A bioengenharia de tecidos baseia-se no uso de moléculas bioativas, células-tronco e biomateriais para reparação de tecidos e/ou órgãos. Biomateriais podem ser classificados de acordo com sua origem em sintéticos ou biológicos. Biomateriais biológicos podem ser produzidos por decelularização, que visa a remoção de células da matriz extracelular (MEC), a qual deve manter sua integridade química e física. Placentas são órgãos de grande interesse na bioengenharia de tecidos visto que são descartadas após o parto e possuem grande volume de matriz extracelular. Métodos de decelularização podem ser classificados em químicos, físicos e enzimáticos. Todos conhecidamente causam alterações na MEC, sendo que a associação deles é comumente utilizada. Este trabalho comparou diferentes protocolos e estabeleceu um método mais favorável para a decelularização de placentas caninas, visando a produção de um biomaterial para futuras aplicações clínicas. Inicialmente ambas as porções - materna e fetal - das placentas foram submetidas à 10 protocolos, que avaliaram variáveis como concentração e tempo de incubação em detergentes, diferentes gradientes de temperatura e a influência da perfusão versus imersão das soluções, na MEC remanescente. Com base na transparência do tecido e na ausência de núcleo celular em cortes histológicos, dois protocolos foram selecionados (I e II). Além dos critérios já mencionados, ambos os protocolos foram comparados quanto à quantidade de DNA remanescente na MEC decelularizada e à permanência e distribuição de algumas das proteínas da matriz. O detergente SDS foi o mais eficaz na remoção de células, embora não tenha sido suficiente para promover uma decelularização tecidual completa. O congelamento prévio das placentas requereu um maior tempo de incubação posterior das amostras nos distintos detergentes. Ambos métodos de perfusão e imersão foram eficazes na remoção das células, embora grande concentração de proteínas do citoesqueleto tenham permanecido retidas na matriz. As amostras processadas pelo protocolo I (SDS 1%, 5mM EDTA + 50mM TRIS + 0,5% antibiótico, e Triton X-100 1%) apresentaram maior preservação da organização estrutural da MEC quando comparadas àquelas processadas de acordo com o protocolo II (que diferiu do anterior pela utilização de solução contendo 0,05% tripsina ao invés de 50mM TRIS), esse último método entretanto foi o que melhor removeu as células das placentas, conforme observado em lâminas histológicas e demonstrado pela menor concentração de DNA. Tanto as porções materna quanto fetal submetidas à ambos protocolos, mantiveram as proteínas laminina, fibronectina e colágeno tipo I. O colágeno tipo III foi observado somente na porção fetal. Conclui-se que o protocolo II foi o mais eficaz no processo de decelularização de placentas caninas tendo promovido a remoção do conteúdo celular e diminuição da concentração de DNA na MEC remanescente. No entanto é necessário otimizar o tempo de incubação das placentas em soluções enzimáticas visando maior conservação do arranjo da matriz decelularizada. A análise da capacidade da MEC decelularizada por tal método para ser utilizada em bioengenharia de tecidos ainda deve ser avaliada in vitro e in vivo / Tissue engineering is based on the use of bioactive molecules, stem cells and biomaterials to repair tissues and/organs. Biomaterials can be classified according to their origin in synthetic or biological. Biological biomaterials can be produced by decellularization wich aims at removing cells from the extracellular matrix (ECM), while maintain its chemical and physical integrity. Placentas are organs of great interest in tissue engineering due to the fact that they are discarded after birth and present large amount of ECM. Decellularization methods can be classified into chemical, physical and enzymatic. All of them are known to cause changes on ECM; thus their association has been commonly used. This study compared different protocols and established a more favorable method for decellularization of canine placentas, aiming at the production of a biomaterial for clinical applications. Initially both placental portions maternal and fetal were subjected to ten different protocols that evaluated variables such as concentration and time of incubation in detergents, different temperatures and the influence of perfusion versus immersion of solutions in the remaining ECM were analysed. The analysis of tissue transparence and absence of cellular nuclei in histological slices stained with HE, led to selection of two protocols (I and II). Besides the before mentioned criteria, both protocols were compared according to the amount of DNA that remained in the ECM decelullarized and the distribution of some ECM proteins. SDS was the most effective detergent for cell removal although it was not enough to complete decellularization. The freezing of placentas led to larger periods of samples incubation in different detergents. Both perfusion and immersion methods were capable of removing cells, although large concentration of cytoskeletal proteins remained entrapped in the matrix. Samples subjected to protocol I (1% SDS, 5 mM EDTA + 50 mM TRIS + 0,5% antibiotic, and 1% Triton X-100) better preserved the structural organization of ECM when compared to those subjected to protocol II (wich differed from the first by the use of 0,05% trypsin instead of 50mM TRIS). However, protocol II optimized cell removal as observed in histological slices and decreased the DNA concentration. Both maternal and fetal portions, subjected to both protocols, retained the laminin, fibronectin and collagen type I proteins. Collagen type III was identified only in fetal portion. In conclusion, protocol II was more effective in the decellularization of canine placentas than protocol I; it removed cellular content and decrease the concentration of remaining DNA in remaining ECM. The ability of ECM decellularized by such method to be applied in tissue engineering strategies still need to be evaluated in vitro and in vivo

