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La cellule est l’élément fondamental de la vie. Plus d’une vingtaine de trillions de cellules forment les organes et tissus de notre corps. Ces cellules sont de taille spécifique puisqu’elles ont des fonctions précises au sein de leur tissu respectif. Dans la plupart des cas, les cellules doivent proliférer en se divisant pour se renouveler et ainsi assurer le bon fonctionnement d’un organisme. La dernière étape de la division cellulaire, la cytokinèse, est exécutée par la contraction d’un anneau contractile d’actomyosine, nécessaire pour effectuer la séparation physique de la cellule en deux cellules filles. La première partie des travaux décrits dans cet ouvrage portent sur la caractérisation de la cytokinèse en utilisant, comme modèle in vivo, les cellules précurseur de la vulve (VPCs) du nématode C. elegans. Notre étude révèle que plusieurs aspects de l’anneau d’actomyosine s’ajustent en fonction de la taille de la cellule. Entre autres, la largeur de l’anneau contractile, juste avant sa constriction, s’ajuste en fonction de la longueur des VPCs. De plus, la rapidité avec laquelle l’anneau se contracte dépend de la circonférence de la cellule. Ces découvertes nous ont amené à nous demander comment la cellule régule sa taille? Les cellules en prolifération maintiennent leur taille en homéostasie en équilibrant leur taux de croissance et de division cellulaire. Afin d’interroger les gènes impliqués dans le maintien de la taille cellulaire du mammifère, nous avons utilisé la technologie CRISPR/Cas9, afin d’éliminer par délétion tous les gènes humains, à raison d’un par cellule, pour identifier ceux qui causent une augmentation ou une diminution de la taille cellulaire. Cette étude nous a permis d’identifier plusieurs gènes déjà connus régulant la croissance cellulaire. De plus, nous avons identifié un groupe de gènes, incluant TLE4 un corépresseur de la transcription que nous avons caractérisé, n’ayant jamais été associé avec une fonction de contrôle de la taille cellulaire chez les mammifères. En somme, nos travaux ont contribué à l’approfondissement des connaissances sur la division cellulaire, plus précisément la cytokinèse, et des gènes impliqués dans le maintien de la taille cellulaire. Une meilleure connaissance du fonctionnement de ces deux évènements cellulaires est essentielle puisque leur dérégulation peut entrainer plusieurs pathologies, incluant le cancer. / Cells are the fundamental building blocks of life. The human body contains over twenty trillion cells that make up the different tissues and organs of our bodies. Cells within organs are of specific sizes to perform their specialized functions. In most cases, these cells must divide to proliferate and replenish the population of cells essential for proper organism function. The final stage of cellular division, termed cytokinesis, entails the assembly and constriction of a contractile ring that drives the dramatic cell shape changes required to physically partition the cell into two daughter cells. The first part of the work presented in this thesis addresses the characterization of cytokinesis in the epithelial vulval precursor cells (VPCs) of the nematode worm C. elegans. This study principally revealed that several aspects of cytokinesis scale with cell size. For instance, I observed that the breadth of the actomyosin ring scaled with VPC length. In addition, the speed of contractile ring constriction scaled with the circumference of VPCs. These scaling events raised the more general question as to how cells regulate their size. Proliferating cells attain cell size homeostasis by balancing cell growth and cell division. In order to define the molecular regulators of size in human cells a genome-wide approach was taken. Recently developed CRISPR/Cas9 technology was used to perform the first pooled knockout screens for human cell size regulators in the NALM-6 pre-B lymphocytic cell line. These screens revealed many genes that affect the size of NALM-6 cells, a number of which were previously known to be involved in growth regulation. In addition, these screens revealed the identity of many genes with no previously established functions associated with cell size regulation. Amongst the previously unknown regulators, I characterized the function of a co-repressor of transcription, TLE4, which I showed functions as a regulator of the B-cell lineage. This work contributes to the knowledge of the mechanics of cytokinesis in C. elegans epithelial cells and of the genes that coordinate cell size in humans. These results provide insights into cell growth and division in normal cells and how these processes may be perturbed in cancer and other diseases.

