Nas últimas décadas, com aumento da industrialização e o uso mais intenso de práticas agrícolas, está havendo a liberação de altas quantidades de elementos potencialmente tóxicos na biosfera, como o metal pesado cádmio (Cd), que é muito tóxico à maioria dos organismos. Uma alternativa para solucionar este problema é o uso da fitoextração, que se baseia no cultivo de plantas para recuperar áreas degradadas. Porém, atualmente, poucas espécies de plantas foram descritas como hiperacumuladoras de Cd e há pouca informação sobre os mecanismos envolvidos na tolerância das plantas dessas espécies a altos teores deste metal em seus tecidos. Assim, o objetivo deste trabalho foi identificar e caracterizar novas espécies da família Solanaceae hiperacumuladoras de cádmio e os respectivos genes relacionados à sua absorção, translocação e acúmulo em plantas. Utilizaram-se três estratégias de análise. Inicialmente foram identificadas novas espécies hiperacumuladoras de Cd. Após, realizou-se um estudo na espécie modelo Arabidopsis thaliana para identificar genes relacionados a absorção, translocação e acúmulo de Cd nas plantas e, finalmente, buscou-se a aplicação dos conhecimentos obtidos em A.thaliana em duas espécies identificadas neste trabalho como hiperacumuladoras de Cd. Foram identificadas e caracterizadas duas espécies hiperacumuladoras de plantas, Solanum americanum e Solanum lycopersicum (tomate), cultivares Micro-Tom e Gaúcho. Os resultados obtidos evidenciaram que os genes HMA2 e HMA3 de A. thaliana estão relacionados ao processo de acúmulo de Cd na parte aérea da planta. Nesse estudo, foram identificados genes ortólogos aos genes HMA2 e HMA3 de A. thaliana em tomate, cv. Micro-Tom. A análise dos genes HMA2 e HMA3 indica alteração de suas expressões quando as plantas são expostas a Cd, sugerindo a participação desses genes em algum mecanismo de tolerância do tomate a esse metal pesado. Estudos de análise funcional dos genes identificados (HMA2 e HMA3) em tomate, cv. Micro- Tom, será importante para comprovar a importância desses dois genes nos processos de detoxificação e acúmulo de Cd nos tecidos das plantas. / In recent decades, with increasing industrialization and more intensive management of agricultural practices, the release of large quantities of potentially toxic elements in the biosphere has also increased, such as the heavy metal cadmium (Cd), which is extremely toxic element to most organisms. An alternative to solve this problem is phytoextraction, which is based on the use of plants to recover degraded areas. But so far, few plant species have been described as a Cd hyperaccumulator and there is little information about the mechanisms that allow these plants to tolerate high levels of this methal in their tissues. The aim of this study was to identify and characterize new species of Solanaceae Cd hyperaccumulators species and the genes related with Cd absorption, translocation and accumulation in these plants. Three strategies were used. First, Cd hyperaccumulators species were identified. Then, a study in the model specie Arabidopsis thaliana was performed to indentify genes related to Cd absorption, translocation and accumulation and, finally, we tried to apply the knowledge obtained in A. thaliana to two species described here as Cd hyperaccumulators. Two new Cd hyperaccumulator plant species were identified and characterized, Solanum americanum and Solanum lycopersicum (tomato), cultivar Micro-Tom and Gaucho. In this study, the A. thaliana genes HMA2 and HMA3 were related to the process of shoot Cd accumulation. From this result, we identified orthologous genes in tomato cv. Micro-Tom to the A. thaliana genes HMA2 and HMA3. The analysis of these genes indicates change in their expressions patterns when plants are exposed to cadmium, suggesting their participation in some mechanism of tolerance of this species to heavy metal. Functional analysis studies of identified genes (HMA2 and HMA3) in tomato cv. Micro-Tom will be important to demonstrate the importance of these two genes in the process of detoxification and accumulation of Cd in tissues.

A superfamília das fosfolipases A2 (FLA2) é composta por proteínas dotadas de propriedades diferenciadas que as tornam capazes de apresentar distintas atividades biológicas, além de sua atividade catalítica. Esta diversidade funcional é intrigante devido à alta similaridade de seqüência primária e de estrutura entre essas proteínas. O principal objetivo deste trabalho é o desenvolvimento de uma metodologia para a predição de atividades biológicas específicas em FLA2 de peçonha de serpentes a partir da análise de seqüências primárias. A metodologia desenvolvida compreende: a) seleção de seqüências anotadas quanto à função ou atividade biológica que desempenham; b) detecção e validação estatística de motivos de seqüência relacionados à atividade estudada; e c) construção de Modelos Ocultos de Markov (MOMs) representando cada motivo. MOM consiste em uma modelagem estatística que tem sido aplicada com sucesso em diversas áreas onde se faz necessária a detecção e representação de padrões de informação; por sua base matemática robusta e formal, pode ser utilizada na automação deste tipo de processo. A metodologia foi testada para duas atividades de FLA2 de peçonha de serpente: neurotoxicidade e miotoxicidade. Para as FLA2 neurotóxicas, foram detectados seis motivos conservados, dos quais três foram validados estatisticamente como sendo adequados na discriminação de seqüências neurotóxicas de não neurotóxicas. Para as FLA2 miotóxicas, foram detectados seis motivos conservados, dos quais quatro foram validados. Os MOMs dos motivos validados podem ser usados na predição de atividade neurotóxica e miotóxica. As relações entre seqüência, estrutura, função e evolução das FLA2s são discutidas. Os dados obtidos foram coerentes com a hipótese apresentada por Kini (2003), da existência de diferentes sítios farmacológicos na superfície das FLA2, interagindo independente ou cooperativamente com diferentes receptores, para gerar as diversas funções biológicas observadas. Por não haver, até o momento, qualquer ferramenta automatizada para a predição de função biológica de FLA2, os resultados deste trabalho foram a base para a construção de uma ferramenta (disponível em www.cbiot.ufrgs.br/bioinfo/phospholipase) para a identificação de miotoxicidade e neurotoxicidade em FLA2.

