptionnelle d’enhancers en complément aux promoteurs de Nppa et Nppb. La concordance quasiment parfaite entre les profils d’expression de Tbx5 et de ces deux gènes natriurétiques chez les mammifères, suggère que le gradient d’expression ventriculaire de Tbx5 est interprété par le recrutement de ce facteur au niveau des différents enhancers identifiés. En somme, les études présentées dans cette thèse ont permis de clarifier la profusion de fonctions cardiaques que possède Tbx5. Certaines de ces fonctions émanent de l’épissage alternatif de Tbx5, qui favorise la synthèse d’isoformes dotés de propriétés spécifiques. Les diverses interactions combinatoires entre ces isoformes et d’autres facteurs cardiaques au sein des diverses sous-populations de progéniteurs cardiogènes contribuent à l’émergence de RRGs cardiaques divergents. / The vertebrate heart is a modular organ, which requires the complex patterning of the morphogenetic heart fields and the coordinated convergence of the diverse subpopulations of cardiogenic progenitors. At least 7 transcription factors of the T-box family cooperate within these numerous subpopulations of cardiogenic progenitors to regulate the morphogenesis and the layout of multiple structures along the primordial heart tube, which explains that the human mutations of these genes induce various congenital heart defects (CHDs). One of these T-box genes, Tbx5, whose haploinsufficiency generates the Holt-Oram syndrome (HOS), intervenes in a wide variety of gene regulatory networks (GRNs) that orchestrate the morphogenesis of the atria, the left ventricle, the mitral valve, the inter-atrial and inter-ventricular septa, as well as the cardiac conduction system. The diversity of GRNs involved in the formation of these cardiac structures suggests that Tbx5 holds a profusion of functions which will be identifiable only by indexing its molecular activities in each separately examined cardiac lineage. To address this problem, a conditional knockout of Tbx5 in the endocardium was generated. This experiment demonstrated a crucial role of Tbx5 in the survival of the endocardial cells lining the septum primum and the cardiomyocytes within this embryonic structure, which will contribute to the morphogenesis of the inter-atrial septum. Moreover, this study revealed a crosstalk between the Tbx5-positive endocardial cells subpopulation and the myocardium at the level of the septum primum to ensure the survival of cardiomyocytes, and ultimately to guarantee the maturation of the inter-atrial septum. Our results also confirmed the importance of genetic interdependence (Tbx5 and Gata4 as well as Tbx5 and Nos3) between different loci in the morphogenesis of the inter-atrial septum, and particularly the influence that the environment can have on the penetrance and the expressivity of atrial septal defects (ASDs) in the HOS. Besides, since the functions of a gene usually depend on the different isoforms it can generate, a second study focused more on the transcriptional aspect of Tbx5. This approach led to the discovery of 6 alternative transcripts exhibiting both common and specific functions. The characterization of 2 of these isoforms revealed the role of the long isoform (Tbx5_v1) in the regulation of cardiomyocytes growth during cardiogenesis, whereas the short isoform (Tbx5_v2), preferentially expressed in the mature heart, represses cell growth. It is thus entirely conceivable that TBX5 mutations leading to a C-terminal truncation increase the concentration of a mutated protein, which, like Tbx5_v2, interferes with the growth of certain cardiac structures. On the other hand, the divergence of functions of these isoforms, characterized by the disparities of subcellular localization and interaction with other cardiac cofactors, suggests that mutations affecting more one isoform would favor the emergence of a particular type of CHD. Finally, a last objective was to identify one or several molecular mechanism(s) by which Tbx5 regulates its main target gene, Nppa, and to extract clues that might clarify its transcriptional function. This objective required in a first place to identify the various cis-regulatory modules (CRMs) coordinating the transcriptional regulation of Nppa and Nppb, two natriuretic genes whose tandem organization and expression pattern during cardiogenesis are preserved in most vertebrates. The phylogenetic footprint approach employed to scan the Nppb/Nppa locus allowed the identification of three CRMs evolutionary conserved between different mammals species, one of which (US3) is specific to eutherians. This study confirmed that the regulation of the tandem genes Nppb/Nppa required the transcriptional activity of enhancers in complement to Nppa and Nppb promoters. The almost perfect concordance between the expression profiles of Tbx5 and these two natriuretic genes in mammals, suggests that the ventricular expression gradient of Tbx5 is interpreted by the recruitment of this factor to the identified enhancers. Altogether, the studies presented in this thesis allowed clarifying the profusion of Tbx5 cardiac functions. Some of these functions emanate from the alternative splicing of Tbx5, which favors the synthesis of isoforms endowed with specific properties. The diverse combinatorial interactions between these isoforms and other cardiac factors within the various cardiogenic progenitor subpopulations contribute to the emergence of distinct cardiac RRGs.