Le diabète et/ou l’obésité sont associés à la stéatose hépatique non-alcoolique (SHNA). Cette maladie du foie affecte environ un tiers de la population nord-américaine. Elle peut progresser vers un stade d’inflammation, de stress oxydatif et de fibrose appelé la stéatohépatite pouvant éventuellement entraîner le développement d’un cancer primitif du foie comme le carcinome hépatocellulaire (CHC). Cependant, les mécanismes reliant la diète, les maladies métaboliques et le développement du cancer sont complexes et peu connus. Le coactivateur transcriptionnel PGC-1α est un important régulateur du métabolisme énergétique de la cellule et la perte de ce dernier mène à un métabolisme nutritionnel inefficace, ainsi qu’à des défauts mitochondriaux importants. Fait intéressant, une réduction de PGC-1α est retrouvée chez les patients atteints de la maladie du foie gras non-alcoolique (SHNA) et du carcinome hépatocellulaire (HCC). Nous avons précédemment démontré qu’une réduction de PGC- 1α dans le foie murin en combinaison avec une diète obésogène peut provoquer l’apparition de la stéatohépatite. Cependant, le rôle causal de PGC-1α dans le cancer du foie associé à la diète demeure inconnu. Ensuite, un variant génétique de PGC-1α (SNP rs8192678) modifie un résidu glycine en sérine à la position 482 (PGC-1α G482S) chez l’humain et mène à une perte de stabilité protéique dans des cellules hépatiques humaines. Ce polymorphisme est associé au développement de maladies métaboliques, mais son impact sur le cancer demeure inconnu. Enfin, le gène de PGC-1α (PPARGC1A) est régulé par deux promoteurs (proximal et alternatif) donnant naissance à différents isoformes (PGC-1α1-4) de fonctions inconnues. L’action indépendante de ces variants pourrait fournir des indices quant au paradoxe entourant les recherches sur PGC-1α. Nous posons l’hypothèse principale que la perte d’expression de PGC-1α dans le foie favorise le développement du cancer hépatique en réponse à une diète riche en gras/fructose et à l’agent carcinogène diéthylnitrosamine. Dans cette thèse, nous montrons que la perte de PGC-1α favorise le développement du cancer du foie dans un modèle murin combinant une diète obésogène et un carcinogène hépatique. En effet, PGC-1α est nécessaire au maintien de l’expression du marqueur épithélial E-cadhérine et à la réponse cellulaire (apoptose, yH2AX) face aux dommages hépatiques. Nous montrons également que le variant G481 stabilise PGC-1α au niveau protéique et a un effet protecteur contre le cancer du foie chez la souris. Enfin, à l’aide d’expériences in vivo et in vitro nous montrons que la forme canonique PGC-1α1 et le variant PGC-1α4 exercent des rôles distincts sur la mort des cellules hépatiques en réponse à l’inflammation. En conclusion, cette thèse apporte de nouvelles connaissances sur les fonctions de PGC-1α au sein des complications hépatiques associées aux maladies métaboliques et inflammatoires. / Diabetes and obesity are associated to nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD). This pathology affects approximately 30% of the population in North America. It ranges from simple steatosis to a more severe necro-inflammatory form called nonalcoholic steatohepatitis (NASH) that can ultimately lead to cirrhosis and primary liver cancer, such as hepatocellular carcinoma (HCC). However, the relationship between diet, metabolic disorders, and cancer development is poorly understood. PGC-1α is a transcriptional coactivator that regulates cellular energy metabolism. Loss of PGC-1α can lead to inefficient nutrient metabolism and severe mitochondrial defects. Interestingly, patients with NAFLD/NASH and HCC exhibit reduced levels of hepatic PGC-1α. We have previously shown that low hepatic PGC-1α combined with an obesogenic diet leads to hallmarks of NASH in mice. However, whether low hepatic PGC-1α reflects a cause or a consequence of liver cancer remains to be determined. Furthermore, a single nucleotide polymorphism within the PPARGC1A coding sequence (SNP rs8192678) leads to a switch between glycine to serine residue at position 482 (PGC-1α G482S) in humans and is associated with reduced protein stability in human liver cells. This SNP is associated with metabolic disorders, but its impact on liver cancer remains un- known. Lastly, the PGC-1α gene (PPARGC1A) is regulated by two promoters (proximal and alternative) that give rise to different isoforms (PGC-1α1-4) of unknown functions. Independent actions of these isoforms could provide a plausible explanation for the paradox observed in previous studies covering the role of PGC-1α. We proposed the general hypothesis that loss of hepatic PGC-1α promotes diet-associated liver cancer development in mice through increased susceptibility to hepatotoxicity. In this thesis, we show that loss of hepatic PGC-1α promotes diet-associated liver cancer in mice. Indeed, PGC-1α is essential to maintain E-cadherin expression and liver cell response (apoptosis, yH2AX) to damage. We also show that G481 variant stabilizes hepatic PGC-1α protein and protects against liver cancer development in mice. Finally, using in vivo and in vitro experiments we show that canonical PGC-1α1 and the PGC-1α4 variant differentially regulate liver cell apoptosis in response to inflammatory signaling. In conclusion, this thesis sheds new light on the role of PGC-1α in liver complications associated with metabolic disorders and inflammation.