Orientador: Rui Seabra Ferreira / Resumo: O lobo-guará (Chrysocyon brachyurus) é encontrado em grande parte do território da América do Sul, mas 90% de seus exemplares se distribui principalmente no cerrado brasileiro, sendo o maior canídeo sul americano, e como tal, demanda grandes áreas em suas atividades. Consequentemente, ele sofre severamente os efeitos da perda de habitat pelas ações antrópicas. Isto o faz estar na lista vermelha pela União Internacional de Conservação da Natureza, como espécie ameaçada de extinção da fauna brasileira. Tendo em vista a necessidade de desenvolver estratégias para a conservação do lobo-guará, o objetivo deste projeto foi caracterizar e padronizar o isolamento, o cultivo e a criopreservação de células tronco mesenquimais derivado da medula óssea do lobo-guará, além de utilizar o selante heterólogo de fibrina derivado de veneno de serpente como arcabouço tridimensional possibilitando procedimentos de terapia celular para a espécie. Também foi realizada uma revisão bibliográfica sobre a espécie, terapia celular e selantes de fibrina. Para tanto, realizou-se a coleta de medula óssea de animais provenientes de CETAS e zoológicos; o cultivo das células tronco mesenquimais (CTMs); a caracterização a partir do uso de marcadores de superfície (CDs) por citometria de fluxo; o potencial de diferenciação das CTMs em linhagens celulares osteogênica, adipogênica e condrogênica; a análise da viabilidade celular pré e após a criopreservação; e por fim a observação e avaliação do selante de fibri... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Mestre

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Consequentemente, ele sofre severamente os efeitos da perda de habitat pelas ações antrópicas. Isto o faz estar na lista vermelha pela União Internacional de Conservação da Natureza, como espécie ameaçada de extinção da fauna brasileira. Tendo em vista a necessidade de desenvolver estratégias para a conservação do lobo-guará, o objetivo deste projeto foi caracterizar e padronizar o isolamento, o cultivo e a criopreservação de células tronco mesenquimais derivado da medula óssea do lobo-guará, além de utilizar o selante heterólogo de fibrina derivado de veneno de serpente como arcabouço tridimensional possibilitando procedimentos de terapia celular para a espécie. Também foi realizada uma revisão bibliográfica sobre a espécie, terapia celular e selantes de fibrina. Para tanto, realizou-se a coleta de medula óssea de animais provenientes de CETAS e zoológicos; o cultivo das células tronco mesenquimais (CTMs); a caracterização a partir do uso de marcadores de superfície (CDs) por citometria de fluxo; o potencial de diferenciação das CTMs em linhagens celulares osteogênica, adipogênica e condrogênica; a análise da viabilidade celular pré e após a criopreservação; e por fim a observação e avaliação do selante de fibrina como arcabouço celular mostrando sua interação com as CTMs pela microscopia de varredura e viabilidade por microscopia confocal. A técnica empregada para coleta de medula óssea e posterior cultivo foi eficiente, sendo possível sua expansão até a sexta passagem. Os marcadores de superfície celular utilizados foram capazes de reconhecer as células possibilitando a sua caracterização por citometria de fluxo. As CTMs apresentaram potencial de diferenciação em linhagens osteogênica, adipogênica e condrogênica. O processo de criopreservação foi eficaz pois manteve alta a viabilidade celular após o seu descongelamento. A interação com o selante de fibrina foi adequada e manteve as células viáveis como verificado por microscopia confocal, demonstrando a estrutura tridimensional do selante por microscopia eletrônica de varredura. A terapia celular pode proporcionar para a espécie, um tratamento alternativo e eficaz na agilidade de processos regenerativos, minimizando o estresse em tratamentos convencionais de longa duração. O sucesso na criopreservação das CTMs torna possível a criação de um banco de células tronco que certamente ajudará na conservação da espécie. / Maned wolf (Chrysocyon brachyurus) is found in South America, but 90% of its specimens are distributed mainly in the Brazilian Cerrado, being the largest South American canid, and as such, it demands large areas. Consequently, maned wolf severely undergoes the effects of habitat loss by human actions. This makes it on the red list by the International Union for Conservation of Nature, as a threatened species of extinction of Brazilian fauna. Objective of this project was to characterize and standardize the isolation, cultivation and cryopreservation of mesenchymal stem cells derived from the bone marrow of maned wolf. In addition to using the fibrin sealant derived from snake venom as a three-dimensional scaffold enabling cellular therapy procedures for the species. A literature review on the species, cell therapy and fibrin sealants were also carried out. For that, the bone marrow was collected from CETAS and zoological animals; culture of mesenchymal stem cells (MSCs); characterization by surface markers (CDs) using flow cytometry; differentiation potential of MSCs into osteogenic, adipogenic and chondrogenic cell lines; analysis of cell viability before and after cryopreservation; and finally, observation and evaluation of the fibrin sealant as cellular scaffold showing its interaction with the MSCs by scanning microscopy and viability by confocal microscopy. The technique used for collection of bone marrow and subsequent culture was efficient, being possible to expand until the sixth passage. Cell surface markers used were able to recognize the cells allowing their characterization by flow cytometry. CTMs presented differentiation potential in osteogenic, adipogenic and chondrogenic linages. Cryopreservation process was effective because it maintained high cell viability after thawing. The interaction with the fibrin sealant was adequate and kept the cells viable as verified by confocal microscopy, demonstrating their three-dimensional structure of the sealant by scanning electron microscopy. Cell therapy may provide for the species an alternative and effective treatment in the agility of regenerative processes, minimizing stress in conventional long-term treatments. Success in cryopreservation of MSCs makes it possible to create a stem cell bank that will certainly help in its conservation.