A necessidade de modificar a matriz energética, fortemente dependente de combustíveis fósseis, está impulsionando estudos que visam buscar alternativas mais sustentáveis. Uma alternativa promissora é a utilização de processos biotecnológicos para a conversão de resíduos lignocelulósicos agroindustriais ricos em celulose (casca de soja, casca de arroz, bagaço de cana-de-açúcar, entre outros) a açúcares fermentescíveis para uma posterior fermentação a etanol de segunda geração. Neste contexto, o presente trabalho tem por objetivo estudar a capacidade de conversão dos açúcares provenientes de biomassas hidrolisadas por diferentes leveduras e avaliar a utilização de líquidos iônicos na dissolução de materiais lignocelulósicos. Desta forma, a capacidade de bioconversão dos açúcares contidos no hidrolisado de casca de arroz (RHH) e em meio sintético a etanol foi avaliada utilizando a levedura Candida shehatae e sua co-cultura com Saccharomyces cerevisiae. Este estudo foi realizado em agitador orbital e biorreator. Nos experimentos utilizando co-cultura e agitador orbital o rendimento de etanol (YP/S) foi de 0,42 e 0,51 g g-1 em meio sintético simulando a composição do hidrolisado e em RHH, respectivamente. Utilizando culturas puras de C. shehatae nas mesmas condições, o rendimento de etanol foi de 0,40 g g-1. Determinadas leveduras tem seu metabolismo alterado com a variação de oxigenação do meio. Com o intuito de realizar esta avaliação, experimentos em anaerobiose e com limitação de oxigênio foram realizados em biorreatores. Nestas condições e utilizando as leveduras em co-cultura foi possível obter rendimentos de etanol similares (0,50-0,51g g-1) em meio sintético, enquanto que em RHH, rendimentos de 0,48 e 0,44 g g-1 foram obtidos, respectivamente. Assim como o RHH, o hidrolisado de casca de soja também pode ser uma alternativa para este desenvolvimento. Foi investigada a capacidade de uma linhagem recentemente isolada de Candida guilliermondii converter hexoses e pentoses a partir de hidrolisado ácido/enzimático de casca de soja em etanol. As condições operacionais e suplementação do meio de cultivo foram otimizados utilizando planejamentos experimentais estatísticos (Plackett-Burman e CCD). Os resultados demonstraram que a C. guilliermondii BL 13 foi capaz de crescer em hidrolisado nãosuplementado, não-detoxificado, e as melhores condições de cultivo foram 28 °C, pH 5 e um tamanho de inóculo de 109 UFC ml-1. A produtividade do etanol atingiu um máximo de 1,4 g h-1 L-1e o rendimento de 0,41 g g-1. Para que os materiais lignocelulósicos sejam utilizados em processos destinados à produção de etanol, uma etapa de pré-tratamento é necessária a fim de desorganizar a estrutura deste material facilitando a sacarificação dos açúcares. Com esta finalidade e pensando na utilização de recursos renováveis, foram utilizados no pré-tratamento de casca de soja líquido iônico (LI) de acetato de 1-butil-3-metilimidazólio ([bmim][Ac]). Desta forma, a fim de otimizar o processo de dissolução da celulose, os efeitos da temperatura, tempo de incubação, da relação sólido/líquido (biomassa/IL) e a concentração de líquido iônico (mistura de IL-água) foram avaliadas utilizando um planejamento composto central (CCD). A biomassa regenerada foi analisada por espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR). A eficiência do pré-tratamento foi quantificada através da glicose liberada após hidrólise enzimática utilizando um complexo celulolítico produzido por Penicillium echinulatum em comparação a casca de soja não tratada (matriz celulolítica). O hidrolisado do ponto ótimo foi utilizado em processo fermentativo com C. shehatae HM 52,2. As condições ótimas foram de 75 °C, 165 minutos de tempo de incubação, 57 % (fração de massa) de [bmim] [Ac] e 12,5 % de carga sólida. As análises de FTIR demonstraram que a casca de soja teve uma perda na cristalinidade de sua estrutura. A utilização do complexo enzimático no processo de hidrólise da biomassa conseguiu liberar 92 % da glicose da matriz celulósica e foi obtido uma conversão de glicose em etanol com rendimento de 0,31 (g g-1). As alterações na estrutura da biomassa regenerada após tratamento com os líquidos iônicos cloreto de 1-butil-3-metilimidazólio ([bmim][Cl]) ou acetato de 1-butil-3- metilimidazólio ([bmim][Ac]) também foram estudadas. A caracterização foi realizada por uma combinação de análise termogravimétrica (TGA), análise de espectroscopia de absorção no infravermelho por Transformada de Fourier (FTIR), difracção de raios X (XRD) e por microscopia electrônica de varredura (MEV). Os tratamentos foram estudados utilizando diferentes tempos de tratamento (2 h e 6 h), diferentes temperaturas (75 °C e 100 °C) e variações na concentração de LI (50 % e 100 %). Os resultados sugerem que a casca de soja apresenta uma maior perda da cristalinidade do que a casca de arroz. A alta recalcitrância da casca de arroz