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Les fonctions endocriniennes des os sont médiées par au moins deux hormones, l’ostéocalcine et le facteur de croissance fibroblastique 23 « Fibroblast growth factor 23 » (FGF23), ces derniers sont secrétés par les cellules osseuses, les ostéoblastes et les ostéocytes. L’ostéocalcine est produite par les ostéoblastes et régule le métabolisme du glucose et énergétique. Elle améliore ainsi la tolérance au glucose et la sensibilité à l’insuline. Également, elle favorise la sécrétion d’insuline et la prolifération des cellules β, elle augmente la dépense énergétique et réduit l’accumulation de graisse. L'ostéocalcine est gamma-carboxylée au niveau de trois résidus d'acide glutamique (Glu), un processus qui inhibe sa fonction endocrinienne chez la souris et l'humain. Le pH acide de la lacune de résorption décarboxyle l'ostéocalcine et libère sa forme non carboxylée (ucOCN), la forme active de cette hormone. Nos connaissances sur la régulation des fonctions endocriniennes d’ostéocalcine sont encore limitées à sa gamma-carboxylation. Puisque cette hormone est secrétée par les ostéoblastes et les ostéocytes, des cellules endocriniennes non classique, nous avons émis l’hypothèse que l'ostéocalcine pourrait être soumise à d'autres modifications post-traductionnelles (PTMs) au niveau de la voie de sécrétion contrôlant ses fonctions endocriniennes. Dans la première partie de cette thèse, nous avons montré que le propeptide de l'ostéocalcine pouvait être clivé dans son extrémité C-terminale au niveau du motif de base « RLRR » par la pro-protéine convertase furine, un processus qui se produit indépendamment de la gamma-carboxylation de l'ostéocalcine. L’inactivation du gène codant pour la furine, spécifiquement dans les ostéoblastes et les ostéocytes chez la souris, abolit totalement le clivage de la pro-ostéocalcine et altère son activation et sa libération lors de la résorption osseuse. Par conséquent, ces souris sont caractérisées par un niveau bas d'ucOCN dans le sérum, ce qui entraîne une altération de la tolérance au glucose, une diminution de la sécrétion d'insuline et de la dépense énergétique ainsi qu’une augmentation de l'accumulation de graisses. De plus, ces souris ont une perte d'appétit indépendamment de l'ostéocalcine. La restriction de la nourriture pour les souris contrôles ou « pair feeding » rend le phénotype des souris déficientes en furine plus apparent. Il apparait à un plus jeune âge avec une résistance à l'insuline. Dans la deuxième partie de cette thèse, nous avons découvert que l'ostéocalcine de souris est O-glycosylée au niveau de la sérine 8, un processus qui se produit indépendamment de sa gamma-carboxylation et de son clivage. Cette modification, qui n'est pas présente chez l'ostéocalcine humaine, augmente la demi-vie de l'ostéocalcine de souris dans le plasma ex vivo et in vivo. Il est intéressant de noter que la tyrosine 12 dans l'ostéocalcine humaine correspond à la sérine 8 dans la séquence de la souris, tandis que la mutation Tyr12Ser est suffisante pour générer une ostéocalcine humaine O-glycosylée et lui conférer une demi-vie plus longue dans le plasma de la souris comparativement à la forme native. FGF23 est une hormone secrétée par les ostéoblastes et les ostéocytes. Elle régule la réabsorption de phosphate et la production de vitamine D dans le tubule proximal du rein. Sa fonction endocrine est inhibée par un clivage endoprotéolytique qui libère ses fragments N- et C-terminaux. La mutation du motif « RHTR », un site de clivage consensus pour les proprotéines convertases PC(s), a été identifié chez les patients atteints du rachitisme hypophosphatémique génétiquement déterminés ou « Autosomal dominant hypophosphatemic rickets » (ADHR). Ces patients se caractérisent par une augmentation du taux de FGF23 intact, une hypophosphatémie et une ostéomalacie. Malgré l’importance de FGF23 dans plusieurs maladies, l’identité de l’enzyme responsable du clivage de FGF23 n’est pas encore connue, même si la furine et la proprotéine convertase subtilisine/kexine type 5 (PC5) peuvent cliver FGF23 in vitro. Dans la troisième partie de cette thèse, nous tentons de répondre à cette question en utilisant des souris déficientes en furine et/ou PC5 spécifiquement dans les ostéoblastes et les ostéocytes. Sous des conditions physiologiques, l’inactivation du gène de furine dans les ostéoblastes et les ostéocytes augmente le niveau du FGF23 intact par 25%. Malgré cette augmentation ces souris maintiennent une phosphatémie normale et elles ne montrent pas de signe d’ostéomalacie. On a aussi montré qu’une déficience en fer, une condition qui augmente la production de FGF23 au niveau de l’ARN messager et protéique, le FGF23 est totalement en forme intact dans les souris déficientes en furine, montrant que le clivage de FGF23 est totalement inhibé dans cette condition. En revanche, l’injection d’érythropoïétine ou d’interleukine 1-β, des conditions qui augmentent la production de FGF23, induit une augmentation significative du taux de FGF23 total dans le sérum des souris déficientes en furine et/ou PC5 dans les ostéoblastes et les ostéocytes, tandis que le niveau du FGF23 intact n’a pas augmenté de la même façon, suggérant que la FGF23 est correctement clivée chez ces souris. D’une façon intéressante et malgré les défauts développementaux et le retard dans la minéralisation osseuse observée dans les souris complètement déficientes en PC5, la suppression conditionnelle de PC5 dans les ostéoblastes et les ostéocytes chez la souris n'a entraîné aucun défaut