Um dos grandes desafios para o tratamento de defeitos ósseos extensos na região bucomaxilofacial têm sido o desenvolvimento de um biomaterial substituto ósseo ao enxerto autógeno. No presente trabalho avaliou-se a formação óssea e a biodegrabilidade do osso desproteinizado bovino Bio-Oss® e do seu similar GenOx Inorg® e da cerâmica bifásica GenPhos® XP no processo de reparo de defeitos ósseos cranianos em coelhos, comparativamente ao osso autógeno (controle positivo) e coágulo sanguíneo (controle negativo). Foram realizados cirurgicamente defeitos bilaterais de 8-mm de diâmetro nos ossos parietais de 39 coelhos. A seguir os defeitos foram preenchidos aleatoriamente com 0,1cm3 de material ou coágulo conforme cada grupo de tratamento. Após os períodos de 4, 8 e 24 semanas os crânios foram coletados, analisados no microtomógrafo e processados histologicamente. O percentual de volume do defeito ocupado pelo material e osso neoformado foi avaliado pela microtomografia e histomorfometria, enquanto que, para a medula óssea, tegumento e tecido conjuntivo, apenas pela análise histomorfométrica. Os resultados quantitativos obtidos foram comparados estatisticamente pela ANOVA a dois critérios (período e tratamento) e teste de Tukey com p<0,05. A intensidade da associação linear dos dados microtomográficos e histomorfométricos avaliada pelo coeficiente de correlação de Pearson, mostraram correlação moderada a forte. Nos períodos iniciais de reparo (30 e 60 dias), os defeitos tratados com Bio-Oss®, GenOx® Inorg e GenPhos® XP apresentaram manutenção do volume do material enxertado (Vvi médio de 34% ) e formação óssea menor e mais imatura em relação grupo autógeno (Vvi = 22% vs. 32% no grupo autógeno). No período mais tardio (180 dias) a quantidade de formação óssea foi estatisticamente similar nos grupos Bio-Oss® (Vvi = 27%), GenOx® Inorg (Vvi = 26%) e GenPhos® XP (Vvi = 20%) porém, o GenOx® Inorg promoveu a formação de um tecido ósseo mais organizado e com maior acúmulo de biomaterial+osso+medula óssea (Vvi = 67,9%) comparado ao GenPhos® XP (Vvi =58,9%) e Bio Oss (Vvi = 55,6%) mas, inferior ao do enxerto autógeno (Vvi = 78%). Os resultados aqui obtidos permitem concluir que o osso autógeno promove rápida formação e maturação óssea, porém não consegue promover o reestabelecimento completo da díploe removida cirurgicamente. Os materiais BioOss, GenOx® Inorg e GenPhos® XP são excelentes materiais osteocondutores levando a formação óssea em toda extensão do defeito, sendo o GenOx® Inorg o que apresenta menor grau de reabsorção e maior e melhor preenchimento do defeito. / One major challenge for treatment of critical size defects in maxillofacial region has been the development of a substitute biomaterial to the autogenous bone grafts. In present study we evaluated the bone formation and biodegradability of deproteinized bovine bone Bio-Oss® and GenOx® Inorg, and biphasic calcium phosphate GenPhos XP® during bone repair process in rabbits cranial defects compared to autogenous bone (positive control) and blood clot (negative control). In parietal bone of 39 rabbits were made bilateral 8-mm diameter defects, which were filled randomly with 0,1cm3 material or clot as each treatment group. After periods of 4, 8 and 24 weeks skulls of animals were collected, analyzed the MicroCT scanner and histologically processed. The percentage of defect volume occupied by biomaterial and new-formed bone were assessed by histomorphometry and microtomography, while the bone marrow, connective tissue and tegument only by first analysis. The quantitative data were compared by two-way ANOVA analysis (time and treatment) and Tukey\'s test at p <0.05. The intensity of the linear association of MicroCT and morphometric data evaluated by the Pearson correlation coefficient, showed moderate to strong correlation. In the early repair periods (30 and 60 days), the defects treated with Bio- Oss, GenOx® Inorg and GenPhos® XP showed maintenance of the graft material volume (average Vvi of 34%) and lower and more immature bone compared autograft group (Vvi = 22% vs. 32% in the autograft group). In the later period (180 days) the amount of bone formation was statistically similar to the groups Bio-Oss® (Vvi = 27 %), GenOx® Inorg (Vvi = 26%) and GenPhos® XP (Vvi = 20%) however, the bone formation in GenOx® Inorg was more organized and with greater accumulation of particles + bone tissue + bone marrow (Vvi = 67.9%), when compared to GenPhos® XP (Vvi = 58.9%) and Bio-Oss® (Vvi = 55.6%) but lower than the autograft (Vvi = 78%). It was concluded that the autogenous bone promotes rapid bone formation and maturation, but cannot promote the complete reestablishment of diploe surgically removed. The Bio-Oss®, GenOx® Inorg and GenPhos® XP are excellent osteoconductive materials leading to bone formation in the full extent of the defects, and the GenOx® Inorg showing less absorption promotes more and better defect filling.

