Le cancer épithélial de l’ovaire (CEO) est le cancer gynécologique le plus létal. Plus de 70% des patientes diagnostiquées avec une tumeur de stade avancé rechutent suite aux traitements chimiothérapeutiques de première ligne, la survie à cinq ans étant ainsi très faible. Afin de mieux comprendre l’évolution de la maladie, nous avons recherché de nouveaux gènes, responsables de l’initiation et de la progression du CEO. Précédemment, des lignées cellulaires ont été dérivées à partir de la tumeur primaire et récurrente et/ou d’ascites de trois patientes. Le séquençage de l’ARN de ces lignées par la technologie de séquençage de nouvelle génération (TSNG) nous a permis d’identifier des mutations ponctuelles qui pourraient nous indiquer des gènes dérégulés dans le CEO. La TSNG est un bon outil qui permet d’identifier et de cribler à grande échelle des mutations. Nous avons sélectionné PLEC1, SCRIB, NCOR2, SEMA6C, IKBKB, GLCE et ITGAE comme gènes candidats présentant des mutations dans nos lignées et ayant une relation fonctionnelle avérée avec le cancer. Étant donné que la TSNG est une technique à taux de fiabilité limité, nous avons validé ces mutations par séquençage Sanger. Ensuite, nous avons étudié l’effet de ces mutations sur la structure protéique et l’expression de PLEC1, de SCRIB et de SEMA6C. Seules certaines mutations dans les gènes PLEC1, SCRIB et SEMA6C ont pu être confirmées. PLEC1 et SCRIB sont deux protéines d’échafaudage dont la mutation, rapportée dans plusieurs cancers, pourrait induire des changements de leurs conformations et affecter leurs interactions et leurs fonctions. Les conséquences de ces mutations sur la tumorigenèse de l’ovaire devront être étudiées. / Epithelial ovarian cancer (EOC) is the most lethal gynecological cancer. Over 70% of the patients diagnosed with advanced stage of cancer relapse following first-line chemotherapy treatments; consequently the five-year survival is very low. To better understand the evolution of the disease, our aim was to identify new genes responsible for the initiation and progression of EOC. Previously, cell lines derived from solid tumors or ascites were developed from the primary and recurrent tumor or ascites of three patients. RNA sequencing of these cell lines by next-generation sequencing technology (NGST) allowed us to identify mutations that might point to genes whose deregulation is important in EOC. Mutations were detected in PLEC1, SCRIB, NCOR2, SEMA6C, IKBKB, GLCE and ITGAE. We selected these genes for further studies as they have previously been identified as being associated with cancer. First, we validated these mutations by Sanger sequencing in order to determine the concordance with NGST data. Secondly, we studied the impact of the validated mutations on protein structure and gene expression. Only certain mutations in PLEC1, SCRIB and SEMA6C were confirmed. Of interest, PLEC1 and SCRIB are two scaffold proteins, where mutations have been reported in several cancers and, possibly leading to changes in their conformation and thereby affecting their interactions and functions. The consequences of these mutations on ovarian tumorigenesis remain to be determined.

L’adaptation des cellules à leur environnement externe repose sur la transduction adéquate de signaux régulés par une pléthore d'événements moléculaires. Parmi ces événements moléculaires, les modifications post-traductionnelles (MPT) de protéines aident à intégrer, à traduire et à organiser de façon spatiotemporelle ces signaux pour que les cellules puissent réagir aux stimuli externes. Parmi les modifications post-traductionnelles, les petites protéines de la famille de l’Ubiquitine (Ublps, Ubiquitin-like proteins) jouent un rôle majeur dans presque toutes les voies de signalisation. Cette thèse rapporte des études fonctionnelles et structurales des interactions covalentes et non covalentes entre SUMO (Small Ubiquitin related MOdifier), un membre de la famille des Ublps, et trois protéines d'échafaudage, TIF1beta, le corépresseur universel des protéines KRAB-multidoigt de zinc, PIAS1, une ligase E3 pour SUMO et PML, un suppresseur de tumeur. La première étude rapporte l'identification et la caractérisation biochimique des sites de SUMOylation de TIF1beta. Nous avons déterminé que la modification covalente de six résidus lysine par SUMO est essentielle à l’activité de répression de la transcription induit par TIF1beta. En outre, nous présentons des évidences indiquant que la SUMOylation de TIF1 exige non seulement sa capacité à homo-oligomériser, mais est aussi positivement régulée par son interaction avec le domaine KRAB des protéines à doigts de zinc. Partant de ce constat, nous postulons que les protéines KRAB-multidoigt de zinc recrutent leur corépresseur TIF1betaà des gènes cibles, mais aussi accentuent son activité répressive grâce à l'augmentation de sa SUMOylation. Notre seconde étude révèle qu’en plus de réprimer la transcription en tant que MPT covalente, SUMO joue aussi un rôle important dans la répression en tant que partenaire non covalent d’interactions protéine-protéine. Nous avons montré que SUMO interagit simultanément avec deux enzymes de la machinerie de SUMOylation, l’unique enzyme de conjugaison E2, UBC9, et la ligase E3 PIAS1 au sein d’un complexe ternaire répresseur. En outre, nous révélons que la formation du complexe ternaire PIAS1:SUMO:UBC9 est modulée par le niveau de phosphorylation de résidus sérine juxtaposés à un motif d’interaction avec SUMO (SIM) dans PIAS1. Ainsi, SUMO agit comme un adaptateur spécifique qui stabilise les interactions UBC9 E2: E3 PIAS1. Partant de ce constat, nous proposons que les enzymes E2 et E3 des autres systèmes Ublps exploitent des mécanismes similaires dans le cadre de leur fonction Enfin, notre troisième étude explore la régulation des interactions non covalentes de SUMO par la phosphorylation. En utilisant une combinaison d'études in vivo et in vitro, nous démontrons que l'interaction entre SUMO1 et PML est régi par la phosphorylation dépendant de CK2 sur quatre résidus sérine de PML. Les structures cristallographiques des complexes PML-SIM:SUMO1 révèlent que les phospho-sérines de PML contactent des résidus de la région basique de SUMO1. Sachant que la kinase CK2 peut être induite par des kinases activables par le stress, ces résultats suggèrent que les interactions non-covalentes avec SUMO sont modulées par le stress cellulaire. Sur la base de cette constatation, nous postulons que des événements analogues affectent des protéines contenant des séquences SIM ciblées par CK2. En résumé, cette étude révèle qu’en plus de son rôle de MPT, SUMO peut fonctionner comme un adaptateur permettant des interactions spécifiques entre protéines tel que pour les enzymes E3 et E2. / Cell adaption to the external environment relies on proper signal transduction that is orchestrated by a plethora of molecular events. Among these molecular events, post-translational modifications (PTMs) of proteins help to spatiotemporally integrate, translate and dispatch signals so cells can respond to external stimuli. Among these post-translational modifications, the Ubiquitin-like proteins (Ublps) play a major role in almost all signaling pathways. This thesis reports functional and structural studies of the covalent and non-covalent interactions between the Small Ubiquitin-related MOdifier (SUMO), a member of the Ublps family, and three scaffold proteins, TIF1beta, the corepressor of KRAB-Multifinger proteins, PIAS1, a SUMO E3 ligase and the Promyleocytic leukemia (PML) tumor suppressor protein. The first study reports the identification and the biochemical characterization of TIF1betaSUMOylation sites. We mapped six SUMOylation sites in TIF1beta and determined that the covalent modification of these sites by SUMO is essential for its transcriptional repression activity. In addition, we present evidence indicating