osseux. Cependant, l’inactivation du gène codant pour la furine dans les ostéoblastes et les ostéocytes chez la souris a augmenté les paramètres osseux trabéculaires et a diminué l'épaisseur de l’os cortical. De plus, ces souris ont eu une diminution de la densité minérale et la rigidité des os reflétant une mauvaise qualité osseuse. En résumé, nous avons décrit pour la première fois que la furine est un régulateur multifonctionnel de la fonction des ostéoblastes et des ostéocytes in vivo. Elle régule le métabolisme du glucose en assurant le clivage de la pro-ostéocalcine, qui est nécessaire à la maturation et à la bio-activité de l'ostéocalcine, et en régulant l'appétit indépendamment de l'ostéocalcine. Ces résultats suggèrent la présence d'ostéokines supplémentaires régulant l'appétit et contrôlées par la furine. De plus, dans les ostéoblastes, la furine régule partiellement le clivage de FGF23 en assurant une phosphatémie normale, suggérant que la régulation de l'accumulation de masse osseuse par la furine est indépendante du FGF23. En outre, nous avons découvert que l'ostéocalcine de souris est soumise à l’O-glycosylation, une modification qui n'est pas conservée chez l'humain, ni chez d’autres espèces, et qui augmente la demi-vie de l'ostéocalcine de souris. La glycosylation artificielle confère à l'ostéocalcine humaine une demi-vie plus longue, offrant ainsi une approche permettant d'augmenter potentiellement la bio-activité de l'ostéocalcine humaine dans les futures applications thérapeutiques de l'ostéocalcine dans les maladies humaines. / Bone endocrine functions are mediated by at least two hormones, osteocalcin and fibroblast growth factor 23 (FGF23) which are secreted by the bone cells, osteoblasts and osteocytes. Osteocalcin is an osteoblast-derived hormone regulating glucose and energy metabolism. It improves glucose tolerance and insulin sensitivity, promotes insulin secretion and β-cell proliferation, increases energy expenditure and reduces fat accumulation. Osteocalcin is gamma-carboxylated on three of its glutamic acid residues (Glu), a process that inhibits its endocrine function in mice and humans. It is the acidic pH in the resorption lacuna which decarboxylates osteocalcin releasing the uncarboxylated osteocalcin (ucOCN), the active form of this hormone. Our knowledge on osteocalcin regulation by post-translational modifications is limited to its gamma-carboxylation. Since osteocalcin is secreted by differentiated osteoblasts, a non-classical endocrine cell, we hypothesized that osteocalcin may be subjected to additional post translational modifications (PTMs) in the secretory pathway that regulates its endocrine functions. In the first part of the thesis we showed that osteocalcin’s putative pro-peptide is cleaved in its C-terminus at the basic motif «RLRR», by the proprotein convertase furin. This process occurs independently of osteocalcin gamma-carboxylation. Furin inactivation specifically in osteoblasts in mice totally abolishes osteocalcin processing and impairs its activation and release during bone resorption. Consequently, these mice have decreased serum level of ucOCN resulting in impaired glucose tolerance, reduced insulin secretion and energy expenditure, and increased fat accumulation. Moreover, these mice have a decrease in the appetite independently of osteocalcin. Pair feeding of control mice resulted in more apparent phenotype in furin deficient mice, as it appears at younger age alongside with insulin resistance. In the second part of this thesis, we discovered that mouse osteocalcin is O-glycosylated on serine 8, a process that occurs independently of its gamma-carboxylation and processing. This modification is not conserved in human or any other species and it increases mouse osteocalcin half-life in plasma ex vivo and in vivo. Interestingly, tyrosine 12 in human osteocalcin corresponds to the serine 8 in the mouse sequence. Tyr12Ser mutation was sufficient to O-glycosylate human osteocalcin and to confer this hormone a longer half-life in mouse plasma compared to the native form. FGF23 is a hormone secreted by osteoblasts and osteocytes which regulates phosphate reabsorption and vitamin D production in the kidney proximal tubule. Its endocrine function is inhibited by endoproteolytic cleavage which releases its N-terminal and C-terminal fragments. Mutations in the «RHTR» motif, a consensus cleavage site for proprotein convertases (PCs), were found in patients with autosomal dominant hypophosphatemic rickets (ADHR). These patients are characterized by an increased intact FGF23 levels, hypophosphatemia and osteomalacia. Despite the importance of FGF23 in the pathology of multiple diseases, the identity of the enzyme(s) involved in FGF23 cleavage is yet unclear, even though furin and the proprotein convertase subtilisin/kexin type 5 (PC5) were shown to cleave FGF23 in vitro. In the third part of the thesis, we addressed this question using mice model deficient in furin and/or PC5 in osteoblasts and osteocytes in mice. Under physiological conditions, furin inactivation resulted in a 25% increase in intact FGF23; however, these mice maintained normal phosphate level and did not shown any sign of osteomalacia. We also showed that under iron restriction, a condition that induce FGF23 expression at the mRNA and protein level, FGF23 processing is totally impaired in furin deficient mice. However, the injection of erythropoietin or interleukin 1-β, two conditions that increase FGF23 production, induce FGF23 serum level while it is still properly processed in mice deficient in furin and/or PC5 