A bioengenharia de tecidos baseia-se no uso de moléculas bioativas, células-tronco e biomateriais para reparação de tecidos e/ou órgãos. Biomateriais podem ser classificados de acordo com sua origem em sintéticos ou biológicos. Biomateriais biológicos podem ser produzidos por decelularização, que visa a remoção de células da matriz extracelular (MEC), a qual deve manter sua integridade química e física. Placentas são órgãos de grande interesse na bioengenharia de tecidos visto que são descartadas após o parto e possuem grande volume de matriz extracelular. Métodos de decelularização podem ser classificados em químicos, físicos e enzimáticos. Todos conhecidamente causam alterações na MEC, sendo que a associação deles é comumente utilizada. Este trabalho comparou diferentes protocolos e estabeleceu um método mais favorável para a decelularização de placentas caninas, visando a produção de um biomaterial para futuras aplicações clínicas. Inicialmente ambas as porções - materna e fetal - das placentas foram submetidas à 10 protocolos, que avaliaram variáveis como concentração e tempo de incubação em detergentes, diferentes gradientes de temperatura e a influência da perfusão versus imersão das soluções, na MEC remanescente. Com base na transparência do tecido e na ausência de núcleo celular em cortes histológicos, dois protocolos foram selecionados (I e II). Além dos critérios já mencionados, ambos os protocolos foram comparados quanto à quantidade de DNA remanescente na MEC decelularizada e à permanência e distribuição de algumas das proteínas da matriz. O detergente SDS foi o mais eficaz na remoção de células, embora não tenha sido suficiente para promover uma decelularização tecidual completa. O congelamento prévio das placentas requereu um maior tempo de incubação posterior das amostras nos distintos detergentes. Ambos métodos de perfusão e imersão foram eficazes na remoção das células, embora grande concentração de proteínas do citoesqueleto tenham permanecido retidas na matriz. As amostras processadas pelo protocolo I (SDS 1%, 5mM EDTA &#43; 50mM TRIS &#43; 0,5% antibiótico, e Triton X-100 1%) apresentaram maior preservação da organização estrutural da MEC quando comparadas àquelas processadas de acordo com o protocolo II (que diferiu do anterior pela utilização de solução contendo 0,05% tripsina ao invés de 50mM TRIS), esse último método entretanto foi o que melhor removeu as células das placentas, conforme observado em lâminas histológicas e demonstrado pela menor concentração de DNA. Tanto as porções materna quanto fetal submetidas à ambos protocolos, mantiveram as proteínas laminina, fibronectina e colágeno tipo I. O colágeno tipo III foi observado somente na porção fetal. Conclui-se que o protocolo II foi o mais eficaz no processo de decelularização de placentas caninas tendo promovido a remoção do conteúdo celular e diminuição da concentração de DNA na MEC remanescente. No entanto é necessário otimizar o tempo de incubação das placentas em soluções enzimáticas visando maior conservação do arranjo da matriz decelularizada. A análise da capacidade da MEC decelularizada por tal método para ser utilizada em bioengenharia de tecidos ainda deve ser avaliada in vitro e in vivo / Tissue engineering is based on the use of bioactive molecules, stem cells and biomaterials to repair tissues and/organs. Biomaterials can be classified according to their origin in synthetic or biological. Biological biomaterials can be produced by decellularization wich aims at removing cells from the extracellular matrix (ECM), while maintain its chemical and physical integrity. Placentas are organs of great interest in tissue engineering due to the fact that they are discarded after birth and present large amount of ECM. Decellularization methods can be classified into chemical, physical and enzymatic. All of them are known to cause changes on ECM; thus their association has been commonly used. This study compared different protocols and established a more favorable method for decellularization of canine placentas, aiming at the production of a biomaterial for clinical applications. Initially both placental portions maternal and fetal were subjected to ten different protocols that evaluated variables such as concentration and time of incubation in detergents, different temperatures and the influence of perfusion versus immersion of solutions in the remaining ECM were analysed. The analysis of tissue transparence and absence of cellular nuclei in histological slices stained with HE, led to selection of two protocols (I and II). Besides the before mentioned criteria, both protocols were compared according to the amount of DNA that remained in the ECM decelullarized and the distribution of some ECM proteins. SDS was the most effective detergent for cell removal although it was not enough to complete decellularization. The freezing of placentas led to larger periods of samples incubation in different detergents. Both perfusion and immersion methods were capable of removing cells, although large concentration of cytoskeletal proteins remained entrapped in the matrix. Samples subjected to protocol I (1% SDS, 5 mM EDTA &#43; 50 mM TRIS &#43; 0,5% antibiotic, and 1% Triton X-100) better preserved the structural organization of ECM when compared to those subjected to protocol II (wich differed from the first by the use of 0,05% trypsin instead of 50mM TRIS). However, protocol II optimized cell removal as observed in histological slices and decreased the DNA concentration. Both maternal and fetal portions, subjected to both protocols, retained the laminin, fibronectin and collagen type I proteins. Collagen type III was identified only in fetal portion. In conclusion, protocol II was more effective in the decellularization of canine placentas than protocol I; it removed cellular content and decrease the concentration of remaining DNA in remaining ECM. The ability of ECM decellularized by such method to be applied in tissue engineering strategies still need to be evaluated in vitro and in vivo