Les cascades de Mitogen-Activated Protein Kinases (MAPKs) sont présentes chez tous les eucaryotes et permettent la transduction des signaux de l’extérieur vers l’intérieur de la cellule. Chez les végétaux, elles sont très abondantes et actives dans une multitude de processus, autant lors de la réponse aux stress que lors du développement. Elles fonctionnent comme un système de phosphorelais, se transférant un groupement phosphate d’une protéine à l’autre, de la MAPKKK à la MAPKK (MKK), puis de la MKK à la MAPK (MPK) et finalement, de la MPK vers des facteurs de transcription ou toute autre protéine qui permettra un changement au niveau de la réponse cellulaire. Depuis quelques années, plusieurs membres de la grande famille des MAPKs ont été étudiés pour leur rôle dans la reproduction sexuée des végétaux. Des mutants ont été caractérisés, mais jusqu’à maintenant, peu de voies complètes ont été décelées. Des précédents travaux dans le laboratoire ont démontré que deux MAPKKKs, de la sous-famille des MEKKs, ScFRK1 et ScFRK2, sont importantes pour le développement normal de l’ovule et du pollen chez Solanum chacoense, une espèce de pomme de terre sauvage diploïde. Sachant que les mutants des gènes les plus orthologues chez Arabidopsis thaliana ne possèdent pas les mêmes phénotypes, nous avons émis l’hypothèse que les Solanacées, du moins S. chacoense, possèdent une famille de MAPKKKs différente, qui n’est pas présente chez A. thaliana. Nous avons donc analysé les génomes/transcriptomes/protéomes de 15 espèces issues de différents clades du règne végétal afin d’étudier les relations phylogénétiques à l’intérieur de la sous-famille des MEKKs. Cela nous a permis d’observer que ScFRK1 et ScFRK2 ne sont pas seuls, mais sont inclus dans un groupe monophylétique que nous avons nommé la classe des FRKs (FRK pour Fertilization-Related Kinase). De plus, nous avons observé une expansion considérable de cette classe chez les Solanacées, comparativement à d’autres dicotylédones comme le peuplier, la vigne ou le coton. La classe des FRKs est absente chez les monocotylédones étudiées (riz et maïs) et ne possède qu’un seul membre (une FRK primitive) chez l’angiosperme basal Amborella trichopoda. Cette analyse phylogénétique des MEKKs nous a poussés à nous poser des questions sur l’origine de la classe des FRKs ainsi que sur son rôle au sein des Solanacées. Dans un deuxième temps, nous avons fait la caractérisation fonctionnelle de ScFRK3, un troisième membre de la classe des FRKs chez S. chacoense, aussi impliqué dans le développement des gamétophytes mâle et femelle. Du patron d’expression jusqu’à l’établissement d’une voie de signalisation potentielle, en passant par la caractérisation phénotypique des mutants, plusieurs expériences ont été réalisées dans le but de comprendre le rôle de ScFRK3 au niveau de la reproduction chez S. chacoense. Dans un contexte plus global, il est important de se questionner sur les rôles semblables, mais forcément différents, des trois membres de la famille FRKs qui ont été caractérisés jusqu’à présent. / Mitogen-Activated Protein Kinases (MAPKs) signaling cascades are found in all Eucaryotes and allow signal transduction from the outside of the cell to the inside. In plants, they are particularly numerous and play roles in several signaling processes, including stress responses and response to developmental cues. Their system involves a phosphorelay: they interact with each other to transfer a phosphate group. It starts with an activated MAPKKK, which transfers the phosphate group to a MAPKK (MKK), then this MKK transfers the signal to a MAPK (MPK), which ends this relay by phosphorylating transcription factors or any other proteins that will, in a way or an other, change the cell response according to the signal. During the last few years, many MAPKs members have been studied for their role in plants sexual reproduction. Some mutants were characterized, but until now, our knowledge of complete signaling cascades is very limited. Previous studies in our lab have shown that two MAPKKKs from the MEKK subfamily, ScFRK1 and ScFRK2, are important for male and female gametophytes development in Solanum chacoense, a wild diploid potato species. Genes that are the most orthologous to ScFRK1 and ScFRK2 in Arabidopsis thaliana, AtMAPKKK19, 20 and 21, do not seem to play the same roles in reproduction, which led us to make the hypothesis that in solanaceous species, at least in S. chacoense, there is one MAPKKK family that is different and not present in A. thaliana. At first, we did analyze the genomes/transcriptomes/proteomes of 15 species from different clads of the plant kingdom to find all the members of the MEKK subfamily of MAPKKKs in order to study their phylogenetic relationship. We then observed that ScFRK1 and ScFRK2 are included in a large monophyletic group which was called the FRK class (Fertilization Related Kinase). Moreover, we also observed that this class has considerably expanded within the solanaceous species, compared to other species like A. thaliana, poplar, cotton or grape vine. The FRK class is totally absent in the monocot species studied (rice and maize) and only one member is found in the basal angiosperm Amborella trichopoda. This phylogenetic analysis led us to ask questions about the origins of the FRK class and its role inside the Solanaceae family. Secondly, we characterized ScFRK3, a third member of the FRK class in S. chacoense, which is also involved, as its two FRK sisters, in male and female gametophytes development. From its expression pattern to the establishment of a potential signaling cascade, analysis and phenotyping of ScFRK3 mutant lines, many experiments were realized in order to understand the role of ScFRK3 in S. chacoense sexual reproduction. Overall, the appearance of this new and expanded class of MEKKs questions its specific role in comparison to other species that have much lesser members, mainly when compared to the model plant A. thaliana, which harbor only a fifth of the FRKs found in solanaceous species.

