Thesis (MScAgric)--University of Stellenbosch, 2004. / ENGLISH ABSTRACT: Botrytis cinerea Pers.: Fr., a pathogen of grapevine (Vitis vinifera L.), moves mainly through conidia by air currents in vineyards which are deposited intermittently on the surfaces of leaves, inflorescences and bunches. Little is known about the relationship between the inoculum dosage in air and incidence of Botrytis bunch rot, and how the relationship is influenced by environmental and host factors. To better understand this relationship, information is needed on the period over which conidia have accumulated, the time they are able to survive and remain infectious, time of symptom expression in relation to conidium arrival at the infection court and host surface wetness. The aims of this study were (i) to estimate the amount of viable B. cinerea occurring in air in vineyards, and at different positions on leaves, inflorescences and bunches of grape at different phenological stages, (ii) to determine the relationships between the number of B. cinerea colonies recorded on spore traps placed in the bunch zone of vines and the incidence of B. cinerea recorded from the different tissues, and (iii) to compare the efficacy of fenhexamid on leaves and inflorescences carrying natural B. cinerea inoculum with those inoculated with dry, airborne conidia. Different techniques were used to detect viable Botrytis cinerea in air currents and on plant material obtained from table (cultivars Dauphine and Waltham Cross in Paarl- and Worcester-district) and wine grape (cultivars Chardonnay, Sauvignon Blanc and Merlot in Stellenbosch- and Malmesbury district) vineyards in the Western Cape province during 2001-02 and 2002-03. For four consecutive days during prebloorn, bloom, pea-size, bunch closure, veraison and harvest, sets of Petri dishes with freshly prepared Kerssies' B. cinerea selective medium (spore traps) were left overnight in the bunch zone of vines. Plant material was collected from the vines on the fourth day. Leaves, infloresence and bunches were treated with paraquat to terminate host resistance and to promote the development of the pathogen on the tissues. The B. cinerea inoculum dosage in air, and the incidence at which the pathogen was detected at various positions on leaves and in bunches normally differed between vineyards. However, the various tests revealed that the pathogen generally occurred in a consistent pattern in air in the bunch zone of vines, on leaves and in bunches from all vineyards. The inoculum dosage in air in the bunch zone of the vine was generally highest during prebioom or during bloom, it decreased at pea size and mostly remained at a very low level at the later growth stages. The estimations of viable B. cinerea residing naturally on leaves and in bunches, showed that their amounts depicted levels occurring in air in the bunch zone of the vine. Necrotic leaves occurring early season in vineyards were identified as an important source of secondary inoculum for dispersal to the developing bunches. Latent infections at the various positions in bunches were few at véraison and harvest. However, due to the necrotrophic ability of the pathogen, extensive berry rot (due to berry-to-berry contact) and thus severe bunch rot developed from a single berry that become symptomatic at the base of the pedicel/berry attachment zone. The B. cinerea occupation pattern explains why Botrytis bunch rot develops mostly from the inner bunch and why disease management strategies should concentrate on the bloom to pre-bunch closure stage and on inhibiting B. cinerea development in the inner bunch during the early part of the season. Thus, to effectively reduce B. cinerea in grapevine, preventative applications are recommended to reduce two primary infection events: (a) between budding and pre-bloom to counteract primary leaf infection; (b) during late bloom or early pea size stage, to reduce the amount of the pathogen on leaves and infloresences and to prevent colonisation of floral debris. A third spray can be applied at bunch closure to reduce the amount of B. cinerea at various positions of the inner bunch, especially for cultivars with tight bunches. The efficacy of fenhexamid on leaves and inflorescences carrying natural B. cinerea inoculum was compared with those inoculated with dry, airborne conidia. Shoots were obtained during late bloom from a vineyard (wine grape cultivar Merlot) in the Stellenbosch region. The shoots were divided into two main groups. One group of shoots was left uninoculated, the other shoots were inoculated by dusting with dry B. cinerea conidia in a settling tower. Before inoculation, equal numbers of shoots in each main group was sprayed with fenhexamid, or left unsprayed. Following inoculation and incubation, shoots of each treatment were divided in two equal groups. The one lot of shoots were rinsed in water. The other lot of shoots were immersed in paraquat solution to terminate host resistance and to promote the development of the pathogen from the tissues. For both uninoculated and inoculated shoots, irrespective of fungicide treatment, leaves remained asymptomatic at both the blade and petiole position for the water rinse treatment. No symptom of B. cinerea decay developed at any of the positions on leaves from shoots sprayed with fenhexamid. Spraying of shoots with fenhexamid completely suppressed B. cinerea infection and symptom expression on both uninoculated and inoculated inflorescens. For inoculated shoots, B. cinerea developed from approximately 50% of the laterals in the water rinse treatment. However, inflorescences rinsed in water remained asymptomatic. The laboratory studies showed that fungicides, if applied properly to shoots and bunches under controlled conditions, effectively reduced the amount of B. cinerea at the various positions on leaves and inflorescence, and prevented infection and symptom expression at bloom. However, these goals are not achieved in vineyards where the fungicides are applied by conventional spraying methods. Therefore, more work is needed to evaluate fungicide application techniques by conventional spraying methods for proper fungicide coverage, and the reduction of B. cinerea in bunches. / AFRIKAANSE OPSOMMING: Botrytis cinerea Pers.: Fr., 'n patogeen van druiwe (Vilis vinifera L.), beweeg hoofsaaklik deur middel van konidia in lugstrome deur die wingerd, en word dan afwisselend