O objetivo deste trabalho foi produzir hidroxiapatita (HA) contendo diferentes tipos de própolis de origem brasileira e avaliar a possível atividade antimicrobiana dos materiais. Os extratos etanólicos de própolis (EEP) vermelha, verde e marrom foram obtidos em solução alcoólica 80%. EEP verde e vermelha (8 mg/mL e 20 mg/mL) foram incorporados ao material a 10% (m/v) via atomização (spray drying), obtendo-se HA-GP8, HA-GP20, HA-RP8 e HA-RP20. Os EEP e os materiais foram caracterizados quanto ao conteúdo de compostos fenólicos e flavonoides totais. A atividade antimicrobiana dos EEP foi avaliada por difusão em ágar, concentração inibitória mínima (CIM) e bactericida mínima (CBM) frente à Staphylococcus aureus (S. aureus), Staphylococcus epidermidis (S. epidermidis) e Escherichia coli (E. coli). Os pós de HA incorporados com própolis foram avaliados frente à S. aureus por contagem de colônias bacterianas em placa, CIM e CBM. A caracterização dos materiais foi realizada por difração de raios X (DRX), espectroscopia na região do infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) e microscopia eletrônica de varredura (MEV). A citotoxicidade foi determinada pelo cálculo da viabilidade celular, realizada pelo método de incorporação do vermelho neutro. Para os extratos, o conteúdo de fenólicos variou entre 278,3 e 325,6 mg EAG/g ES. EEP vermelha mostrou maior conteúdo de flavonoides (112,4 mg EQ/g ES) em relação aos outros EEP (48,4 e 52,3 mg EQ/g ES), apresentando maior atividade inibitória (CIM) frente à S. aureus e S. Epidermidis (12,5 &micro;g/mL), comparado ao EEP verde (100 e 200 &micro;g/mL) e marrom (200 &micro;g/mL). Para CBM, os EEP vermelha e verde foram mais efetivos (800 &micro;g/mL) comparado ao EEP marrom (1600 &micro;g/mL), frente às mesmas bactérias. Entretanto, não foi observada atividade frente à E coli. A caracterização dos pós incorporados ou não com própolis apresentou estrutura cristalina e morfologia aparentemente esférica, indicando diminuição no grau de aglomeração com a adição de própolis. FTIR indicou a presença de grupos funcionais característicos para HA e própolis. Os materiais apresentaram alta liberação de fenólicos (228,3 a 327,6 mg EAG/g ES) e menores quantidades de flavonoides (14,0 a 35,8 mg EQ/g ES), sendo as maiores quantidades de flavonoides atribuída à HA contendo própolis vermelha. Foi verificado efeito bactericida a partir de 0,5 h (HA-RP20 e HA-GP20) e 1 h (HA-RP8 e HA-GP8) e menor atividade inibitória (CIM) para HA-GP20 e HA-GP8 (175,4 e 182,0 &micro;g/mL) e para HA-RP20 e HA-RP8 (51,7 e 66,8 &micro;g/mL), comparado aos EEP. Entretanto, observou-se maior atividade bactericida (CBM) para HA-GP20 e HA-GP8 (701,5 e 728,0 &micro;g/mL) e para HA-RP20 e HA-RP8 (206,5 e 267,0 &micro;g/mL), em relação aos EEP. O ensaio de citotoxicidade mostrou valores para IC50 (concentração que reflete 50% da viabilidade celular) de 387,1 e 84,8 &micro;g/mL para as amostras HA-GP8 e HA-RP8, respectivamente. Considerando os resultados obtidos neste trabalho, sugere-se que a HA incorporada com própolis (HA-GP8 e HA-RP8) pode ser utilizada como possível agente antimicrobiano, inibindo o crescimento de S. aureus, respeitando-se os valores máximos para IC50. Entretanto, não poderia ser utilizada como agente bactericida, uma vez que nestas condições os materiais apresentaram efeito citotóxico. / The aim of this study was to produce hydroxyapatite (HA) containing different types of propolis of Brazilian origin and to evaluate the possible antimicrobial activity materials. The ethanolic extracts of red, green and brown propolis (EEP) were obtained in alcoholic solution 80%. Green and red EEP (8 mg / mL and 20 mg / mL) were incorporated into the 10% (m/v) via atomization (spray drying), obtaining HA-GP8, HA-GP20, HA-RP8 and HA -RP20. EEP and materials were characterized regarding the content of phenolic compounds and total flavonoids. The antimicrobial activity of the EPS was evaluated by diffusion in agar, minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal (MBC) against Staphylococcus aureus (S. aureus), Staphylococcus epidermidis (S. epidermidis) and Escherichia coli (E. coli). The HA powders incorporated with propolis were evaluated against S. aureus by plate colony counting , CIM and CBM. Materials characterization was made by X-ray diffraction (XRD), Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR) and Scanning Electron Microscopy (SEM). The cytotoxicity of the materials was determined by cell viability calculation, which was made by the neutral red incorporation method. For extracts, phenolic content ranged from 278.3 to 325.6 mg EAG/g ES. The red EEP showed a higher flavonoid content (112.4 mg EQ/g ES) than the other EEP (48.4 and 52.3 mg EQ/g ES), showing a higher inhibitory activity (MIC) against S. aureus and S. epidermidis (12.5 &micro;g/mL) compared to green EEP (100 and 200 &micro;g/mL) and brown (200 &micro;g/mL). For CBM, red and green EEP were more effective (800 &micro;g/mL) compared to brown EEP (1600 &micro;g/mL) against the same bacteria. However, no activity was observed against E coli. The characterization of the powders incorporated or not with propolis presented crystalline structure and apparently spherical morphology, indicating a decrease in the degree of agglomeration with the addition of propolis. FTIR indicated the presence of functional groups characteristic for HA and propolis. The materials presented high phenolic release (228.3 to 327.6 mg EAG/g ES) and lower amounts of flavonoids (14.0 to 35.8 mg EQ/g ES), with the highest amounts of flavonoids attributed to HA containing red propolis. The bactericidal effect for all materials was observed within the interval of 0.5 (HA-RP20 and HA-GP20) to 1 hour (HA-RP8 and HA-GP8). The materials showed lower inhibitory activity (MIC) for HA-GP20 and HA-GP8 (175, 4 and 182.0 &micro;g/mL) and for HA-RP20 and HA-RP8 (51.7 and 66.8 &micro;g/mL) compared to EEP. However, higher bactericidal activity (MBC) was observed for HA-GP20 and HA-GP8 (701.5 and 728.0 &micro;g/mL) and for HA-RP20 and HA-RP8 (206.5 and 267.0 &micro;g/mL) when compared to the EEP. The cytotoxicity assay showed values for IC50 (concentration that reflects 50% of cellular viability) of 387.1 and 84.8 &micro;g/mL for HA-GP8 and HA-RP8 samples, respectively. Considering the results obtained in this work, it is suggested that HA incorporated with propolis (HA-GP8 and HA-RP8) can be used as a possible antimicrobial agent, inhibiting the growth of S. aureus, respecting the maximum values for IC50. However, it could not be used as a bactericidal agent, since under these conditions the materials had a cytotoxic effect.