devido a sílica presente pode explicar a pequena redução na cristalinidade desta biomassa. Observou-se que a dissolução da biomassa lignocelulósica sofreu influencia do tipo de biomassa e LI utilizado, temperatura, tempo e proporção LI-água. / The necessity of changing energy matrix, which is highly dependent on fossil fuel, it is booking studies wich seek more sustainable alternatives. One promising alternative is the use of biotechnological processes from the conversion of lignocellulosic agroindustrial waste rich in cellulose (soybean hulls, rice hull, bagasse, etc.) to fermentable sugars for subsequent fermentation second-generation ethanol. In this context, the present work has the goal to study the capacity of the conversion sugars coming from biomass hydrolyze by different yeasts and evaluates the use of ionic liquids on the dissolution of lignocellulosic materials.Thus, the capacity of the sugars bioconversion contained in the rice hull hidrolisate (RHH) and in synthetic medium for ethanol was evaluated using the yeast Candida shehatae and their co-culture with Saccharomyces cerevisiae. This study was carried in an orbital shaker and bioreactor. In co-culture experiments using orbital shaker the ethanol yields (Y P/S) was 0.42 and 0.51 g g-1 in synthetic medium simulating the sugar composition of RHH and in RHH, respectively. By using pure cultures of C. shehatae in the same conditions the ethanol yield was 0.40 g g-1. Certain yeasts have their altered metabolism by varying the oxygenation of the medium. In order to accomplish this evaluation experiments under anaerobic conditions and with limited oxygen were performed in bioreactors. In those conditions and by using the yeast in co-culture, it was possible to obtain similar ethanol yields of (0.50 to 0.51 g g-1) in the synthetic medium, while in RHH, yields of 0.48 and 0.44 g g-1 were obtained respectively.The ability of a newly isolated strain of Candida guilliermondii BL13converting hexoses and pentoses from the soybean hull hydrolysate acid / enzyme in ethanol was investigated. The operating conditions and supplementation of the culture medium were optimized using statistical experimental design (Plackett-Burman and CCD). The results bring to us the conclusion that C. guilliermondii BL 13 was able to grow on non-supplemented and non-detoxified hydrolyzate, and best culture conditions were 28 °C, pH 5 and inoculum size of 109 CFU ml-1. The ethanol productivity reached a maximum of 1.4 g L-1 h-1, and the yield of 0.41 g g-1. For that lignocellulosic materials was used in processes for the production of ethanol, a pretreatment step is required in order to disrupt the structure of this material facilitating the saccharification of sugar. With this purpose, and considering the use of renewable resources were used in the pretreatment of soybean hulls with ionic liquid (IL) 1-butyl-3-methylimidazolium acetate ([bmim][Ac]). Thus, in order to optimize the dissolution of the cellulose process, the effects of temperature, incubation time, the solid / liquid ratio (biomass / IL), and the concentration of ionic liquid (IL-water mixture) were evaluated using a central composite design (CCD). The regenerated biomass was analyzed by Fourier transform infrared (FTIR) analysis. The effectiveness of the pretreatment was measured by glucose released after enzymatic hydrolysis using a cellulolytic complex produced by Penicillium echinulatum in untreated soybean hulls comparison (cellulolsic matrix). The hydrolyzate was used in optimum fermentation with C. shehatae HM 52.2. Optimal conditions were 75 °C, 165 minutes of incubation time, 57 % (mass fraction) of [bmim][Ac] and 12.5 % of solid. The FTIR analysis showed that soybean hulls had a loss in the crystallinity of its structure. The use of the enzyme complex in the biomass hydrolysis process achieved 92 % of the glucose release the cellulosic matrix was obtained and an ethanol conversion of glucose to yield 0.31 (g g-1).The changes in the structure of the regenerated biomass after treatment with ionic liquids 1-butyl-3-methylimidazolium chloride ([bmim][CI]) or 1-butyl-3- methylimidazolium acetate ([bmim][Ac]) were also studied. The characterization was done by a combination of thermogravimetric analysis (TGA), Fourier transform infrared (FTIR) analysis, X-ray diffraction (XRD) and scanning electron microscopy (SEM). The treatments were studied using different treatment times (2h and 6h), different temperatures (75 °C and 100 °C) and different IL concentration (50 % and 100 %). The results suggest that soybean hull has a higher loss of crystallinity than rice hull. The high recalcitrance of rice hull, due to silica present, may explain the low decrystallization this biomass. It was observed that the dissolution of the lignocellulosic biomass has undergone the influence of the type of biomass used and IL, temperature, time and ratio IL-water.