op die oppervlakte van die blare, bloeiwyses en trosse gedeponeer. Daar is nog min bekend oor die verhouding tussen die hoeveelheid inokulum in die lug en die voorkoms van Botrytis op die trosse, en hoe die verhouding deur omgewings- en gasheerfaktore beïnvloed word. Ten einde hierdie interaksie beter te verstaan, word inligting benodig oor die tydperk waarin die konidia akkumuleer, die tyd wat hulle oorleef en virulent bly, en die tyd van simptoom-uitdrukking in verhouding tot die verspreiding van die konidia by die infeksie-setel en benatbaarheid van die gasheer-oppervlakte. Die doel van hierdie studie was (i) om die hoeveelheid lewensvatbare B. cinerea wat in die lug voorkom, asook by verskeie posisies op blare, bloeiwyses en trosse by verskillende fenologiese stadiums te kwantifiseer, (ii) om die verhouding tussen die aantal aangetekende B. cinerea kolonies op spoorvangers wat in die trossone van die wingerd geplaas is, en die voorkoms van B. cinerea, aangeteken van verskeie weefsels, te bepaal, en (iii) om die effektiwiteit van fenhexamid op blare en bloeiwyses wat natuurlike B. cinerea inokulum dra, te vergelyk met dié wat met droë, luggedraagde konidia geïnokuleer is. Verskillende tegnieke is gebruik om lewensvatbare Botrytis cinerea in lugstrome en op plantmateriaal van tafeldruiwe (kultivars Dauphine en Waltham Cross In Paarl- en Worcester-distrik) en wyndruiwe (kultivar Chardonnay, Sauvignon Blanc en Merlot in Stellenbosch- en Malmesbury distrik) in wingerde van die Wes-Kaap provinsie gedurende 2001-02 en 2002-03 te kwantifiseer. Petri bakkies met vars voorbereide Kerssies medium, selektief vir B. cinerea (spoorvangers), is vir vier agtereenvolgende dae gedurende vóórblom, blom, ertjiekorrel, trostoemaak, kleurbreek en oes, oornag in die trossone van wingerdstokke in betrokke wingerde, gelaat. Plantmateriaal is op die vierde dag versamel. Blare, bloeiwyses en trosse is met paraquat behandel ten einde die gasheerweerstand af te breek en ontwikkeling van die patogeen op die weefsel te bevorder. B. cinerea inokulum in die lug, en die frekwensie waarby die patogeen op verskeie posisies op blare en in die trosse voorgekom het, het normaalweg tussen wingerde verskil. Die verskeie toetse het getoon dat die patogeen normaalweg in 'n vaste patroon in die lug en die trossones van wingerde, asook op blare en in trosse van alle wingerde voorkom. Die inokulumkonsentrasie in die lug in die trossones van wingerdstokke was normaalweg die hoogste gedurende vóórblom of gedurende blom. Die inokulumdruk het by ertjiekorrel verminder en meestal by 'n 'n baie lae vlak tydens die latere groeistadia gebly. Die bepaling van lewensvatbare B. cinerea wat natuurlik op blare en in trosse gedeponeer is, het getoon dat hul hoeveelhede ooreenstem met vlakke wat in die lug in die trossone van die wingerd voorkom. Nekrotiese blare vroeg in die seisoen is 'n belangrike bron van sekondêre inokulum en speel dus 'n belangrike rol by die verspreiding van Botrytis tussen die ontwikkelende trosse. Latente infeksies by die verskeie posisies in trosse was laag by kleurbreek en oes. Weens die saprofitiese vermoëns van die patogeen, kan uitgebreide korrelvrot (a.g.v. korrel-tot-korrel kontak) en dus ernstige trosvrot, ontwikkel. 'n Enkele korrel kan by die basis van die pedisel/korrel vashegtingsone simptomaties raak, en vandaar na aangrensende korrels versprei. Die B. cinerea kolonisasiepatroon verduidelik waarom Botrytis trosvrot meestal vanaf die binneste tros ontwikkel en waarom siektebeheerstrategieë op die vóórblom- tot blomstadium gekonsentreer moet word, en op die inhibering van B. cinerea ontwikkeling in die binneste tros gedurende die vroeë stadia van die seisoen. Dus, om B. cinerea effektief tydens die twee primêre infeksie stadiums in wingerde te verminder, kan voorkomende toedienings aanbeveel word: (a) tussen knopvorming en vóórblom om primêre blaarinfeksie te verhoed; (b) gedurende láátblom en vroeë ertjiekorrel om die hoeveelheid inokulum op die blare en bloeiwyses te verminder, en die kolonisasie van blomdebris te voorkom. 'n Derde toediening kan tydens trostoemaak aangewend word om B. cinerea by verskeie posisies in die binneste tros te verminder, veral by kultivars met digte trosse. Die effektiwitiet van fenhexamid op blare en bloeiwyses waarop natuurlike B. cinerea inokulum voorkom is vergelyk met dié wat met droë, luggedraagde konidia geïnokuleer is. Lote is vanaf 'n wingerd (wyndruif kultivar Merlot) in die Stellenbosch distrik tydens láátblom verkry en in twee hoofgroepe verdeel. Die een groep lote is geïnokuleer deur droë B. cinerea konidia in 'n afsettingstoring te strooi, terwyl die ander groep nie geïnokuleer is nie. Vóór inokulasie, is die helfte van die lote in elke groep met fenhexamid behandel, terwyl die ander helfte onbehandeld gelaat is. Ná inokulasie en inkubasie, is lote van elke behandeling verder in twee eweredige groepe verdeel. Die een groep lote is in water gespoel, terwyl die ander groep lote in 'n paraquatoplossing gedompel is om die gasheerweerstand te verwyder, en die ontwikkeling van die patogeen vanuit die weefsels te bevorder. Vir die waterspoelbehandeling van beide ongeïnokuleerde en geïnokuleerde lote, ongeag van die fungisiedbehandeling, het die blare asimptomaties by beide die bladoppervlakte en blaarsteelposisie gebly. Geen simptome van B. cinerea verrotting het by emge van die blaarposisies van die lote, met fenhexamid gespuit, ontwikkel nie. Die spuit van die lote met fenhexamid het die B. cinerea infeksie en die simptoomontwikkeling op beide die ongeïnokuleerde en geïnokuleerde bloeiwyses heeltemalonderdruk. By die geïnokuleerde lote, het B. cinerea vanaf ongeveer 50% van die laterale in die waterspoelbehandeling ontwikkel, alhoewel, bloeiwyses wat in water afgespoel is, heeltemal asimptomaties gebly het. Laboratoriumstudies het getoon dat fungisiedes, indien korrek toegedien op lote en trosse onder gekontroleerde toestande, tot effektiewe vermindering van B. cinerea getalle by die verskillende posisies op blare en bloeiwyses lei, en infeksie en simptoomuitdrukking tydens blom voorkom. Weens die feit dat die doelwitte nie behaal kan word in wingerde waar die fungisiede deur konvensionele spuitmetodes toegedien is nie, moet meer studies gedoen word om fungisied toedieningstegnieke, by konvensionele spuitmetodes, VIr deeglike fungisiedbedekking en die vermindering van B. cinerea in trosse, te evalueer.

La pourriture grise est une maladie qui affecte de nombreuses cultures dont la vigne. Elle est provoquée par un complexe de deux espèces fongiques, l’espèce majoritaire Botrytis cinerea et l’espèce minoritaire Botrytis pseudocinerea. Les deux espèces se distinguent par leur sensibilité à certains fongicides notamment au fenhexamid, inhibiteur de la 3-cétoréductase des stérols. Ce fongicide a un spectre d’action restreint aux espèces phylogénétiquement proches du genre Botrytis (Sclerotinia et Monilinia fructicola). Son utilisation a conduit à la sélection de souches résistantes parmi lesquelles on distingue trois phénotypes : le phénotype HydR1 correspond à l’espèce B. pseudocinerea naturellement résistante ; les phénotypes HydR2 et HydR3 correspondent à l’espèceB. cinerea ayant acquis la résistance suite à l’introduction du fongicide. L’objet de cette thèse est l’étude des phénotypes HydR1 et HydR2 présents à de faibles, voire très faibles fréquences dans des populations de pourriture grise.Chez B. pseudocinerea (HydR1), nous avons identifié une monooxygénase à cytochrome P450 nommée Cyp684 responsable de la résistance au fenhexamid. Le gène cyp684 montre des polymorphismes (structure et séquence nucléotidique) entre les espèces ainsi qu’une induction par le fenhexamid chez B. pseudocinerea. La comparaison de la séquence du gène cyp684 chez plusieurs espèces de Botrytis et de leurs niveaux de résistance au fenhexamid indique que les acides aminés polymorphes de la protéine Cyp684 sont responsables de la résistance au fenhexamid chez B. pseudocinerea. Le rôle connu des monooxygénase à cytochrome P450 dans la métabolisation des xénobiotiques et la synergie entre le fenhexamid et des inhibiteurs de monooxygénases à P450 suggèrent que Cyp684 soit impliqué dans la métabolisation du fenhexamid. Concernant le phénotypeHydR2 de B. cinerea, le mécanisme de résistance reste à identifier. Les souches HydR2 se distinguent par leur phénotype rose dû à un métabolite secondaire nommé bikavérine. Le génotypage réalisé sur les descendantes d’un croisement entre une souche HydR2 et une souche sensible a mis en évidence un lien physique entre le gène ou l’allèle hydR2 et le cluster bikavérine. Afin d’identifier la niche écologique et de comprendre l'épidémiologie de B. pseudocinerea, nous avons développé une méthode de qPCR espèce spécifique, nommée « B. pseudocinerea allele specific PCR » (BpASP). Cet outil permettra de détecter et de quantifier l’espèce B.pseudocinerea dans les populations de Botrytis, selon la saison, la région géographique et les plantes hôtes. / Grey mold is a fungal disease affecting many crops including grapevine. It is generated by a species complex of two fungal species, the major one, Botrytis cinerea, and the minor species, Botrytis pseudocinerea. Both species differ by their sensitivity to several fungicides, in particular to fenhexamid, a potent inhibitor of sterol 3-ketoreductase. This fungicide has a narrow spectrum of activity limited to species closely related to the genus Botrytis (e.g., Sclerotinia and Monilinia fructicola). Fenhexamid applications have led to the selection of resistant strains with three different phenotypes: the HydR1 phenotype corresponds to the naturally resistant species B. pseudocinerea; HydR2 and HydR3 phenotypes correspond to B. cinerea strains that acquired resistance after the introduction of fenhexamid. The topic of this thesis is the study of the phenotypes HydR1 andHydR2 present at low or even very low frequencies in grey mold populations. We identified a cytochrome P450 monooxygenase named Cyp684 responsible for resistance to fenhexamid in B.pseudocinerea (HydR1). The cyp684 gene differs between both species in its gene structure, nucleotide sequence (polymorphisms) and expression. The comparison of cyp684 sequences among different Botrytis species and their resistance levels to fenhexamid indicate the polymorphic amino acids of the Cyp684 protein to be responsible for fenhexamid resistance in B. pseudocinerea. The known involvement of cytochrome P450s in xenobiotic metabolisation and synergy between fenhexamid and P450-inhibitors suggest that Cyp684 could be involved in fenhexamid metabolisation. Concerning the B. cinerea HydR2 phenotype, the resistance mechanism remains to be identified. HydR2 strains have a specific purple pigmentation due to the secondary metabolite bikaverin. Genotyping of progeny derived from a cross between a HydR2 and a sensitive strain revealed aphysical link between the hydR2 gene or allele and the gene cluster involved in bikaverin biosynthesis. In order to identify the ecological niche of B. pseudocinerea and its epidemiological behavior we developed a species-specific qPCR method named “B. pseudocinerea allele specific PCR” (BpASP). This tool will allow detecting and quantifying the species B. pseudocinerea in natural Botrytis populations, collected according to season, geographic origin or plant hosts.

Le fractionnement au pressurage, étape clé de la méthode champenoise, et le type de pressurage, conditionnent de façon significative la composition biochimique du moût et du vin. Le pressurage est fractionné en séparant les premiers moûts extraits, qui constituent la "cuvée", et qui proviennent de la pulpe, partie la plus riche en sucre et en acides (tartrique et malique), des volumes suivants, appelés "tailles", qui sont aussi riches en sucre, en sels minéraux (potassium notamment) et en matières colorantes mais moins acides. Les moûts ont des caractéristiques analytiques bien spécifiques. L’évolution de la composition des moûts au cours du pressurage et la mesure des principaux paramètres analytiques permettant de juger de la qualité de l’extraction ont fait l’objet de quelques études (Valade et Blanck, 1989; Blouin, 1998) sur la base d’un fractionnement volumétrique répondant à un cahier des charges champenois. Toutefois, aucune étude portant sur un large nombre de paramètres, dont les propriétés moussantes, n’avait été entreprise avant ce travail de thèse.Une contamination du raisin par le champignon pathogène Botrytis cinerea (pourriture grise) et l’effet de la maturité du raisin, autres paramètres clés dans l’élaboration du Champagne, ont un impact sur la qualité et la composition des moûts et des vins de base et notamment sur les compositions protéique, polysaccharidique et oligosaccharidique. Les essais ont été réalisés avec 2 pressoirs différents : un pressoir pneumatique industriel (capacité 8000 kg) et un pressoir de laboratoire (capacité 6 kg). Ce travail a été réalisé sur deux cépages : Pinot meunier (millésimes 2013 et 2015) et Chardonnay (millésimes 2014 et 2015). Les analyses suivantes ont été réalisées sur les moûts et vins de base : (i) paramètres œnologiques classiques des moûts et des vins, (ii) isolement et analyse des polysaccharides et oligosaccharides solubles des vins de base, (iii) quantification et identification des protéines solubles des vins de base, (iv) mesure de l’activité protéasique des vins de base (impact de Botrytis cinerea), (v) comparaison de la composition des moûts et des vins issus de raisins sains de deux millésimes : 2013 (pressoir industriel) et 2014 (pressoir de laboratoire).La connaissance de l’état sanitaire et l'optimisation du choix de la date des vendanges en fonction de la maturité sont des outils à la disposition de l’œnologue qui lui permettent d’améliorer la qualité des moûts produits au cours du pressurage et par conséquent celle des vins qui en sont issus. A la suite de cette approche, il serait intéressant de voir dans quelles conditions ces paramètres pourraient être reproduits à grande échelle pour une application industrielle. / Press fractioning is a key step in the Champagne method, and the type of pressing will significantly determine the biochemical composition of the juice and the wine. The first pressed juice obtained in the fractioned pressing cycle, called the “cuvée”, is rich in sugar and acids (tartaric and malic). The second pressed juice, called the “tailles”, is as rich in sugar, mineral salt (potassium in particular) and colorant materials as the first one but less acidic. Must has specific analytical characteristics. The evolution of composition in the must during the pressing cycle and the measure of current analytical parameters, allowing the understanding of grapes extraction, have led to little studies in the Champagne region (Valade et Blanck, 1989; Blouin, 1998). These studies have followed the changes between the Cuvée and the Tailles, according to the rules applied for Champagne production. Nevertheless, no study had considered a large number of parameters, including the foaming properties, before this thesis.The contamination of grapes by the pathogenic Botrytis cinerea (gray mold) and the effect of grape maturity, which are other key parameters in the elaboration of Champagne, have an impact on the quality of must and base wine, especially on proteins, polysaccharides and oligosaccharides. The essays were carried out in two different presses: an industrial automatic press (capacity 8000 kg) and a laboratory press (capacity 6 kg). This study was made on two grape varieties: Pinot meunier (vintages 2013 and 2015) and Chardonnay (vintages 2014 and 2015). The following analyzes were effectuated on must and base wine: (i) determination of current oenological parameters of must and base wine, (ii) isolation and analysis of soluble polysaccharides and oligosaccharides in base wine, (iii) analysis, quantification and identification of soluble proteins in base wine, (iv) quantification of protease activity in base wine (the impact of Botrytis cinerea), (v) comparison of composition of must and base wine from healthy grapes of two vintages: 2013 (industrial press) and 2014 (laboratory press).The knowledge of the sanitary state and the optimization of the harvest date are tools used by oenologist to improve the quality of must, obtained during the pressing cycle, and therefore of wine elaborated from them. Following this study, it could be interesting to examine in which conditions these parameters may be reproduced at a bigger scale for forward industrial applications.

Paraburkholderia phytofirmans souche PsJN est une bactérie endophyte capable d’induire une promotion de croissance de la vigne et de lui conférer une tolérance vis-à-vis des basses températures. Puisque la bactérie PsJN induit également une tolérance de la vigne contre la pourriture grise causée par le champignon Botrytis cinerea, l’objectif de ce travail était de caractériser les mécanismes de la résistance induite par P. phytofirmans suite à une infection par B. cinerea chez la vigne.Nos résultats indiquent que l’inoculation des racines de vitroplants par la bactérie PsJN entraîne des modifications du métabolisme phénolique au niveau des plantules bactérisées. En effet, des tanins d’origine gallique et ellagique sont accumulés au niveau des racines en réponse à PsJN alors qu’une accumulation de lignine a été observée dans la tige et d’anthocyanes dans les feuilles. De même, PsJN induit une résistance contre B. cinerea en potentialisant l'expression de gènes de défense dépendants de l’acide salicylique et de l’acide jasmonique dans les feuilles de vigne. Parallèlement, une accumulation de callose et d’H2O2 a été observée ainsi qu’une meilleure mobilisation des glucides dans les plantules bactérisées, corrélée à une réduction des dommages de l’activité photosynthétique.Suite aux résultats obtenus avec le modèle vitroplant, nous avons optimisé la bactérisation des boutures fructifère et évaluer l’impact de cette bactérie sur la résistance des inflorescences contre B. cinerea. Les résultats présentés dans ce travail permettent d’envisager l’utilisation de la bactérie PsJN comme agent de lutte biologique. / Paraburkholderia phytofirmans strain PsJN is an endophytic beneficial bacterium able to promote the growth of grapevine and to induce the plant resistance to biotic and abiotic stresses. Indeed, the interaction between PsJN and grapevine confers to the grapevine a protection towards cold stress (4 °C), by reducing damages on the photosynthetic system and modulating the carbon metabolism. The PsJN strain also induces a protection against gray mold caused by Botrytis cinerea. In this context, the aim of this work was to better characterize this P. phytofirmans strain PsJN-induced resistance in grapevine against B. cinerea.Our results indicate that the inoculation of in vitro-plantlets roots with PsJN altered the phenolic metabolism in bacterized-plantlets. Gallic and ellagic derived tannins are clearly accumulated in roots of bacterized-plantlets whereas an accumulation of lignin in stems and anthocyanins in leaves was observed. We also showed that PsJN induces a protection against B. cinerea by priming the expression of genes involved in salicylic acid and jasmonic acid pathways. In parallel, an accumulation of callose and H2O2, as well as a better mobilization of carbohydrates in bacterized plantlets were observed. In addition to the defense mechanisms setting up by plants, we demonstrated that PsJN reduces in vitro and in vivo development of B. cinerea, in a dose-dependent manner.Following results obtained with the in vitro-plantlets model, we optimized the protocol of bacterization of grapevine fruiting cuttings by the PsJN strain, and evaluate the impact of the bacteria on to induce the resistance of inflorescences to B. cinerea. Our results provide new insights for the use of PsJN and suggest its commercial use as a biological control agent.

Certains champignons sont très dommageables pour les plantes mais aussi pour la conservation après récolte des produits végétaux. Les restrictions réglementaires concernant l’utilisation des fongicides nécessitent de trouver des solutions alternatives. L'amélioration de la résistance des plantes en utilisant des méthodes physiques, comme les rayonnements UV, peut présenter une alternative prometteuse en association avec d’autres méthodes dans le cadre d’une protection intégrée des cultures. L'objectif de cette thèse a été d’étudier l’effet des rayonnements UV-C sur la sensibilité des plantes aux agents pathogènes. Les rayonnements UV-C ont été appliqués durant la culture, seuls ou en combinaison à des agents de biocontrôle, ou en post-récolte. Les expérimentations ont été menées sur deux espèces végétales : le fraisier et la tomate.Sur fraisier, des traitements UV-C à une dose de 1,70 kJ/m² entraînent une diminution systématique d'environ 20 % de la sensibilité des feuilles à Botrytis cinerea et diminuent jusqu’à 50 % le nombre de feuilles attaquées par Podosphaera aphanis, l’agent causal de l’oïdium. Chez la tomate, la protection des feuilles contre B. cinerea atteint 43 % avec une dose d’UV-C cumulée de 4,0 kJ/m². Ces mêmes traitements UV-C appliqués sur fruits réduisent la sensibilité des fraises vis-à-vis de Rhizopus de 75 % mais aucun effet n’est observé vis-à-vis de B. cinerea. Au contraire, sur fruits de tomate, la sensibilité est diminuée d'environ 63 % contre cet agent pathogène. Parallèlement, des tests biochimiques et gustatifs suggèrent que la qualité des fruits n’est pas significativement améliorée ni altérée par les expositions UV-C. Malgré un effet germicide marqué des rayonnements UV-C sur feuilles de fraisiers, aucun effet bénéfique de l’application de ces rayonnements sur le niveau d’efficacité d’agents de lutte biologique n’a été mis en évidence.Nos observations sont encourageantes pour envisager une utilisation de cette méthode dans un schéma de protection intégrée des cultures. Cependant, une compréhension claire de la façon dont les rayonnements UV-C sont perçus par les plantes et traduits en mécanismes de défense est nécessaire avant que leur utilisation ne soit recommandée sur le terrain. / Some fungi are very damaging during plant cultivation and also in post-harvest storage of products. Regulatory restrictions on fungicide use require alternative solutions. Improving plant resistance using physical methods, such as aplication of UV radiation, can be a promising alternative in association with other methods as part of an integrated pest management strategy. The objective of the present thesis was to study the effect of UV-C aplication on the sensitivity of plants to fungal pathogens. UV-C radiation was applied during plant cultivation, alone or in combination with biocontrol agents, or in post-harvest. Experiments were conducted on two plant species: strawberry and tomato.On strawberry plants, UV-C treatments at 1.70 kJ/m² result in a systematic 20 % decrease in leaves sensitivity to Botrytis cinerea and in a reduction by up to 50 % of the number of leaves infected by Podosphaera aphanis, the causal agent of powdery mildew. In tomato, leaves protection against B. cinerea reaches 43 % with a cumulative dose of 4.0 kJ/m². UV-C treatments applied on fruits reduce the strawberry sensitivity to Rhizopus by 75 % but no effect is observed against B. cinerea. On the contrary, sensitivity against B. cinerea is reduced by 63 % on tomato fruit. Biochemical and taste tests suggest that fruit quality is not significantly improved or altered by UV-C treatment. Despite a marked germicidal effect of UV-C radiation on strawberry leaves, it has no significant effect on the protective efficacy of biocontrol agents.Our observations are encouraging to consider the use of this tool in an integrated crop protection scheme. However, a clear understanding of how UV-C radiations are perceived by plants and their translation into defense mechanisms is necessary before their use is recommended in the field.

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2016-10-05T13:55:43Z No. of bitstreams: 1 joaosuendermoreira.pdf: 2727096 bytes, checksum: 15959d5ff7f375e41f8c2bc20e5308fe (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2016-10-05T13:58:13Z (GMT) No. of bitstreams: 1 joaosuendermoreira.pdf: 2727096 bytes, checksum: 15959d5ff7f375e41f8c2bc20e5308fe (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-05T13:58:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 joaosuendermoreira.pdf: 2727096 bytes, checksum: 15959d5ff7f375e41f8c2bc20e5308fe (MD5) Previous issue date: 2009-03-12 / FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Um dos principais problemas mundiais na agricultura está diretamente relacionado às enormes perdas na produção causada por fungos fitopatogenicos, onde sua infecção nas culturas se dá desde o plantio até a pós- colheita. O fungo Botrytis cinerea, causador do mofo cinzento em mais de 200 espécies de plantas é um grande problema no agronegócio em todo o mundo. O uso de fungicidas é o principal método de controle em plantas, enquanto os resultados obtidos de imediato e a facilidade de aplicação justificam o seu uso. No entanto, o uso contínuo de fungicidas pode promover a seleção de fungos resistentes além de causar a contaminação de ecossistemas. Com o objetivo de encontrar uma solução para esse problema, diversos estudos tem se concentrado na busca de novas alternativas de controle, como por exemplo, as proteínas de plantas com atividades antifúngicas (AFPs). Nesse sentido, uma seleção de peptídeos antimicrobianos de flores, folhas e sementes de espécies do gênero Lippia bem como o isolamento de peptídeos antifúngicos de flores de Lippia sidoides foi o objetivo desse trabalho. Neste trabalho, a purificação e identificação de dois novos peptídeos de aproximadamente 10 kDa e 15 kDa de flores de Alecrim-pimenta (Lippia sidoides) foi descrito. As flores de L. sidoides, depois de secadas em estufa a 25o por cinco dias, foram submetidas à extração de proteínas com solução de HCl 0,1% e NaCl 0,6M, seguido por precipitação com sulfato de amônia (100%). Após a precipitação, o extrato foi dialisado contra água destilada (cut off 1,0 kDa) e liofilizado. A fração rica foi aplicada em cromatografia hidrofóbica Octyl-sepharose, seguida por cromatografia de fase-reversa de HPLC (Vydac C18-TP). Bioensaios com EB, e fração PR in vitro indicaram a inibição do crescimento do fungo Botrytis cinerea. As sequências N-terminal, obtidas por degradação de Edman, seguidas por alinhamento indicam que esses dois peptídeos podem ser classificados com proteínas R NBS-LRR. Esta descoberta pode contribuir, futuramente, para o desenvolvimento de produtos biotecnológicos como drogas antifúngicas e plantas transgênicas com resistência elevada a fungos patogênicos. / One of the major global issues in agriculture could be directly related to the severe production crop losses caused by phytopathogenic fungi, especially when infection affects post-harvest cultures. In this view, the fungus Botrytis cinerea is able to cause gray mold in more than 200 species of plants, being considered a major problem for the agribusiness. The use of fungicides is a primary fungi control method in plants, due to velocity and facility of application. However, the continuous use of fungicides may promote the selection of resistant fungi and also the ecosystems contamination. Aiming to find different solutions to this problem, several studies have focused on the search for new alternatives to fungi control, such as plant proteins with antifungal activities (AFPs). In this view, a selection of antimicrobial peptides from flowers, leaves and seeds from Lippia genus and further isolation of antifungal peptides from Lippia sidoides flowers was focused in this work. In this work, the purification and identification of two novel peptides of approximately 10 kDa and 15 kDa from flowers of rosemary-pepper (L. sidoides) was described. L. sidoides flowers were oven dried at 25 oC for 5 days, following protein extraction with a solution containing 0.1% HCl 0.6 M NaCl, and further ammonium sulfate precipitation (100%). After precipitation the extract was dialyzed against distilled water (cut off 1.0 kDa) and lyophilized. The rich fraction was applied onto an Octyl-Sepharose hydrophobic chromatography, followed by HPLC reversed-phase chromatography (Vydac C18-TP). Bioassays using crude extract and in vitro PR fraction indicated the inhibition of Botrytis cinerea growth. N-termini sequences, obtained by the Edman degradation, followed by alignment indicate that these two peptides can be classified as NBS-LRR R proteins. This discovery may help in a near future to the development of biotechnology products such as antifungal drugs and transgenic plants with enhanced resistance to fungal pathogens.

Au cours des interactions plante/agent pathogène, la disponibilité en sucres est un des enjeux majeurs pour les deux partenaires. Il s'établit donc une compétition vis-à-vis des ressources carbonées entre l'agent pathogène hétérotrophe pour le carbone et la plante consommant de l'énergie pour se défendre. Les transporteurs de sucres sont les acteurs moléculaires qui interviennent dans cette compétition et probablement dans le devenir de l'interaction. L'objectif de cette étude est de déterminer l'implication des transporteurs de sucres au cours de l'interaction entre la plante modèle Arabidopsis thaliana et le champignon nécrotrophe Botrytis cinerea.Parmi la famille des transporteurs d'hexoses (STPs) d'A. thaliana, l'expression du gène STP13 est régulée positivement durant l'infection par B. cinerea. Le rôle potentiel de STP13 au cours de cette interaction a donc été étudié à l'aide de plantes transgéniques (Knock-Out et surexpresseur). Le suivi du développement des symptômes et la mesure d'absorption du glucose ont permis de montrer des modifications phénotypiques entre les différents génotypes étudiés. Les résultats indiquent une corrélation entre le niveau d'expression de STP13, le transport de glucose et le développement du champignon, confortant ainsi le rôle de STP13 dans la tolérance face à B. cinerea.Les résultats préliminaires de l'étude du transport de glucose à l'échelle cellulaire montrent une inhibition dans des conditions mimant l'infection. Ces analyses ont été effectuées grâce à un modèle constitué d'une suspension cellulaire d'A. thaliana subissant un traitement éliciteur à partir d'un extrait protéique de B. cinerea.Nous nous sommes également intéressés au transport de saccharose à l'échelle de la plante infectée. Nos résultats suggèrent que l'inoculation par le champignon modifie les flux de saccharose classiquement observés créant ainsi une nouvelle force d'appel. Ainsi, la feuille infectée se comporte comme un nouveau puits. Ces travaux de recherche s'inscrivent dans la nécessité d'une meilleure compréhension des mécanismes de transport des sucres qui permettra à terme d'agir sur les capacités de résistance des plantes vis-à-vis d'agents pathogènes. / During plant/pathogen interactions, sugar availability is one of the major issues for both partners. There is a competition for the same carbohydrates necessary for carbon supply on the pathogen's side and to support the additional energy demand for plant's defense. Sugar transporters are the molecular actors in this competition which is determinant for the final outcome of the interaction. In this study, we characterized the implication of sugar transporters in the interaction between the model plant Arabidopsis thaliana and the necrotrophic fungus Botrytis cinerea.Among the A. thaliana hexose transporter family (STPs), STP13 is induced during B. cinerea infection. A potential role of STP13 in this interaction was investigated using transgenic plants (Knock-Out and over-expressor lines). Disease symptoms characterization and glucose uptake assays showed phenotypical variations between the different genotypes. It seems that STP13 expression, glucose uptake and fungus spreading are correlated pointing to a role of STP13 in tolerance to B. cinerea. Other preliminary results showed an inhibition of the cellular glucose uptake upon condition mimicking B. cinerea infection. These analyses were performed on a model composed of an A. thaliana cell suspension elicited with a proteinaceous extract from B. cinerea.We also studied sucrose fluxes in the whole infected plant. Our results suggest that fungus inoculation modifies the usual fluxes creating a new sink.This study may lead to a better understanding of sugar transport mechanisms to improve plant resistance capacity against pathogens in the future.

Les jasmonates jouent des rôles essentiels en réponse aux stress environnementaux et dans le développement des plantes. Jasmonoyl-isoleucine (JA-Ile), la forme hormonale active, est sous un contrôle métabolique strict. Nos études biochimiques, génétiques et métaboliques ont montré que l’inactivation de JA-Ile est contrôlée par 2 voies, l’une oxydative par les cytochromes P450 CYP94 et l’autre hydrolytique par les amido-hydrolases IAR3 et ILL6. Ces enzymes définissent une grille métabolique vers de nombreux jasmonates. Ces conversions constituent un mécanisme général contrôlant le turnover de JA-Ile et les réponses induites, opèrant après blessure, infection par le champignon Botrytis cinerea ou le développement floral. En outre, les CYP94s oxydent le conjugué Jasmonoyl-Phenylalanine (JA-Phe) accumulé dans les feuilles blessées. Les CYP94s catalysent la carboxylation de JA-Ile et de JA-Phe via un intermédiaire aldéhyde, le JA-Ile-aldéhyde étant accumulé in vivo. Ces travaux élucident un nouveau catabolisme hormonal de plantes et son impact sur un réseau métabolique dynamique et complexe par l’action concertée de deux familles d’enzymes. / Jasmonates are plant molecules playing essential roles in response to environmental stresses and in plant development. Jasmonoyl-Isoleucine (JA-Ile) is an active hormonal form of jasmonates so it is crucial for the plant to control its levels. Biochemical, genetic and metabolic studies showed that JA-Ile inactivation after wounding is controlled by two pathways, based on oxidations by cytochromes P450 of the CYP94 family and on cleavage by the amido-hydrolases IAR3 and ILL6. These enzymes also define a pathway for tuberonic acid (12OH-JA) production from JA. CYP94-catalyzed oxidations seem to be a general mechanism to control JA-Ile hormone turnover, jasmonate signaling and responses as it also occurs upon infection by the fungus Botrytis cinerea and in floral development. CYP94s oxidize also the Jasmonoyl-Phenylalanine (JA-Phe) conjugate accumulated in wounded leaves. CYP94s mediated JA-Ile and JA-Phe carboxylation includes an aldehyde intermediate, that of JA-Ile being accumulated in vivo.This work highlights the dynamic metabolism of jasmonate derivatives in a complex branched network involving the concerted action of two enzyme families.

B. Cinerea, l'agent responsable de la pourriture grise, possède deux alpha-tubulines : l'alpha-tubuline A et l'alpha-tubuline B. Ces protéines sont connues pour participer à la construction des microtubules, mais la connaissance de leurs rôles est relativement limitée chez les champignons et particulièrement chez les pathogènes des plantes. L'analyse du profil d'expression des gènes codant pour ces tubulines a démontré que l'alpha-tubuline B est majoritairement exprimé et qu'il se caractérise par un pic au moment de la germination de la spore fongique. L'étude du promoteur de son gène a révélé la présence de trois zones possibles de régulation, et l'approche de «simple-hybride» a permis de mettre en évidence deux régulateurs potentiels : BcYOH1 et BcFT027. Un mini-réseau de régulation entre les différents gènes codants pour les tubulines et ces facteurs de transcription a été mis en évidence. Nos résultats ont montré que le gène codant pour l'alpha-tubuline B n'est pas indispensable à la vie cellulaire et l'étude du mutant de délétion a permis d'attribuer un rôle particulier de cette protéine dans la formation du mycélium aérien et, donc dans la production des spores de la reproduction asexuée, mais également dans le cycle infectieux du champignon. Par ailleurs, les mutants de délétion des gènes codant pour les deux facteurs de transcription identifiés dans notre étude ont permis l'analyse de leur rôle sur le développement et le pouvoir infectieux du champignon. Nous avons ainsi montré que la vitesse de croissance, la biomasse, le mycélium aérien et la vitesse d'infection étaient augmentés chez le mutant BcFT027 / The plant pathogen Botrytis cinerea contains two alpha-tubulin isomers (alpha-tubulin A and B). These proteins are known to participate in the construction of microtubules in all eukaryotes, but our knowledge about the roles of different isomers is particularly poor in fungi, and null in fungal plant pathogens. Analysis of gene expression profiles in B. cinerea revealed that the alpha-tubulin B encoding gene is more expressed than the alpha-tubulin A one and that its expression peaks during spore germination. Subsequent promoter studies led to the identification of three DNA regions probably involved in this regulation, and two putative regulators were then found by using the one-hybrid yeast system : the already discovered BcYOH1 and the totally unknown and ascomycetous specific BcFT027. Additional expression studies in mutant strains of these regulators finally suggested the existence of a regulatory network between these two regulators and the two alpha-tubulin encoding genes. Production and analysis of alpha-tubulin B deletion mutants showed that this isomer is not essential for cell viability in B. cinerea. More importantly, this study revealed that the alpha-tubulin protein plays a role during plant infection as well as in the formation of aerial mycelium and the production of asexual spores. Partial to complete characterization of the BcYOH1 and BcFT027 deletion mutants strengthened these results and showed that BcFT027 is a key player in the development of areal mycelium and of the infection process (via the development of penetration structures called infection cushions). Never reported before, these results are of significant interest in our understanding of tubulins and fungal development

De nombreux métaux sont indispensables au métabolisme cellulaire, d’autres sont considérés toxiques même à de faibles concentrations. Différents champignons appartenant à des différents groupes taxonomiques ont été identifiés dans des milieux pollués et ont révélé une capacité à survivre et à croître en présence de concentrations potentiellement toxiques. Pour s'adapter à ce stress, les champignons ont développé plusieurs mécanismes au niveau intracellulaire et extracellulaire. En particulier, ils sont connus pour leur capacité à sécréter un large panel de protéines. Cependant, leur rôle dans l'adaptation des champignons à la toxicité des métaux n'a pas encore été étudié. Pour répondre à cette question, le champignon Botrytis cinerea a été soumis à un stress métallique en présence de cuivre, zinc, nickel ou cadmium, les protéines sécrétées ont été collectées et séparées par 2D-PAGE. Deux métabolites ont également été analysés, l'acide oxalique et la nicotianamine. Enfin, les capacités de biosorption des champignons isolés à partir de sols pollués ont été étudiées. L'analyse du sécrétome a révélé 116 spots dont le volume varie en réponse d'au moins un métal. Cinquante-cinq de ces spots sont associés à des protéines uniques. La classification fonctionnelle de ces protéines a révélé que la production d'oxydoréductases et des enzymes dégradant la paroi cellulaire a été modifié en réponse aux métaux. L’étude de la production d'acide oxalique par Botrytis cinerea en réponse aux métaux montre une induction de la sécrétion d'oxalate en réponse au Zn et une accumulation de la nicotianamine, métabolite intracellulaire capable de fixer les métaux chez les plantes. Le gène de la nicotianamine synthase, est d’ailleurs surexprimé en présence de Cu, Zn et Ni. Plusieurs espèces fongiques ont été isolées à partir de sols pollués par des métaux, parmi ceux-ci Trichoderma asperellum et Zygorrhynchus moelleri montrent les meilleurs capacités de biosorption (10mg de Cu/g de matière sèche) des ions Cu / Metal ions are essential elements in many cellular processes. However, metal excess becomes toxic and constitutes a global environmental hazard. A range of fungi from all major taxonomic groups were found in metal-polluted habitats and the ability to survive and grow in the presence of potentially toxic concentrations is frequently encountered. To adapt to this stress, fungi have evolved several mechanisms at both intracellular and extracellular levels. In particular, fungi are well known for their ability to secrete a large panel of proteins. However, their role in the adaptation of fungi to metal toxicity has not yet been investigated. To address this question, here, the fungus Botrytis cinerea was challenged to copper, zinc, nickel or cadmium stress and secreted proteins were collected and separated by 2D-PAGE. Two metabolites were also analyzed, oxalic acid and nicotianamine. Finally, biosorption capacities of fungi isolated from polluted soils were investigated. Secretome analysis revealed one hundred and sixteen spots whose volume varied in at least one tested condition were observed on 2D gels. Fifty-five of these spots were associated with unique proteins and functional classification revealed that the production of oxidoreductases and cell-wall degrading enzymes was modified in response to metals. Study of oxalic acid and nicotianamine (NA) production by Botrytis cinerea in response to tested metals reveal that Zn induces oxalate secretion and that NA synthase gene is upregulated in presence of Cu, Zn and Ni. Many fungal species were isolated from metal polluted soils among them Trichoderma asperellum and Zygorrhynchus moelleri which show the maximum biosorption capacities of Cu ions