that SUMOylation of TIF1beta requires not only its ability to homo-oligomerize, but is positively regulated through its interaction with KRAB domains found in zinc-finger proteins. Based on this finding, we postulate that these KRAB domain containing multifinger proteins not only recruit TIF1beta co-repressor to target genes but also increase its repressive activity through enhancement of its SUMOylation. The work in the second study reveals that in addition to suppressing transcription as a covalent PTM, SUMO plays an important role in repression as a non-covalent protein-protein interaction partner. We determine that SUMO can form a repressive complex by simultaneously forming non-covalent interactions with UBC9 and PIAS1, the E2 and E3 enzymes in the SUMOylation system. In addition, we report that the formation of the PIAS1:SUMO:UBC9 ternary complex is modulated by the phosphorylation of serine residues juxtaposed to a SUMO-Interacting Motif (SIM) found in PIAS1. Thus SUMO acts as a specific adaptor that stabilizes UBC9 E2: PIAS1 E3 interactions. Based on this finding, we propose that the E2 and E3 enzymes from other Ublps systems exploit similar mechanisms as part of their function Finally, our third study explores the regulation of SUMO non-covalent interactions by phosphorylation. Using a combination of in vivo and in vitro studies we demonstrate that the interaction between SUMO1 and PML is governed by CK2-dependent phosphorylation of four serine residues in PML. Crystal structures of PML-SIM:SUMO1 complexes reveal that these PML phospho-serine specifically contact SUMO1 basic patch residues. Since CK2 kinase is induced by stress activated kinases pathways, this indicates that SUMO non-covalent interactions are regulated by cellular stress. Based on this finding, we postulated that analogous events influence other CK2-targeted SIM-containing proteins. In summary, this study reveals that in addition to its well described function as PTM, SUMO can function as an adaptor enabling specific proteins interactions such as functional E3:E2 enzymes pairs.

Notre laboratoire a récemment découvert un mode d’expression des gènes mitochondriaux inédit chez le protozoaire biflagellé Diplonema papillatum. Outre son ADNmt formé de centaines de chromosomes circulaires, ses gènes sont fragmentés. Le gène cox1 qui code pour la sous unité I de la cytochrome oxydase est formé de neuf modules portés par autant de chromosomes. L’ARNm de cox1 est obtenu par épissage en trans et il est également édité par insertion de six uridines entre deux modules. Notre projet de recherche a porté sur une étude globale des processus post-transcriptionnels du génome mitochondrial de diplonémides. Nous avons caractérisé la fragmentation de cox1 chez trois autres espèces appartenant aux deux genres du groupe de diplonémides à savoir : Diplonema ambulator, Diplonema sp. 2 et Rhynchopus euleeides. Le gène cox1 est fragmenté en neuf modules chez tous ces diplonémides mais les modules sont portés par des chromosomes de taille et de séquences différentes d’une espèce à l’autre. L’étude des différentes espèces a aussi montrée que l’édition par insertion de six uridines entre deux modules de l’ARNm de cox1 est commune aux diplonémides. Ainsi, la fragmentation des gènes et l’édition des ARN sont des caractères communs aux diplonémides. Une analyse des transcrits mitochondriaux de D. papillatum a permis de découvrir quatre autres gènes mitochondriaux édités, dont un code pour un ARN ribosomique. Donc, l'édition ne se limite pas aux ARNm. De plus, nous avons montré qu’il n’y a pas de motifs d’introns de groupe I, de groupe II, de type ARNt ou d’introns impliqués dans le splicéosome et pouvant être à l’origine de l’épissage des modules de cox1. Aucune complémentarité significative de séquence n’existe entre les régions flanquantes de deux modules voisins, ni de résidus conservés au sein d’une espèce ou à travers les espèces. Nous avons donc conclu que l’épissage en trans de cox1 chez les diplonémides fait intervenir un nouveau mécanisme impliquant des facteurs trans plutôt que cis. L’épissage et l’édition de cox1 sont dirigés probablement par des ARN guides, mais il est également possible que les facteurs trans soient des molécules protéiques ou d’ADN. Nous avons élucidé les processus de maturation des transcrits mitochondriaux de D. papillatum. Tous les transcrits subissent trois étapes coordonnées et précises, notamment la maturation des deux extrémités, l’épissage, la polyadénylation du module 3’ et dans certains cas l’édition. La maturation des extrémités 5’ et 3’ se fait parallèlement à l’épissage et donne lieu à trois types d’intermédiaires. Ainsi, un transcrit primaire avec une extrémité libre peut se lier à son voisin. Cet épissage se fait apparemment sans prioriser un certain ordre temporel alors que dans le cas des transcrits édités, l’édition précède l`épissage. Ces études donnant une vue globale de la maturation des transcrits mitochondriaux ouvrent la voie à des analyses fonctionnelles sur l’épissage et l’édition chez D. papillatum. Elles sont le fondement pour finalement élucider les mécanismes moléculaires de ces deux processus post-transcriptionnels de régulation dans ce système intriguant. / Our laboratory has recently discovered an unprecedented mode of expression of mitochondrial genes in D. papillatum, a biflagellate protozoan. In addition to its mtDNA formed of hundreds of circular chromosomes, genes are fragmented. For example, the cox1 gene which encodes the subunit one of the cytochrome oxidase complex, comprises nine modules carried by nine chromosomes. The cox1 mRNA is obtained by trans-splicing and is also edited by the insertion of six uridines between two modules. My thesis project focused on the study of post-transcriptional processes in diplonemid mitochondria. We characterized the fragmentation of cox1 in three other species belonging to two diplonemids genera: Diplonema ambulator, Diplonema sp. 2 and Rhynchopus euleeides. The cox1 gene is fragmented into nine modules in all species but the modules are carried by chromosomes of different size and sequences from one species to another. We have shown that there are no motifs for classical introns, including spliceosomal and archaeal introns, as well as introns of group I and II, that might be implicated in the trans-splicing of cox1 modules. No significant complementarity exists between the flanking regions of two neighboring modules, nor are any conserved residues within a species or across species. We therefore concluded that the trans-splicing of cox1 in diplonemids involves a novel mechanism implicating trans rather than cis-factors. Trans-splicing and editing of cox1 probably involve guide RNAs, but it is also possible that the trans-factors are proteins or DNA molecules. The study of different species has also shown that the insertion of six uridines between two cox1 modules in mRNA is a shared trait in these diplonemids. We discovered that four other mitochondrial genes are also edited in D. papillatum and that RNA editing is not limited to mRNA. So, fragmented genes and RNA editing are common characteristics of diplonemids. We elucidated D. papillatum’s mitochondrial transcript maturation steps. All transcripts undergo three coordinated and precise processes including end processing, trans-splicing and / or editing and polyadenylation. The processing of the 5 'and 3' ends gives rise to three kinds of maturation intermediates. A primary transcript with one free end can bind to its neighbor and trans-splicing occurs without directionality. In the case of edited transcripts, editing precedes trans-splicing. These studies have prepared the ground for functional studies of trans-splicing and RNA editing with the long term goal to elucidate the molecular mechanisms involved in post-transcriptional regulation in this intriguing system.