Le protéasome (CP) contrôle la majorité des fonctions cellulaires par la dégradation des protéines intracellulaires. En plus d’exprimer le CP, les vertébrés expriment également l’immunoprotéasome (IP), caractérisé par des préférences de dégradation distinctes. Le rôle le mieux caractérisé pour l’IP est la génération d’antigènes adaptés pour la liaison au complexe majeur d’histocomptabilité de classe I (CMH-I). Cependant, les nombreux phénotypes observés au niveau de cellules déficientes en IP ou avec une mutation révèlent que l’IP influence des fonctions immunitaires indépendamment de la génération d’antigènes et peut atténuer le stress présent au niveau de cellules non-immunitaires. L’objectif de cette thèse était de caractériser les rôles de l’IP qui ne sont pas reliés à la génération d’antigènes associés au CMH-I. L’analyse du transcriptome de cellules dendritiques IP-déficientes en cours de maturation révèle que l’IP affecte l’expression de plus de 8 000 transcrits. L’IP affecte l’expression génique principalement au niveau transcriptionnel en contrôlant l’abondance de régulateurs de transcriptions tels que NF-κB et les membres des familles IRF et STAT. Les cellules dendritiques IP-déficientes sont également moins efficaces pour activer des lymphocytes T CD8+, même chargées artificiellement avec des quantités optimales d’antigènes associés au CMH-I. En outre, nos études montrent que l’IP est fortement exprimé au niveau de cellules de patients atteints de leucémie myéloïde aigue. L’expression de l’IP est intrinsèque aux leucémies, puisque qu’elle n’est pas corrélée à la présence de lymphocytes sécréteurs d’IFN-γ. De plus, l’expression d’IP est particulièrement élevée au niveau de leucémies monocytaires et/ou possédant un réarrangement MLL. Notamment, des analyses de corrélation montrent que l’IP est connecté à des gènes impliqués dans le métabolisme, l’activité mitochondriale et la réponse au stress. En effet l’inhibition de la sous-unité PSMB8 de l’IP mène à l’accumulation de protéines ubiquitinées et la mort de cellules leucémiques monocytaires. Globalement, nos travaux montrent que le rôle de l’IP n’est pas limité à la génération d’antigènes, mais qu’il peut contrôler l’expression génique et la survie des leucémies. / By regulating protein degradation, constitutive proteasomes (CP) control practically all cellular functions. In addition to CP, vertebrates express immunoproteasomes (IP), which display distinct substrate preferences. The first non-redundant role ascribed to IP is its enhanced ability to generate MHC I-associated antigens. However, deletion or inhibition of IP subunits can affect several immune cell functions independently of MHC-I antigen generation. Moreover, recent work has shown that IP can be expressed in non-immune cells to deal with cell stress. Thus, we wished to investigate the roles of IP that are not related to antigen generation and that are not redundant with the CP. Based on profiling of WT and IP-deficient maturing mouse dendritic cells (DCs), we report that IP regulate the expression of more than 8,000 transcripts. The broad impact of IP on gene expression is cell-autonomous, mediated mainly at the transcriptional level, and involves major signaling pathways including IRFs, NF-kB and STATs. Moreover, even when engineered to present optimal amounts of antigenic peptides, IP-deficient DCs are inefficient for in vivo T-cell priming. In addition, consistent with the fact that cancer cells endure proteotoxic stress, we report that acute myeloid leukemia (AML) cells from patients express high levels of IP genes. Expression of IP genes in AML is a cell-autonomous and IFN-independent feature that correlates with the methylation status of IP genes, and is particularly high in AML with a monocytic phenotype and/or MLL rearrangement. Notably, IP inhibition leads to accumulation of polyubiquitinated proteins and cell death in IPhigh but not IPlow AML cells. Co-clustering analysis reveals that genes correlated with IP subunits in monocytic AMLs are primarily implicated in cell metabolism and proliferation, mitochondrial activity and stress responses. Overall, our studies show that the role of IP is not limited to antigen processing and reveals major non-redundant roles for IP in transcription regulation and resistance to cell stress in AML.

Les acides biliaires sont cruciaux pour l’absorption intestinale des lipides et ils représentent une voie majeure d’élimination du cholestérol. À concentration élevée, ils sont cytotoxiques et potentiellement carcinogènes. Il est donc essentiel de maintenir des niveaux adéquats afin de préserver une homéostasie optimale. Le récepteur nucléaire FXR est grandement impliqué dans cette régulation, en étant activé par les acides biliaires qui agissent comme ligands et en régulant les gènes nécessaires à leur synthèse et leur métabolisme. FXR est aussi impliqué dans le métabolisme lipidique et glucidique, tout en ayant un rôle anti-inflammatoire et antiprolifératif. Les mécanismes régulant l’expression et l’activité transcriptionnelle de FXR sont toutefois peu connus. Leur caractérisation pourrait mener à l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques pour les pathologies associées au syndrome métabolique. L’activation des récepteurs nucléaires peut se faire également de façon indépendante du ligand, soit via les modifications post-transcriptionnelles. Celles-ci permettent l’intégration d’une panoplie de signaux extracellulaires et l’adaptation de la réponse transcriptionnelle des récepteurs nucléaires aux variations de conditions cellulaires. La SUMOylation et l’ubiquitination sont deux modifications pouvant affecter la localisation cellulaire des récepteurs, leur interaction avec des partenaires protéiques, l’affinité de liaison au ligand, à l’ADN, leur dimérisation, la dégradation de leurs cibles et l’arrêt de la transcription. Étant donné le rôle important des modifications post-traductionnelles des récepteurs nucléaires en réponse aux divers signaux cellulaires, nous nous sommes intéressés particulièrement à leur impact sur la dégradation et l’activité transcriptionnelle de FXR. Nos études nous ont permis d’identifier et de caractériser un nouveau site de SUMOylation de FXR, impliqué dans la régulation du récepteur. Le résidu lysine responsable de conjuguer la protéine SUMO est localisé dans un motif non-consensus de SUMOylation, prénommé pSuM, qui est sous le contrôle de la phosphorylation d’un résidu serine régulé par la kinase CK2. Nous avons également déterminé que la modification de FXR par SUMO-2 permet le recrutement de l’ubiquitine E3-ligase SUMO-dépendante RNF4, qui induit l’ubiquitination et la dégradation de FXR. Cette cascade de signalisation est nécessaire pour l’activation transcriptionnelle de FXR et pour la régulation de l’expression des gènes cibles. Elle permet de contrôler ses niveaux protéiques de façon très dynamique et d’assurer ainsi une homéostasie optimale. Dans la deuxième étude, nous identifions un nouveau signal régulant l’activité transcriptionnelle de FXR. Les récepteurs tyrosine kinase de la famille EGFR/ErbB sont connus pour activer plusieurs voies de signalisation favorisant la croissance et la prolifération cellulaire. Cependant, leur expression et activité sont souvent altérées dans différents cancers, menant à une prolifération tumorale soutenue et dérégulée. Nous démontrons que l’activation des récepteurs de la famille EGFR/ErbB mène à la répression de