Em trigo, os genes de tolerância ao alumínio tóxico (Al3+) tem sido identificada no cromossomo 4DL, incluindo o gene presente em BH1146, o mais estudado dos genótipos tolerantes brasileiros. Embora Toropi tenha sido identificado como um genótipo altamente tolerante ao Al3+, a genética e a singularidade dessa fonte nunca tinha sido investigada. Os objetivos desse estudo foram investigar a genética da tolerância ao Al3+ em Toropi e verificar se o gene é o mesmo presente em BH1146; mapear quantitative trait loci (QTLs) associados à tolerância ao alumínio em Toropi e investigar suas localizações no genoma de trigo e desenvolver uma biblioteca de subtração de Toropi objetivando identificar genes candidatos regulados por estresse de alumínio. Duas populações de linhagens recombinates (recombinant inbred line – RIL), uma F7 de Toropi (tolerante) por Anahuac (sensível) e outra F6 RIL de Toropi por BH1146 foram avaliadas quanto à tolerância ao alumínio, avaliando a taxa de crescimento da raiz após tratamento com alumínio em solução hidropônica. A segregação genética indica a presença de um gene principal para tolerância ao Al3+, denominado AltTp, que difere do gene presente em BH1146. AltTp está a 21cM do marcador microssatélite Xgdm129, previamente mapeado no cromossomo 4DS. Linhagens nulitetrassômicas e ditelossômicas foram utilizadas para confirmar a posição do AltTp no braço curto do cromossomo 4D de trigo. Este é o primeiro estudo reportando a presença de um gene para tolerância ao Al3+ em trigo no cromossomo 4DS, confirmando a singularidade de Toropi como fonte de genes para essa característica. Outros QTLs foram identificados nesse estudo, incluindo um presente no cromossomo 3B de trigo que corresponde ao cromossomo 1 de arroz, onde foram identificados os maiores QTLs para a tolerância ao Al3+ nessa espécie. Cento e nove sequências foram obtidas pela análise de Supression Subtractive Hybridization (SSH), sendo 99 sequências únicas. Análises de seqüências revelaram genes envolvidos em diversas vias metabólicas incluindo metabolismo de ácidos orgânicos e carboidratos, transdução de sinais, fatores de transcrição, biossíntese de proteínas, proteínas envolvidas na aliviação de estresse oxidativo, estrutura de membrana e outras funções. É possível que AltTp seja o gatilho para uma cascata de resposta ao estresse de Al3+ que envolve vias de sinalização e metabólicas complicadas. Esses genes de resposta ao estresse de trigo fornecem uma visão sobre o mecanismo de tolerância ao Al3+ em plantas. / In wheat most of the of aluminum tolerance genes have been identified on chromosome 4DL, including one present in BH1146, the most studied wheat Brazilian tolerant genotype. Although Toropi has been identified as a highly tolerant genotype to Al3+, the genetics and uniqueness of this source has never been investigated. The objectives of this study were to investigate the genetics of Toropi aluminum tolerance and its uniqueness compared to AltBH gene present in BH1146; to map the quantitative trait loci (QTLs) associated to Toropi aluminum tolerance and investigate their genome locations in wheat; and to develop a differential library from Toropi aiming to identify candidate genes regulated by aluminum stress. Two recombinant inbreed line populations (RILs), one F7 from Toropi (tolerant) by Anahuac (sensitive) and another F6 RIL from Toropi by BH1146, were screened for Al-tolerance by mensuring root growth rate following Al treatment in hidroponic solution. Genetic segregations indicated the presence of a major gene for aluminum tolerance in Toropi, named as AltTp, which differs from the one present in BH1146. AltTp is 21cM from Xgdm129 SSR marker, which has been previously mapped on chromosome 4DS. Nulitetrasomic and ditelosomic lines were used to confirm AltTp position on the wheat short arm of chromosome 4D. This is the first study to report a gene for aluminum tolerance in wheat on chromosome 4DS, confirming the uniqueness of Toropi as a genetic source for this trait. Other QTLs were identified in this study, including one present on wheat chromosome 3B which corresponds to rice chromosome 1, where most of aluminum tolerance QTLs have been identified in that species. One-hundred and nine sequences were obtained by the analysis of Supression Subtractive Hybridization (SSH), being 99 unique ones. Sequence analysis has revealed genes involved in several metabolic pathways including organic acid and carbohydrates metabolism, signal transduction, transcription factors, protein biosynthesis, oxidative stress alleviation, membrane structure and other functions. It is possible that AltTp triggers a cascade of responses to aluminum stress, which involves complex signaling and metabolic pathways. These wheat response stress genes provide new insights about Al-tolerant mechanisms in plants.