Os princípios biológicos da regeneração óssea guiada (ROG) têm contribuído para o desenvolvimento de membranas que, em odontologia, são utilizadas em diversas situações como tratamentos com implantes dentários, aumento de rebordo alveolar e reparo de defeitos ósseos de origem traumática e patológica. Resultados de experimentos in vitro comparando a membrana obtida pela associação do polímero poli(fluoreto de vinilideno-trifluoretileno) e da cerâmica titanato de bário (P(VDFTrFE)/ BT) à membrana de politetrafluoretileno (PTFE) mostraram uma resposta favorável de osteoblastos, fibroblastos e queratinócitos à membrana de P(VDFTrFE)/ BT. O objetivo do presente estudo foi avaliar o efeito da membrana de P(VDFTrFE)/ BT sobre a formação óssea in vivo. Foram criados defeitos ósseos com 5 mm de diâmetro em calvárias de ratos machos Wistar (peso 200-250 g), distribuídos em três grupos com relação à utilização ou não de membranas nos defeitos ósseos: (1) membrana de P(VDF-TrFE)/BT; (2) membrana de PTFE; (3) nenhum tipo de membrana. Ao final de 4 e 8 semanas os animais foram eutanasiados e as amostras foram submetidas à: (1) análise por microtomografia computadorizada (micro-CT) para avaliar volume ósseo, superfície óssea, superfície óssea específica, número de trabéculas, separação trabecular e espessura trabecular, (2) análise histológica com base em cortes histológicos não descalcificados, (3) análise por reação em cadeia da polimerase em tempo real (PCR em tempo real) para avaliar a expressão gênica dos marcadores ósseos runt-related transcription factor 2 (RUNX2), fosfatase alcalina (ALP), sialoproteína óssea (BSP), osteocalcina (OC), osteoprotegerina (OPG) e receptor activator of nuclear factor-kappa B ligand (RANKL) e (4) análise da expressão de microRNAs (miRs) pela técnica de sequenciamento na plataforma Illumina. Os dados das análises morfométricas e da expressão gênica foram submetidos ao teste de Kruskal-Wallis, seguido pelo teste de Fischer quando apropriado, e para a análise da expressão de miRs foi utilizado o teste de Mann-Whitney para comparar a membrana de P(VDF-TrFE)/BT à de PTFE. Para todas as comparações o nível de significância adotado foi de 0,05. Os defeitos que não receberam a membrana tiveram uma formação óssea insignificante. Ambas as membranas favoreceram a formação óssea, sendo a superfície óssea maior sobre a membrana de P(VDF-TrFE)/BT comparada à de PTFE em 4 (p=0,01) e 8 (p=0,001) semanas e a separação trabecular maior sobre a membrana de PTFE comparada à de P(VDF-TrFE)/BT em 4 (p=0,05) e 8 (p=0,001) semanas. A expressão gênica de BSP (p=0,01), OC (p=0,001) e OPG (p=0,001) foi maior e de RANKL (p=0,001) foi menor sobre a membrana de P(VDFTrFE)/ BT comparada à de PTFE em 4 semanas. A expressão gênica de RUNX2 (p=0,001) e OC (p=0,05) foi maior e de ALP (p=0,05), RANKL (p=0,01) e OPG (p=0,001) foi menor sobre a membrana de P(VDF-TrFE)/BT comparada à de PTFE em 8 semanas. Quarenta e cinco e 13 miRs foram regulados positivamente (>2 vezes) em 4 semanas e 8 semanas, respectivamente, e 11 e 39 miRs foram regulados negativamente (>2 vezes) em 4 semanas e 8 semanas, respectivamente, pela membrana de P(VDF-TrFE)/BT comparada à de PTFE. Os resultados indicam que a membrana de P(VDF-TrFE)/BT favorece a formação óssea quando comparada à membrana de PTFE e, portanto, pode ser considerada um biomaterial promissor para ser utilizado em procedimentos de ROG. / Biological principles of guided bone regeneration (GBR) have contributed to development of membranes that, in dentistry, are used in several situations such as treatment with dental implants, alveolar bone augmentation and repair of traumatic and pathological bone defects. Results of in vitro experiments comparing membrane obtained by the combination of poly(vinylidene fluoride-trifluoroethylene) and barium titanate ceramics (P(VDF-TrFE)/BT) with polytetrafluoroethylene (PTFE) membrane showed a favorable response of osteoblasts, fibroblasts and keratinocytes to the P(VDF-TrFE)/BT membrane. The aim of this study was to evaluate the effect of P(VDFTrFE)/ BT membrane on in vivo bone formation. Bone defects with 5 mm in diameter were created in calvaria of male Wistar rats (weight 200-250 g), distributed into three groups regarding the use or not of membranes on defects: (1) P(VDF-TrFE)/BT membrane; (2) PTFE membrane; (3) no membrane. At the end of 4 and 8 weeks, the animals were euthanized and samples were subjected to: (1) computed microtomography analysis (micro-CT) to assess bone volume, bone surface, specific bone surface, trabecular number, trabecular thickness and trabecular separation; (2) histological analysis based on non-decalcified histological sections; (3) real time polymerase chain reaction (real time PCR) to evaluate gene expression of the bone markers runt-related transcription factor 2 (RUNX2), alkaline phosphatase (ALP), bone sialoprotein (BSP), osteocalcin (OC), osteoprotegerin (OPG) and receptor activator of nuclear factor-kappa B ligand (RANKL); (4) microRNAs (miRs) sequencing analysis at Illumina platform. Data from morphometric and gene expression analyses were submitted to the Kruskal-Wallis test followed by Fischer\'s test, when appropriate, and from miRs expression to the Mann-Whitney test to compare P(VDF-TrFE)/BT with PTFE membrane. For all comparisons, the significance level was 0.05. Defects without membrane exhibit a non significant bone formation. Both membranes favored osteogenesis with an increased bone formation on the P(VDF-TrFE)/BT membrane compared with PTFE at 4 (p=0.05) and 8 weeks (p=0.001). Trabecular separation was greater on PTFE membrane compared with the P(VDF-TrFE)/BT at 4 (p=0.05) and 8 weeks (p=0.001). At 4 weeks, the gene expression of BSP (p=0.01), OC (p=0.001) and OPG (p=0.001) were higher on P(VDF-TrFE)/BT membrane compared with PTFE, while RANKL (p=0.001) was lower. The gene expression of RUNX2 (p=0.001) and OC (p=0.05) were higher and ALP (p=0.05), RANKL (p=0.01) and OPG (p=0.001) were lower on the membrane of P(VDF- TrFE)/BT compared with PTFE at 8 weeks. Fortyfive and 13 miRs were up-regulated (> 2 fold) at 4 weeks and 8 weeks, respectively, and 11 and 39 miRs were negatively regulated (> 2 fold) at 4 weeks and 8 weeks, respectively, on the P(VDF-TrFE)/BT membrane compared with PTFE membrane. The results indicate that the P(VDF-TrFE)/BT membrane favors bone formation compared with PTFE membrane and, therefore, may be considered a promising biomaterial for using in GBR procedures.