l’activité transcriptionnelle de FXR en induisant la SUMOylation de FXR sur des résidus lysines situés dans des sites consensus de FXR. Étant donné le rôle antiprolifératif de FXR, l’impact répresseur des récepteurs ErbB sur l’activité de FXR pourrait contribuer à leur potentiel tumorigénique. Nos résultats approfondissent notre compréhension des mécanismes de régulation de l’expression et de l’activité de FXR. Étant donné son rôle important dans le métabolisme énergétique, la réponse transcriptionnelle de FXR doit être adaptée efficacement aux variations des conditions cellulaires dans un processus de régulation homéostatique. Les modifications post-traductionnelles assurent une régulation dynamique de l’activité de FXR et leur dérégulation pourrait être impliquée dans les pathologies associées au syndrome métabolique. / Bile acids are crucial for the absorption of intestinal lipids, and are directly involved in the efflux pathway to eliminate cholesterol. At high concentrations, bile acids are cytotoxic and potentially carcinogenic. It is therefore essential to maintain bile acids to adequate levels in order to preserve optimal homeostasis. Nuclear receptor FXR is directly involved in bile acid homeostasis by being activated by bile acids to regulate critical genes required for their synthesis and their metabolism. FXR is also involved in lipid and glucose metabolism, as well as having anti-inflammatory and anti-proliferative roles. However, the exact mechanisms regulating the degradation and activity of FXR are not well understood. Therefore, elucidation of FXR activity and response to cellular signals is essential to develop novel strategies and therapeutic targets for pathologies associated with the metabolic syndrome. Besides ligand activation, nuclear receptor can be regulated in a ligand-independent manner, mainly via post-translational modifications. Such modifications are important to allow homeostatic integration of diverse extracellular signals to ensure adaptation and transcriptional response of nuclear receptors. Among them, SUMOylation and ubiquitination are two modifications that modulate cellular localization of receptors, their interaction with protein partners, ligand binding and sensitivity, DNA affinity, receptor dimerisation, stability of their targets and transcriptional dynamics. Because of the important role of post-translational modifications in nuclear receptor function, we therefore study their specific impact in respect to FXR regulation and transcriptional competence. In this study, we have identified and characterized a new and non-consensus SUMOylation site involved in the regulation of FXR activity. This site, termed pSuM for phosphorylation-dependent SUMOylation motif, consists of a targeted lysine residue that conjugates SUMO proteins under the control of kinase CK2-mediated phosphorylation. We also determined that such modification of FXR with SUMO-2 induced the recruitment of SUMO-dependent E3 ligase RNF4, resulting in FXR ubiquitination and degradation. We demonstrate that this signaling cascade involving CK2 and RNF4 is required for FXR transcriptional activation and regulation of target gene expression. Our findings identify a cellular pathway that allows a dynamic control of FXR function to ensure efficient bile acid and energy metabolism in cells. In the second study, we identify a novel cellular signal that regulates FXR activity. Tyrosine kinase receptors of the EGFR/ErbB family are well known to participate in many signaling pathways, promoting cell growth and proliferation. Aberrant expression and activity of ErbB receptors are often associated to various cancers, leading to deregulated proliferation of tumors. Here, we show that ErbB activation leads to repression of FXR transcriptional activity by inducing FXR phosphorylation and specific SUMOylation at consensus sites. Because of the antiproliferative role of FXR, the negative impact of ErbB receptors on FXR transcriptional activity is thought to contribute to their tumorigenic potential. Altogether, our results expand our understanding of the mechanisms regulating FXR expression and activity. Because of its important role in lipid and energy metabolism, the transcriptional response of FXR needs to be efficiently adapted to variations of cellular conditions in order to achieve essential homeostatic control. As such, post-translational modifications ensure a dynamic regulation of FXR activity and their pathologic deregulation may be involved in diverse diseases associated with metabolic syndrome.

Le cancer épithélial de l’ovaire est le cancer gynécologique le plus létal. La survie à 5 ans est de 30-40% chez les patientes atteintes d’une tumeur invasive (TOV), comparativement à 95% chez les patientes diagnostiquées pour une tumeur à faible potentiel de malignité ou borderline (LMP). Au laboratoire, l’analyse de l’expression des gènes de la micropuce à ADN U133 d’Affymetrix a révélé que la SERPINA1 est un gène dont l’expression varie entre les tumeurs LMP et TOV. La validation par Q-PCR nous a confirmé que cette antiprotéase est majoritairement surexprimée dans les tumeurs LMP, par rapport aux tumeurs bénignes (BOV) et aux tumeurs TOV. Nous avons donc surexprimé la SERPINA1 dans les lignées cellulaires invasives TOV 112D et TOV 1946 du cancer de l’ovaire et dérivé des clones stables. Les résultats obtenus nous indiquent que la surexpression de la SERPINA1 a un effet sur la capacité d’invasion et de migration cellulaire et non au niveau de la croissance cellulaire et la formation de structures tridimensionnelles. Les résultats issus de l’étude in vivo dans les souris SCID nous permettront de déterminer si la surexpression de la SERPINA1 a un effet sur la tumorigénèse ovarienne. Ainsi, la SERPINA1 demeure à notre avis un candidat d’intérêt pour tenter de mieux comprendre les différences biologiques entre les tumeurs LMP et TOV, ainsi que le rôle des protéases et de leurs inhibiteurs dans la progression tumorale du cancer de l’ovaire. / Epithelial ovarian cancer is the most lethal gynecologic cancer with a five-year survival rate of 30-40% in patients diagnosed with high-grade invasive disease (TOV). This is in stark contrast to the 95% five-year survival in patients diagnosed with low malignant potential (LMP) disease. It is therefore important to understand the biological differences between LMP and TOV. We have previously identified differential expression of SERPINA1 between serous LMP and TOV tumors through gene expression analysis using Affymetrix U133 DNA microarrays. Expression of this protease inhibitor in the majority of LMP tumors was confirmed and validated by Q-PCR. To study the effects of its overexpression on the invasive potential of ovarian cancer cell lines, SERPINA1 was cloned in the pcDNA3.1+ plasmid and stable clones were derived from two invasive ovarian cancer cell lines, TOV 112D and TOV 1946. Comparisons between clones and controls have shown no SERPINA1-dependent difference in cellular growth or spheroid formation. However, effects on cellular migration and invasion are observed in cells overexpressing SERPINA1. Results from an in vivo xenograft study in SCID mice will allow us to determine if SERPINA1 overexpression affects ovarian tumorigenesis. SERPINA1 remains an interesting candidate gene whose further characterization may lead to insights into its role, and the role of proteases and their inhibitors, in ovarian cancer disease progression.

