Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2016 / Made available in DSpace on 2016-09-20T04:11:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 339435.pdf: 3716963 bytes, checksum: 8e99ae2ff4c70f00fc25869e89a97b06 (MD5) Previous issue date: 2016 / O paraquat (PQ) é um herbicida amplamente utilizado no Brasil, apesar de ser descrito como indutor da doença de Parkinson (DP) em modelo animal e em estudos epidemiológicos. A flora brasileira apresenta grande diversidade de plantas medicinais e inúmeros extratos de plantas são utilizados na medicina popular, demonstrando a relevância de investigar o potencial terapêutico de compostos naturais. Neste contexto, já foram descritas atividades antioxidante, antiparkinsoniana, antiobesogênica e anticarcinogênica para a erva-mate (Ilex paraguariensis St. Hilaire). O presente estudo investigou as alterações bioquímicas induzidas pela exposição in vivo ao herbicida PQ em hipocampo de ratos de 27 dias de idade, assim como o efeito neuroprotetor da erva-mate. Os animais receberam 10 mg/Kg de peso de PQ via intraperitoneal por 5 dias consecutivos, o grupo controle recebeu solução salina durante o mesmo período. Para avaliar o efeito neuroprotetor do extrato butanólico (BuOH) de I. paraguarienses, os animais receberam 200 mg/kg de peso do extrato via gavagem, o grupo controle recebeu o mesmo volume de água, 1 dia antes e durante o tratamento com PQ. Foram determinados marcadores de dano oxidativo, da neurotransmissão glutamatérgica e do metabolismo energético em hipocampo dos animais. Os resultados obtidos mostraram: aumento do influxo de 45Ca2+; diminuição da captação de 14C-glutamato e da atividade da glutamina sintetase (GS); diminuição da captação de 14C-2-desoxi-D-glicose; aumento da atividade das enzimas alanina aminotransferase (ALT), aspartato aminotransferase (AST) e lactato desidrogenase (LDH). Em relação as defesas antioxidantes, houve diminuição da atividade da gama glutamil transferase (GGT), da glicose-6-P desidrogenase (G6PD), aumento da atividade da superóxido dismutase (SOD) e catalase (CAT) e aumento da peroxidação lipídica causados pela exposição ao PQ. O tratamento com I. paraguariensis preveniu o efeito do paraquat na captação de glicose, na atividade da LDH e da ALT e na captação de glutamato, além de exercer efeito neuroprotetor nos mecanismos de defesa antioxidante avaliados, como na atividade da G6PD, SOD, GGT e conteúdo de glutationa (GSH). Os resultados obtidos neste estudo poderão sugerir o potencial terapêutico da erva-mate como protetor dos danos induzidos pela exposição a pesticidas. <br> / Abstract: Paraquat (PQ) is widely used in Brazil, despite being described as a Parkinson's disease (PD) inductor in animal models and in epidemiological studies. Considering that Brazilian flora has a great diversity of medicinal plants and many plant extracts are used in folk medicine, the investigation of the therapeutic potential of a natural compound is an important challenge to researchers. Considering that, several properties have been described such as antioxidant, anti-Parkinson, anti-obesity and anticarcinogenic for yerba mate (I. paraguariensis St. Hilaire). The present study investigated the biochemical changes induced by in vivo exposure to the herbicide PQ on hippocampus of 27 days old rats, as well as the neuroprotective effect of yerba mate. Animals received PQ (10 mg/kg body weight, i.p.) for 5 consecutive days, the control group received saline for the same period. In order to evaluate the neuroprotective effect of the butanolic (BuOH) extract of I. paraguarienses, rats received 200 mg/kg body weight by gavage) and the control group received the same amount of water, 1 day before and during PQ treatment. Biomarkers of oxidative damage, glutamatergic neurotransmission and energy metabolism were determined on hippocampus. The present study showed increased 45Ca2+ influx associated with decreased glutamate uptake and glutamine synthetase (GS) activity. Moreover, glucose uptake was decreased while alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST) and lactate dehydrogenase (LDH) activities were increased. Regarding the antioxidant defenses, PQ leads to decreased gamma-glutamyl transferase (GGT) and glucose-6-P dehydrogenase (G6PD) activities, as well as increased superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT) activities, which were associated with increased lipid peroxidation all caused by PQ exposure. The co-treatment with I. paraguariensis prevented the effect of PQ on glucose uptake, LDH and ALT activities and glutamate uptake. Besides, I. paraguariensis exerted neuroprotective effect on antioxidant defense mechanisms evaluated in this study, such as G6PD, SOD, GGT and GSH levels. In conclusion, these findings suggested the therapeutic potential of yerba mate as damage protector induced by exposure to pesticides.