No presente trabalho está descrita a análise de experimentos de microarranjos de DNA realizados pelos pesquisadores do Projeto GENOLYPTUS em conjunto com a empresa NimbleGen Systems Inc. (Reykjavik, Iceland), assim como a validação dos resultados gerados por essa análise, com a finalidade de encontrar genes diferencialmente expressos entre folhas e xilema de E. grandis para futuro estudo. O processo de análise dos microarranjos de DNA envolveu a busca por um software com programas estatísticos adequados ao estudo de grande quantidade de dados com mínima probabilidade de erro. A comprovação dos resultados gerados pelo software escolhido foi realizada com o uso da técnica da reação em cadeia da DNA-polimerase quantitativa (em tempo real) precedida de transcrição reversa (qRT-PCR). Alguns dos genes mais diferencialmente expressos foram selecionados para esta etapa, juntamente com alguns genes com expressão não tão alta. Os genes mais expressos nas folhas que foram escolhidos codificam para; (i) uma proteína semelhante à metalotioneína do tipo 3 (MT-3); (ii) uma glicolato-oxidase; (iii) uma catalase; (iv) uma fosforribulocinase precursora de cloroplasto (PRK); (v) um fator de transcrição MYB do tipo MYB142 e, (vi) uma proteína tipo “dedo-de-zinco”. Os genes mais expressos no xilema escolhidos foram os que codificam (i e ii) duas proteínas expressas em Arabidopsis thaliana; (iii) uma proteína hipotética expressa em Nicotiana benthamiana; (iv) uma descarboxilase de UDPglicuronato do tipo 2, (v) uma quitinase do tipo ELP; (vi) uma celulosesintase tipo 3; (vii) um fator de transcrição MYB; (viii) uma cafeoil-CoA-3- O-metiltransferase (CCoAOMT) e; (ix) uma proteína rica em prolina híbrida do tipo 2 (HyPRP2). Os resultados das qRT-PCRs demonstraram que o experimento de microarranjo e seus resultados foram consistentes e válidos, embora os primeiros tenham demonstrado valores de expressão freqüentemente mais altos. Acreditamos que tanto a análise dos microarranjos de DNA quanto a equivalência das amostras (duplicatas) biológicas estudadas foram totalmente sustentadas pelos resultados da qRT-PCR, pois foram robustas o suficiente para estimar um grande número de genes simultaneamente e indicar aqueles mais importantes como candidatos para futuras análises. / In the present work it is described the analysis of DNA microarray experiments developed by GENOLYPTUS researchers together with Nimblegen Systems Inc. (Reykjavik, Iceland), as well as the validation of the generated results with the aim to find differentially expressed genes between leaves and xylem tissue of E. grandis for further study. The DNA microarray analysis process comprised the search for software containing statistical programs satisfactory for studying an enormous amount of data with a very low false discovery rate. The confirmation of the generated data by the chosen software was made with the use of quantitative (real-time) reverse-transcription followed by polymerase chain reaction (qRT-PCR). Some of the most differentially expressed genes were selected for this step, along with some genes with average expression. Leaf chosen genes were those that codify (i) a metallothionein-like protein type 3 (MT-3), (ii) a glycolate oxidase, (iii) a catalase, (iv) a precursor phosphoribulokinase (PRK) from chloroplast, (v) a MYB transcription factor (MYB142), and (vi) a CONSTANS-LIKE 16 zincfinger protein. Xylem chosen genes were those codifying (i and ii) two expressed proteins from Arabidopsis thaliana, (iii) a hypothetic protein expressed in Nicotiana benthamiana, (iv) a putative UDP-glucuronate decarboxylase type 2, (v) a chitinase type ELP (ectopic deposition of lignin in pith), (vi) a cellulose synthase type 3, (vii) a MYB transcription factor, (viii) a caffeoyl-CoA 3-O-methyltransferase (CCoAOMT), and (ix) a hybrid proline-rich protein type 2 (HyPRP2). Our qRT-PCR results proved the full consistency and validation of the microarray experiments, although the relative expression ratios of the first were often higher. We believe that our microarray analysis as well as the equivalence of biological samples (duplicates) were fully supported by the qRT-PCR findings since they were robust enough to evaluate a massive number of genes and able to point out important candidate genes.