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie très sévère, progressive et sans traitement vraiment efficace. Elle est caractérisée par l’absence fonctionnelle de la dystrophine, une protéine essentielle au maintien des muscles squelettiques. La thérapie génique est actuellement envisagée comme approche thérapeutique pour livrer la dystrophine dans les muscles. Les vecteurs adénoviraux de troisième génération (Helper-dependent adenoviral vector, HD) sont des véhicules de transfert génique très prometteurs pour traiter la DMD. Puisque les gènes adénoviraux ont été enlevés complètement du HD, ils sont peu toxiques, faiblement immunogéniques et ils possèdent un espace cargo suffisant pour transporter l’ADN codant complet de la dystrophine. Bien que le HD puisse fournir la dystrophine de façon thérapeutique chez des souris dystrophiques (mdx), l’expression du gène thérapeutique est progressivement perdue plusieurs mois suivant l’injection intramusculaire. Deux stratégies innovantes furent explorées dans cette thèse dans le but de stabiliser l’expression de la dystrophine. La première stratégie vise à l’intégration de l’ADN du HD dans les chromosomes cellulaires, ce qui pourrait le protéger contre son élimination progressive des muscles. Une intégrase site-spécifique issue du phage ΦC31 a été utilisée pour catalyser l’intégration d’un HD transportant un marqueur de sélection. Dans les cellules humaines et les myoblastes murins, l’activité de l’intégrase a été évaluée d’après son efficacité d’intégration (après sélection) et sa spécificité (dans les clones résistants). L’efficacité atteint jusqu’à 0,5 % par cellule et jusqu’à 76 % des événements d’intégration ont été réalisés de façon site-spécifique. Bien que des délétions aient été trouvées aux extrémités du vecteur, 70 % des clones analysés montraient une seule copie du vecteur intégré (le nombre attendu). Seulement une petite augmentation du nombre de brisures double-brin a été mesurée dans les myoblastes exprimant l’intégrase. En conclusion, l’intégration du HD est relativement efficace, spécifique et sécuritaire. Cette méthode est très prometteuse, car la dystrophine peut être livrée dans le muscle avec l’aide du HD et l’intégration de l’ADN du HD pourrait stabiliser son expression in vivo. La deuxième stratégie implique l’utilisation d’un nouveau promoteur musculospécifique (ΔUSEx3) pour réduire la toxicité induite liée à une expression trop étendue de la dystrophine. Dans cette étude, nous avons investigué l’effet du contexte viral sur l’activité du promoteur. Un HD et un vecteur lentiviral (LV) ont été construits avec le promoteur ΔUSEx3 pour contrôler l’expression d’un gène rapporteur. Les résultats démontrent que ΔUSEx3 confère une expression puissante, musculospécifique et stable (via le LV) in vitro. L’injection intramusculaire du HD a conduit à une expression puissante du transgène. Ces résultats contrastent avec ceux du LV, car après l’injection de ce dernier, l’expression était faible. La livraison du HD dans le muscle, mais aussi dans plusieurs organes démontre la musculospécificité de ΔUSEx3. Par conséquent, le contexte du vecteur et l’environnement musculaire modulent tous les deux l’activité de ΔUSEx3. Bien que ΔUSEx3 soit musculospécifique, d’autres études sont requises pour déterminer si le promoteur peut stabiliser l’expression de la dystrophine in vivo. / Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a severe, progressive and orphan disease that is characterized by the absence of the functional muscle protein dystrophin. Gene therapy is currently investigated as a therapeutic approach to deliver dystrophin into muscles. Helper-dependent adenoviral vectors (HD) are promising gene transfer vehicles for gene therapy of DMD. Because HD are devoid of all adenoviral genes, they are weakly toxic, poorly immunogenic and possess sufficient cargo capacity to carry the full-length dystrophin cDNA. Although HD can provide dystrophin therapeutically in dystrophic mice, gene expression decays months after intramuscular injection. Two strategies that both aimed to stabilize dystrophin expression were explored here. The first strategy involved the integration of HD DNA into cellular chromosomes. Stabilizing HD DNA could prevent its elimination from muscles. A site-specific integrase from phage ΦC31 was used to integrate an HD carrying a selection marker in human cells and murine myoblasts. Efficacy of integration (obtained after selection) reached up to 0.5% per cell, and up to 76% of integration events (in clones) were mediated site-specifically. Although some deletions in HD extremities occurred, 70% of clones analyzed showed one integrated copy of HD (as expected). Only a small increase in the number of double-strand breaks was found in myoblasts expressing the integrase. In conclusion, HD integration was relatively efficient, specific and safe. This method could be used to stabilize dystrophin expression in vivo. The second strategy involved using a muscle-specific promoter (ΔUSEx3) to reduce potential toxicity induced by widespread expression of dystrophin. Because ΔUSEx3 would be delivered by HD, we investigated whether or not the viral context could affect ΔUSEx3 activity. We constructed an HD and a lentiviral vector (LV) carrying a reporter gene under its control. Strong, muscle-specific and stable (with LV) expression was obtained in vitro. Intramuscular injection of HD resulted into a powerful transgene expression contrasting with LV, where expression was relatively weak. Delivery of ΔUSEx3 in multiple tissues by HD demonstrated its muscle-specificity. Therefore, both the viral context and the muscular environments modulate ΔUSEx3 activity. Further studies are required to determine whether or not ΔUSEx3 can stabilize dystrophin expression in vivo.