in osteoblasts and osteocytes. Interestingly, despite the patterning defects observed in global inactivation of PC5, conditional inactivation of PC5 in osteoblasts and osteocytes in mice did not result in any bone defect. However, furin inactivation in osteoblasts and osteocytes in mice increases trabecular bone parameters and decreases cortical thickness. Moreover, these mice have decreased bone mineral density and bone strength reflecting a poor bone quality. In summary, we described for the first time that furin is a pleotropic regulator of osteoblast and osteocyte function in vivo. It regulates glucose and energy metabolism by mediating pro-osteocalcin processing which is required for osteocalcin maturation and bioactivity, and by regulating appetite independently of osteocalcin. These findings suggest the presence of additional osteokines controlling appetite and which are regulated by furin. Moreover, furin partially regulates FGF23 processing while maintaining normal phosphate homeostasis, suggesting that the regulation of bone mass accrual by furin occurs independently of FGF23. Additionally, we discovered that mouse osteocalcin is subjected to O-glycosylation, a species-specific modification that is not conserved in humans or any other species and increases mouse osteocalcin half-life. Artificial O-glycosylation confer human osteocalcin a longer half-life, thus providing an approach to increase human osteocalcin bioactivity in future therapeutic applications of osteocalcin in human diseases.

ITCH est une ligase de l’ubiquitine impliquée dans différents processus cellulaires. Elle contient une région riche en prolines (PRR, proline rich region) qui lui permet de lier le domaine SH3 (Src homology 3) d’Endophiline et d’autres protéines à domaine SH3. Plusieurs de ces protéines sont impliquées dans l’endocytose clathrine-dépendante de récepteurs tel le récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR, epidermal growth factor receptor). Après activation, l’EGFR est internalisé dans des vésicules enrobées de Clathrine et un complexe protéique formé par CBL, CIN85 et Endophiline participe à cet évènement. ITCH lie l’ubiquitine à CBL et à Endophiline pour vraisemblablement modifier leurs fonctions, ce qui suggère un lien direct entre cette ligase et l’endocytose de l’EGFR. Afin de déterminer le rôle d’ITCH dans ce processus, plusieurs expériences furent réalisées. Premièrement, la modalité de liaison entre la ligase ITCH et les protéines à domaine SH3 a été étudiée en détails. Une série de mutations dans la région PRR d’ITCH nous a aidé à identifier trois résidus arginines (R252, R255, R258) nécessaires pour son interaction avec Endophiline et d’autres protéines à domaine SH3. Deuxièmement, des lignées cellulaires HeLa et Cos7 furent modifiées génétiquement par CRISPR pour empêcher l’expression d’ITCH. Ces lignées cellulaires knockout furent caractérisées et utilisées dans un essai d’endocytose de l’EGFR, puis examinées par spectrométrie de masse. L’internalisation d’EGFR fut suivie en microscopie confocale à l’aide d’un ligand EGF fluorescent -/- dans les deux types de cellules ITCH . En absence d’ITCH, nous observons une diminution significative du niveau d’EGF internalisé par rapport aux cellules parentales. La surexpression d’ITCH dans les cellules ITCH-/- rétablit l’internalisation normale de l’EGF, confirmant l’implication d’ITCH dans le processus, mais la surexpression des formes mutantes de ITCH incapable de lier Endophiline ou catalytiquement inactive ne rétablit pas l’internalisation de l’EGF. Ces résultats nous permettent de conclure que l’interaction ITCH-Endophiline et la fonction catalytique de ITCH sont nécessaires pour l’endocytose de l’EGFR. Ensemble, ces deux fonctions de ITCH régulent le trafic endocytique de l’EGFR. De plus, les cellules ITCH-/- montrent un délai de dégradation de l’EGFR phosphorylé ainsi qu’une prolongation du temps d’activation de la kinase MAPK (mitogen-activated protein kinase). Finalement, pour explorer l’influence de l’absence d’ITCH sur ses substrats et partenaires moléculaires nous avons effectué une comparaison protéomique des partenaires d’interaction et des protéines ubiquitylées à partir des lysats cellulaires ITCH-/- et WT. Les résultats ont montré que le manque d’expression de la ligase ITCH altère la présence peptidique des protéines liées à la signalisation de l’EGFR, à la voie protéolytique dépendante de l'ubiquitine et à l’adhésion cellulaire. Cette étude révèle pour une première fois que la protéine ITCH est requise pour l’endocytose dépendante de la Clathrine de l’EGFR. / ITCH is a ubiquitin ligase involved in various cellular processes including endocytosis. It contains a proline rich region (PRR) which allows it to bind the SH3 domain of endophilin and other SH3 domain-containing proteins involved in Clathrin-mediated endocytosis (CME). CME is an important regulatory mechanism for growth factor receptor activity. The epidermal growth factor receptor (EGFR) is actively internalized in Clathrin-coated vesicles after activation. This endocytosis is facilitated by a protein complex formed by CBL, CIN85 and Endophilin. ITCH is known to ubiquitinate both CBL and endophilin, providing a potential functional link between the ligase and receptor internalization. In order to determine the role of ITCH in this process, several experiments were performed. First, the mapping of molecular binding sites between the ligase ITCH and SH3 domain proteins has been studied in detail. A series of mutations in the PRR region of ITCH helped us identify three arginine