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2015-11-04T15:57:09Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1919886 bytes, checksum: ec68db1321db78abfb38c0249f4e0f9a (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-04T15:57:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1919886 bytes, checksum: ec68db1321db78abfb38c0249f4e0f9a (MD5) Previous issue date: 2012-02-24 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O gênero Begomovirus (família Geminiviridae) inclui vírus com genoma composto por uma ou duas moléculas de DNA fita simples, transmitidos a espécies de plantas dicotiledôneas pela mosca-branca Bemisia tabaci. No Brasil, os begomovírus são um dos principais entraves para a produtividade do feijoeiro e tomateiro. Entretanto, begomovírus infectando soja (Glycine max) tem sido apenas esporadicamente relatados. Neste trabalho, foi isolado uma espécie do gênero Begomovirus infectando soja na região de Jaiba-MG e designado Soybean chlorotic spot virus (SoCSV). Para a caracterização da espécie, foi feita a clonagem de seu genoma completo seguida de análise molecular, e da obtenção de clones infecciosos para a determinação de sua gama de hospedeiros. Extratos de DNA total de plantas infectadas foram utilizados para a amplificação do genoma viral completo utilizando-se a DNA polimerase do fago ф29. Os produtos da amplificação foram clonados em plasmídeos, completamente sequenciados e submetidas a análise filogenética. O DNA-A de SoCSV apresentou maior identidade de sequência com o vírus Macroptilium yellow spot virus (85% de identidade), enquanto o DNA-B apresentou maior identidade com o Bean golden mosaic virus (67% de identidade). Este nível de conservação de sequências de SoCSV é suficientemente dissimilar (menos que 89%) para ser considerado uma nova espécie de begomovírus. Nos testes de gama de hospedeiros, dentre as espécies testadas foi constatada a infecção viral nas espécies Nicotiana clevelandii, N. tabacum e N. glutinosa, entretanto nenhum sintoma macroscópico foi observado. As plantas das espécies Capsicum annuum, N. benthamiana, N. debneyi, N. rustica e Glycine max, apresentaram sintomas leves. Os sintomas mais severos foram observados nas espécies Phaseolus vulgaris ‘Pérola’ e ‘Ouro Negro’, consistindo em deformação foliar, bolhosidade, clorose entre as nervuras, mosaico e mosaico dourado. Com o objetivo de induzir o silenciamento de genes em plantas de soja, foi construído um vetor de silenciamento viral baseado no DNA-A do SoCSV, denominado pUFV1713, através da substituição da maior parte da sequência que codifica a proteína capsidial (CP) por um sítio múltiplo de clonagem. Assim como os outros begomovírus, o SoCSV demonstrou não necessitar da proteína capsidial para causar infecção sistêmica. A construção do vetor viral foi confirmada por PCR, clivagem enzimática e sequenciamento. A capacidade de pUFV1713 induzir o silenciamento gênico foi testada com a inserção de um fragmento do gene magnesium chelatase subunit I (ChlI) no seu sítio múltiplo de clonagem, seguido por inoculação em plantas de soja. A infecção viral foi confirmada via PCR aos 21 dias pós-inoculação (dpi). O decaimento dos transcritos do gene endógeno ChlI foi avaliado por PCR em tempo real. Os dados do qRT-PCR confirmam a diminuição dos níveis de expressão do mRNA do gene ChlI nas plantas infectadas mas não nas plantas controles. Coletivamente, estes resultados indicam que o vetor VIGS derivado de SoCSV tem o potencial para aplicações em análises de genômica funcional de soja. / The genus Begomovirus (family Geminiviridae) includes viruses with mono or bipartite ssDNA genomes that are transmitted to dicotyledonous plant species by the whitefly Bemisia tabaci. In Brazil, begomoviruses are considered major constraints to tomato and bean production. However, soybean (Glycine max) infecting begomoviruses