Le transport et la traduction localisée des ARN messagers sont observés chez plusieurs organismes et sont requis pour de multiples phénomènes tels la mémoire, la division cellulaire asymétrique et l’établissement des axes durant le développement. Staufen, une protéine liant l’ARN double-brin, a été identifié dans un premier temps chez la mouche à fruits Drosophila melanogaster. Il a été montré, chez cet organisme, que Staufen est requis pour la localisation des messagers bicoid et oskar aux pôles antérieur et postérieur de l’ovocyte, respectivement. Également, Staufen est requis afin que la répression traductionnelle du messager oskar soit levée une fois qu’il est bien localisé. Chez les mammifères, Stau1 est une protéine ubiquiste qui est présente dans des complexes prenant la forme de granules dans les dendrites des neurones. Également, Stau1 peut interagir de façon indépendante de l’ARN avec le ribosome et cofractionner tant avec la sous-unité 40S qu’avec la sous-unité 60S du ribosome dans un gradient de saccharose. L’implication de Stau1 dans un mécanisme permettant la dérépression traductionnelle de certains ARNm chez les mammifères était donc une voie d’investigation intéressante. Nous avons donc décidé de vérifier si Stau1 mammifère avait la capacité de stimuler la traduction d’un ARNm cellulaire via un mécanisme régulé. Au moment où cette thèse a été entreprise, aucun ARNm cellulaire lié par Stau1 n’avait été identifié chez les mammifères. Des structures d’ARN double-brin ont donc été employées afin de réprimer la traduction d’un ARNm rapporteur. C’est ainsi que nous avons montré que Stau1 peut stimuler la traduction d’un ARNm lorsqu’il lie celui-ci dans sa région 5’ non-traduite. Par la suite, en employant des micropuces d’ADN, nous avons identifié des messagers cellulaires dont la distribution dans les polysomes lourds est modifiée par Stau1. En effet, un groupe de messagers est enrichi dans les polysomes lourds suite à une surexpression de Stau1, ce qui suggère que Stau1 stimule la traduction de cette population d’ARNm. Afin d’identifier un mécanisme potentiel de régulation de l’activité traductionnelle de Stau1, nous nous sommes intéressés à la capacité d’auto-association de cette protéine. Nous avons montré que Stau1, tout comme plusieurs protéines liant l’ARN double-brin, est en mesure de s’associer à lui-même, et ce, d’une façon indépendante de l’ARN. Nous avons identifié les déterminants impliqués mettant ainsi au jour un nouveau mécanisme pouvant influencer les activités cellulaires de Stau1. Les résultats présentés dans cette thèse suggèrent donc que Stau1 est en mesure de stimuler la traduction d’une sous-population précise d’ARN messagers au sein de la cellule permettant ainsi de jeter un regard nouveau sur l’implication de cette protéine dans divers phénomènes au sein de l’organisme. / Transport and local translation of RNA are found in several organisms and are required for multiple phenomena such as memory, asymmetric cell division and establishment of the axis during development. Staufen, a double-stranded RNA binding protein, was first identified in Drosophila melanogaster. In the fruitfly, it was shown that Staufen is required for the proper localization of the bicoid and oskar transcripts to the anterior and posterior ends of the oocyte, respectively. It was also found that Staufen is important for the translational derepression of oskar once it is adequately localized. In mammals, Stau1 is a ubiquitous protein found in granules in the dendrites of neurons. Also, Stau1 can bind the ribosome in a RNA-independent manner and cofractionates with both ribosomal subunits in a sucrose gradient. The implication of Stau1 in a mechanism allowing translational derepression of certain RNAs in mammals was therefore an interesting path to explore. Accordingly, we decided to verify if mammalian Stau1 had the capacity to stimulate the translation of cellular RNAs through a regulated mechanism. When this thesis was initiated, no cellular RNA target of Stau1 had been identified in mammals. Therefore, double-stranded RNA structures were used to repress the translation of a reporter mRNA. With this model, we showed that Stau1 can stimulate the translation of a transcript when it is bound to its 5’ UTR. With the use of DNA microarrays, we identified cellular mRNAs which distribution in heavy polysomes was altered by Stau1. When Stau1 is overexpressed, this group of mRNAs is enriched heavy polysomes, suggesting a translational stimulation of this population by Stau1. To identify a regulatory mechanism that could influence Stau1’s translational activity, we studied the self-association capacity of this protein. We showed that Stau1, like several double-stranded RNA binding proteins, can self-associate in a RNA-independent manner. We have identified the determinants required for this interaction that as the potential to be important for the regulation of the cellular activities of Stau1. The results presented in this thesis suggest that Stau1 can stimulate the translation of a specific subset of mRNAs in the cell, letting us look at Stau1’s implication in different processes from a new point of view.