Les dinoflagellés sont des eucaryotes unicellulaires que l’on retrouve autant en eau douce qu’en milieu marin. Ils sont particulièrement connus pour causer des fleurs d’algues toxiques nommées ‘marée-rouge’, ainsi que pour leur symbiose avec les coraux et pour leur importante contribution à la fixation du carbone dans les océans. Au point de vue moléculaire, ils sont aussi connus pour leur caractéristiques nucléaires uniques, car on retrouve généralement une quantité immense d’ADN dans leurs chromosomes et ceux-ci sont empaquetés et condensés sous une forme cristalline liquide au lieu de nucléosomes. Les gènes encodés par le noyau sont souvent présents en multiples copies et arrangés en tandem et aucun élément de régulation transcriptionnelle, y compris la boite TATA, n’a encore été observé. L’organisation unique de la chromatine des dinoflagellés suggère que différentes stratégies sont nécessaires pour contrôler l’expression des gènes de ces organismes. Dans cette étude, j’ai abordé ce problème en utilisant le dinoflagellé photosynthétique Lingulodinium polyedrum comme modèle. L. polyedrum est d’un intérêt particulier, car il a plusieurs rythmes circadiens (journalier). À ce jour, toutes les études sur l’expression des gènes lors des changements circadiens ont démontrées une régulation à un niveau traductionnel. Pour mes recherches, j’ai utilisé les approches transcriptomique, protéomique et phosphoprotéomique ainsi que des études biochimiques pour donner un aperçu de la mécanique de la régulation des gènes des dinoflagellés, ceci en mettant l’accent sur l’importance de la phosphorylation du système circadien de L. polyedrum. L’absence des protéines histones et des nucléosomes est une particularité des dinoflagellés. En utilisant la technologie RNA-Seq, j’ai trouvé des séquences complètes encodant des histones et des enzymes modifiant les histones. L polyedrum exprime donc des séquences conservées codantes pour les histones, mais le niveau d’expression protéique est plus faible que les limites de détection par immunodétection de type Western. Les données de séquençage RNA-Seq ont également été utilisées pour générer un transcriptome, qui est une liste des gènes exprimés par L. polyedrum. Une recherche par homologie de séquences a d’abord été effectuée pour classifier les transcrits en diverses catégories (Gene Ontology; GO). Cette analyse a révélé une faible abondance des facteurs de transcription et une surprenante prédominance, parmi ceux-ci, des séquences à domaine Cold Shock. Chez L. polyedrum, plusieurs gènes sont répétés en tandem. Un alignement des séquences obtenues par RNA-Seq avec les copies génomiques de gènes organisés en tandem a été réalisé pour examiner la présence de transcrits polycistroniques, une hypothèse formulée pour expliquer le manque d’élément promoteur dans la région intergénique de la séquence de ces gènes. Cette analyse a également démontré une très haute conservation des séquences codantes des gènes organisés en tandem. Le transcriptome a également été utilisé pour aider à l’identification de protéines après leur séquençage par spectrométrie de masse, et une fraction enrichie en phosphoprotéines a été déterminée comme particulièrement bien adapté aux approches d’analyse à haut débit. La comparaison des phosphoprotéomes provenant de deux périodes différentes de la journée a révélée qu’une grande partie des protéines pour lesquelles l’état de phosphorylation varie avec le temps est reliées aux catégories de liaison à l’ARN et de la traduction. Le transcriptome a aussi été utilisé pour définir le spectre des kinases présentes chez L. polyedrum, qui a ensuite été utilisé pour classifier les différents peptides phosphorylés qui sont potentiellement les cibles de ces kinases. Plusieurs peptides identifiés comme étant phosphorylés par la Casein Kinase 2 (CK2), une kinase connue pour être impliquée dans l’horloge circadienne des eucaryotes, proviennent de diverses protéines de liaison à l’ARN. Pour évaluer la possibilité que quelques-unes des multiples protéines à domaine Cold Shock identifiées dans le transcriptome puissent moduler l’expression des gènes de L. polyedrum, tel qu’observé chez plusieurs autres systèmes procaryotiques et eucaryotiques, la réponse des cellules à des températures froides a été examinée. Les températures froides ont permis d’induire rapidement un enkystement, condition dans laquelle ces cellules deviennent métaboliquement inactives afin de résister aux conditions environnementales défavorables. Les changements dans le profil des phosphoprotéines seraient le facteur majeur causant la formation de kystes. Les phosphosites prédits pour être phosphorylés par la CK2 sont la classe la plus fortement réduite dans les kystes, une découverte intéressante, car le rythme de la bioluminescence confirme que l’horloge a été arrêtée dans le kyste. / Dinoflagellates are unicellular eukaryotes found in both marine and freshwater environments. They are best known for causing toxic blooms called ‘red-tides’, for their symbiosis with corals, and for their important contribution to carbon fixation in the ocean. On a more molecular level, they are also known for their unique nuclear characteristics, as they generally have huge amount of DNA found in chromosomes that are permanently condensed and packaged into liquid crystalline forms instead of nucleosomes. Nuclear-encoded genes are often present in multiple copies and arranged in tandem, and no putative promoter elements including the conserved TATA box, have yet been observed. The unique organization of dinoflagellate chromatin suggests different strategies may be required to regulate gene expression in these organisms. In this study, I have started to address this problem using the photosynthetic dinoflagellate Lingulodinium polyedrum as a model. L. polyedrum is of particular interest because it shows a number of circadian (daily) rhythms. To date, all circadian changes in gene expression studied are regulated at a translational level. I have used transcriptomic, proteomic and phosphoproteomic approaches along with biochemical studies to provide insight into the gene regulatory mechanisms in dinoflagellates, with particular emphasis on the importance of phosphorylation in the L. polyedrum circadian system. The absence of histone proteins and nucleosomes is a hallmark of the dinoflagellates. Using high throughput RNA-seq technology, I found complete set of sequences encoding the core histones as well as sequences encoding histone-modifying enzymes in L. polyedrum. Thus L. polyedrum expresses conserved histone transcripts, although levels of proteins are still below what can be detected using immunoblotting studies. Using the de novo assembly algorithm the RNA-seq data was used to generate a transcriptome. This transcriptome, a list of genes expressed by L. polyedrum, has been extensively characterized. First, homology based sequence searches were used to classify the transcripts in gene ontology (GO) categories, and this analysis revealed a reduced number of transcription factor types and a surprising predominance of sequences containing a cold shock domain. Alignments of reads from the RNA–seq to genomic copies of L. polyedrum tandem repeat sequences was performed to assess the possibility of polycistronic transcripts, a hypothesis proposed to explain the lack of promoter elements in the intergenic region of the tandem repeat gene sequences. This analysis also showed a surprisingly high conservation of tandemly repeated gene sequences. The transcriptome database was also used to fuel gene identification after protein sequencing by mass spectrometry, and a purified phosphoproteome fraction was found to be particularly amenable to high throughput approaches. A comparison of the phosphoproteome at two different times of day revealed that a major class of proteins whose phosphorylation state varied over time belonged to the RNA binding and translation GO category. The transcriptome was also used to define the spectrum of kinases present in L. polyedrum, which in turn was used to classify the different phosphorylated peptides as potential kinase targets. Predicted peptides of casein kinase 2 (CK2), a kinase known to be involved in the circadian clocks of other eukaryotes, were found to include many RNA binding proteins. To assess the possibility that some of the many cold shock domain proteins identified in the transcriptome might modulate gene expression in L. polyedrum, as has been observed in many other eukaryotic and prokaryotic systems, the cellular response to cold temperatures was examined. Cold temperatures were found to induce rapid encystment, a metabolically inactive cell type whose role is to combat unfavourable environmental conditions. Changes in phosphoproteome profile were found to be the major molecular correlates to cyst formation. Predicted CK2 phosphosites are the most highly reduced class of kinase targets, a finding of interest as measurements of the bioluminescence rhythm confirmed that the clock is stopped in cysts