have been only sporadically reported. In this investigation, a new begomovirus species was isolated from a soybean plant in Jaiba-MG and designated Soybean chlorotic spot virus (SoCSV). The DNA-A and DNA-B of this new virus species were cloned, sequenced and infectious clones were obtained to determine the host range. Total DNA extracts from infected plants were used for the amplification of the full-length viral genome through phage ф29 DNA polymerase. The amplified fragments were cloned into plasmids, sequenced and submitted to phylogenetic analysis. The DNA-A of SoCSV was more closely related to Macroptilium yellow spot virus Tomato (85% identity), whereas the DNA-B was more closely related to Bean golden mosaic virus (67% identity). This level of sequence conservation of SoCSV is sufficiently dissimilar (less than 89%) to be considered a new species of Begomovirus. For the host range experiments, among the analyzed species, SoCSV was capable to cause a symptomless infection in Nicotiana clevelandii, N. tabacum e N. glutinosa. The plant species Capsicum annuum, N. benthamiana, N. debneyi, N. rustica and Glycine max displayed mild symptoms. The most severe symptoms were developed in the species Phaseolus vulgaris ‘Pérola’, and ‘Ouro Negro’, which consisted on leaf distortion, blistering, interveinal chlorosis, mosaic and golden mosaic. To induce gene silencing in soybean plants, we developed a SoCSV DNA-A-based silencing vector, designated pUFV1713, by replacing the majority of the coat protein (CP) sequences with a multiple cloning site. Like other begomoviruses, SoCSV did not require the coat protein for infection. The construction of the viral vector was confirmed by PCR, restriction analysis and sequencing. The capacity of pUFV1713 of inducing gene silencing was tested by cloning a magnesium chelatase subunit I (ChlI) gene fragment in its multiple cloning site followed by inoculation in soybean plants. Vairal infection was confirmed via PCR at 21 days post-inoculation (dpi). The decay of ChlI transcripts was monitored by real time RT-PCR. The results of qRT-PCR confirmed the decrease in the levels of ChlI mRNA expression in the infected plants but not in the control plants. Collectively, these results indicate that the SoCSV-derived VIGS vector has a potential for application in soybean functional genomics analysis. / Identidade da aluna, retirada do Virtua.

Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado de Magíster en Bioquímica área de Especialización en Toxicología y Diagnóstico Molecular / En los Errores Innatos del Metabolismo (EIM), los cultivos de fibroblastos (FB) a partir de biopsia de piel, han sido desarrollados con el objetivo de obtener material para la determinación enzimas deficientes en este tipo de patologías y establecer un diagnóstico definitivo. Este tipo de diagnóstico es realizado en laboratorios especializados, debido a la complejidad en el manejo y mantención de los cultivos de FB. El envío de muestras de FB a estos centros debe ser realizado en condiciones que garanticen la viabilidad de las células durante el trayecto, con el objetivo de evitar un retraso en el diagnóstico, lo que podría ocasionar daño neurológico irreversible o la muerte de estos pacientes. Entre los EIM, el grupo de Enfermedades de Depósito Lisosomal (EDL) han sido ampliamente diagnosticadas mediante análisis enzimático sobre muestras de FB. La detección de enzimas lisosomales deficientes en muestras de FB permite confirmar el diagnóstico en este tipo de patologías. El uso de gotas de sangre seca (GSS) en papel filtro ha permitido el desarrollo de Programas de Pesquisa Neonatal para diversos EIM, ya que se ha demostrado ampliamente la estabilidad de metabolitos y enzimas en GSS en papel filtro. Además, la toma de muestra, el transporte y almacenamiento de muestras en este tipo de soporte se ven facilitados. El objetivo de este estudio fue evaluar la estabilidad de la actividad específica de betagalactosidasa, enzima lisosomal deficiente en la Gangliosidosis GM1, un tipo de EDL, en muestras de lisados de FB obtenidos a partir de la línea celular 3T3-L1 y dispuestos en papel filtro. Las muestras fueron sometidas a distintas condiciones de tiempo y temperatura de almacenaje para la evaluación de la actividad enzimática. Las muestras mantenidas a 4°C mostraron estabilidad de la actividad enzimática de