L’apoptose des cellules endothéliales (CE) représente un évènement initial dans le développement de plusieurs pathologies fibrotiques telles que le rejet chronique d’allogreffe et la sclérose systémique. Nous avons démontré que les médiateurs issus des CE apoptotiques entraîne la différenciation myofibroblastique et la résistance à l’apoptose, deux mécanismes centraux à la fibrogénèse. L’activation de PI3K (phospatidylinositol-3 kinase) caractérise ces deux mécanismes. Un fragment C-terminal du perlécan (LG3) produit par les CE apoptotiques inhibe l’apoptose des fibroblastes. Les objectifs de ce travail étaient de : 1. définir les récepteurs et la signalisation impliqués dans la réponse anti-apoptotique et 2. caractériser les médiateurs fibrogéniques responsables de la différenciation myofibroblastique. En ce qui a trait à la réponse anti-apoptotique, l’inhibition des intégrines 21 ou des kinases de la famille Src (SFK) chez les fibroblastes prévient la résistance à l’apoptose et la phosphorylation d’Akt normalement induites par le milieu conditionné par des CE apoptotiques (SSC) ou le LG3. Ces résultats suggèrent que le LG3 produit par les CE apoptotiques initie un état de résistance à l’apoptose chez les fibroblastes par des voies α2β1integrines/SFK/PI3K dépendantes. Le LG3 n’induit cependant pas la différenciation myofibroblastique. Nous avons donc caractérisé le milieu SSC de façon à identifier les médiateurs responsables de la différenciation myofibroblastique. Les milieux conditionnés par des CE apoptotiques et non-apoptotiques (respectivement SSC et SSC-ZVAD) ont été analysés comparativement par chromatographie liquide bi-dimensionnelle, immunobuvardage et spectrométrie de masse. Le connective tissue growth factor (CTGF) est le seul facteur fibrogénique connu augmenté dans le milieu SSC. L’inhibition de la caspase-3 chez les CE prévient la relâche de CTGF. Au niveau du fibroblaste, l’inhibition de SFK ou de Pyk2 (proline-rich tyrosine kinase-2) prévient la différenciation myofibroblastique induite par le SSC ou le CTGF in vitro. L’anticorps neutralisant contre le TGF- (Transforming growth factor beta) n’est pas en mesure de bloquer la différenciation myofibroblastique induite par le SSC ou le CTGF. Des injections quotidiennes sous-cutanées de SSC chez la souris C3H pour 3 semaines entraîne une augmentation de l’épaisseur de la peau et des niveaux protéiques d’SMA, de vimentine et de collagène I. Cette réponse fibrogénique est réduite chez les souris qui ont reçu le SSC-ZVAD ou le SSC immunodéplété de son CTGF. Ces résultats apportent de nouvelles issues mécanistiques au niveau de la réponse fibrogénique activée par la mort des CE. L’activation des caspases chez les CE apoptotiques entraîne la production de LG3 et de CTGF qui, à leur tour, activent des voies de signalisation pro-fibrotiques SFK/PI3K dépendantes chez les fibroblastes, et ce indépendamment du TGF-. / Apoptosis of endothelial cells (EC) is an early event in various fibrotic diseases including chronic allograft vasculopathy and systemic sclerosis. We showed previously that mediators released by apoptotic EC activate myofibroblast differentiation and resistance to apoptosis, two mechanisms pivotal to fibrogenesis. PI3K (phospatidylinositol-3 kinase) activation was found to be central to these two mechanisms. A C-terminal fragment of perlecan (LG3) produced by apoptotic EC was found to inhibit apoptosis of fibroblasts. The aims of the present project were : 1. to define the receptors and pathways implicated in this anti-apoptotic response and 2. to characterize the fibrogenic mediators implicated in myofibroblast differentiation. Concerning the anti-apoptotic response, the inhibition of 21 integrin activity in fibroblasts exposed to either medium conditioned by apoptotic EC (SSC) or LG3 prevented resistance to apoptosis and was associated with decreased levels of Akt phosphorylation. Neutralizing Src family kinases (SFK) activity in fibroblasts produced the same effects. These results suggest that LG3 produced by apoptotic EC initiate a state of resistance to apoptosis in fibroblasts via an α2β1integrin/SFK/PI3K dependent pathway. LG3 did not induce myofibroblast differentiation. We went on to identify which mediators present in SSC are implicated in myofibroblast differentiation. Media conditioned by apoptotic and non-apoptotic EC (respectively SSC and SSC-ZVAD) were analyzed comparatively by 2-dimension liquid chromatography, western blotting and mass spectrometry. Connective tissue growth factor (CTGF) was the only known fibrogenic factor increased in SSC. Caspase-3 silencing of EC demonstrated that CTGF is released by apoptotic EC downstream of caspase-3 activation. In fibroblasts, blocking the activation of SFK or silencing the proline-rich tyrosine kinase 2 (Pyk2) blocked myofibroblast differentiation triggered by either SSC or recombinant CTGF in vitro. Exposure to a pan-transforming growth factor (TGF-β) neutralizing antibody failed to attenuate myofibroblast differentiation in fibroblasts exposed to either SSC or CTGF. Subcutaneous injection of mouse SSC to C3H mice daily for three weeks led to increased skin thickness, increased protein levels of αSMA, vimentin and collagen I. This fibrogenic response was blunted in mice injected with either SSC-ZVAD or SSC immunodepleted of CTGF. These results bring new mechanistic insights into the fibrogenic pathways activated by EC death. Caspase activation in apoptotic EC triggers the production of LG3 and CTGF which in turn activate SFK/PI3K dependant pathways in fibroblasts thus activating a TGF-β-independent fibrogenic response.

La transcription, la maturation d’ARN, et le remodelage de la chromatine sont tous des processus centraux dans l'interprétation de l'information contenue dans l’ADN. Bien que beaucoup de complexes de protéines formant la machinerie cellulaire de transcription aient été étudiés, plusieurs restent encore à identifier et caractériser. En utilisant une approche protéomique, notre laboratoire a purifié plusieurs composantes de la machinerie de transcription de l’ARNPII humaine par double chromatographie d’affinité "TAP". Cette procédure permet l'isolement de complexes protéiques comme ils existent vraisemblablement in vivo dans les cellules mammifères, et l'identification de partenaires d'interactions par spectrométrie de masse. Les interactions protéiques qui sont validées bioinformatiquement, sont choisies et utilisées pour cartographier un réseau connectant plusieurs composantes de la machinerie transcriptionnelle. En appliquant cette procédure, notre laboratoire a identifié, pour la première fois, un groupe de protéines, qui interagit physiquement et fonctionnellement avec l’ARNPII humaine. Les propriétés de ces protéines suggèrent un rôle dans l'assemblage de complexes à plusieurs sous-unités, comme les protéines d'échafaudage et chaperonnes. L'objectif de mon projet était de continuer la caractérisation du réseau de complexes protéiques impliquant les facteurs de transcription. Huit nouveaux partenaires de l’ARNPII (PIH1D1, GPN3, WDR92, PFDN2, KIAA0406, PDRG1, CCT4 et CCT5) ont été purifiés par la méthode TAP, et la spectrométrie de masse a permis d’identifier de nouvelles interactions. Au cours des années, l’analyse par notre laboratoire des mécanismes de la transcription a contribué à apporter de nouvelles connaissances et à mieux comprendre son fonctionnement. Cette connaissance est essentielle au développement de médicaments qui cibleront les mécanismes de la transcription. / Genomes encode most of the functions necessary for cell growth and differentiation. Gene transcription, RNA processing, and chromatin remodeling are central processes in the interpretation of the information contained in genomic DNA. Although many protein complexes forming the cellular machinery that interprets mammalian genomes have been studied, a number of additional complexes remain to be identified and characterized. Using proteomic approaches, Dr. Benoit Coulombe’s laboratory purified many components of the RNAPII transcription machinery using tandem affinity purification (TAP), a procedure that allows the isolation of protein complexes as they likely exist in live mammalian cells, and the identification of interaction partners using mass spectrometry. High confidence interactions were selected computationally and used to draw the map of a network connecting many components of the mRNA transcriptional machinery. By applying this procedure, our lab has identified, for the first time, a group of proteins, that interacts both physically and functionally with human RNAPII, and whose properties suggest a role in the assembly of multi-subunit complexes, acting as RNAPII-specific scaffolding proteins and chaperones. The aim of my project was to continue the characterization of the network of protein complexes involving transcription factors, and thus, further pursuing our survey of protein complexes in whole cell extracts. Eight novel RNAPII interaction partners (PIH1D1, GPN3, WDR92, PFDN2, KIAA0406, PDRG1, CCT4 and CCT5) were purified using the tandem affinity purification (TAP) method, and their interaction partners were identified by mass spectrometry. Over the years, our lab’s analysis of transcriptional regulation and mechanisms has contributed novel and important knowledge that provided better understanding of mRNA synthesis. This knowledge is paramount to the development of therapeutics that will target transcriptional mechanisms.