Le système ubiquitine-protéasome est le principal mécanisme par lequel les protéines intracellulaires sont dégradées. Le protéasome dit constitutif (PC) est donc essentiel à l’homéostasie mais aussi à la régulation de la majorité des processus cellulaires importants. La découverte d’un deuxième type de protéasome, appelé immunoprotéasome (IP), soulève toutefois de nouvelles questions. Pourquoi existe-t-il plus d’un type de protéasome ? L’IP a-t-il des rôles redondants ou complémentaires avec le PC ? L’IP étant présent principalement dans les cellules immunitaires ou stimulées par des cytokines, plusieurs groupes ont tenté de définir son rôle dans la réponse immunitaire. Or, l’implication de son homologue constitutif dans un éventail de processus non spécifiquement immunitaires nous laisse croire que l’IP pourrait lui aussi avoir un impact beaucoup plus large. L’objectif de cette thèse était donc de caractériser certains rôles cellulaires de l’IP dans les cellules dendritiques. Nous avons d’abord étudié l’impact global de l’IP sur la présentation antigénique de classe I. Ce faisant, nous avons pu déterminer ses deux contributions principales, soit l’augmentation drastique du nombre et de la diversité des peptides présentés sur les complexes majeurs d’histocompatibilité de classe I. Les différences de clivage entre le PC et l’IP pourraient expliquer en partie cette diversité du répertoire peptidique, notamment par l’affinité apparente de l’IP pour les régions protéiques non structurées. Dans un deuxième temps, nous avons dévoilé un nouveau rôle de l’IP sur un processus dépassant le cadre immunitaire : la transcription. Nous avons découvert que l’IP modifie l’abondance des ARNm en agissant principalement au niveau de leur synthèse. L’impact de l’IP sur le transcriptome est majeur et serait dû en partie à une dégradation différente de facteurs de transcription des familles IRF, STAT et NF-kB. Les cellules dendritiques IP-déficientes activent moins efficacement les lymphocytes T CD8+ et nous croyons que cette défaillance est causée (du moins en partie) par la perturbation transcriptomique provoquée par l’absence d’IP. Il importe donc de comprendre les différents rôles moléculaires de l’IP afin de mieux définir sa contribution globale au fonctionnement de la cellule et comprendre l’avantage évolutif, au niveau de l’organisme, procuré par une telle plasticité du système ubiquitine-protéasome. / The ubiquitin-proteasome system is the major mechanism by which intracellular proteins get degraded. Constitutive proteasomes (CPs) are thus essential for cellular homeostasis but also to regulate the majority of important cellular processes. However, the discovery of a second type of proteasome, named immunoproteasome (IP), raises new questions. Why are there more than one type of proteasome? Does the IP perform redundant or complementary roles with the CP? The IP is predominantly expressed in immune or cytokine-stimulated cells and several groups worked at defining its role during the immune response. Yet, the implication of its constitutive homolog in a variety of processes suggests that the IP may also have a much broader impact. The objective was to characterize cellular roles of the IP in dendritic cells. We first studied the global impact of the IP on class I antigen presentation. We discovered that the IP drastically increases the number and the diversity of peptide presented by class I major histocompatibility complexes. Cleavage differences between the CP and the IP are likely part of the explanation for this peptide repertoire diversity, notably due to IP’s apparent affinity for unstructured protein regions. Second, we discovered a new role for the IP in a process unrestricted to the immune system: transcription. We found that the IP affects transcript abundance mostly at the level of mRNA synthesis. The impact of IPs on the transcriptome is major and would be partly based on a different degradation of IRF, STAT and NF-kB transcription factor family members by the two types of proteasomes. IP-deficient dendritic cells are less potent activators of CD8+ T cells and we believe that this defect is at least partly caused by the transcriptome alterations induced by the absence of IPs. It is therefore important to understand the different molecular roles of the IP in order to better define its global contribution to cellular functions and to understand the evolutionary advantage, at the level of the organism, brought by such plasticity of the ubiquitin- proteasome system.

Les différents mécanismes de régulation posttranscriptionnelle de l’expression des gènes sont de plus en plus reconnus comme des processus essentiels dans divers phénomènes physiologiques importants, comme la prolifération cellulaire et la réponse aux dommages à l’ADN. Deux des protéines impliquées dans ce type de régulation sont Staufen1 (Stau1) et Staufen2 (Stau2). Elles sont des protéines de liaison à l’ARN double brin qui contribuent au transport de l’ARN messager (ARNm), au contrôle de la traduction, à l’épissage alternatif et sont responsables de la dégradation de certains ARNm spécifiques. Les protéines Staufen peuvent en effet s’associer à des ARNm bien précis, d’autant plus que, majoritairement, Stau1 et Stau2 ne se retrouvent pas en complexe avec les mêmes cibles. De nombreuses évidences récentes montrent l’implication de divers mécanismes de régulation posttranscriptionnelle dans la réponse aux dommages à l’ADN, plusieurs protéines de liaison à l’ARN y participant d’ailleurs. De façon importante, cette réponse dicte un ou plusieurs destin(s) à la cellule qui doit réagir à la suite de dommages à l’intégrité de son ADN: réparation de l’ADN, arrêt de la prolifération cellulaire, apoptose. Nous avons donc fait l’hypothèse que l’expression de Stau1 et/ou de Stau2 pourrait être affectée en réponse à un stress génotoxique, ce qui pourrait avoir comme conséquence de moduler l’expression et/ou la stabilité de leurs ARNm cibles. De même, notre laboratoire a récemment observé que l’expression de Stau1 varie pendant le cycle cellulaire, celle-ci étant plus élevée jusqu’au début de la mitose (prométaphase), puis elle diminue alors que les cellules complètent leur division. Par conséquent, nous avons fait l’hypothèse que Stau1 pourrait lier des ARNm de façon différentielle dans des cellules bloquées en prométaphase et dans des cellules asynchrones. D’un côté, en employant la camptothécine (CPT), une drogue causant des dommages à l’ADN, pour traiter des cellules de la lignée de cancer colorectal HCT116, nous avons observé que seule l’expression de Stau2 est réduite de façon considérable, tant au niveau de la protéine que de l’ARNm. L’utilisation d’autres agents cytotoxiques a permis de confirmer cette observation initiale. De plus, nous avons constaté que l’expression de Stau2 est touchée même dans des conditions n’engendrant pas une réponse apoptotique, ce qui suggère que cette déplétion de Stau2 est possiblement importante pour la mise en place d’une réponse appropriée aux dommages à l’ADN. D’ailleurs, la surexpression de Stau2 conjointement avec le traitement à la CPT entraîne un retard dans l’induction de l’apoptose dans les cellules HCT116. Nous avons aussi montré que la diminution de l’expression de Stau2 est due à une régulation de sa transcription en réponse au stress génotoxique, ce pourquoi une région minimale du promoteur putatif de Stau2 est nécessaire. Également, nous avons identifié que le facteur de transcription E2F1, couramment impliqué dans la réponse aux dommages à l’ADN, peut contrôler l’expression de Stau2. Ainsi, E2F1 permet une augmentation de l’expression de Stau2 dans des cellules non traitées, mais cette hausse est abolie dans des cellules traitées à la CPT, ce qui suggère que la CPT pourrait agir en inhibant l’activation transcriptionnelle de Stau2 par E2F1. Enfin, nous avons observé que certains ARNm associés à Stau2, et codant pour des protéines impliquées dans la réponse aux dommages à l’ADN et l’apoptose, sont exprimés différemment dans des cellules traitées à la CPT et des cellules non traitées. D’un autre côté, nous avons identifié les ARNm associés à Stau1 lors de la prométaphase, alors que l’expression de Stau1 est à son niveau le plus élevé pendant le cycle cellulaire, grâce à une étude à grande échelle de micropuces d’ADN dans des cellules HEK293T. Nous avons par la suite confirmé l’association entre Stau1 et certains ARNm d’intérêts, donc codant pour des protéines impliquées dans la régulation de la prolifération cellulaire et/ou le déroulement de la mitose. Une comparaison de la liaison de ces