betagalactosidasa hasta al menos los 28 días de almacenaje. Las muestras re-almacenadas a 4°C y - 70°C presentaron una mayor estabilidad de la actividad de beta-galactosidasa, en comparación con otras temperaturas de re-almacenaje estudiadas / In Inborn Errors of Metabolism (IEM), fibroblasts (FB) cultures from skin biopsy have been developed in order to obtain material for the determination of deficient enzymes in this type of pathologies and to establish a definitive diagnosis. This type of diagnosis is performed in specialized laboratories, due to the complexity of sample handling and FB culture maintenance. Shipment of FB samples to these centers must be carried out under conditions that guarantee the viability of the cells during the journey, in order to avoid a delay in diagnosis, which may cause irreversible neurological damage or death of these patients. Among the IEM, the Lysosomal Storage Diseases (LSD) group, has been widely diagnosed by enzymatic analysis of FB samples. The detection of deficient lysosomal enzymes in FB samples allows us to confirm the diagnosis in this type of pathology. The use of dried blood spots (DBS) on filter paper has allowed the development of Neonatal Screening Programs for various IEM, because the stability of metabolites and enzymes in DBS on filter paper has been widely demonstrated. Furthermore, sample collection, transport and storage of samples in this type of support are facilitated. The aim of this study was to evaluate the stability of the beta-galactosidase, a lysosomal enzyme that is deficient in GM1 gangliosidosis, a type of EDL, in fibroblasts lysates obtained from the 3T3- L1 cell line and collected on filter paper. Samples were studied under different conditions of time and temperature of storage for the enzymatic activity assessment. Samples kept at 4°C maintained the stability of enzyme activity for at least 28 days of storage. Samples stored at 4°C and -70°C showed increased stability when are re-stored in these temperatures.

Memoria para optar el título de Bioquímico / La enzima piridoxal quinasa (PLK) pertenece a la familia de quinasas sin dominio menor de la superfamilia de la riboquinasa y cataliza la formación de piridoxal-5’-fosfato (PLP) a partir de piridoxal (PL) y de un complejo metal divalente–ATP (Me+2-ATP), siendo fundamental en la vía de salvataje de PLP en diversos organismos. PLP es la forma activa de la vitamina B-6 y es el segundo cofactor más usado en la naturaleza, luego del ATP, principalmente relacionado con el metabolismo de los compuestos aminos, como los aminoácidos. A partir de análisis filogenéticos se infirió que existen cuatro clados de PLK bien diferenciados, tres de los cuales corresponden al dominio de las bacterias y uno al dominio de los eucariontes, estando ausente el dominio de las arqueas, las que sólo poseen una vía de biosíntesis de novo de PLP. En el caso de las bacterias, uno de los clados corresponde a las proteínas que son homólogos cercanos del gen pdxK y los otros dos clados son homólogos cercanos del gen pdxY, donde en uno se encuentran las PLK de firmicutes, bacteroidetes, espiroquetas, fusobacterias y termotogales, mientras que en el otro se encuentran las PLK de proteobacterias, actinobacterias y deinococos-thermus. Además, se distinguieron tres motivos de secuencia conservados, los cuales corresponden a DPV, NXXE y GXGD, asociados a la unión de sustratos, unión de Mg+2 y la catálisis. La estructura de PLK de origen humano (hPLK) posee una alta similitud estructural con PLKs de otras fuentes, como de Ovis aries y Escherichia coli, salvo en algunos loops de la estrucura. hPLK, que fue expresada en E. coli, se purificó y caracterizó cinéticamente. En cuanto al uso de diferentes metales divalentes (Me+2), se observó que la mayor velocidad inicial se obtiene a bajas concentraciones de Zn+2 libre. En relación a los parámetros cinéticos, la Vmax fue de 4789 U/mg y la kcat de 3,2 s-1, en tanto, la Km para PL fue de 490 μM, mientras que para ZnATP-2 fue de 20 μM. El pH óptimo de hPLK fue de 6,4 en las condiciones usadas. Respecto a la regulación de la actividad enzimática, se determinó que hPLK es inhibida por PL, ZnATP-2 y Zn+2 libre, mientras que las especies ATP-4 y HATP-3 no generan cambios en la actividad de la enzima. La inhibición por Zn+2 libre posee un IC50 de 37 μM, en tanto que la Kd para Zn+2, determinada por