As lesões em membros de grandes animais, com perda significativa de tecido ósseo é um desafio para os médicos veterinários. Isso por que muitas vezes somente técnicas de osteossíntese não são capazes de garantir resultados plenamente satisfatórios. Devido a isso, muitos pesquisadores vêm se dedicando ao desenvolvimento e estudo da biocompatibilidade de substitutos ósseos, entre eles os biomateriais, com propósito de auxiliar na reparação óssea. Os compósitos com constituintes naturais como quitosana, colágeno e hidroxipatita são uma opção, por apresentarem estruturas em sua composição semelhantes ao tecido ósseo.O objetivo deste estudo foi avaliar o comportamento biológico do ovino frente a implantação de compósito de quitosana, colágeno e hidroxiapatita após implante em osso III/IV metacarpianos. Seis ovinos fêmeas da raça Santa Inês foram submetidos à ostectomias unicorticais de sete milímetros de diâmetro na região próximal da superfície dorso-medial do III/IV metacarpianos. Em seguida, de forma randômica, foi implantado o compósito de quitosana, colágeno e hidroxiapatita em um membro torácico. No membro contralateral, foi reproduzida a mesma técnica, porém foi mantido como controle, não sendo preenchido com o compósito. Todos os animais foram submetidos à avaliação física, radiográfica, ultrassonográfica, termográfica e perfil hematológico e bioquímico previamente a cirurgia para avaliação dos padrões fisiológicos. No período pós operatório os animais foram avaliados por meio de exame físico diário, durante os 60 dias de observação, exame radiográfico, exame ultrassonográfico , exame termográfico nos momentos sete, 14, 21, 28, 35, 42, 49 e 56 dias de pós-operatório. Com 60 dias de pós-operatório, realizou-se a biópsia óssea com trefina de 3,55 mm de diâmetro na área de interface entre biomaterial-osso (membro com compósito) e osso-osso (membro controle), para realização de avaliações histológicas de material calcificado, através de microscopia de luz e eletrônica de varredura. Não foram observadas alterações no exame físico dos animais (frequência cardíaca, frequência respiratória ou temperatura retal), ou claudicação ao longo dos 60 dias, que pudessem estar relacionados ao procedimento cirúrgico ou a presença do implante. A avaliação termográfica demonstrou que as alterações de temperatura no membro com compósito e controle seguiram os mesmo padrões, retornando aos padrões fisiológicos ao fim do período de avaliação. As avaliações radiográficas e ultrassonográficas sugerem que o membro controle e com compósito se encontravam em fases semelhantes de preenchimento de falha. Na histomorfometria, através da microscopia de luz, observou-se maior porcentagem de tecido neoformado em membro controle, quando comparado ao membro com compósito.Além disso, foi possível observar tanto por microscopia de luz quanto por microscopia eletrônica de varredura, que o biomaterial apresentou comportamento osteocondutor e não foram observadas reações adversas ao implante, como formação de tecido cicatricial ou reações de corpo estranho. Com os resultados dessa pesquisa, é possível concluir que o compósito de quitosana, colágeno e hidroxipatita quando implantado em tecido ósseo ovino apresenta biocompatibilidade e perfil osteocondutor. / The lesions in limbs of large animals, with significant bone loss is a challenger for veterinarians. That\'s why frequentely only osteosynthesis are not able to fully guarantee satisfactory results. Because of this, many researchers have dedicated the projects to develop and study the biocompatibility of bone substitutes, including biomaterials, in order to assist bone repair. The composites with natural constituents such as chitosan, collagen and hydroyapatite may be an option, because they have similar structures with bone tissue. This study evaluated the biological behaviour of composite chitosan, collagen and hydroxyapatite following implantation in the ovine III / IV metacarpal bone. Six healthy female sheep Santa Inês were submitted to bilateral unicortical ostectomy (7 mm/ diameter) on the proximal aspect of the medial-dorsal surface of the III / IV metacarpal bone. One front limb was randomly selected for composite chitosan, collagen and hydroxyapatite implantation, while the contralateral limb was left untrated, not being filled. The animals were submited to daily physical examination during 60-day follow-up period. Radiographic, ultrasonographic and thermographic reassessment were performed on postoperative days seven, 14, 21, 28, 35, 42, 49 and 56. On postoperative day 60, the animals were reoperated and 3,55 mm biopsy fragment collected from the biomaterial bone or bone-new bone interface to histological evaluation by light and scanning electron microscopy. No changes in the physical examination (heart rate, respiratory rate or rectal temperature), or lameness over the 60 days, which could be related to the surgery or the presence of the implant were observed. Thermographic evaluation showed that temperature changed on the members with composite and control limb and they followed the same patterns, returning to physiological rate at the end of study. The radiographic and ultrasonographic evaluations have suggested that the control limb and limb with composite were in similar stages of bone healing. On the morphology by light microscopy, we observed a higher percentage of the new bone formation at the control limb when compared with the composite limb. However it was observed at the light and electron scanning microscopy, which showed osteoconductive biomaterial behavior and no adverse reactions to the implant, as scar tissue or foreign body reactions. With the results of this research, it can be concluded that the composite of chitosan, collagen and hidroxipatita when implanted in sheep bone tissue presents biocompatibility and osteoconductive characteristics.