Le cancer épithélial de l’ovaire est le cancer gynécologique le plus agressif avec le plus haut taux de mortalité. La croissance des cellules cancéreuses de l’ovaire est limitée par les nutriments de l’environnement, le fer étant un des éléments indispensables à leur prolifération. L’hémochromatose héréditaire est une maladie associée à une accumulation corporelle de fer. Cette maladie est liée à deux mutations majeures du gène HFE soit H63D et C282Y. Étant donnée l’influence de la protéine HFE sur l’entrée du fer dans la cellule, des mutations du gène HFE pourraient être associées à une croissance rapide des cellules cancéreuses. Des études de génotypage du gène HFE effectuées chez 526 patientes avec cancer épithélial de l’ovaire, ont révélées une fréquence allélique de la mutation C282Y significativement plus élevées chez les patientes avec tumeur ovarienne comparativement aux patientes du groupe contrôle (5.9% versus 1.3%, p = 0.02). De plus, le taux de survie des patientes avec mutations C282Y et tumeur ovarienne de G3, après 2 ans, est faible (20%) lorsque comparé à celui des patientes sans mutations (60%, p = 0.005). Une analyse de régression multivariée de Cox a démontrée un risque relatif de 3.1, suggérant que les patientes avec mutations C282Y ont 3 fois plus de chance d’avoir une faible survie (p=0.001). Également, des études de corrélation ont démontrées que les niveaux de ferritine du sérum étaient plus élevés chez les patientes avec grade avancé du cancer épithélial de l’ovaire (r = 0.445 et p= 0.00001), suggérant que ce paramètre pourrait servir comme marqueur tumoral. Afin de comprendre ces résultats, nous avons tout d’abord étudiés l’influence des mutations HFE sur les cellules cancéreuses. Pour ce faire, la lignée du cancer de l’ovaire TOV-112D, homozygote pour la mutation C282Y, a été transfectée avec les vecteurs HFEwt et HFEC282Y. Bien qu’aucune différence significative n’ait été trouvée en termes de TfR totaux, des analyses par FACS ont démontrées un phénotype de déficience de fer pour les clones stables HFEwt. In vitro, la restauration de la protéine HFE, dans la lignée TOV-112D du cancer de l’ovaire, n’influence pas la croissance cellulaire. Ensuite, nous avons étudiés l’influence des niveaux de fer sur la progression tumorale. Une expérience in vivo préliminaire a démontré une tendance à un volume tumoral supérieur dans un modèle de souris de surcharge de fer,HfeRag1-/-. De plus, les souris HfeRag1-/-, injectées avec la lignée du cancer de l’ovaire TOV-21G, ont montrées des niveaux significativement plus faibles de fer sérique comparativement à leur contrôle (fer sérique 40±7μM versus 27±6μM, p = 0.001). En conclusion, des études supplémentaires sont nécessaires afin de comprendre davantage le rôle des mutations HFE sur la progression tumorale. Notamment, les niveaux élevés de fer pourraient rendre les cellules tumorales résistantes aux traitements ou encore, augmenter la toxicité et ainsi, contribuer à un mauvais prognostique. / Epithelial ovarian cancer is the most aggressive gynecological cancer with the highest mortality rates. Growth of the ovarian cancer cells is limited by nutrients in the environment; iron being one of the elements essential to their proliferation. Hereditary hemochromatosis is a disease associated with an accumulation of body iron, and is linked to two mutations of the HFE gene including C282Y and H63D. Given the influence of HFE protein on the entry of iron in the cell, mutations in the HFE gene may be associated with rapid growth of cancer cells. By genotyping the HFE gene of 526 patients with epithelial ovarian cancer, we have found that the allelic frequency of the C282Y mutation is significantly higher in patients with ovarian cancer compared to patients in the control group (5.9% versus 1.3% p = 0.02). Moreover, the 2-year survival rate, of patients with C282Y mutations and G3 ovarian tumor, is low (20%) when compared to patients without mutations (60%, p = 0.005). A multivariate survival analysis, using Cox’s regression model, also showed a hazard ratio value of 3.1,suggesting that patients with the C282Y mutation are 3 times more likely to have a poor survival (p =0.001). As well, correlation studies have demonstrated that serum ferritin levels were higher in patients with advanced grade of ovarian cancer (r = 0.445 and p = 0.00001), suggesting that this iron parameter could serve as a tumor marker for assessing the progression of ovarian cancer. In order to investigate these findings, we first studied the influence of HFE mutations on cancer cells. The ovarian cancer cell line TOV-112D, homozygous for the C282Y mutation, was transfected with the HFEwt and HFEC282Y vector, and although there were no differences in total TfR levels, FACS analysis demonstrated an iron deficient phenotype for the HFEwt stable clones (p<0.05). In vitro,restoration of the HFE protein, in the TOV-112D ovarian cancer cell line, does not influence cell growth. We then studied the influence of iron levels on tumor progression. A preliminary in vivo experiment has demonstrated a tendency to a higher tumor volume in a mouse model of iron overload,HfeRag1-/-. Furthermore, HfeRag1-/- mice that were injected with the ovarian cancer cell line TOV-21G showed significant lower serum iron levels compared to their controls (SI 40±7μM versus 27±6μM, p = 0.001). In conclusion, more studies are required to further understand the role of HFE mutations on tumor progression. Higher iron levels may confer tumor cells to be drug resistant or increase toxicity and thus, may contribute to a bad prognostic.