residues (R252, R255, R258) as necessary for its interaction with endophilin and all the tested SH3-domain containing proteins. Secondly, HeLa and Cos7 cell lines were genetically modified by CRISPR to prevent ITCH expression. These knockout cell lines were characterized for use in an EGFR endocytosis assay and for mass spectrometry analysis. EGFR internalization was monitored by confocal microscopy using fluorescent EGF ligand in both ITCH-/- cell types. In the absence of ITCH, a significant decrease in the level of internalized EGF compared to parental cells is visible. Overexpression of WT ITCH in the knockout cells restores normal internalization of EGF, confirming the involvement of ITCH in the process. Overexpression of Endophilin-binding defective or catalytically inactive ITCH does not restore the internalization of EGF in ITCH-/- cells. These results show that the ITCH- Endophilin interaction as well as the catalytic function of ITCH are necessary for the endocytosis of EGFR. In addition, ITCH-/- cells show a delay in the degradation of phosphorylated EGFR accompanied with an extended period of mitogen-activated protein kinase (MAPK) activation. In a last set of experiments, we explored the influence of the absence of ITCH on its substrates and molecular partners. We performed a proteomic comparison of ITCH-binding partners and potential substrates using the ITCH-/- and WT cell lysates. The results showed that the lack of ITCH expression alters the peptide count of proteins mainly related to EGFR signaling, theubiquitin-dependent proteolytic pathway and cell adhesion. This study shows for the first time that the protein ITCH is required for the clathrin-dependent endocytosis of EGFR.

La maladie d'Alzheimer (MA) est la démence la plus importante dans le monde développé. Cette maladie neurodégénérative rend de plus en plus difficile la capacité d'accomplir les tâches quotidiennes de routine, elle peut également faire oublier les mots aux patients, les désorienter dans le temps et l'espace, et à des stades avancés entraîne une perte de mémoire. Malheureusement, la MA est considérée comme le prochain grand défi pour la santé publique de la plupart des pays, le nombre de cas devant doubler au cours des 20 prochaines années en raison du vieillissement de la population. Cette augmentation du nombre de patients s'accompagne d'une augmentation des besoins de financement et de personnel de santé afin de répondre aux demandes et aux besoins de ces patients. La MA peut être divisée en deux entités distinctes: une maladie héréditaire bien définie et bien comprise qui représente jusqu'à 5% de tous les cas de MA appelés maladie d'Alzheimer familiale, et une maladie moins définie appelée maladie d'Alzheimer sporadique. Le facteur de risque le plus défini pour la MA est l'âge, mais récemment, il a été démontré que le cerveau des patients atteints de MA avait un niveau réduit de BMI1 et que la suppression de BMI1 dans les neurones humains ou chez la souris déclenche les caractéristiques de cette maladie. Alors que BMI1 était connu pour être important dans les stades de développement, nous rapportons ici qu'il est crucial dans les cellules adultes pour maintenir la compaction de la chromatine et l’inhibition de la transcription des séquences répétitives. De plus, ces deux fonctions de BMI1 empêchent l'ADN d'acquérir une conformation G4. Cette conformation peut entraîner une instabilité du génome, une augmentation des dommages à l'ADN et une altération de l'expression des gènes, mais surtout, nous avons montré que dans les neurones corticaux, les structures G4 peuvent influencer l'épissage alternatif de divers gènes, notamment APP. Ces résultats apportent un éclairage nouveau sur l'origine de la maladie et l'importance de BMI1 et de la structure secondaire de l'ADN dans le cadre de la MA. / Alzheimer's disease is the most prominent dementia in the developed world. This neurodegenerative disease renders the ability to do the routine daily tasks more and more difficult; it can also cause patients to forget words, be disoriented in time and space, leading to a memory loss. Unfortunately, AD is considered the next big challenge for most country’s public health, with the number of cases thought to be doubling within the next 20 years due to the aging of the population. This increase in the number of patients comes with an increase in the need for funding and for healthcare personnel to meet the demands and the requirements of these patients. AD is divided into two separate entities: a well-defined and understood hereditary disease that makes up to 5% of all AD cases called familial Alzheimer disease, and a less defined one called sporadic Alzheimer disease. sAD most defined risk factor is age, but recently it was shown that brains of sAD patients had a reduced level of BMI1 and that the knockdown of BMI1 in human neurons or mice triggers the hallmarks of this disease. While BMI1 was known to be important in the developmental stages, we report here that it is crucial in adult cells to maintain the compaction of the chromatin and the silencing of the repetitive sequences. Furthermore, these two functions of BMI1 prevent the DNA from acquiring a G4 conformation. This conformation can lead to genome instability, increased DNA damage, and altered gene expression. However, most importantly, we showed that in cortical neurons, G4 structures could influence the alternative splicing of various genes, notably APP. These results shed new light on the origin of AD, and the importance of BMI1 and the secondary structure of the DNA in its context.

