Orientador: Fernanda da Cruz Landim / Banca Eunice Oba / Banca: Maria Denise Lopes / Banca: Claudia Barbosa Fernandes / Banca: Gisele Zoccal Mingoti / Resumo: O forskolin eleva as concentrações de adenosina monofosfato cíclica (cAMP) por meio da ativação da adenilato ciclase. Esse experimento possuiu o objetivo de utilizar o forskolin para melhorar a produção in vitro (PIV) de embriões bovinos. No Experimento I o forskolin foi adicionado no meio de maturação in vitro (MIV) com o objetivo de bloquear a meiose nuclear induzindo sua sincronização com a maturação citoplasmática. O Experimento II possuiu o objetivo de induzir uma lipólise química em embriões do D 6 a partir da utilização do forskolin, diminuindo sua sensibilidade após a vitrificação. No Experimento I, os oócitos permaneceram em meio MIV durante 6 horas na presença de três concentrações de forskolin: 0,025 mM; 0,05 mM; 0,1 mM e em seguida foram cultivados em meio MIV livre de forskolin por 18 horas. Após esse tempo os oócitos foram fertilizados e cultivados in vitro. Foi avaliado o estágio de maturação nuclear, a atividade e distribuição mitocondrial, a ultraestrutura oocitária, contagem do número de células e a apoptose celular. O tratamento com forskolin por 6 horas não resultou em atraso na quebra da vesícula germinativa em relação ao controle. Entretanto, após a retirada do bloqueio e maturação por 18 horas um maior número de oócitos tratados com 0,1 mM de forskolin se encontrou em MI (P<0,05). Não houve diferença com relação a atividade e distribuição mitocondrial nos oócitos, no entanto a maior concentração da droga levou a alterações ultraestruturais nos oócitos, com excesso de metabolização lipídica e desorganização do citoesqueleto. Apesar disso, não se observou diferença na taxa de produção de blastocistos avaliados no D 7, bem como no número total de células íntegras dos embriões. Entretanto, observou-se uma maior taxa de apoptose no grupo de blastocistos produzidos a partir de oócitos bloqueados com a maior concentração ... / Abstract: The forskolin raises concentrations of cyclic adenosine monophosphate (cAMP) through the activation of adenylate cyclase. This experiment aimed the use of forskolin to enhance in vitro production (IVP) of bovine embryos. In Experiment I, forskolin was added in the medium of in vitro maturation (IVM) with the objective of blocking nuclear meiosis inducing your synchronization with cytoplasmic maturation. Experiment II aimed to induce lipolysis chemical in D 6 embryos from the use of forskolin, decreasing its sensitivity after vitrification. In the first experiment, the oocytes remained in IVM medium for 6 hours in the presence of three concentrations of forskolin: 0.025 mM, 0.05 mM, 0.1 mM and then were cultured in medium free forskolin for 18 hours. After this time the oocytes were in vitro fertilized and cultured. We assessed the stage of nuclear maturation, activity and distribution mitochondrial, ultrastructure oocyte, total number of cells and apoptosis. The treatment with forskolin for 6 hours did not resulted in delay in VCBD in relation to control group. However, after the removal of the drug and maturation for 18 hours a higher number of oocytes treated with 0.1 mM of forskolin were still in MI (P<0.05). No differences in relation to mitochondrial activity and distribution were observed between groups. However the higher concentration of the drug induced ultrastructural damage to oocytes, with excess of lipid metabolization and cytoskeleton disorganization. Nevertheless, no statistical differences were observed on blastocyst production and on the number of total cells. Despite of that, a higher rate of ... / Doutor

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:17Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2003-09-24Bitstream added on 2014-06-13T19:55:42Z : No. of bitstreams: 1 dias_fc_me_jabo.pdf: 243067 bytes, checksum: 77d4da4195de951e6f94630f9509518f (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Pela pesquisa de anticorpos contra o vírus da diarréia viral bovina (BVD), utilizando o teste de ELISA indireto, foi estudada a correlação existente entre a proporção de vacas lactantes e a presença de anticorpos no leite de conjunto do tanque de expansão. Para isso foram analisadas amostras de soro sangüíneo e de leite individual de 376 vacas lactantes não vacinadas, provenientes de 10 propriedades localizadas nas regiões Sul do Estado de Minas Gerais e Nordeste do Estado