ARNm à Stau1 dans des cellules bloquées en prométaphase par rapport à des cellules asynchrones nous a permis de constater une association préférentielle dans les cellules en prométaphase. Ceci suggère une augmentation potentielle de la régulation de ces ARNm par Stau1 à ce moment du cycle cellulaire. Les données présentées dans cette thèse indiquent vraisemblablement que la régulation posttranscriptionnelle de l’expression génique contrôlée par les protéines Staufen se fait en partie grâce à la modulation de l’expression de Stau1 et de Stau2 en fonction des conditions cellulaires. Nous envisageons alors que cette variation de l’expression des protéines Staufen ait des conséquences sur des sous-ensembles d’ARNm auxquels elles sont liées et que de cette façon, elles jouent un rôle pour réguler des processus physiologiques essentiels comme la réponse aux dommages à l’ADN et la progression dans le cycle cellulaire. / The various mecanisms of post-transcriptional regulation of gene expression are more and more recognized as essential processes in diverse important physiological phenomenons, like cell proliferation and the DNA damage response (DDR). Two of the proteins implicated in this type of regulation are Staufen1 (Stau1) and Staufen2 (Stau2). They are double-stranded RNA binding proteins contributing to messenger RNA (mRNA) transport, translation control, alternative splicing and are responsible for the degradation of some specific mRNAs. The Staufen proteins are indeed able to associate with particular mRNAs. Interestingly, Stau1 and Stau2 predominantly form complexes with different targets. Recent evidences show the implication of various post-transcriptional regulation mecanisms in the DDR, moreover several RNA binding proteins are involved. Importantly, this response dictates one or several cell fates following damage to the integrity of the cell’s DNA: DNA repair, cell proliferation arrest, apoptosis. We hypothesized that Stau1 and/or Stau2 expression could be affected in response to genotoxic stress, which could consequently modulate the expression and/or the stability of their mRNA targets. Also, our laboratory has recently observed that Stau1 expression varies during the cell cycle. It is elevated up to the beginning of mitosis (prometaphase) and it decreases as cells complete their division. We therefore hypothesized that Stau1 could differentially bind mRNAs in cells blocked in prometaphasis and in asynchronous cells. On the one hand, by using camptothecin (CPT), a DNA damaging agent, to treat cells from the colorectal cancer cell line HCT116, we observed that only the expression of Stau2 is considerably reduced, both at the level of the protein and that of the mRNA. The use of other cytotoxic agents allowed us to confirm this initial observation. We also noted that Stau2 expression is down-regulated even in conditions that do not induce apoptosis, suggesting that the decrease in Stau2 expression may be required for a proper DDR. Indeed, Stau2 overexpression together with the CPT treatment causes a delay in apoptosis induction in HCT116 cells. We also showed that Stau2 down-regulation is due to the regulation of its transcription in response to the genotoxic stress, which necessitates a minimal region in Stau2’s putative promoter. Besides, we identified the E2F1 transcription factor, commonly implicated in the DDR, as a regulator of Stau2 expression. E2F1 thus stimulates an increase in Stau2 expression in non-treated cells, but this up-regulation is abolished in CPT-treated cells, which suggests that CPT could act by inhibiting Stau2 transcriptional activation by E2F1. Finally, we observed that some Stau2-associated mRNAs, which code for proteins implicated in the DDR and apoptosis, are differentially expressed in CPT-treated cells compared to non-treated cells. On the other hand, we identified Stau1-associated mRNAs during prometaphase, when Stau1 expression is at its highest level in the cell cycle, by performing a large-scale study using DNA microarrays in HEK293T cells. We subsequently confirmed the association between Stau1 and some mRNAs of interest, mainly coding for proteins involved in the regulation of cell proliferation and/or mitosis progression. A comparison of the association between Stau1 and these mRNAs in prometaphase-blocked cells with that in asynchronous cells allowed us to notice a preferential association in prometaphase-blocked cells. This suggests a potential increase of the regulation of these mRNAs by Stau1 at that point of the cell cycle. The data presented in this thesis indicate that in all likelihood the post-transcriptional regulation of gene expression controlled by the Staufen proteins happens in part thanks to the modulation of Stau1 and Stau2 expression according to the cellular conditions. We then contemplate that this fluctuation in Staufen proteins expression has consequences on mRNA subsets with which they associate, and that this may mean they have an important role to play in regulating essential physiological processes like DDR and cell cycle progression.

Dans les dernières années, une explosion de la recherche sur les ARN a eu lieue à cause de nombreuses découvertes démontrant l’importance de l’ARN dans plusieurs processus biologiques. Ainsi, de grandes quantités d’ARN sont devenues indispensables au bon déroulement de plusieurs études, notamment pour la biologie structurale et la caractérisation fonctionnelle. Cependant, il existe encore peu de méthodes de purification simples, efficaces, fiables et produisant un ARN sous forme native. Dans les dernières années, le laboratoire Legault a mis au point une méthode de purification par affinité utilisant une étiquette ARiBo pour la purification d’ARN transcrits in vitro par la polymérase à ARN du phage T7. Cette méthode de purification d’ARN a été spécifiquement développée pour maximiser la pureté et le rendement. De plus, elle est très rapide et fonctionne avec plusieurs types d’ARN. Cependant, comme plusieurs autres méthodes de purification, cette méthode produit des ARN avec des extrémités 5′ hétérogènes. Dans ce mémoire, des solutions sont proposées pour remédier au problème d’hétérogénéité en 5ʹ′ des ARN transcrits avec la polymérase à ARN du phage T7 et purifiés par la méthode ARiBo. La première solution consiste à choisir la séquence en 5′ parmi celles des 32 séquences testées qui ne présentent pas d’hétérogénéité en 5ʹ′. La seconde solution est d’utiliser une étiquette clivable en 5ʹ′ de l’ARN d’intérêt, tel que le ribozyme hammerhead, déjà utilisée pour ce genre d’application, ou le système CRISPR/Cse3 que nous proposons dans l’article présenté dans ce mémoire. De plus, nous avons adapté la méthode ARiBo pour rendre possible la purification d’un long ARN de 614 nt, le polycistron miR-106b-25. Nous avons également démontré la possibilité d’utiliser la méthode ARiBo pour l’isolation de protéines qui se lient à un ARN donné, le précurseur de miRNA pre-miR-153-2. En conclusion, ce mémoire démontre la possibilité d’adapter la méthode ARiBo à plusieurs applications. / In recent years, the field of RNA research has exploded due to several discoveries demonstrating the importance of RNA in many biological processes. Along with the increased interest in this field, large amounts of RNA have become essential to the success of several studies, in particular for structural biology and functional characterization. However, there are still very few native purification methods that are simple, efficient and reliable. In the past few years, the Legault laboratory has established an affinity purification method using an ARiBo tag to purify RNAs produced by in vitro transcription with the T7 RNA polymerase. This RNA purification method was specifically developed to maximise purity and yield. In addition, this method is fast and works with several types of RNAs. However, like several other purification methods, this method produces RNAs with 5' heterogeneity. This Master’s thesis propose solutions to overcome the problem of 5' heterogeneity for RNAs transcribed with the T7 RNA polymerase and purified with the ARiBo method. The first solution proposed is to choose a 5' sequence among those of the 32 sequences tested that do not present 5'- heterogeneity. The other possibility is the use of a cleavable tag at the 5'-end of the RNA of interest, such as the hammerhead ribozyme, already used for this purpose or the CRISPR/Cse3 system, which is presented here. Furthermore, we have adapted the ARiBo method to purify an RNA of 614 nt, the miRNAs cluster miR- 106b-25. We also demonstrate the possibility to use the ARiBo method to isolate proteins that bind a given RNA, the miRNA precursor pre-miR-153-2. In conclusion, this Master’s thesis demonstrates the possibility of adapting the ARiBo method for several applications.