Les télomères sont raccourcis à chaque cycle de réplication de l’ADN à cause du problème de réplication des extrémités. Leur longueur dicte la capacité proliférative des cellules eucaryotes. Des télomères trop courts, aillant atteints la limite de Hayflick, feront entrer les cellules en sénescence réplicative. Pourtant dans les cellules progénitrices ainsi que 90% des cellules cancéreuses la longueur des télomères est maintenue par un complexe ribonucléoprotéique, la télomérase. L’assemblage de ce complexe ainsi que son recrutement aux télomères son des processus dynamiques sous le contrôle d’une régulation fine. Toutefois, comment cette régulation à un impact sur la dynamique de la télomérase dans le noyau n’est toujours pas complétement compris. Dans ce projet nous avons développé une nouvelle méthode se basant sur le système MS2 permettant d’observer pour la première des particules uniques d’ARN de télomérase (hTR) par microscopie à fluorescence sur cellules cancéreuse humaines vivantes. Le suivi en temps réel de ces particules aux télomères a permis de révéler que la télomérase scanne activement les télomères via des interactions courtes avec la protéine télomérique TPP1. Des interactions plus stables nécessaires à l’allongement des télomères peuvent être formées grâce à l’appariement entre hTR et l’ADN simple brin du télomère sous contrôle du domaine OB-fold de la protéine télomérique POT1. Le suivi de ces particules au cours du cycle cellulaire a révélé que ces interactions ne sont pas restreintes à la phase S, la phase d’élongation des télomères. La mesure de la dynamique de hTR dans les corps de Cajal (CBs) couplé à des expériences de photo-activation ont pu montrer que hTERT joue un rôle dans la sortie de hTR des CBs. Enfin des mesures d’intensités de fluorescence de hTR aux télomères montrent qu’une seule particule est recruté sur un télomère en phase S. / Telomeres are shortened at each DNA replication cycle, due to the end replication problem. Their length dictates the proliferative capacity of eukaryotic cells. Too short telomeres, reaching the Hayflick limit, will lead the cells to replicative senescence. However, in stem cells and 90% of cancer cells telomere length is maintained by a ribonucleoproteic complex named telomerase. The assembly of this complex and its recruitment to telomeres are process under a fine regulation. Yet, how this regulation impacts the nuclear dynamics of telomerase is not fully understood. In this project, we developed a new method based on the MS2 system to image for the first time telomerase RNA (hTR) particles in living human cancer cells by fluorescence microscopy. The real time tracking of these particles at telomeres revealed that telomerase actively scan all telomeres by short interactions with the TPP1 shelterin protein. Long stable interaction needed for telomere elongation can be made by the pairing of hTR template and single stranded telomeric DNA under the control of the OB-fold domains of the shelterin protein POT1. By tracking telomerase particle during the cell cycle, we revealed that telomerase recruitment to telomeres is not restricted to S phase, when telomeres are elongated. By measuring the dynamics of hTR in Cajal bodies (CBs) with photo-activation and photo-bleaching technics we showed that hTERT play a role in the hTR exit from CBS. Finally, fluorescence intensity measures of hTR at telomeres showed the recruitment of only one particle on a telomere.