fluorescencia intrínseca, es de 266 nM. El Zn2+ libre presenta un patrón de inhibición complejo: cuando se varía el sustrato ZnATP-2 los datos se ajustan a un modelo de inhibición denominado sistema C1 de tipo mixto lineal, mientras que cuando se varía el sustrato PL, los datos se ajustan a dos modelos, debido a que se observa un perfil de inhibición dual dependiendo de la concentración de Zn+2 libre. El primer modelo, que explica el comportamiento inhibitorio hasta una concentración de Zn+2 libre de 50 μM, es lo que se denomina sistema C5 de inhibición de tipo mixto hiperbólico, en tanto que el segundo modelo, que explica el comportamiento inhibitorio desde 50 μM a concentraciones mayores, corresponde a un modelo de inhibición incompetitiva modificado, en el cual se incluye la unión de un Zn+2 adicional a la enzima libre

El avance de la informática y el poder de proceso de los computadores han posibilitado la aparición de una disciplina emergente, la Bioinformática; cuyos objetivos son una visión amplia de los procesos biológicos y el entendimiento de grupos complejos de datos. En esta tesis, el uso de herramientas bioinformáticas en datos de hipermetilación de promotores de genes en cáncer gástrico difuso reveló asociaciones con características clínicas y 2 genes que se asocian a mal pronóstico (APC y p73). Por otro lado, el análisis de librerías de SAGE de estómago con estas herramientas mostró genes diferencialmente expresados en adenocarcinomas gástricos y diferencias étnicas en la transcriptómica de estas células neoplásicas

Memoria para optar al título de Bioquímico / Las células dendríticas (DC) son células presentadoras de antígeno (APC) profesionales que juegan un papel principal en la iniciación de la respuesta inmune primaria y secundaria. Se encuentran en distintos estados funcionales. En estado inmaduro residen en tejidos no linfoides y poseen una alta capacidad para capturar y procesar el antígeno. Una vez que han sido expuestas a un ambiente inflamatorio o presencia de lipopolisacárido (LPS), disminuyen su capacidad de capturar el antígeno, incrementan la expresión de moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) y de moléculas co estimuladoras como CD80 y CD86. El antígeno es presentado como un complejo péptido-MHC clase I y/o II que es reconocido por células T CD8+ y CD4+, respectivamente. Hemos logrado obtener DCs derivadas de médula ósea (BMDC) de ratones DBA1/lacJ tras 7 días de cultivo en presencia de factor estimulante de colonias monocíticas y macrofágicas (GM-CSF) caracterizándolas fenotípica y funcionalmente en tres estados de maduración o diferenciación. El estado inmaduro de las DCs se obtuvo por pre tratamiento en cultivo con IL-10, éstas poseen una alta capacidad fagocítica representado por su propiedad de capturar un péptido sintético marcado (Dextran-FITC). Poseen bajos niveles de expresión de la molécula coestimuladora CD86 y de CD40, alta secreción de citoquinas anti inflamatorias como IL-10 y baja producción de IL-12p70. Bajo estimulación con LPS de E. coli por 24 horas, las DCs muestran un fenotipo maduro, caracterizado por una baja capacidad de capturar Dextran-FITC, una regulación positiva de CD40 y CD86, disminución en la secreción de IL-10 y un aumento de IL-12p70. Finalmente, se obtuvo un estado intermedio mediante un estímulo de LPS de E.coli por 4 horas, que al igual que con TNFa por 24 horas, exhibe características fenotípicas y funcionales indicadoras de un estado semi-maduro. Esta última población corresponde a DCs con características reguladoras o tolerogénicas capaces generar una respuesta in vivo en el modelo murino de artritis inducida por colágeno bovino tipo II (CIA), que se demostró por la inoculación intraperitoneal post inducción de la CIA, con BMDC estimuladas con LPS por 4 horas y cargadas con CII. Se midieron parámetros clínicos de inflamación como edema e índice artrítico en las extremidades de los animales sometidos a la inmunoterapia, logrando una disminución de estos parámetros en los ratones inoculados con BMDC comparados con controles CIA y CIA inoculados con BMDC estimuladas por 4 horas con LPS sin cargar. Estos hallazgos sugieren un re establecimiento de la tolerancia al CII inductor del proceso autoinmune. / Dendritics cells (DC) are professional antigen presenting cells (APC), that play a main role in the initiation of the primary and