La polykystose rénale autosomique dominante (ADPKD) est une des maladies génétiques les plus communes. ADPKD se manifeste le plus souvent au stade adulte par la présence de kystes rénaux, et bien souvent de kystes hépatiques, avec une progression très variable. ADPKD mène à une insuffisance rénale: les seuls recours sont la dialyse puis la transplantation rénale. Les mutations dispersées sur les gènes PKD1 (majoritairement; la protéine polycystine-1, PC1) et PKD2 (la protéine polycystine-2, PC2) sont responsables de l’ADPKD. Le mécanisme pathogénétique de perte de fonction (LOF) et donc d’un effet récessif cellulaire est évoqué comme causatif de l’ADPKD. LOF est en effet supporté par les modèles murins d’inactivation de gènes PKD1/PKD2, qui développent de kystes, quoique in utéro et avec une rapidité impressionnante dans les reins mais pas dans le foie. Malgré de nombreuses études in vitro, le rôle de PC1/PC2 membranaire/ciliaire reste plutôt hypothétique et contexte-dépendant. Ces études ont associé PC1/PC2 à une panoplie de voies de signalisation et ont souligné une complexité structurelle et fonctionnelle exceptionnelle, dont l’implication a été testée notamment chez les modèles de LOF. Toutefois, les observations patho-cellulaires chez l’humain dont une expression soutenue, voire augmentée, de PKD1/PC1 et l’absence de phénotypes extrarénaux particuliers remet en question l’exclusivité du mécanisme de LOF. Il était donc primordial 1) d’éclaircir le mécanisme pathogénétique, 2) de générer des outils in vivo authentiques d’ADPKD en terme d’initiation et de progression de la maladie et 3) de mieux connaitre les fonctions des PC1/PC2 indispensables pour une translation clinique adéquate. Cette thèse aborde tous ces points. Tout d’abord, nous avons démontré qu’une augmentation de PKD1 endogène sauvage, tout comme chez l’humain, est pathogénétique en générant et caractérisant en détail un modèle murin transgénique de Pkd1 (Pkd1TAG). Ce modèle reproduit non seulement les caractéristiques humaines rénales, associées aux défauts du cil primaire, mais aussi extrarénales comme les kystes hépatiques. La sévérité du phénotype corrèle avec le niveau d’expression de Pkd1 ce qui supporte fortement un modèle de dosage. Dans un deuxième temps, nous avons démontré par les études de complémentations génétiques que ces deux organes reposent sur une balance du clivage GPS de Pc1, une modification post-traductionelle typique des aGPCR, et dont l’activité et l’abondance semblent strictement contrôlées. De plus, nous avons caractérisé extensivement la biogénèse de Pc1 et de ses dérivés in vivo générés suite au clivage GPS. Nous avons identifié une toute nouvelle forme et prédominante à la membrane, la forme Pc1deN, en plus de confirmer deux fragments N- et C-terminal de Pc1 (NTF et CTF, respectivement) qui eux s’associent de manière non-covalente. Nous avons démontré de façon importante que le trafic de Pc1deN i.e., une forme NTF détachée du CTF, est toutefois dépendant de l’intégrité du fragment CTF in vivo. Par la suite, nous avons généré un premier modèle humanisant une mutation PKD1 non-sens tronquée au niveau du domaine NTF(E3043X) en la reproduisant chez une souris transgénique (Pkd1extra). Structurellement, cette mutation, qui mimique la forme Pc1deN, s’est également avérée causative de PKD. Le modèle Pkd1extra a permis entre autre de postuler l’existence d’une cross-interaction entre différentes formes de Pc1. De plus, nos deux modèles murins sont tous les deux associés à des niveaux altérés de c-Myc et Pc2, et soutiennent une implication réelle de ces derniers dans l’ADPKD tou comme une interaction fonctionnelle entre les polycystines. Finalement, nous avons démontré un chevauchement significatif entre l’ADPKD et le dommage rénal aigüe (ischémie/AKI) dont une expression augmentée de Pc1 et Pc2 mais aussi une stimulation de plusieurs facteurs cystogéniques tel que la tubérine, la β-caténine et l’oncogène c-Myc. Nos études ont donc apporté des évidences cruciales sur la contribution du gène dosage dans l’ADPKD. Nous avons développé deux modèles murins qui serviront d’outil pour l’analyse de la pathologie humaine ainsi que pour la validation préclinique ADPKD. L’identification d’une nouvelle forme de Pc1 ajoute un niveau de complexité supplémentaire expliquant en partie une capacité de régulation de plusieurs voies de signalisation par Pc1. Nos résultats nous amènent à proposer de nouvelles approches thérapeutiques: d’une part, le ciblage de CTF i.e., de style chaperonne, et d’autre part le ciblage de modulateurs intracellulaires (c-Myc, Pc2, Hif1α). Ensemble, nos travaux sont d’une importance primordiale du point de vue informatif et pratique pour un avancement vers une thérapie contre l’ADPKD. Le partage de voies communes entre AKI et ADPKD ouvre la voie aux approches thérapeutiques parallèles pour un traitement assurément beaucoup plus rapide. / Autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD) is one of the most common genetic diseases. ADPKD is manifested by the presence of renal cysts detected most often in the adult stage, and frequently liver cysts, with highly variable progression. ADPKD leads to kidney failure with the only recourse of dialysis and eventual kidney transplantation. Mutations dispersed throughout the PKD1 gene (major player, the polycystin-1 protein, PC1) and the PKD2 gene (polycystin-2 protein, PC2) are responsible for ADPKD. The loss of function (LOF) pathogenetic mechanism, and therefore a cellular recessive effect, has been suggested as causative of ADPKD. LOF is indeed supported by the PKD1/PKD2 gene inactivation mouse models, which develop cysts, although in utero with impressive speed in the kidney but not in the liver. Despite many in vitro studies, the membrane/ciliary role of PC1/PC2 remains rather hypothetical and context-dependent. These studies have associated PC1/PC2 to a variety of signaling pathways and underlined exceptional structural and functional complexity, whose involvement has been tested especially in LOF models. However, pathocellular observations in humans with sustained and even increased expression of PKD1/PC1, and the absence of particular human extrarenal phenotypes questions the exclusivity of the LOF mechanism. It was therefore essential 1) to clarify the pathogenetic mechanism, 2) to generate in vivo tools authentic of ADPKD in terms of initiation and progression of the disease and 3) to better understand the essential functions of PC1/PC2 for an adequate clinical translation. This thesis addresses all of these issues. First, we demonstrated that an increase in endogenous PKD1, just like in humans, is pathogenetic by generating and characterizing in detail a transgenic mouse model of Pkd1 (Pkd1TAG). This model not only reproduces the renal human characteristics associated with defects of the primary cilium, but also the extrarenal, namely, liver cysts. The severity of the phenotype correlates with the expression level of Pkd1, which strongly supports a dosage model. Secondly, we