Die vorliegende Arbeit hatte die Herstellung phasenreiner ß-Tricalciumphosphat (ß-TCP) - Implantate durch 3D-Pulverdruck zum Ziel. Variiert wurden hierbei die zum Druck verwendeten Pulver-Binder-Systeme. Als Verfestigungsmechanismen wurden hydraulisch abbindende Pulver-Binder-Systeme aus Tricalciumphosphat / Phosphorsäure bzw. Tetracalciumphosphat / Citronensäure untersucht, sowie der Zusatz quellfähiger Polymere zum Pulver, etwa Polyacrylsäure oder Hydroxypropylmethyl-Cellulose. Die gedruckten Strukturen wurden anschließend in Hinblick auf die zu erreichende Auflösung, die mechanischen Eigenschaften und die Zusammensetzung des Endproduktes verglichen. / Custom made ß-tricalcium phosphate (ß-TCP) bone substitutes with a macroporous architecture were fabricated in this study using 3D powder printing with three different preparation strategies and analysed with regard to their mechanical and physical properties. Samples were either obtained by (A) using hydroxypropylmethylcellulose (5wt%) modified TCP (Ca/P=1.5) powder with water as a binder, (B) by using phosphoric acid (10%) as a binder with a calcium phosphate powder of a Ca/P ratio of 1.7 and different binder/volume ratios or (C) by printing a tetracalcium phosphate (Ca/P=2.0) / dicalcium phosphate (Ca/P=1.0) / tricalcium phosphate powder mixture with citric acid (25wt%). The production process was followed by a heat treatment at 1100°C for all variations to produce phase pure ß-TCP (Ca/P=1.5). The results showed that ß-TCP samples fabricated according to method (B) showed the best printing resolution with a minimum macropore diameter of approximately 500µm and a compressive strength of up to 7.4 ± 0.7 MPa. Since the samples could be removed from the powder bed immediately after printing, this method would significantly decrease processing time for commercial fabrication.

In der vorliegenden Arbeit wurde die Eignung einer im 3D-Pulverdruckverfahren fabrizierten Trägerstruktur auf Calciumphosphat-Basis (Bruschit) als Zellkultur-Scaffold untersucht. Dazu wurden die Konstrukte in vitro mit osteoblastären Zellen besiedelt und deren Proliferations- und Differenzierungsverhalten über eine Kultivierungsdauer von 12 Tagen analysiert. Als Parameter dienten hierbei die Zellviabilität, die Aktivität des osteoblastären Enzyms Alkalische Phosphatase sowie die Mediumkonzentration von Osteocalcin. Des Weiteren wurde der pH-Wert des Kulturmediums sowie die Konzentrationen der freien Elektrolyte Calcium und Phosphat untersucht. Die Ergebnisse belegen eine gute Zytokompatibilität des Trägermaterials. Diese äußerte sich in einer progredienten Proliferation phänotypisch osteoblastärer Zellen (gemäß Rasterelektronenmikroskopie). Die Zellen exprimierten das ostoblastentypische Enzym Alkalische Phosphatase, welches als früher Differenzierungsmarker gilt. Die Analyse der Osteocalcinproduktion führte aufgrund methodischer Probleme nicht zu verwertbaren Ergebnissen. Die Untersuchung des verbrauchten Zellkulturmediums ergab keine unphysiologischen Schwankungen des pH-Wertes. Jedoch konnten signifikante Veränderungen der Konzentration an freien Calcium und Phosphat-Ionen im Medium festgestellt werden. Diese sind auf die Löslichkeit des Trägermaterials im physiologischen Milieu zurückzuführen. Zusammenfassend konnte mittels vorliegender in vitro Versuche eine geeignete Zytokompatibilität des untersuchten Materials herausgearbeitet werden. Für mögliche klinische Anwendungen zum Knochenersatz sind weitergehende Untersuchungen, insbesondere osteokonduktiver Eigenschaften im orthotopen Implantatlager im Rahmen von in vivo Untersuchungen, erforderlich. / This study investigated the cytocompatibility of low-temperature direct 3-D printed calcium phosphate scaffolds in vitro. The fabrication of the scaffolds was performed with a commercial 3-D powder printing system. Diluted phosphoric acid was printed into tricalcium phosphate powder, leading to the formation of dicalcium phosphate dihydrate (brushite). The biocompatibility was investigated using the osteoblastic cell line MC3T3-E1. Cell viability and the expression of alkaline phosphatase served as parameters. The culture medium was analyzed for pH value, concentration of free calcium and phosphate ions and osteocalcin. The brushite scaffolds showed a considerable increase of cell proliferation and viability. The activity of alkaline phosphatase showed a similar pattern. Optical and electron microscopy revealed an obvious cell growth on the surface of the brushite scaffolds. Analysis of the culture medium showed minor alterations of pH value within the physiological range. The content of osteocalcin of the culture medium was reduced by the printed scaffolds due to adsorption. We conclude that the powder printed brushite matrices have a suitable biocompatibility for their use as cell culture scaffolds. The material enables osteoblastic cells in vitro to proliferate and differentiate due to the expression of typical osteoblastic markers.