secondary immune responses. DCs can be found in different functional stages. In an immature state they reside in lymphoid nodes, presenting a high capacity to capture and process the antigen. Once they have been exposed to danger signals like lipopolisacaride (LPS), DCs show an increases expression of the major complex histocompatibility (MHC), co stimulatory molecules (CD80 y CD86) and CD40, and a reduction in their antigen capture capability. Antigens are presented as peptides complexed MHC class I and II molecules which are recognized by CD8+ and CD4+T cells, respectively. We have generated bone marrow derived DC (BMDC) from DBA1/lacJ mice after 7 days of culture in the presence of GM-CSF. These DCs were characterized phenotypically and functionally displayed three stages according the stimulus that were subjected characterized maturation. Immature stage was obtained by the pre treatment of BMDC with IL-10. These DCs have a high endocitic capacity given by their ability to capture a synthetic peptide (Dextran-FITC), They also show low levels of CD40 and CD86, high secretion of anti inflammatory cytokine, IL-10 and, a low production of IL-12p70. Under stimulation with LPS from E. coli for 24 hours, BMDC show a diminished capacity to capture Dextran-FITC, up-regulate CD40 and CD86 expression, a reduce IL-10 secretion and increase IL-12p70 secretion. An intermediate phenotypic and functional stage was obtained when BMDC were pre-treated with a single stimulus of LPS for E. coli by 4 hours, or with TNFα for 24 hours. These semi-mature BMDC with tolerogenic characteristics allows us to perform in vivo challenge. Thus, using the murine model of type II collage-induced arthritis (CIA), we demonstrate by single ip. Inoculation of 4 hours LPSstimulated BMDC, that unlike BMDC without CII, CII pulsed BMDC interfere with arthritis progression. The clinical parameters evaluated were arthritis index and edema in all mouse. Both parameters showed better scores when compared to CIA controls or group of mice inoculated with 4 hours LPS-stimulated BMDC unloaded with CII. These findings suggest a CII tolerance reestablishment responsible of the autoimmune process

Memoria para optar el título de Bioquímico / La chirimoya (Annona cherimola Mill.) es uno de los candidatos más atractivos para su procesamiento por corte fresco en la nueva industria alimenticia. Sin embargo, este fruto presenta una marcada tendencia al pardeamiento, proceso en el que se ha descrito estar involucrada la enzima polifenol oxidasa (PPO). Resultados recientes nos han permitido definir la secuencia génica completa responsable de la síntesis de PPO en chirimoyas (Acppo). La proteína deducida desde esta secuencia (AcPPO) presentó dos codones de inicio candidatos (ATG), lo que llevó a un complejo análisis bioinformático sobre el significado de los aminoácidos encontrados en el extremo N-terminal de la proteína predicha. En este trabajo, se describe un análisis funcional detallado de las secuencias N-terminal de AcPPO y su importancia en los eventos post-traduccionales relacionados a la destinación sub-celular final de la proteína propuesta. Se fusionaron al gen reportero GFP, las dos zonas candidatas a señal (definidas por estas metioninas) encontradas en el extremo N-terminal de AcPPO, junto con la secuencia completa y los respectivos controles. Las construcciones desarrolladas se evaluaron por transformación vía Agrobacterium tumefaciens e infiltración de plantas de Nicotiana tabacum, para evaluar la emisión de fluorescencia debido a GFP a través de microscopía confocal. Los resultados indicaron que, efectivamente, el péptido definido como N-terminal de AcPPO posee la propiedad de dirigir GFP (y por lo tanto PPO) hacia cloroplastos, determinándose la existencia de una secuencia mínima necesaria para que esto ocurra (péptido CLORO). Esto demuestra experimentalmente, la idea previa de que AcPPO es destinada hacia cloroplasto / Cherimoya (Annona cherimola Mill.) fruit is an attractive candidate for food processing applications as fresh cut. However, it has a marked susceptibility to browning and this condition is mainly attributed to polyphenol oxidase activity (PPO). Recent work has allowed us the cloning, sequencing and experimental analysis of the full length Acppo gene. The predicted protein (AcPPO) presented two candidates ATG starting codons, generating a complex