The epidermis is the first barrier of protection of living organisms against external attacks. It is constantly renewed throughout life, through a process called "homeostasis", which ensures that every cell lost on its surface is replaced by new ones. Recent studies have shown that this balance is ensured by a hierarchy of stem cells (SC) and progenitors that perform 3 types of cell divisions, each having a fixed probability. Although the epidermis has been extensively studied during homeostasis, little is known about the cellular dynamics taking place when the epidermis must expand its surface. Are these probabilities of division immutable or can they change? In this project, we focused on two conditions of epidermal expansion: postnatal growth and wound healing. Using the mouse tail epidermis as a model, we show that the re-epithelialization after a wound is achieved via the formation of two transient compartments that are spatially and molecularly distinct :a leading edge and a proliferative hub. We show that the leading edge cells have a specific transcriptional signature that is independent of their quiescent state and we propose new markers not previously described. Using the technique of "lineage tracing", coupled with clonal analysis and mathematical modeling, we highlight the proliferation dynamics of SCs and progenitors during healing. We show that different populations of cells residing in different compartments, the hair follicle infundibulum and the interfollicular epidermis, acquire a similar dynamics and re-activate their SC while the progenitors increase their rate of proliferation without changing their division probabilities. This similar proliferation dynamics in two compartments of the epidermis suggests that division probabilities are not dictated by the cell of origin. Interestingly, cell dynamics is different during postnatal growth. Using lineage tracing, clonal analysis and single-cell transcriptional analysis, we demonstrate that the post-natal epidermis is composed of a homogeneous population of equipotent progenitors which ensure a harmonious tissue growth through a constant imbalance towards self-renewing divisions and an ever decreasing proliferation rate. On the other hand, we show that basal cells in the adult epidermis display a greater molecular heterogeneity and that this heterogeneity is acquired progressively at the end of growth. Finally, by coupling in vivo measurements and in vitro micro-patterning experiments, we show that the orientation of cell division of equipotent progenitors is locally influenced by the alignment of the collagen fibers of the underlying dermis. These data suggest that SC specification occurs late in postnatal development and that proliferation dynamics are not immutable and could therefore be influenced by extrinsic factors. / L’épiderme est la première barrière de protection des organismes vivants contre des attaques extérieures. Il est constamment renouvelé au cours de la vie, via un processus appelé « homeostasie », qui assure que chaque cellule perdue à sa surface soit remplacée par de nouvelles. Des études récentes ont montré que cet équilibre était assuré par une hiérarchie de cellules souches (CS) et de progéniteurs qui réalisent 3 types de divisions cellulaires, chaque type de division ayant une probabilité fixe. Bien que l’épiderme ait été intensivement étudié durant l’homeostasie, peu de choses sont connues concernant la dynamique cellulaire prenant place lors de phénomènes où l’épiderme doit grandir. Ces probabilités de division sont-elles immuables ou peuvent-elles au contraire changer ?Dans ce projet, nous nous sommes intéressés à deux conditions d’expansion de l’épiderme :la croissance post-natale et la cicatrisation des plaies. En utilisant l’épiderme de la queue de souris comme modèle, nous montrons que la ré-épithélialisation d’une plaie est réalisée via la formation de deux compartiments cellulaires transitoires distincts spatialement et du point de vue moléculaire :un front de migration et un centre prolifératif. Nous montrons que les cellules du front de migration ont une signature transcriptionnelle spécifique qui est indépendante de leur état de quiescence et proposons de nouveaux marqueurs non décrits auparavant. En utilisant la technique du « lineage tracing », couplée à une analyse clonale et à de la modélisation mathématique, nous mettons en évidence la dynamique de prolifération des CS et des progéniteurs lors de la cicatrisation. Nous montrons que différentes populations de cellules résidant dans des compartiments différents, l’infundibulum du follicule pileux et l’épiderme interfolliculaire, acquièrent une dynamique similaire et ré-activent leur CS tandis que les progéniteurs augmentent leur taux de prolifération sans changer leur probabilité de division. Cette dynamique de prolifération similaire dans deux compartiments de l’épiderme suggère que les probabilités de divisions ne sont pas dictées par la cellule d’origine. De façon intéressante, la dynamique cellulaire est par contre différente durant la croissance post-natale. En utilisant le lineage tracing, l’analyse clonale et des analyses transcriptionnelles sur cellule unique, nous démontrons que l’épiderme post-natal est composé d’une population homogène de progéniteurs équipotents qui présentent un constant déséquilibre envers des divisions d’auto-renouvèlement et un taux de prolifération décroissant, assurant une croissance harmonieuse de l’épiderme. En revanche, les cellules basales de l’épiderme adulte montrent une plus grande hétérogénéité moléculaire et cet hétérogénéité est acquise progressivement à la fin de la croissance. Enfin, en couplant des mesures in vivo et des expériences de micro-patterning in vitro, nous montrons que l’orientation de la division cellulaire des progéniteurs équipotents est localement influencée par l’alignement des fibres de collagène du derme sous-jacent. Ces données suggèrent que la spécification des CS survient tardivement au cours du développement post-natal et que la dynamique de prolifération n’est pas immuable et pourraient donc être influencée par des facteurs extrinsèques. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Pharmacie) / info:eu-repo/semantics/nonPublished