Ureases (EC 3.5.1.5) são amplamente distribuídas em bactérias, fungos e plantas onde sua função biológica não é completamente conhecida. Acredita-se que ureases estejam envolvidas na biodisponibilidade de nitrogênio e mecanismos de defesa contra predadores e patógenos. Plantas de soja Glycine max (L.) Merril contêm duas isoformas de urease. Neste trabalho, clonamos e seqüenciamos um fragmento de 300 pb que corresponde a uma região interna do gene de urease. Relatamos, também, a utilização de um gene de soja como modo de gerar resistência a doenças fúngicas em plantas. Plantas transgênicas de tabaco (Nicotiana tobacum var. Turkish) contendo o cDNA codificador completo da urease ubíqua de soja sob a regulação do promotor 35S do vírus do mosaico da couveflor (CaMV) e do terminador do gene da nopalina sintase, foram geradas a partir da transformação de discos foliares por Agrobacterium tumefaciens. Extratos proteicos obtidos a partir das folhas das plantas transgênicas foram analisados quanto à atividade ureásica e à imunorreatividade contra anticorpos da urease do feijão-de-porco. A habilidade dos extratos proteicos em inibir o crescimento de fungos fitopatogênicos foi comparada com a atividade fungicida da urease embrião-específica isolada de sementes tipo-selvagem. Nossos resultados demonstraram a atividade antifúngica de ambas as isoformas de urease e apresentaram uma correlação positiva entre a inibição do crescimento de fungos e o conteúdo/atividade da urease ubíqua de soja recombinante. Os dados sugerem que a superexpressão da urease, em plantas transgências, pode auxiliar na resistência das plantas contra fungos fitopatogênicos, além de seus efeitos conhecidos sobre insetos. / Ureases (EC 3.5.1.5) are largely distributed in bacterial, fungi and plants, where theis physiological role is not completely understood. It is thought that ureases are involved in nitrogen bioavailability and defense mechanisms against predators and pathogens. Soybean [Glycine max (L.) Merril] plants contain two isoforms of urease. Here we describe the cloning and sequencing of a fragment of 300 bp corresponding to an internal region of one of the soybean urease genes. Here we also reported the employment of a gene from soybean as a tool to confer resistance to fungal diseases in plants. Transformed tobacco (Nicotiana tobacum var. Turkish) plants harbouring the full length cDNA encoding the soybean ubiquitous urease under the control of the Cauliflower Mosaic Virus (CaMV) 35S promoter and the nopaline synthase gene (nos) terminator were obtained after leaf disc transformation by Agrobacterium tumefaciens. Leaf protein extracts of transgenic plants were analyzed for urease activity and immunoreactivity against antibodies to the jackbean urease. The ability of leaf protein extracts to impair growth of selected phytopathogens was compared to the fungicidal activity of the embryo-specific urease isolated from wild-type seeds. Our results demonstrated the antifungal activity of both soybean ureases and showed a positive correlation between the inhibiton of fungal growth and content/activity of the recombinant soybean ubiquitous urease in leaves of transgenic tobacco. The data suggest that urease overexpression in transgenic plants may help to improve plant resistance against phytopathogenic fungi, besides its known effect on insects.

A produção de oleoresina (uma complexa mistura de mono, sesqui e diterpenos) por espécies de coníferas é uma resposta de defesa contra ataques por insetos e microrganismos patogênicos. A extração de oleoresina de Pinus elliottii é também uma importante atividade econômica, pois seus derivados voláteis, terebintina (mono e sesquiterpenos) e breu ou rosina (diterpenos), encontram diversas aplicações na indústria química e farmacêutica. O processo de extração de oleoresina é baseado na realização de estrias seqüenciais na casca, expondo a interface entre o xilema secundário e o floema. O ferimento ativa a liberação de resina dos ductos resiníferos, sendo aplicada sobre a estria uma pasta comercial estimuladora de resina que contém ácido sulfúrico e um precursor do etileno, os quais favorecem o fluxo do produto. Até o presente estudo, havia escassez de informação sobre a fisiologia da produção de resina em Pinus no sul do Brasil. Neste trabalho foi realizada a investigação da produção sazonal de oleoresina por Pinus elliottii em diferentes sítios florestais, bem como avaliado o papel de possíveis agentes moduladores da produção de resina, selecionados com base eu seu papel fisiológico geral em plantas, para inclusão em pastas estimulantes de resina. Foram monitoradas mais de 5000 árvores. Os resultados mostraram que o desempenho de produção é afetado pela temperatura e condições edáficas, sendo que o melhor rendimento está associado às estações mais quentes e a solos relativamente pobres e/ou temporariamente alagados. A produção de inverno, estação normalmente não incluída no ano de resinagem, no entanto, foi expressiva. Dentre os agentes testados como adjuvantes da pasta estimuladora de resina, destacaram-se auxina (2-4-D), ácido salicílico e extrato de levedura. Em determinadas concentrações e estações do ano estes adjuvantes agregados à pasta foram superiores na capacidade de indução de resina em relação à pasta comercial. Alguns deles (como auxina e ácido salicílico) foram capazes de substituir o precursor de etileno com rendimento de resina equivalente ou superior. Os custos dos adjuvantes de pasta identificados são bastante vantajosos em relação aos atualmente usados. Os resultados indicaram que o componente induzido da resina de P. elliottii possui expressiva importância, mostrando que a espécie utilizada não só é componente constitutivo de resina em respostas de defesa.