have demonstrated with genetic complementation studies that these two organs rely on a balance of Pc1 GPS cleavage, a typical post-translational modification of aGPCR, whose activity and abundance seem strictly controlled. Furthermore, we have extensively characterized Pc1 biogenesis and its derivatives in vivo generated upon GPS cleavage. We have identified a new form, predominantly on the membrane, the Pc1deN form, in addition to confirming the two N- and C-terminal Pc1 fragments (NTF and CTF, respectively), which associate non-covalently. Importantly, we have demonstrated that traffic of Pc1deN i.e., the NTF form detached from the CTF, is still dependant on the integrity of the CTF fragment. Next, we generated a first model humanizing a PKD1 nonsense truncated mutation at the level of the NTF(E3043X) domain by reproducing it in a transgenic mouse (Pkd1extra). Structurally, this mutation, which mimics Pc1deN, has also been shown to be causative of PKD. The Pkd1extra model allowed the proposition of the existence of a cross-interaction between different forms of Pc1. In addition, our two mouse models are both associated with altered levels of c-Myc and Pc2, which is supportive of their involvement in ADPKD and a functional interaction between the polycystins. Finally, we have shown a significant overlap between ADPKD and acute renal injury (ischemia/AKI) namely increased expression of Pc1 and Pc2 but also stimulation of several cystogenic factors such as tuberin, β-catenin and the oncogene c-Myc. Our studies have therefore given crucial evidence to the contribution of PKD1 gene dosage mechanism in ADPKD. We have developed two mouse models, which can serve as a tool for the analysis of human pathology as well as for preclinical validation of ADPKD. The identification of a new form of Pc1 adds an additional level of complexity in part explaining the regulation capacity of Pc1 on several signaling pathways. Our findings lead us to propose new therapeutic approaches: firstly, targeting the CTF i.e., chaperone style, and also targeting intracellular modulators (c-Myc, Pc2, Hif1α). Together, our work is of paramount importance in an informative point of view and practical perspective for progress towards a therapy for treating ADPKD. The sharing of common pathways between AKI and ADPKD paves the way for parallel therapeutic approaches for assured much faster treatment.

La déubiquitinase BAP1 (« BRCA1-Associated Protein1 ») a initialement été isolée pour sa capacité de promouvoir la fonction suppressive de tumeurs de BRCA1. BAP1 est muté de manière homozygote dans plusieurs cancers (tel que le cancer du rein, de la peau, de l’oeil et du sein) suggérant fortement que cette déubiquitinase est un suppresseur de tumeurs. Effectivement, la surexpression de BAP1 réduit la prolifération cellulaire et la croissance tumorale dans des modèles de xénogreffe de souris. Toutefois, la fonction biologique et le mécanisme d’action de cette déubiquitinase restent encore marginalement connus. Ainsi, les objectifs de cette thèse sont de caractériser la fonction biologique de BAP1 et de révéler les bases moléculaires de sa fonction suppressive de tumeurs. Pour déterminer la fonction biologique de BAP1, nous avons immuno-purifié et identifié les protéines associées à BAP1, qui s’avèrent être principalement des facteurs et co-facteurs de transcription. Ensuite, nous avons démontré que BAP1 est un régulateur de la transcription. Parallèlement, un autre groupe a montré que BAP1 chez la drosophile, Calypso, régule l’ubiquitination de H2A et la transcription génique. D’autre part, nos résultats d’analyse d’expression génique globale suggèrent que BAP1 jouerait un rôle important dans la réponse aux dommages à l’ADN. Effectivement, des expériences de gain et de perte de fonction (méthode de l’ARNi, modèle de cellules KO en BAP1 et de cellules déficientes en BAP1 re-exprimant BAP1) ont révélé que cette déubiquitinase régule la réponse aux bris double brin d’ADN par la recombinaison homologue. Nos résultats suggèrent que BAP1 exerce sa fonction suppressive de tumeurs en contrôlant la réparation sans erreur de l’ADN via la recombinaison homologue. En cas d’inactivation de BAP1, les cellules deviendront plus dépendantes du mécanisme de réparation par jonction d'extrémités non-homologues, qui est potentiellement mutagénique causant ainsi l’instabilité génomique. D’autres études seront nécessaires afin de déterminer le rôle exact de BAP1 dans la transcription et de comprendre comment la dérégulation de l’ubiquitination de H2A contribue au développement du cancer. Définir les mécanismes de suppression tumorale est de grand intérêt, non seulement pour comprendre la carcinogénèse mais également pour le développement de nouvelles thérapies contre cette maladie. / The deubiquitinase BAP1 (BRCA1-Associated Protein1) is a nuclear member of the ubiquitin C-terminal hydrolase (UCH) family, previously isolated for promoting the function of the tumor suppressor BRCA1. Importantly, homozygous inactivating mutations of BAP1 have been found in mesothelioma, renal, melanoma and breast cancers strongly suggesting that this deubiquitinase is a tumor suppressor. Indeed BAP1 overexpression reduces cell proliferation and tumor growth in xenograft models. Nonetheless, the biological function and the mechanism of action of this deubiquitinase remain poorly defined. The goals of this thesis are to characterize the biological function of BAP1 and to reveal the molecular basis of its tumor suppressive function. To provide insights into BAP1 biological function, we conducted a tandem affinity immunopurification of BAP1-associated proteins and found that most interacting partners are transcription factors and cofactors. Next, we demonstrated that BAP1 is indeed a transcription regulator. Concomitantly, another group showed that the drosophila BAP1, Calypso, is a Polycomb Group protein that regulates the ubiquitination levels of H2A and gene expression. Indeed, our global gene expression analysis suggests that BAP1 plays important role in DNA damage response. Consistently, loss- and gain- of function experiments (RNAi approach, DT40 chicken B cells KO model and re-introduction of BAP1 in BAP1 null-cells) revealed that BAP1 promotes homologous recombination-mediated DNA double strand break repair. Our data suggest that BAP1 exerts its tumor suppressor function by controlling error-free DNA repair by homologous recombination. Thus, in a situation of BAP1 inactivation, cells might become more reliant on non-homologous end joining, an error-prone DNA repair mechanism, which would result in the accumulation of mutations and chromosomal aberrations, causing genomic instability. Further studies are required to delineate the exact role of BAP1 in transcription and to define how deregulation of H2A ubiquitination pathway contributes to cancer. Defining the mechanisms of tumor suppression is of great interest, not only for understanding cancer development, but also for designing rational cancer therapies.