Les champignons mycorhiziens à arbuscules (CMA), classés dans le phylum Glomeromycota, ne peuvent pas être facilement identifiés par la morphologie de leurs spores et leurs mycélia à l'intérieur ou à l'extérieur des racines de leurs hôtes. Ce problème fondamental d'identification rend l'étude de leur diversité, en particulier dans leur habitat naturel (sol et racine) extrêmement difficile. Les gènes ribosomaux ont été largement utilisés pour développer des amorces spécifiques et en inférer des arbres phylogénétiques. Cependant, ces gènes sont très polymorphes et existent en plusieurs copies dans le génome des CMA, ce qui complique l’interprétation des résultats. Dans notre étude, nous avons étudié le polymorphisme intra- et inter-spécifique du gène β-tubuline, présent en faible nombre de copies dans le génome des CMA, afin d’obtenir de nouvelles séquences nucléotidiques pour développer des marqueurs moléculaires. Les gènes β-tubuline amplifiés à partir de l'ADN génomique de cinq espèces du genre Glomus ont été clonés et séquencés. L’analyse des séquences indique un polymorphisme intraspécifique chez trois espèces de CMA. Deux séquences paralogues très variables ont été nouvellement identifiées chez les G. aggregatum, G. fasciculatum et G. cerebriforme. Aucun polymorphisme n’a été détecté chez les G. clarum et G. etunicatum. Toutes les séquences montrent la présence de deux introns hautement variables. La majorité des substitutions ont été localisées dans les exons et sont synonymes à 90%. La conservation des acides aminés suggère un niveau élevé de sélection négative sur le gène β-tubuline et nous permet de confirmer que les CMA représentent un ancien groupe fongique (400 million d’années). L’analyse phylogénétique, réalisée avec vingt et une séquences nucléotidiques du gène β-tubuline, a révélé que les séquences des Glomaceae forment un groupe monophylétique bien supporté, avec les Acaulosporaceae et Gigasporaceae comme groupe frère. Les séquences paralogues nouvellement identifiées chez les G. aggregatum et G. fasciculatum n'ont pas été monophylétiques au sein de chaque espèce. Les oligonucléotides ont été choisis sur la base des régions variables et conservées du gène β-tubuline. Le test PCR des amorces β-Tub.cerb.F/ β-Tub.cerb.R a révélé des bandes spécifiques de 401 pb pour les séquences paralogues du G. cerebriforme. Deux paires d’amorces ont été développées afin d’identifier les séquences du groupe nommé Tub.1. Les tests PCR nous ont permis d’identifier certaines séquences du groupe Tub.1. Une paire d’amorce β-Tub.2.F/ β-Tub.2.R nous a permis d’identifier certaines séquences paralogues du groupe nommé Tub.2. L’analyse d’autres gènes combinée à celle du gène β-tubuline permettra le développement de marqueurs moléculaires plus spécifiques pour l’identification de CMA. / Arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) are classified in the phylum Glomeromycota. This fungal group cannot be easily identified using morphology of their spores and hyphae inside or outside plant-roots. This fundamental problem renders the study of their diversity extremely difficult, particularly in their natural habitat (soil and roots). The ribosomal genes have been widely used to develop specific primers and to infer phylogenetic trees. However, these genes are highly polymorphic and exist in multiple copies in the genome of the AMF. This leads misinterpretation of the results. In our study, we analysed the intra- and inter specific polymorphism of the β-tubulin gene, which is present in low copy number in AMF genome, to obtain further nucleotide sequences to develop molecular markers. β-tubulin genes were sequenced from genomic DNA of five Glomus species. PCR amplified β-tubulin genes were cloned and sequenced. Intra- and inter-specific polymorphism analyses indicate the polymorphic nature of β-tubulin gene in three AMF species. Two highly variable β-tubulin paralogs were newly identified in G. aggregatum, G. fasciculatum and G. cerebriforme. No evidence for the presence of paralogs was found in G. clarum and G. etunicatum. All AMF sequences show the presence of two introns, which are highly variable. The majority of substitutions are located in the exons and 90% are synonymous. The conservation of amino-acids level suggests a high level of negative selection acting on the β-tubulin gene and allows us to consider that the AMF represent an ancient fungal group (400 million years). A phylogenetic analysis, carried out with twentyone β-tubulin nucleotidic sequences, revealed that the sequences of Glomeraceae form a highly supported monophyletic group with Acaulosporaceae and Gigasporaceae as sistergroup. The newly identified paralogs from G. aggregatum and G. fasciculatum were not found to be monophyletic within each species. Oligonucleotides were designed in the conserved and variable regions. PCR amplification test of β-Tub.cerb.F / β-Tub.cerb.R revealed specific bands of 401 bp for the G. cerebriforme paralogs. Two pairs of primers were developed to identify sequences of the group named Tub.1. PCR tests have allowed us to identify certain sequences of Tub.1 group. A primer pair of β-Tub.2.F / β-Tub.2.R we identified some sequences paralogous group named Tub.2. Analysis of other genes combined with that of β-tubulin gene enable the development of more specific molecular markers for AMF identification.