ERO são produzidas continuamente por organismos aeróbicos. Em situações de estresse, a produção de ERO é aumentada, podendo causar a morte celular. Para manter uma concentração ideal de ERO dentro da célula, as plantas desenvolveram um complexo sistema antioxidante para proteção das membranas celulares e organelas contra os efeitos danosos causados pela ação dessas ERO sobre os tecidos vegetais. A ascorbato peroxidase (APx) é uma das principais enzimas do sistema de detoxificação de ERO nas plantas, catalisando a conversão do peróxido de hidrogênio em água, usando o ascorbato como doador de elétrons. No arroz, oito genes codificam APx. As diferentes isoformas são classificadas de acordo com a localização subcelular em citosólicas (APx1 e APx2), peroxissomais (APx3 e APx4), mitocondriais (APx5 e APx6) e cloroplastídicas (APx7 e APx8). O desenvolvimento do presente trabalho teve como objetivo geral caracterizar funcionalmente os genes de APx em arroz (Oryza sativa) com o intuito de identificar a função dos diferentes membros dessa família no controle dos níveis de ERO na planta. Foi analisado o padrão de expressão dos genes que codificam as diferentes isoformas de APx em arroz cultivado sob condições de estresses abióticos tais como o tratamento com concentrações tóxicas de alumínio, frio, seca e exposição ao peróxido de hidrogênio exógeno. Utilizando a estratégia de silenciamento por RNA de interferência (RNAi), foram produzidas construções para o silenciamento simultâneo dos genes OsAPx5 e OsAPx6 e, também, para os genes OsAPx7 e OsAPx8. Adicionalmente, foram ainda geradas construções gênicas para o silenciamento individual dos genes OsAPx7 e OsAPx8. Linhagens de arroz contendo construções RNAi para o silenciamento individual de OsAPx7 e OsAPx8 apresentaram redução de cerca de 90% na expressão relativa destes genes quando comparadas com plantas nãotransformadas. Os oito membros da família gênica APx em arroz mostraram padrão de expressão diferencial frente às condições de estresse testadas, indicando um complexo modo de regulação desses genes. / Aerobic organisms continuously produce Reactive Oxygen Species (ROS). Under stress conditions ROS production is increased and can lead to cellular death. To keep the ideal concentration of ROS inside the cells, plants developed a complex antioxidant system to protect cellular membranes and organelles against harmful effects produced by the action of these ROS. Ascorbate peroxidase (APx) is a major enzyme of the ROS detoxification system in plants, catalyzing the conversion of hydrogen peroxide into water using ascorbate as electron donor. In rice (Oryza sativa), eight genes encode APx. The different isoforms are classified according to their subcellular localization in cytosolic (APx1 and APx2), peroxisomal (APx3 and APx4), mitochondrial (APx5 and APx6) or chloroplastidic (APx7 and APx8). The general aim when developing the present work was to functionally characterize the APx genes in rice in order to identify the function of different members of this family in the control of ROS levels in the plant cell. The expression pattern of genes encoding different isoforms of APx in rice was analyzed when plants were grown under abiotic stress conditions such as under the treatment with toxic concentrations of aluminum, cold, drought and exposition to exogenous hydrogen peroxide. Using the strategy of gene silencing by interference RNA (RNAi), were produced RNAi constructs to simultaneously silence the OsAPx5 and OsAPx6 genes, and also the OsAPx7 and OsAPx8 genes. In addition, it was produced constructs to individually silence the OsAPx7 and OsAPx8 genes. Rice lines carrying RNAi to silence OsAPx7 and OsAPx8 individually presented reduction of gene expression of about 90% when compared to the expression assayed in non-transformed plants. The eight genes coding APx presented different expression patterns in response to the stress conditions tested, indicating that these genes are under a complex mode of regulation.

O arroz é umas das mais importantes plantas cultivadas no mundo, sendo constituinte da dieta básica de mais da metade da população humana, inclusive no Brasil. Entretanto, o arroz é um cereal nutricionalmente pobre, apresentando baixas concentrações de metais essenciais, como o ferro e o zinco. Programas de melhoramento e de engenharia genética têm sido empregados na tentativa de melhorar o teor nutritivo dos grãos de arroz. Entretanto, para se alcançar este objetivo é essencial conhecer os mecanismos que envolvem a aquisição de metais, transporte interno e armazenamento nas plantas. A literatura recente tem revelado a existência de diversas famílias de genes candidatos a desempenharem função na homeostase de metais em arroz (genes Yellow Stripe Like, IRT, FRO, MTP, etc). Entre estes, a família Yellow Stripe Like é forte candidata a possuir genes envolvidos na alocação de ferro para o grão, visto que é uma família numerosa (18 genes) de transportadores de ferro, com diferentes isoformas capazes de transportar ferro ligado a fitossideróforos ou a nicotiamina (o principal quelante de ferro intracelular), e com expressão comprovada de pelo menos uma isoforma em células de floema. No entanto, a alocação de minerais para o grão é um processo altamente regulado, que provavelmente requer a atividade de outros genes, com funções ainda desconhecidas. Neste estudo visamos avaliar a contribuição de genes YSL em plantas de arroz e identificar novos genes potencialmente envolvidos com o transporte de metais aos grãos de arroz utilizando diferentes ferramentas: análise de plantas mutantes no gene OsYSL15 por inserção do retroelemento TOS17; avaliação da expressão de genes YSL em folhas bandeira e panículas de arroz em dois estádios de desenvolvimento; construção de uma biblioteca de hibridização subtrativa (SSH) de panículas em dois estádios de desenvolvimento, visando identificar genes com expressão induzida no enchimento dos grãos. Estas diferentes abordagens nos permitiram concluir que: o gene OsYSL15 é fortemente induzido em raízes sob deficiência de ferro, mas não necessário para o desenvolvimento das plantas nas condições estudadas; a função do gene OsYSL15 provavelmente possui sobreposição com as de outros transportadores de ferro, que podem compensar a sua falta; o gene OsYSL18 é um forte candidato a participar dos processos de alocação de minerais para os grãos de arroz. Além disso, foi possível identificar um novo gene, com função ainda desconhecida, com alta expressão em panículas de arroz durante o enchimento do grão. / Rice is one of the most important crops worldwide. Although being a poor source of nutrients, such as iron and zinc, rice is the dietary basis of over half the world's population, including Brazil. Breeding and genetic engineering programs have been employed with the intent to improve the nutritive characteristics in rice grains, including the increase of mineral nutrients, such as iron and zinc. To reach this objective, it is necessary to understand how metal homeostasis occurs in plants, including rhizosphere uptake, internal transport and storage. The recent literature has revealed several families of genes which are candidates to be involved in metal homeostasis in rice (Yellow Stripe Like, IRT, FRO, MTP, etc). Among them, the Yellow Stripe Like family is a strong candidate to contain genes involved with iron allocation to the grain. This is a large family (18 genes) of iron transporters, with different isoforms being able to transport iron chelated to siderophores or to nicotianamine (the main intracellular iron ligand in plants), and with at least one isoform being expressed in phloem cells. However, mineral allocation to the grain is a highly regulated process, which probably requires the activity of other genes, with functions that are still unknown. This study aimed at the evaluation of the contribution of YSL genes and at the identification of new genes potentially involved with metal transport to the rice grain, making use of three different tools: analysis of OsYSL15 mutant plants, containing TOS17 retroelement insertion; gene expression evaluation of YSL genes in rice flag leaves and panicles during two reproductive stages; construction of a panicle subtractive library (SSH) comparing two reproductive stages, in order to identify genes up-regulated during grain filling. These diverse approaches allowed us to reach the following conclusions: the OsYSL15 gene is strongly induced in roots under iron deficiency, but is not necessary for plant development under control conditions; probably there is function overlap between the OsYSL15 gene and other iron transporters, which can compensate for its absence; the OsYSL18 gene is a strong candidate to participate in mineral allocation to the rice grain. Moreover, it was possible to identify a new gene, with still unknown function, which is highly up-regulated in panicles after anthesis.