N-terminal analysis about the real compartmentalization of the enzyme by simple bionformatic processing of the sequences. A detailed functional analysis of the post-translational events involved in the final AcPPO sorting and cell distribution, was carried out by fusion of the two putative N-terminal signals found in AcPPO, to the green fluorescent protein (GFP) gene. Constructs either with the full-length (first ATG) or the second-half (second ATG) segment of the N-terminal peptide, were separately studied in transient expression assays. Agrobacterium tumefaciens infections with clones harboring these constructs on Nicotiana tabacum leaves were then evaluated by confocal microscopy. The existence of a minimal sequence in this N-terminal segment of the gene needed to direct AcPPO into chloroplasts was well established, supporting the idea that the cloned gene generates a protein that is sorted into these organelles

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Tesis para optar al grado académico de Magister en Bioquímica, área de especialización en Bioquímica Toxicológica y Diagnóstico Molecular y Memoria para optar al título profesional de Bioquímica / En la actualidad la mujer ha decido posponer la maternidad hasta después de los 30 años. El aplazar la maternidad hacia la ventana de subfertilidad (31 a 41 años), provoca una disminución de la fertilidad y en el éxito de los programas de fertilización in vitro, los cuales poseen estrechos márgenes de éxito, que se hacen cada vez más pequeños conforme va aumentando la edad de las mujeres. Por esta razón es necesario conocer los mecanismos involucrados en el envejecimiento ovárico, durante el periodo de subfertilidad femenino. Para ello se ha utilizado el modelo múrido, debido a su similitud con procesos que regulan la función del ovario en el ser humano, considerándose como un buen modelo para comprender los mecanismos involucrados en el envejecimiento reproductivo. Se ha demostrado que durante el periodo de sub-fertilidad y en mujeres menopáusicas, los ovarios presentan características fisiológicas similares a las encontradas en el Síndrome de ovario poliquístico, patología de alta prevalencia en mujeres durante edad fértil. Estas observaciones se basan en el hecho de que en ambas condiciones existe un retraso en el desarrollo folicular, disminución del número de folículos antrales y la aparición de estructuras quísticas, que prevalecen incluso después de la menopausia. Se ha descrito que uno de los factores que participa en la aparición de estas condiciones es el aumento del tono nervioso simpático y del contenido de noradrenalina (NA) intraovárica, la que ejerce su función a través de la activación de los receptores 2-adrenérgicos. Este aumento en la actividad nerviosa simpática del ovario se ha relacionado con un aumento en la secreción de hormonas esteroidales y la mantención y/o aparición de las estructuras quísticas, lo que conduce a problemas de fertilidad. Para disminuir la estimulación del sistema nervioso simpático sobre el ovario en el periodo de subfertilidad de la rata (8 a 10 meses), y para determinar si la NA participa en el cese de la función ovárica y/o formación de los quistes foliculares, se propuso bloquear la acción de los receptores -adrenérgicos. Para ello, se administró una inyección diaria de propranolol (antagonista -adrenérgico), durante 2 meses a ratas que se encuentran en el periodo de subfertilidad. Después de los dos meses de tratamiento se analizó la ciclicidad estral de la rata por medio de la observación microscópica del frotis vaginal, se determinaron las hormonas esteroidales en plasma mediante EIA, la concentración de NA y su metabolito MHPG en ovario mediante HPLC; además se realizó análisis morfológico de los ovarios. Los resultados muestran que el bloqueo -adrenérgico con propranolol permite reactivar el desarrollo folicular. Esto evidenciado por: a) el aumento en el número de folículos antrales sanos y cuerpos lúteos, b) el aumento del porcentaje de ovulación y los niveles de hormonas esteroidales en el plasma, c) la disminución en el número de folículos quísticos (quistes y prequistes) y el tamaño de los folículos tipo III y prequistes. Considerando que durante el envejecimiento existe un aumento del tono adrenérgico sobre el ovario, que podría resultar perjudicial, hemos logrado, mediante el bloqueo - adrenérgico, mejorar la funcionalidad ovárica. Este tratamiento reactivó el desarrollo folicular, evidenciado en la recuperación de la esteroidogénesis y foliculogénesis, dando a este fármaco expectativas para su uso a nivel clínico como terapia de ayuda, para poder expandir o retrasar la ventana de subfertilidad en la mujer / Today women have decided to postpone childbearing even after their thirties. The delay of the motherhood towards the subfertility period is associated to diminished fertility and a decreased success rate in in vitro fertilization programs, the latter being rarely successful and even less successful as women get older. For this reason it became necessary to understand the mechanisms related to ovarian ageing during the subfertility period. To accomplish this, the murine model has been used, because it describes almost all the process that regulates the ovarian function in humans, therefore is a good model for understanding the mechanisms involved in the reproductive aging. It has been show that during the sub-fertility and the menopausal period in woman, the ovaries present physiological characteristics similar to those found in the polycystic ovarian syndrome, the pathology with the highest prevalence in women during the fertility age. The observations are based, for example, in the delay in follicular development, decreased number of antral follicles and the spontaneous generation of cystic structures, that prevail until the menopausal age. Today we know one of the factors that participates in the generation of this condition is the rise in the sympathetic tone and the noradrenaline (NA) released in the ovary, which exerts his function through the 2-adrenergic receptor activation. That is correlated with the steroid hormone secretion and the maintenance or generation of the cystic structures, leading to fertility issues. To inhibit the effect in the rise of the sympathetic tone in the ovary during the sub fertility period, and to determine if the NA participates in the cessations of the ovarian function and/or follicular cyst formation and maintenance, we propose a pharmacological block the - adrenergic receptors. To achieve this we administered propranolol, a -adrenergic receptors antagonist, in a daily injection for 2 months, to rats that have reached the sub fertility period (8 and 10 months old). After 2 months of propranolol treatment, estrous cyclicity was analyzed through vaginal smear, steroidal hormones were analyzed in plasma through EIA, the NA content and one of its metabolites was measured in HPLC and finally we performed a morphological analysis of the complete ovary. The results show that the -adrenergic blockade allows reactivation of the follicular development, which is evidenced by an increase in: a) healthy antral follicles and corpora lutea amount, b) ovulation percentage and esteroidal hormones levels in plasma, and c) decreased amount of cystic follicles (cyst and precyst) and in the follicles size (type III follicles and precyst). Therefore we can observe an activation in follicular development that leads to ovulation and inhibits the cyst formation pathway. During aging there is an increase in the ovarian adrenergic tone. After the -adrenergic blockade, we could see the improvement of the ovarian function and follicular development, as evidenced by the rise in the steroidogenesis and folliculogenesis. These findings let us propose propranolol for use in clinical trials as a clinical therapy help, to expand or delay the sub fertility period in the woman

Orientador: Avelino Rodrigues de Oliveira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-13T22:49:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Gouvea_CibeleMarliCacaoPaiva_M.pdf: 1235251 bytes, checksum: dce6095476448c394e3cf784a1181d2b (MD5) Previous issue date: 1990 / Resumo: Foram mantidas e aumentadas culturas monoxênicas de Pratylenchus , P. penetrans e P. brachyurus. A influência de dois meios de cultura sobre a reprodução dos nematóides em calos de alfafa foi estudada...Observação: O resumo, na integra, podera ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: Monoxenic cultures of Pratylenchus zeae, P. penetrans and P. brachyurus have been maintained and increased. The influence of two culture media on the nematode reprodllction has been studied...Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia