Orientador: Avelino Rodrigues de Oliveira / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-18T01:59:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Moraes_WalkyriaBuenodeCamargo_D.pdf: 6399767 bytes, checksum: ceb637122aeabfe9f1048e27d1ba4a8e (MD5) Previous issue date: 1973 / Resumo: Uma substância extraída de folhas de Abutilon striatum Dicks. Inibe a infecção causada pelo vírus do mosaico do fumo *TMV), quando inculado em folhas de glutinosa ( Nicotiana glutinosa L. ). A substância termoestável, não dialisável e de alto peso molecular (5000-10000) é de natureza polissacarídica, podendo ser retida pelo carvão ativo, não se alterando em pH alcalino ou quando submetida a tratamento para desproteinização. Não é degradada pelos tratamentos com diastase ou pectinase. Possue duas bandas características de absorção a ultravioleta, nas regiões compreendidas entre 260-276nm e 320 nm. A presença do inibidor não altera a capacidade de reação do TMV com seu antissoro específico, em testes de dupla- difusão em Agar. O inibidor forma complexo instável com TMV, podendo ser separado deste por ultracentrifugação. As eletromicrografias sugerem que o inibidor recubra as partículas de vírus, além de promover o agregamento, fragmentação e deformações das mesmas. Mantendo-se constante a concentração do TMV a porcentagem de inibição da infectividade deste é função logarítmica da concentração do inibidor. A redução da infectividade do vírus, quando empregado em diferentes concentrações, é inversamente proporcional às concentrações do mesmo, sob ação de uma determinada concentração do inibidor.O inibidor reduz a infectividade do TMV inoculado em N. glutinosa ...Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: Na inhibitory substance present in leaves of Abutilon striatum reduced the infectivity of tobacco mosaic vírus (TMV) when assayed on leaves of Nicotiana glutinosa. The inhibitory substance presented the following characteristics: it was not dialyzable, it was stable in high temperature and high pH (11). It was retained by active charcoal. The substance was unaffected by treatments to inactivate proteins, and seemed to be a polysaccharide of high molecular weight (5000-10000). It was unaffected by enzymatic preparations of diastase and pectinase. The ultraviolet spectra showed two characteristic bands: I (260-276nm) and II (310-320nm). In serological agar double-diffusion tests, the presence of the inhibitor did not interfere with the capacity of reaction between the TMV and its specific antisserum. The TMV- inhibitor bounds could be disrupted by ultracentrifuging the mixture without loss of activity of any of the components.Studies on the fine-structure of the complex virus-inhibitor suggested that the virus particles were recovered by the inhibitor which promoted their aggregation, fagmentation and distortion. At constant TMV-concentration, the percentage of reduction of infectivity was a logarithmic function of inhibitor concentration.Under the action of a constant inhibitor concentration the reduction of TMV infectivity was inversely proportional to the virus concentration.The infectivity of TMV was inhibited when inoculated on N...Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations / Doutorado / Doutor em Ciências Biológicas

Tesis de Magíster en Bioquímica, Área de Especialización en Toxicología y Diagnóstico Molecular / La infección de transmisión sexual más común a nivel mundial, tanto en hombres como en mujeres es la producida por el Virus Papiloma Humano (HPV). Los diferentes HPV que afectan la zona anogenital se dividen en dos grupos: bajo y alto riesgo carcinogénico. La infección con HPV-AR ha sido detectada en más del 99,7% de los casos de cáncer cérvico-uterino. Este cáncer ocupa el sexto lugar dentro de las neoplasias malignas femeninas, produciendo alrededor de 600 muertes al año en Chile. En la actualidad no se dispone de biomarcadores adecuados para estimar el pronóstico de la infección viral en los pacientes. Por lo anterior, en esta investigación se evaluó la utilidad de la medición de la carga viral como predictor de progreso de la infección en mujeres infectadas con HPV-16. La hipótesis planteada fue que las pacientes infectadas con HPV-16 y con lesiones cervicales de alto grado presentan una mayor carga viral cuantificada a través de la amplificación de segmentos de los genes L1 y E7 en comparación con aquellas infectadas y con lesiones de bajo grado. El estudio se realizó con muestras cervicales de 60 mujeres controladas ginecológicamente en el Hospital San Juan de Dios. Todas las pacientes presentaban un examen citológico alterado: 40 estaban infectadas con HPV-16 y 20 fueron negativas a la presencia del virus. En todas las muestras se cuantificó la carga de DNA viral mediante PCR en tiempo real. El 28,3%, 18,3% y 53,3% de las pacientes presentaron lesiones NIE I, NIE II y NIE III, respectivamente. En las pacientes infectadas con HPV-16 se determinó que la mediana de la carga viral del ensayo utilizando L1 en LIBG es 1,4 veces mayor en comparación con la obtenida en las LIAG. La carga viral obtenida al amplificar un segmento del gen E7 se encontró que es 1,5 veces mayor en LIBG en comparación con LIAG. Además, los niveles de los amplicones de ambos genes en los diferentes grados de lesión mostraron una correlación lineal positiva. Estos resultados muestran que en LIBG existe una mayor carga viral en comparación con aquellas con lesiones LIAG / The most common worldwide sexually transmitted disease in both men and women is Human Papillomavirus (HPV). Different HPV infect the anogenital area and they are divided into two groups: low and high carcinogenic risk. High risk HPV have been found in 99,7% of cervical cancer cases. This cancer ranks sixth in female malignancies, causing about 600 deaths a year in Chile. Currently there are no good biomarkers to predict the viral infection in patients. Therefore, this study evaluated the usefulness of viral load as a predictor of disease progression in HPV-16-infected women. The hypothesis was that patients infected with HPV-16 and with high-grade cervical lesions have a higher viral load quantified through the amplification of segments of L1 and E7 genes compared to those infected with low-grade lesions. We studied vaginal samples of 60 women attending a gynecological control at San Juan de Dios Hospital. All patients had an altered cytology testing: 40 of them were HPV-16 infected and 20 non infected. Viral load of L1 and E7 genes were quantified in all samples by real time PCR. The overall detection of cervical intraepithelial neoplasia NIEI, NIEII and NIEIII was 28,3%, 18,3% and 53,3%, respectively. In LIBG patients infected with HPV-16 it was determined that the median viral load assay using L1 is 1,4 times higher compared with that obtained in LIAG. The viral load obtained by amplifying a segment of the E7 gene was found to be 1,5 times higher in patients with LIBG than LIAG. Furthermore, levels of L1 and E7 genes show a positive lineal correlation in all cervical lesions. These results indicate that lesions with low severity have higher viral load than high severity

Tesis de Magíster en Bioquímica Área de Especialización, Bioquímica de Proteínas y Biotecnología; y Memoria para Optar al Título de Bioquímico / Los mecanismos moleculares que permiten a Salmonella Typhimurium causar enfermedades en mamíferos son numerosos y generan manifestaciones clínicas que abarcan desde una colitis hasta septicemia y la posterior muerte del hospedero. Estos mecanismos se relacionan con su capacidad de infectar en primera instancia células epiteliales del tracto digestivo y su posterior supervivencia y replicación en células fagocíticas. Esto es posible gracias a la existencia de factores de virulencia que se encuentran codificados en genes localizados mayoritariamente en islas de patogenicidad o en el plasmidio de virulencia de Salmonella. La gran mayoría de estos mecanismos han sido caracterizados en la infección del modelo murino o aviar. En este trabajo buscamos identificar los genes de S. Typhimirium que están implicados en la supervivencia de esta bacteria dentro de organismos eucariontes simples tales como amebas. Considerando que Salmonella podría interactuar con estos organismos en el medio ambiente, en este trabajo se usó como modelo de estudio la ameba social Dictyostelium discoideum, que de acuerdo a nuestras observaciones sería incapaz de degradar a Salmonella. Esto es interesante si se toma en cuenta que las amebas presentan una estrecha relación con los macrófagos, ya que ambas son células eucariontes que comparten muchos de los mecanismos implicados en el proceso de fagocitosis. Para estudiar la supervivencia de Salmonella al interior de D. discoideum implementamos un ensayo de competencia infectando esta ameba con S. Typhimurium 14028s y mutantes definidas. Nuestros resultados indican que las mutantes ΔinvA y ΔssaD (relacionadas directamente con la patogenicidad de Salmonella en otros modelos de infección) y ΔaroA (mutante metabólica), presentan problemas de supervivencia en D. discoideum en comparación con la cepa silvestre parental. Posteriormente, para identificar el conjunto de genes involucrados en la supervivencia intracelular de S. Typhimurium en este organismo modelo realizamos infecciones de D. discoideum utilizando una genoteca de ~3690 mutantes de S. Typhimurium 14028s por deleción de genes individuales, que contienen un cassette de resistencia a kanamicina. Desarrollamos un protocolo que permite amplificar y secuenciar las regiones adyacentes a la inserción de este cassette e identificar a nivel genómico cada una de las mutantes presentes en la población recuperada desde D. discoideum. Mediante este análisis a gran escala fue posible identificar un total de 81 mutantes bajo selección negativa. Entre las mutantes identificadas podemos mencionar a ΔorgB, gen que codifica un componente esencial para el funcionamiento del sistema de secreción tipo III (T3SS) codificado en la isla de patogenicidad SPI-1 y 3 mutantes (ΔssrA, ΔssaR y ΔpipB2) cuya función se asocia al T3SS codificado en la isla de patogenicidad SPI-2. El análisis a escala genómica también nos permitió tener una idea general del ambiente en el que se encuentra S. Typhimurium al interior de D. discoideum. Esta idea surge de la selección negativa que presentan mutantes en genes como rpoE y creB, que codifican proteínas que participan de la regulación transcripcional de genes asociados con la respuesta al estrés extracitoplasmático y al crecimiento en medio mínimo, respectivamente. En conjunto, los resultados de esta tesis constituyen un primer paso para comprender la interacción entre Salmonella y la ameba D. discoideum a nivel molecular / The molecular mechanisms that allow Salmonella Typhimurium to cause disease in mammals are numerous, and are responsible for clinical traits ranging from a self-limited colitis to septicemia and eventually the death of the host. These mechanisms are related to the ability of the pathogen to infect epithelial cells in the small intestine and its intracellular survival and growth in phagocytic cells of the host. This ability is the result of genes coding for virulence factors generally located in pathogenicity islands or in the Salmonella virulence plasmid. The vast majority of these mechanisms have been characterized using murine and avian infection models. In this work, we aimed to identify S. Typhimurium genes involved in the survival of this pathogen in simple eukaryotic organisms like amoebas. Considering that Salmonella can interact with these organisms in the environment, in this work we used the social amoeba Discoideum discoideum as a model. According to our data, this organism is unable to degrade Salmonella after phagocytosis. This is remarkable considering that amoebas show a close relationship with macrophages, both being eukaryotic cells that share many phagocytosis mechanisms. To study the intracellular survival of Salmonella in D. discoideum we developed a competition assay where the amoeba was infected with S. Typhimurium 14028s and selected derivative mutants. Our data show that mutants ΔinvA and ΔssaD (directly related to pathogenicity in other infection models) and ΔaroA (metabolic mutant) have an impaired intracellular survival in D. discoideum as compared to the wild-type strain. Later, in order to identify the complement of genes involved in the intracellular survival of S. Typhimurium in this organism, we infected D. discoideum using a single-gene deletion mutant library of S. Typhimurium 14028s (~3690 mutants), containing a kanamycin resistance cassette. We developed a protocol to amplify and sequence the genomic region adjacent to the resistance cassette. This protocol allowed us to identify at the genomic level the mutants present in the population of bacteria recovered from D. discoideum. Using this genomic analysis, we identified 81 mutants under negative selection. Relevant mutants in this group include ΔorgB, a gene that encodes an essential component required for the function of the T3SS encoded in SPI-1, and 3 mutants (ΔssrA, ΔssaR and ΔpipB2) in genes associated to the T3SS encoded in SPI-2. Furthermore, our genomic analysis allowed us to have a general idea of the environment faced by Salmonella within D. discoideum. This notion comes from the negative selection observed for mutants in genes such as rpoE and creB, coding proteins involved in the transcriptional regulation of genes associated to extracitoplasmatic stress and growth in minimal media, respectively. Taken together, the results in this work are the first step in the understanding of the molecular mechanisms involved in the interaction between Salmonella and D. discoideum / Conicyt; Fondecyt

Orientador: Sandro Roberto Valentini / Banca: Márcia Aparecida Silva Graminha / Banca: Carlos Frederico Martins Menck / Banca: Carla Columbano de Oliveira / Resumo: A expressão gênica pode ser regulada em eucariotos em diversas etapas dometabolismo de mRNA, como transcrição, processamento, tradução e degradação. A estabilidade de mRNA é modulada por elementos presentes no transcrito e por proteínas ligantes de RNA associadas a esses elementos. Pub1 de S. cerevisiae é uma proteína citoplasmática capaz de estabilizar transcritos contendo elementos ricos em AU (ARE e ARE-like) ou elementos estabilizadores (STE). O presente trabalho identificou num rastreamento de duplo-híbrido a proteína Nab2 como ligante de Pub1. Nab2 é uma proteína nucleocitoplasmática essencial que regula o comprimento da cauda poli(A) e a exportação nuclear de mRNA. A interação entre Pub1 e Nab2 foi confirmada por co-purificação e ensaio de interação in vitro. Foi demonstrado também que essa interação é mediada pelo domínio de dedos de zinco presente na região C-terminal de Nab2. A análise da relação funcional entre essas duas proteínas revelou que Nab2, assim como Pub1, é capaz de modular a estabilidade de mRNA. A estabilidade do transcrito de RPS16B, mensageiro contendo sequência ARE-like e regulado por Pub1, é diminuída nos mutantes nab2- 1 e nab2-67. No entanto, a estabilidade do transcrito de GCN4, mensageiro contendo STE e também regulado por Pub1, não é afetada nos mesmos mutantes. Resultados semelhantes foram observados para outros transcritos contendo sequências ARE-like ou STE. Ainda, dados obtidos com um mutante da via NMD (?upf1) mostraram que esta via de decaimento não está envolvida com o mecanismo de estabilização de RPS16B mediada por Pub1 e Nab2. Uma análise mais profunda mostrou que a sequência ARE-like presente no mensageiro de RPS16B é necessária para a estabilização mediada por Nab2. A proteína Pub1 e seus domínios isolados foram produzidos e purificados, mas não foi possível a obtenção de cristais para...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Regulation of gene expression can occur at different levels of mRNA life cycle, including transcription, processing, translation and degradation. mRNA stability is modulated by elements in the mRNA transcript and their cognate RNA-binding proteins. Poly(U)-binding protein 1 (Pub1) is a cytoplasmic S. cerevisiae mRNA binding protein that stabilizes transcripts containing AU-Rich Elements (ARE and ARE-like) or Stabilizer Elements (STE). In a yeast two-hybrid screen, we identified Nuclear poly(A)-binding protein 2 (Nab2) as a Pub1-interacting protein. Nab2 is an essential nucleocytoplasmic shuttling mRNA binding protein that regulates poly(A) tail length and mRNA export. The interaction between Pub1 and Nab2 was confirmed by co-purification and in vitro binding assays. The interaction is mediated by the Nab2 zinc finger domain. Analysis of the functional link between these proteins reveals that Nab2, like Pub1, can modulate the stability of specific target mRNA transcripts. We find that the half-life of the RPS16B transcript, an ARE-likecontaining Pub1 target, is decreased in both nab2-1 and nab2-67 mutants. In contrast, GCN4, an STE-containing Pub1 target, is not affected. Similar results were obtained with other ARE- and STE-containing Pub1 target transcripts. Additionally, results obtained with a mutant of the NMD pathway (?upf1) showed that this pathway is not involved in the mechanism of RPS16B stabilization mediated by Pub1 and Nab2. Further analysis reveals that the ARE-like sequence is necessary for Nab2- mediated transcript stabilization. Full-length Pub1 and isolated domains were produced and purified, however, it was not possible to obtain protein crystals for tertiary structure determination. Taken together, these results suggest that Nab2 acts together with Pub1 to modulate mRNA stability and strengthen a model where nuclear events involved in mRNA biogenesis...(Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Antecedentes: En los últimos años se ha utilizado la conducta pupilar para medir el desempeño cognitivo de las personas, donde un mayor esfuerzo cognitivo produce un incremento en el diámetro pupilar. Diversos estudios han mostrado que la Memoria Visual Integrativa de Corto Plazo (memoria que permite almacenar la imagen completa y unívoca de un objeto) se encuentra alterada en personas con Enfermedad de Alzheimer (EA). A su vez, se ha vinculado al funcionamiento de la Memoria Visual Integrativa de Corto Plazo con una alta demanda de recursos cognitivos. Trabajos previos usando diversos estímulos visuales, mostraron que personas con Enfermedad de Alzheimer no presentan cambios significativos en sus pupilas a medida que aumenta la exigencia cognitiva. Objetivos: Establecer si el análisis del tamaño pupilar puede constituirse como un biomarcador cognitivo no invasivo para contribuir al diagnóstico temprano de la Enfermedad de Alzheimer. Métodos: Para analizar la conducta pupilar se utilizó la técnica de seguimiento ocular (eyetracking) en una muestra de 30 personas sanas (Controles) y 18 pacientes con diagnóstico de Enfermedad de Alzheimer leve mientras se evaluó el desempeño de la Memoria Visual Integrativa de Corto Plazo. Resultados: La media de dilatación pupilar en los Controles se amplió significativamente a medida que la actividad demandó mayor esfuerzo cognitivo. Por el contrario, pacientes con EA no mostraron mayor dilatación pupilar significativa frente al incremento de la demanda cognitiva. Además, el análisis de regresión logística mostró que el análisis pupilar permite separar personas sanas (Controles), de Enfermos con Alzheimer con una sensibilidad de 94% y una especificidad del 100%. Conclusiones: Los pacientes con Enfermedad de Alzheimer leve presentaron alteraciones cognitivas que impidieron modificar significativamente el diámetro de sus pupilas a medida que se incrementaba la demanda cognitiva. A su vez, la regresión logística mostró que lasrespuestas pupilares pueden considerarse una herramienta muy eficaz para clasificar desempeño a nivel individual, clasificando a todos los pacientes con Enfermedad de Alzheimer como tales (100 % especificidad). Los análisis, resultados e interpretaciones reportados aquí, son pioneros en la investigación de alteraciones en mecanismos moleculares y cognitivos en la Enfermedad de Alzheimer. Finalmente, proponemos el análisis de la conducta pupilar durante la ejecución de tareas que involucren a la Memoria Visual Integrativa de Corto Plazo como un biomarcador para detectar demencia tipo Alzheimer en estadíos tempranos de la patología / Background: In recent years, pupillary behavior has been used to measure the cognitive performance of people, where greater cognitive effort produces an increase in pupillary diameter. Several studies have shown that Integrative Visual Short-Term Memory (memory that allows storing the complete and univocal image of an object) is altered in people with Alzheimer's Disease (AD). In turn, the functioning of the Integrative Visual Short-Term Memory has been linked to a high demand of cognitive resources. Previous work using different visual stimuli showed that people with Alzheimer's disease do not show changes in their pupils as cognitive demand increases. Objectives: To establish whether pupil size analysis can be used as a non-invasive cognitive biomarker to contribute to the early diagnosis of Alzheimer's disease. Methods: To analyze pupillary behavior, the eyetracking technique was used in a sample of 30 healthy people (Controls) and 18 patients with a diagnosis of mild Alzheimer's disease while the performance of the Integrative Visual Short-Term Memory was evaluated. Results: Mean pupillary dilation in Controls widened significantly as the activity demanded greater cognitive effort. In contrast, AD patients did not show greater pupillary dilation as cognitive demand increased. In addition, logistic regression analysis showed that pupillary analysis allows separating healthy people (Controls), from Alzheimer's Disease with a sensitivity of 94% and a specificity of 100%. Conclusions: Patients with mild Alzheimer's Disease presented cognitive alterations that prevented significant modification of their pupil diameter as cognitive demand increased. In turn, logistic regression showed that pupillary responses can be considered a very effective tool to classify performance at the individual level, classifying all patients with Alzheimer's disease as such (100% specificity). The analyses, results and interpretations reported here are pioneering in the investigation of alterations in molecular and cognitive mechanisms in Alzheimer's disease. Finally, we propose the analysis of pupillary behavior during the execution of tasks involving Integrative Visual Short-Term Memory as a biomarker to detect Alzheimer's type dementia in early stages of the pathology.

A pesar de los avances de la ciencia, las enfermedades cardiovasculares (ECV) continúan siendo la principal causa de muerte en el mundo occidental. La función vascular es regulada por diferentes agonistas incluyendo las hormonas esteroides sexuales estrógenos, progestágenos y andrógenos. La menopausia, es un período en el cual la probabilidad de contraer ECV se incrementa notablemente, hecho que ha sido atribuido a la disminución de estrógenos en circulación como consecuencia del cese de la actividad ovárica. Si bien los niveles de estradiol disminuyen marcadamente, éste no representa el único cambio hormonal de este período. La contribución ovárica de andrógenos, progesterona y estrona también se ve modificada. Los efectos vasculares de los estrógenos han sido objeto de numerosas investigaciones en las últimas décadas, mientras que la acción vascular de los andrógenos no ha recibido la misma atención. En este trabajo se propuso investigar las acciones celulares y moleculares de testosterona sobre los procesos que participan activamente en la fisiopatología vascular, con la finalidad que los conocimientos aportados por esta tesis contribuyan a elucidar el rol de esta hormona en la homeostasis y/o en la enfermedad vascular. Para tal fin, como modelo experimental se emplearon anillos de aorta torácica y cultivos de células endoteliales (CE) y células musculares lisas vasculares (CMLV) que fueron tratados in vitro con concentraciones fisiológicas del andrógeno. Se demostró que, a tiempos muy cortos de tratamiento, testosterona estimula la producción de óxido nítrico (NO) tanto en tejido aórtico como en CE en cultivo. Esta acción se produce en forma independiente de la transcripción génica y de la síntesis proteica. El mecanismo a través del cual la hormona regula la producción del vasoactivo involucra la participación del receptor de andrógenos (RA), las vías mensajeras MAPK, PLC/PKC, PI3K/Akt y el ingreso de Ca2+ desde el medio extracelular. Respecto a la especificidad de la acción hormonal se demostró que el efecto es propio de testosterona, independiente de su aromatización a estradiol y debido en parte a la conversión de testosterona al andrógeno más potente dihidrotestosterona. Sobre los procesos celulares involucrados en la lesión vascular se obtuvo evidencia que testosterona previene la adhesión de monocitos al endotelio vascular inducida por el agente proinflamatorio LPS. Si bien el tratamiento de las CE con testosterona no modifica la adhesión basal, cuando los monocitos fueron expuestos por 24 horas al andrógeno la adhesión leucocitaria se inhibió significativamente. El esteroide disminuye los niveles de expresión de los ARNm de las moléculas de adhesión ICAM-1 y VCAM-1, que median la unión firme de monocitos a las CE. En cambio el andrógeno no afectó la expresión de las integrinas CD11b y CD11c en membrana de los monocitos. En cuanto a las funciones de testosterona sobre la interacción plaqueta - CE se demostró que la hormona inhibe la agregación plaquetaria en forma dependiente de la producción de NO por el endotelio. En un ambiente proinflamatorio, el esteroide previene la adhesión plaquetaria inducida por LPS. El andrógeno estimula la proliferación y migración de CMLV. La acción mitogénica involucra la participación del RA y es independiente de conversión de testosterona a estradiol. Si bien en condiciones basales el andrógeno no afecta la motilidad de las CMLV, en presencia de un estimulador de la migración, norepinefrina, el esteroide potencia dicho efecto. En relación a los procesos celulares involucrados en la reparación vascular, en CE testosterona promueve la expresión del ARNm de VEGF y estimula la migración y la proliferación celular, siendo este último efecto dependiente de la producción endotelial de NO. Los resultados obtenidos en este trabajo de tesis doctoral aportan conocimientos sobre las acciones vasculares de testosterona. A nivel molecular se obtuvo información acerca del mecanismo a través del cual el andrógeno regula la producción del principal compuesto vasoactivo que produce el lecho vascular. A nivel celular se pudo determinar el rol del esteroide en algunos de los eventos celulares implicados en la enfermedad y en la reparación vascular, encontrándose acciones deseables (en CE y su interacción con plaquetas, monocitos) y no deseables (en CMLV). Resta por determinar la relevancia fisiológica de la evidencia aportada. / Despite the advances of science, cardiovascular disease (CVD) remains the leading cause of death in the western world. Vascular function is regulated by various agonists including the sex steroid hormones estrogen, progesterone and androgen. During menopause the risk of developing CVD increases considerably. This fact has been attributed to the decrease of estrogen circulation levels due to ovarian function impairment. However, serum estradiol drop does not represent the only hormonal change of this period since ovarian synthesis of androgen, progesterone and estrone is also modified. Vascular actions of estrogen have been subject of extensive research in recent decades, while vascular actions of androgens have not received the same attention. In order to contribute to the knowledge of the role of androgens on vascular homeostasis and/or disease, in this work we investigated the cellular and molecular actions of testosterone on the regulation of cellular events involved in vascular physiology. For this purpose, rat aortic strips (RAS) and cell cultures of endothelial cells (EC) and vascular smooth muscle cells (SMVC) were used as experimental models. In vitro treatments were performed with physiological concentrations of testosterone. We provide evidence that testosterone induces an acute stimulation of nitric oxide (NO) production, either in RAS and EC cultures, in a gene transcription independent manner. The mechanism of steroid action involves the participation of the androgen receptor (AR), and is dependent on MAPK, PLC/PKC and PI3K/Akt signaling pathways activation and extracellular Ca2+ influx. Regarding to the specificity of the hormonal action, we demonstrated that testosterone regulates NO production “per se”, and not through its conversion to estradiol via aromatization. The enhancement in the production of the vasoactive synthesis is partially due to testosterone reduction to dihydrotestosterone. When the effect of the androgen on cellular processes involved in vascular lesion was evaluated, we found that testosterone prevents monocytes adhesion to vascular endothelium induced by the proinflammatory agent LPS. Although testosterone treatment did not affect basal adhesion to EC, 24 hours of monocytes treatment with 1 nM testosterone significantly inhibited leukocyte adhesion. Indeed, the steroid decreases mRNA expression of the adhesion molecules ICAM-1 and VCAM-1, proteins involved in firm monocyte adhesion to EC. On the other hand the androgen does not affect CD11b and CD11c integrins expression on monocyte surface. Concerning platelet - EC interaction, we demonstrated that the hormone inhibits endothelium-dependent platelet aggregation through a direct action on EC via stimulation of NO production. Under inflammatory conditions the steroid prevents LPS induced platelet adhesion. The androgen stimulates proliferation and migration of SMVCs. This mitogenic action involves the participation of AR and is independent of testosterone conversion to estradiol. While under basal conditions the androgen does not affect SMVC motility, in the presence of the migration inducer agent, norepinephrine, the hormone is able to enhance the migratory effect. Related to the cellular processes involved in vascular repair, testosterone promotes EC mRNA expression of VEGF, and stimulates cell proliferation and migration. The mitogenic action exhibited by the steroid is dependent on endothelial NO production. The results obtained in this thesis provide knowledge about vascular actions of testosterone. At a molecular level, information was provided about the mechanism by which androgens regulate the production of one of the main biochemical factors produced by the vascular bed. At cellular level, we obtained evidence about desirable (EC-platelets, ECmonocytes interactions) and undesirable (VSMC proliferation and migration) actions of testosterone on the regulation of cellular events that play key roles on vascular remodeling. It remains to be determined the physiological relevance of our findings.

A pesar de los grandes avances logrados en el tratamiento de las enfermedades oncológicas, la sobrevida de los pacientes se ha alargado mínimamente en algunos tipos de cáncer. Por ello resulta fundamental profundizar la búsqueda de terapias novedosas evaluando nuevos compuestos. El 1α,25(OH)2-vitamina D3 o calcitriol tiene efectos antitumorales en varios tipos de cáncer y algunos ensayos clínicos realizados han dado resultados alentadores, aunque en la mayoría de los casos se ha observado hipercalcemia, lo que dificulta la administración de la dosis necesaria para inducir una respuesta antitumoral. Por ello se han sintetizado análogos con el objeto de hallar algunos que conserven o incrementen los efectos antitumorales pero carezcan de la actividad calcémica. En este sentido, análogos de la vitamina D3 que poseen un grupo fosfonato en su cadena lateral y los derivados de la vitamina D2 han mostrado tener baja actividad calcémica, y los llamados tipo gemini han mostrado poseer una potente actividad antitumoral. Es por ello que en colaboración con dos grupos de investigación de Química Orgánica, hemos diseñado y sintetizado análogos de la vitamina D con estas características. En este trabajo de tesis nos propusimos evaluar la actividad calcemiante y antitumoral de tres de los análogos sintetizados. Se demostró que dos de ellos (C10 y UVB1) no poseen efectos hipercalcemiantes, mientras que el tercero (UVB2) genera hipercalcemia. Se comprobó que los dos primeros análogos poseen efectos sobre la viabilidad celular de varias líneas celulares tumorales diferentes, indicando su potencial utilidad como agentes terapéuticos. El C10 demostró ejercer los efectos anti-proliferativos más potentes y se eligió para seguir evaluando con mayor profundidad. El análisis de los mecanismos subyacentes a la actividad antitumoral demostró que el aumento en los niveles del inhibidor del ciclo celular p27 es un evento común en todos los tipos celulares estudiados. Además, se demostró que el C10 induce arresto del ciclo celular en la línea de glioma T98G, aumentando los niveles de expresión de p21 y disminuyendo los de Ciclina D1. También se identificaron algunas vías implicadas en la acción del C10. Posteriormente, se realizaron ensayos in vivo en modelos animales de cáncer. La administración del C10 a un modelo animal de glioma mostró tener efectos in vivo disminuyendo la carga tumoral. Un ensayo similar realizado en un modelo de cáncer mamario demostró efectos inhibitorios del C10 en el proceso de metástasis. En dos modelos animales de carcinoma celular escamoso, en cambio, no se observaron efectos antitumorales. Los resultados obtenidos en esta tesis aportan evidencia que indica que este nuevo análogo podría ser, solo o en combinación con otros tratamientos, un posible agente terapéutico contra el cáncer. El calcitriol y sus análogos usualmente requieren del receptor de vitamina D (VDR) para ejercer su accion antitumoral. Teniendo en cuenta los resultados obtenidos para el C10 en gliomas y sabiendo que, hasta el momento, no se ha reportado la expresión de VDR en éstos, nos propusimos también estudiar la expresión y el rol de este receptor en gliomas humanos. Encontramos principalmente que la expresión de VDR se correlaciona con una sobrevida global más larga de los pacientes de glioblastoma multiforme. Modulando genética y farmacológicamente al VDR en una línea celular de glioma humano demostramos que este receptor se encuentra implicado en la viabilidad y la migración celular y que es necesario para los efectos del calcitriol sobre la migración celular. Estos resultados indican que el estudio de la expresión de VDR en biopsias de gliomas constituye un importante requisito para la potencial utilización del calcitriol y/o sus análogos en el tratamiento de esta entidad tumoral. / Despite major advances in the treatment of oncological diseases, patient survival has only improved minimally for some types of cancer. It is therefore vital to search new therapies by evaluating novel compounds. The 1α,25(OH)2 vitamin D3 or calcitriol has antitumor effects in several types of cancer and some clinical trials have yielded encouraging results, although in most cases side effects such as hypercalcemia have been observed. These side effects preclude the administration of the dose required to induce an antitumor response. For this reason, new analogs are being synthesized with the object of finding those that maintain or increase the antitumor effects but lack calcemic activity. In this regard, analogs of vitamin D3 that possess a phosphonate group in its side chain and analogs derived from vitamin D2 have shown to display low calcemic activity, and the Gemini family analogues have been shown to display potent antitumor activity. That is why, in collaboration with two research groups of Organic Chemistry, we have designed and synthesized analogues of vitamin D with these features. In this thesis work we assessed the calcemic and the antitumor activity of three of the analogues synthesized. Of the three analogues studied, two showed no hypercalcemic effects (C10 and UVB1) while the third (UVB2) induced an important hypercalcemia. The two non-calcemic analogues evidenced effects on cell viability in various cancer cell lines, indicating their potential utility as therapeutic agents. The C10 is the one that proved to display the most potent antiproliferative effects on cell lines and it was chosen to perform additional studies. The analysis of the mechanisms underlying the antitumor activity of C10 showed that the increase in the levels of the cell cycle inhibitor p27 is a common event in all cell types studied. In addition, this compound induces cell cycle arrest in the glioma cell line T98G, increasing the levels of expression of p21 and decreasing Cyclin D1. In vivo assays using animal models of cancer were further performed. The administration of C10 to an animal model of glioma evidenced a decrease in the tumor load. A similar experiment carried out in an animal model of breast cancer showed that C10 exerted inhibitory effects of the metastasic process. In two models of squamous cell carcinoma, in contrast, no antitumor effects were observed for C10. The results obtained provide evidence that indicates that this new analog could be, alone or in combination with other treatments, a therapeutic agent against cancer. Calcitriol and its analogs exert their antitumor effect mainly through vitamin D receptor (VDR) action. Taking into account the interesting results obtained for C10 in gliomas and knowing that so far there have been no reported studies that describe the expression of VDR in gliomas, we proposed to investigate the expression of this receptor in human gliomas. We found that the expression of VDR correlates with a longer overall survival time of glioblastoma multiforme patients. By modulating genetically and pharmacologically VDR in a glioma cell line we showed that the receptor is involved in the cellular survival and migration processes and that is necessary for calcitriol-mediated inhibition of cell migration. The results obtained in human gliomas provide evidence that indicates that the study of the expression of VDR is an important requisite for the utilization of 1α,25(OH)2-vitamin D3 or its analogues in the treatment of gliomas.

Dentro de la estructura del ojo de los vertebrados, la retina es tal vez el tejido que más capta la atención de los científicos por ser el primer actor en la recepción y transmisión del estímulo visual. La retina si bien forma parte de un sentido periférico, posee gran cantidad de homologías con el Sistema Nervioso Central. Esto provoca que los eventos y patologías asociadas a la retina puedan, hasta cierto punto, relacionarse con las enfermedades neurodegenerativas del cerebro más difíciles de estudiar como son el mal de Parkinson y la enfermedad de Alzheimer. En el caso particular de la retina, existen dos enfermedades aún hoy incurables como son la Retinitis Pigmentosa (RP) y la Degeneración Macular asociada a la Edad (AMD, por sus siglas en ingles). La muerte de las neuronas fotorreceptoras cumple un rol fundamental en el desarrollo de estas enfermedades, que se basan en la pérdida gradual y prácticamente irreversible de la visión. En la retina, las células gliales de Müller proveen el sostén necesario para la estructura de la misma. Se ha reportado que estas células expresan marcadores de células madre por lo cual están involucradas en la regeneración de la retina ante un eventual daño. Existen ya terapias destinadas a estimular el desarrollo de dichas células madre. Sin embargo, aún es necesario un mayor avance en la búsqueda de tratamientos destinados al mantenimiento y posterior diferenciación de las células regeneradas, evitando el proceso de muerte al que están expuestas. En otras palabras, evitar que las neuronas fotorreceptoras sean sometidas al proceso de suicidio celular conocido en líneas generales como Apoptosis. Dentro del enorme abanico de causas que pueden generar apoptosis en una neurona, la falta de factores tróficos o de crecimiento es una de ellas. Este trabajo de tesis buscó revertir la muerte provocada por la falta de factores tróficos en un modelo de cultivo neuronal puro compuesto en su mayor proporción por neuronas fotorreceptoras. En la primera parte nos enfocamos en estudiar el rol de la Melatonina como agente neuroprotector. Los resultados apuntan a que la Melatonina resulta eficaz para disminuir el avance de la apoptosis a días avanzados en el desarrollo. Pudimos demostrar que el efecto que la Melatonina ejerce específicamente en neuronas fotorreceptoras, está dado por la activación de la vía de señalización de ERK/MAPK. Respecto a la capacidad de la Melatonina de mantener la población de neuronas fotorreceptoras, no se vio un aumento en la expresión de proteínas del ciclo visual. Por el contrario, se observó un aumento de la expresión génica del factor de transcripción CRX (Cone Rod Homeobox) que ayudaría a mantener el fenotipo de neuronas fotorreceptoras a aquellas que hayan iniciado el proceso de diferenciación. Estos resultados sugieren que la Melatonina, podría ejercer su acción protectora directamente en las neuronas fotorreceptoras, e indirectamente, a través del estímulo de la población de neuronas que acompaña a los fotorreceptores en el ciclo visual, como ser las células amacrinas. La segunda parte de este trabajo se enfocó en la caracterización de la vía de muerte por falta de factores tróficos. En ese sentido, la vía de NO-GAPDH-SIAH consiste en la translocación a núcleo de la enzima GAPDH y el posterior desencadenamiento de la muerte celular. Comprobamos que efectivamente en nuestro modelo se verifica la translocación nuclear; y que al pre-tratar los cultivos con un inhibidor selectivo de dicha translocación se recupera significativamente la perdida de la viabilidad en los cultivos neuronales. Los resultados de esta tesis por un lado enriquecen el conocimiento sobre el rol de la Melatonina como agente neuroprotector en la retina. Por otro lado contribuyen a esclarecer los mecanismos de muerte en las células de la retina ante la falta de factores tróficos para poder, en un futuro, unificar su tratamiento. / The retina is probably the most interesting tissue within the structure of vertebrate eye, given its role as the first one in charge of receiving and transmitting the visual stimuli. Even though the retina is part of a peripheral sensory system, it shares many homologies with the Central Nervous System. This allows correlating to some extent the pathologic events associated with the retina with neurodegenerative illness more difficult to study such as Alzheimer’s and Parkinson’s disease. There are two main disorders of the retina named Retinitis Pigmentosa and Age-related Macular Degeneration. Those two pathologies share a common trait which is the death of photoreceptor cells as the main cause of gradual and irreversible loss of vision. In the retina, Müller glial cells are in charge among other functions, to support and maintain the structure of the retina. It has been reported for this cells the expression of stem cell markers and the involvement on retina regeneration after damage. Even though there are treatments nowadays that aim to stimulate Müller glia development of their stem potential, treatments aiming to the maintenance and ulterior differentiation of newly regenerated cells are just as important. The general idea is to prevent newly generated photoreceptor cells to undergo cell suicide, also known as Apoptosis. Within the large range of causes that can trigger apoptosis on a neuron, the lack of growth factors is one of them. In this thesis we aim to revert photoreceptor cell death induced by lack of growth factors, on a model of pure neuronal cultures. On the first chapter we focused on assessing the role of Melatonin as a neurotrophic factor. Results showed that Melatonin is effective on slowing down the apoptotic pathway after 4 days of development. We proved the involvement of Melatonin on the activation of the ERK/MAPK pathway directly on photoreceptor cells. Regarding Melatonin as a factor promoting neuronal differentiation, we could not observe an overexpression of visual cycle proteins. On the other hand, we observed the genetic overexpression of a transcription factor (Cone Rod Homeobox) which will help maintain the phenotype of those neurons that started developing as photoreceptors. Our results suggest that Melatonin could accomplish neuroprotection by either acting directly on photoreceptor cells, or indirectly through engaging the neurons that aid said cells on the visual cycle. The second part of this thesis focuses on the characterization on the cell death pathway caused by lack of trophic factors. On that matter, the NO-GAPDH-SIAH pathway consist in nuclear translocation of the glycolytic enzyme GAPDH followed by onset of neuronal death. We found that nuclear translocation of GAPDH occurs in our model, and that by pre-treating cultures with R-(-)-Deprenyl (a selective inhibitor for such translocation), we recovered neuronal cultures from loss of cell viability. The results shown on this thesis on one hand contribute to deepen the knowledge of Melatonin as a neuroprotective agent in the retina. On the other hand they shed light into the mechanisms involving neuronal death on lack of trophic factors so we may, in the future, unify their treatment.

El receptor de acetilcolina nicotínico (AChR) es una proteína integral de membrana, en íntimo contacto con los lípidos de la misma. El objetivo de este trabajo de Tesis fue analizar si las propiedades intrínsecas del AChR son las que determinan su partición en un determinado dominio de lípidos. Para ello se eligió el tipo de AChR con mejor caracterización, el del tejido eléctrico del pez marino Torpedo. El AChR completo, purificado a partir de T. californica, se reconstituyó en membranas mode-lo con proporciones definidas de colesterol, esfingomielina y fosfatidilcolina, y luego se procedió a su análisis mediante téc-nicas bioquímicas y biofísicas. Una porción del AChR que se sabe reside normalmente en el interior de la membrana, el péptido sintético γM4, se estudió de manera similar con el objetivo de aprender acerca de la contribución del anillo exte-rior del segmento transmembrana, en contacto directo con los lípidos, en la supuesta segregación lateral en la membrana del AChR. La distribución del AChR o del péptido γM4 se evaluó por extracción de los liposomas con el detergente no-iónico Triton X-100, y su posterior centrifugación, para obtener membranas resistentes al detergente (DRM). Se ha postulado que tales fracciones serían el homólogo bioquímico de los dominios de lípidos tipo balsa ("rafts") preexistentes en la membrana plasmática de células. La contrapartida de tales fracciones, las denominadas "no-rafts", son las membranas solubles en el detergente (DSM). Se estudió también la in-fluencia de la rapsina (una proteína periférica involucrada en agrupamiento del AChR) o de la agregación de dominios tipo-rafts (utilizando membranas que contienen al gangliósido GM1 seguido por el entrecruzamiento de GM1). Los resultados experimentales permiten concluir que el péptido γM4 exhibe una marcada preferencia por los dominios tipo-rafts. Por el contrario el AChR, ya sea solo o en presencia de la proteína rapsina, o de la agregación del gangliósido GM1, no exhibió tal preferencia por los dominios tipo-rafts. La composición lipídica de las fracciones DRM y DSM obtenidas a partir de liposomas compuestos sólo por fosfatidilcolina:esfingomielina:colesterol en proporciones equimolares, o por la mismo mezcla de lípidos con γM4 o AChR incorporado, estaba enriquecida en todos los casos en colesterol y esfingomielina en la fracciones DRM, y enriquecidas en fosfatidilcolina en las fracciones DSM. Estos resultados demuestran que la composición lipídica de estas fases depende principalmente de las propiedades de los lípidos que las componen. Sin embargo, la proporción de cada dominio de lípidos depende de la presencia del AChR o del péptido γM4. El AChR produjo un aumento significativo en la cantidad total de la fracción DSM, con una reducción concomitante en la cantidad total de la fracción DRM. Por otra parte, γM4 aumentó la proporción de la fracción DRM. Por lo que inferimos que el péptido γM4 actuaría como un promotor de DRM y el AChR completo, por el contrario, actua-ría como un perturbador de DRM. La eficiencia de la transfe-rencia de energía resonante de Förster entre la fluorescencia intrínseca de la proteína (o del péptido) y el dehidroergosterol (mimético fluorescente del colesterol) sirve como una medida de la localización de la proteína en la membrana. La sonda fluorescente Laurdan como aceptora se utilizó como control, ya que no muestra ninguna partición preferencial por un dominio en particular. Los valores de la denominada polariza-ción generalizada, calculados a partir de los espectros de fluorescencia de la sonda Laurdan, fueron utilizados como informativos de las condiciones biofísicas de cada membrana. El AChR purificado no tuvo una partición preferencial entre dominios rafts (dominios enriquecidos en colesterol) y domi-nios no-rafts, mientras que el péptido γM4 se particionó preferentemente en dominios rafts. Podemos inferir que la predilección del AChR en su medio natural por un dominio dado de lípidos no puede ser atribuida exclusivamente a las propiedades fisicoquímicas de ambos o a las interacciones entre el dominio TM de la proteína y el ambiente lipídico, por lo que debería haber señales exteriores en las membranas celulares nativas que direccionen al AChR hacia un dominio de membrana específico. / The nicotinic acetylcholine receptor (AChR) is an integral membrane protein, in intimate contact with the lipids in its native membrane. The aim of the present Thesis was to analyze the possibility that it is the intrinsic properties of the AChR that determine its partition into a given lipid domain. For this purpose we chose the best characterized AChR, the one from Torpedo electric tissue. The AChR purified from Torpedo californica was reconstituted into model membranes with defined proportions of cholesterol, sphingomyelin and phosphatidylcholine, and analyzed by biochemical and biophysical techniques. The synthetic γM4 peptide was studied using the same experimental approach to learn about the contribution of the lipid-contacting transmembrane outer ring to the putative lateral segregation of the AChR in the membrane. The distribution of the AChR or the γM4 peptide was assessed by Triton X-100 extraction of the liposomes combined with centrifugation to yield detergent-resistant membranes (DRMs). These fractions have been postulated to correspond to the biochemical homolog of the lipid rafts domains that preexist in the cellular plasma membrane. Counterparts of those fractions, non-raft domains, are detergent soluble membranes (DSM). The influence of rapsyn (a peripheral protein involved in AChR aggregation) or that of aggregation of raft-like domains (using membranes containing the ganglioside GM1 followed by GM1 crosslinking) was also studied. The γM4 peptide displays a marked preference for raft-like domains. In contrast, the AChR alone or in the presence of rapsyn or ganglioside aggregation exhibits no such preference for raft-like domains. The lipid composition of the DRM and DSM fractions obtained from liposomes composed of the equimolar phosphatidylcholine: sphin-gomyelin:cholesterol mixture alone, or the same lipid mixture with γM4 or AChR, were all enriched in cholesterol and sphingomyelin in the DRM fractions, and enriched in phosphatidylcholine in the DSM fractions. These results indicate that the lipid composition of these phases depended mainly on the properties of the lipid. However, the amount of each lipid domain depends on the presence of the AChR or the γM4 peptide. The AChR macromolecule caused a significant increase in the total amount of the DSM fraction, with a concomitant reduction in the total amount of the DRM fraction. On the other hand, the presence of the γM4 increased the proportion of the DRM fraction. Thus, the γM4 peptide appears to behave as a DRM promoter and the AChR as a DRM disruptor. The efficiency of the Förster resonance energy transfr (E) between the protein (or peptide) intrinsic fluorescence and dehydroergosterol (a fluorescent cholesterol mimetic) served as a measure of the protein location in the membrane. Using the fluorescent probe Laurdan as a control acceptor -as it shows no preferential partition into a particular domain- the so-called generalized polarization values calculated from the Laurdan fluorescence spectra were used as a reporter of the biophysical properties of te membrane. Purified AChR displayed no preferential partition between rafts (domanins enriched in cholesterol) and non-rafts domains, whereas the y M4 peptide preferentially partitioned into raft domains. Putting all the data together, it can be inferred that the preference of the AChR for a given lipid domain in its natural milieu cannot be solely ascribed to the physicochemical properties of the two partners or to the interactions between the protein transmembrane domain and the lipid moiety, and that there must therefore be an external signal in native cell membranes that directs the AChR to a specific membrane domain.

El receptor de acetilcolina nicotínico (AChR) es un canal iónico activado por ligandos, presente en el sistema nervioso central y en la unión neuromuscular. Su estabilidad en la membrana celular es de suma importancia, ya que determina el nivel de respuesta colinérgica, que puede ser alterada ante diversas situaciones fisiológicas y patológicas. En esta Tesis utilizamos como modelo experimental a las células CHO-K1/A5, una línea celular que expresa de forma estable al AChR muscular adulto. En el primer capítulo nos centramos en el estudio de la posible acción de los diacilgliceroles (DAG) sobre la expresión/distribución del AChR. Realizamos los experimentos con el dioctanoilglicerol (DOG), y definimos dos tiempos de tratamiento, a los que denominamos tiempos cortos (3-4 hs) y largos (18 hs) de incubación. A tiempos cortos, el DOG aumenta los niveles de AChR presentes en la superficie celular, mientras que a tiempos largos los disminuye con el concomitante aumento de los AChR intracelulares. A su vez, el incremento de los DAG endógenos como consecuencia de la alteración de diversas vías metabólicas, afecta de igual manera al AChR a tiempos cortos. Como el tratamiento con un éster de forbol, molécula análoga al DAG por su capacidad de interaccionar con los dominios C1 de diversas proteínas, resultó en los mismos cambios sobre la distribución del AChR, concluimos que los efectos del DOG eran debidos a su papel como segundo mensajero lipídico. Mediante el empleo de inhibidores enzimáticos y de anticuerpos específicos para las proteínas quinasas C (PKC) clásicas, las PKC noveles y las PKD, determinamos que los DAG a tiempos cortos de incubación favorecerían la inhibición de las PKCc al favorecer su desfosforilación, y esto disminuiría la internalización del AChR. Por otra parte, el estímulo con DOG a tiempos largos de las distintas PKC estudiadas, provocaría el efecto opuesto. El segundo capítulo se centró en el estudio de la distribución de los clústeres de AChR, generados por la unión de anticuerpos, en dominios lipídicos con diferentes valores de polarización generalizada (GP). Esta medición se realizó gracias a la tinción de las células con di-4-ANEPPDHQ, una sonda fluorescente capaz de poner en evidencia los cambios en la polaridad de la membrana, relacionados a un orden de membrana determinado. La depleción del colesterol (Col) disminuye los valores promedio de la GP de la membrana, aumentando en consecuencia la asociación de los clústeres de AChR a dominios de membrana más desordenados. Por otra parte, la despolimerización del citoesqueleto de actina con Latrunculina A, produce el efecto contrario al aumentar la asociación de los acúmulos de AChR con dominios de membrana más ordenados. Estos resultados indican que la distribución del AChR en la superficie celular depende del contenido de Col y de la integridad del citoesqueleto de actina. Por otra parte, el AChR se internaliza en pequeñas vesículas con valores bajos de la GP y bajo contenido de Col, situación que se mantiene frente a la depleción del Col producida por el tratamiento con metil-β-ciclodextrina, demostrando entonces que la endocitosis del AChR requiere de la disociación previa del receptor con dominios ricos en Col presentes en la membrana. / The nicotinic acetylcholine receptor (AChR) is a ligand-gated ion channel, present at the neuromuscular junction and central nervous synapses. Its stability at the cell membrane is important in determining cholinergic responses and can be altered under physiological and pathological conditions. In this thesis, we used CHO-K1/A5 cells, a cell line that expresses the adult muscle AChR in a stable manner. In the first chapter, we focus on the study of the possible effects of diacylglycerols (DAGs) on expression/distribution of AChR. We performed experiments with dioctanoylglycerol (DOG), and define two treatment times, which we name short (3-4 h) and long (18 h) incubation times. DOG increases AChR levels on the cell surface at short incubation times. At long treatment times however, surface AChRs decrease with the concomitant increase of intracellular AChRs. Besides, endogenous DAGs increase due to the alteration of various metabolic pathways, equally affecting AChR at short times. Since treatment with a phorbol ester, a DAG analogous because of its ability to interact with the C1 domain of different proteins, resulted in similar changes on AChR distribution, we conclude that DOG effects were due to its role as a lipid second messenger. By using specific enzyme inhibitors and antibodies to classical and novel protein kinases C (PKC) and PKD, we determined that DAGs inhibit PKCc by promoting its dephosphorylation at shorter incubation times, and thus the internalization of AChR decreases. Moreover, DOG stimulation of different PKCs at long treatment times, causes the opposite effect. The second chapter is focused on the study of AChR clusters distribution, generated by antibody binding, at lipid domains with different generalized polarization (GP) values. This measurement was performed by staining cells with di-4-ANEPPDHQ, a fluorescent probe that senses changes in the polarity of the membrane, related to membrane order. Cholesterol depletion diminishes the mean cell membrane di-4- ANEPPDHQ GP and concomitantly the number of AChR clusters associated with more disordered membrane domains increases. Depolymerization of the filamentous actin cytoskeleton by Latrunculin A has the opposite effect, with more AChR clusters associated with more ordered domains. In conclusion, the distribution of AChR submicron-sized clusters at the cell membrane depends on cholesterol content and cytoskeleton integrity. AChR internalizes via small vesicles having lower GP and lower cholesterol content than cell surface. This also occurs upon cholesterol depletion by methyl-β-cyclodextrin. Thus, AChR endocytosis is primed by receptor dissociation from Chol-rich plasmalemma domains.