A busca por fontes renováveis de energia é uma das prioridades nas pesquisas na área de engenharia na atualidade, dando-se preferência principalmente para uma alternativa aos derivados de petróleo. A produção de biodiesel com lipídeos extraídos de microalgas é um assunto muito promissor, visto as inúmeras vantagens deste processo. Pesquisas apontam que a diminuição da concentração de nitrogênio presente no meio de cultivo aumenta o acúmulo de lipídeos pelas microalgas, mas a produção de biomassa fica prejudicada. Para mensurar a importância desse nutriente e melhorar a eficiência da extração de óleos, no presente trabalho, foi proposta a avaliação da influência do íon nitrato no cultivo de Chlorella sp., focando o estudo na concentração de biomassa e no acúmulo de lipídeos. Para tal, foram testadas diferentes concentrações iniciais de NaNO3; o melhor perfil de adição de NaNO3 no meio de cultivo (em etapas ou em uma dose única); o desempenho da microalga em um cultivo semicontínuo; e quatro tipos de tratamentos para a quebra da parede celular das microalgas Chorella minutissima e Chlorella sp., a fim de realizar uma extração de lipídeos mais efetiva. A concentração inicial de 300 mg L-1 de NaNO3 apresentou melhores resultados em relação à concentração final de biomassa (2,48 g L-1) e acúmulo de lipídeos totais (12,0 % em peso seco). A adição de NaNO3 em apenas uma etapa obteve os resultados mais satisfatórios, com concentração final de biomassa de 1,92 g L-1 e 6,02 % de lipídeos totais em peso seco de biomassa. No cultivo semicontínuo, o melhor resultado para a o acúmulo de lipídeos foi volume de corte de 1/6 a cada 24 h, resultando em 9,02 % de lipídeos em biomassa seca e produtividade lipídica de 214 mg L-1d-1. Como pré-tratamento para quebra da parede celular da microalga Chlorella minutissima, não houve diferença significativa entre os métodos testados; para a Chlorella sp., as técnicas com resultados mais satisfatórios foram autoclave e micro-ondas. / Nowadays, the search for renewable energy sources is a high priority topic in engineer research, with preference to an alternative to petroleum derived energy spurces. Biodiesel production from microalga lipid is very promising, since the several advantages of this process. Many studies have shown that, to increase the microalga lipid accumulation, low nitrogen concentration is necessary; however, this condition has an opposite effect on biomass production. To measure the effect of this nutrient and improve oil extraction efficiency, in the present work, the nitrate ion influence was evaluated over the microalga Chlorella sp. cultive, measuring biomass concentration and lipid accumulation. This work tested the effect of the initial NaNO3 concentration and different NaNO3 pulse feeding profiles along the culture. A semicontinuous culture was carried out with renewal rate of 1/3 and 1/6 (v/v) in 24 h and 48 h, to improve biomass nad lipid productivity. It was also tested four pre-treatments in order to break the microalga (Chlorella minutissima and Chlorella sp.) cell wall: microwave, autoclave, bead beating and sonication. The highest biomass and lipid concentration were found when used initial NaNO3 concentration of 300 mg L-1, with 2,48 g L-1 and 12,04 %, respectively. Adding NaNO3 all at once (one time at the culture start off ) showed the best results for biomass concentration (1,92 g L-1) and lipid accumulation (6,02 %). In semicontinuous culture, the microalga Chlorella sp. presented good results for lipid production (9,02 %) and lipid productivity (214 mg L-1d-1) at 1/6 renewal rate every 24 h, however. The best pre-treatment for cell wall tested for Chlorella sp were microwave and autoclave; for Chlorella minutissima, there was no difference between the tested pre-treatments and the ones without it.