de São Paulo, assim como uma amostra do leite do tanque de expansão de cada rebanho. Em todas as propriedades foram encontradas vacas reagentes no soro sangüíneo, cuja freqüência variou de 12,28 a 100,00%. Já a análise do leite individual não revelou animais reagentes em duas propriedades, e nas demais a freqüência variou de 5,26 a 70,83%. Foram detectados anticorpos no leite do tanque de expansão das propriedades cuja proporção de soros sangüíneos reagentes foi igual a ou maior que 82,86%, e cuja proporção de leites individuais reagentes foi igual a ou maior que 32,14%. / The correlation between the proportion of reactor lactating cows and the presence of antibodies to the bovine viral diarrhoea virus (BVD) in bulk tank milk was studied by using the ELISA test. Serum and individual milk samples from 376 unvaccinated lactating cows from 10 herds located in the south region of the State of Minas Gerais and the northeast region of the State of São Paulo as well as one milk sample from the bulk tank milk of each herd were analysed. Reacting serum samples were found in all the herds, and this occurrence varied from 12.28 to 100.00%. The analysis of individual milk samples did not show reacting cows in two herds, while the other herds had an ocurrence varying from 5.26 to 70.83%. Antibodies were detected in bulk tank milk from herds whose proportion of reacting sera was equal to or higher than 82.86%, and whose proportion of reacting individual milk samples was equal to or higher than 32.14%.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:17Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-11-30Bitstream added on 2014-06-13T20:35:35Z : No. of bitstreams: 1 salerno_t_me_botfmvz.pdf: 1170640 bytes, checksum: 4141fa14cadaa626e1808eaa0c9abaae (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Nos últimos anos, Prototheca zopfii tem sido considerada uma das causas mais importantes de mastite de origem ambiental, refratária a terapia convencional. As infecções mamárias por P. zopfii acarretam alterações na composição do leite e redução na produção leiteira. O presente estudo avaliou a sensibilidade “in vitro” de 27 linhagens de P. zopfii isoladas do leite de vacas no Brasil frente a diferentes antimicrobianos e anti-sépticos, aliado a caracterização genotípica dos isolados. Nistatina (100,0%) e gentamicina (66,7%) foram as drogas mais efetivas para as 27 linhagens estudadas. A multi-resistência a três ou mais antimicrobianos foi observada em 100,0% das estirpes, principalmente frente a ampicilina, cefoperazona, cloxacilina, enrofloxacina, florfenicol, neomicina e tetraciclina. Hipoclorito de sódio (0,03-0,15%) e iodo (0,15-0,62%) revelaram efetividade “in vitro” para todos os isolados em baixas concentrações. A caracterização genotípica pela técnica de PCR baseada no fragmento 18S rDNA mostrou similaridade à cepa controle de P. zopfii SAG 2021T, caracterizando todos os isolados como pertencentes ao genótipo 2. O presente estudo descreve pela primeira vez no Brasil, a caracterização genotípica de linhagens de P. zopfii isoladas de leite obtido de vacas com mastite clínica, subclínica e de tanque de expansão. / In last years, Prototheca zopfii has been considered one of the most important causes of mastitis from environmental origin, refractory to conventional therapy. The mammary infections caused by Prototheca zopfii lead to severe alterations in composition of the milk, and reduction in production. The present study evaluate the in vitro antimicrobials and anti-septic susceptibility, of 27 P. zopfii strains isolated from milk in cattle raised in Brazil, allied to the genotypic characterization of isolates. Nystatin (100.0%) and gentamicin (66.7%) were the most-effective drugs for 27 P. zopfii strains. Multiple drug resistance for three or more antimicrobials was observed in 100.0% of strains predominantly for ampicilin, cefoperazone, cloxacillin, enrofloxacin, florfenicol, neomycin e tetracycline. Sodium hypochlorite (0.03-0.15%) and iodine (0.15-0.62%) revealed “in vitro” efficacy in all isolates in low concentrations. The genotypic characterization using PCR technique based on the 18S rDNA displayed similarity to the strain-control of P. zopfii SAG 2021T characterizing all isolates belonging to the genotype 2. The present study describe by first time in Brazil the genotype characterization of P. zopfii strains isolated from milk, obtained in clinical and subclinical bovine mastitis and bulk tank milk.

Orientador: Márcio Garcia Ribeiro / Coorientador: Hélio Langoni / Banca: Antônio Carlos Paes / Banca: Alice Maria Melville Paiva Libera / Resumo: Nos últimos anos, Prototheca zopfii tem sido considerada uma das causas mais importantes de mastite de origem ambiental, refratária a terapia convencional. As infecções mamárias por P. zopfii acarretam alterações na composição do leite e redução na produção leiteira. O presente estudo avaliou a sensibilidade "in vitro" de 27 linhagens de P. zopfii isoladas do leite de vacas no Brasil frente a diferentes antimicrobianos e anti-sépticos, aliado a caracterização genotípica dos isolados. Nistatina (100,0%) e gentamicina (66,7%) foram as drogas mais efetivas para as 27 linhagens estudadas. A multi-resistência a três ou mais antimicrobianos foi observada em 100,0% das estirpes, principalmente frente a ampicilina, cefoperazona, cloxacilina, enrofloxacina, florfenicol, neomicina e tetraciclina. Hipoclorito de sódio (0,03-0,15%) e iodo (0,15-0,62%) revelaram efetividade "in vitro" para todos os isolados em baixas concentrações. A caracterização genotípica pela técnica de PCR baseada no fragmento 18S rDNA mostrou similaridade à cepa controle de P. zopfii SAG 2021T, caracterizando todos os isolados como pertencentes ao genótipo 2. O presente estudo descreve pela primeira vez no Brasil, a caracterização genotípica de linhagens de P. zopfii isoladas de leite obtido de vacas com mastite clínica, subclínica e de tanque de expansão. / Abstract: In last years, Prototheca zopfii has been considered one of the most important causes of mastitis from environmental origin, refractory to conventional therapy. The mammary infections caused by Prototheca zopfii lead to severe alterations in composition of the milk, and reduction in production. The present study evaluate the "in vitro" antimicrobials and anti-septic susceptibility, of 27 P. zopfii strains isolated from milk in cattle raised in Brazil, allied to the genotypic characterization of isolates. Nystatin (100.0%) and gentamicin (66.7%) were the most-effective drugs for 27 P. zopfii strains. Multiple drug resistance for three or more antimicrobials was observed in 100.0% of strains predominantly for ampicilin, cefoperazone, cloxacillin, enrofloxacin, florfenicol, neomycin e tetracycline. Sodium hypochlorite (0.03-0.15%) and iodine (0.15-0.62%) revealed "in vitro" efficacy in all isolates in low concentrations. The genotypic characterization using PCR technique based on the 18S rDNA displayed similarity to the strain-control of P. zopfii SAG 2021T characterizing all isolates belonging to the genotype 2. The present study describe by first time in Brazil the genotype characterization of P. zopfii strains isolated from milk, obtained in clinical and subclinical bovine mastitis and bulk tank milk. / Mestre

Orientador: Luiz Carlos de Souza / Resumo: Este trabalho objetivou pesquisar a relação entre os microrganismos patogênicos isolados e identificados em água utilizada na ordenha, com o isolamento e identificação dos mesmos em amostras de leite, de quartos mamários apresentando mastite clínica ou subclínica nas mesmas propriedades. Foram utilizadas 16 propriedades rurais leiteiras, escolhidas aleatoriamente, na região de Cerqueira César - SP, que utilizavam ordenha mecânica. A água utilizada na ordenha foi classificada em relação à presença de coliformes totais e fecais, como: dentro dos padrões ou fora dos padrões de potabilidade humana. Nos resultados obtidos, 94% das amostras foram classificadas como fora dos padrões em relação a coliformes totais e fecais. Os microrganismos identificados foram: Escherichia coli (51%), Enterobacter spp (25%), Enterobacter cloacae (8%) Edwardsiella tarda (8%) e Klebsiella oxytoca (8%). Em relação ao leite, foram analisadas 373 amostras provenientes de vacas em lactação, com mastite clínica (n=19; 5%) e subclínica (n=354; 95%). Os animais com mastite subclínica foram identificados pela contagem de células somáticas (CCS), utilizando-se o aparelho eletrônico (Somacount 300, Bentley), onde a média observada foi de 1.631 x 103 células/mL. Os principais microrganismos identificados foram: Staphylococcus aureus (30%), Corynebacterium bovis (23%) e Staphylococcus spp (15%). Conforme os dados obtidos, os agentes coliformes encontrados na água, utilizada na ordenha, não estavam presentes nas análises das amostras de leite dos quartos mamários com mastite clínica ou subclínica das respectivas propriedades, demonstrando não haver associação entre a qualidade da água e a ocorrência de mastite. / Abstract: The aim of present study was to research the relation between isolated and identified pathogenic microorganisms on the water utilized in milking with isolation and identification of the ones on milk samples of teats showing clinic or subclinic mastitis. Sixteen milk farms were chose in a randomized way, in Cerqueira Cesar - SP town, that used mechanical milking. Water of the farms was classified in relation to presence of totals and fecal coliforms such as: in the standard or out of the standard of human potability. On the results obtained, 94% of the samples were classified as being out of the standards related to total and fecal coliforms. The identified microorganisms were Escherichia coli (51%), Enterobacter spp (25%), Enterobacter cloacae (8%), Edwardsiella tarda (8%) and Klebsiella oxytoca (8%). Related to the milk samples, 373 samples by cows in sukling were analyzed, presenting clinic mastitis (n=19; 5%) and subclinic mastitis (n=354; 95%). Animals presenting subclinic mastitis were identified by count of somatic cells (CSC), utilizing electronic equipment (Somacount 300 - Bentley), where the mean found was 1.631 thousand cells/mL. The main identified microorganisms were Staphylococcus aureus (30%), Corynebacterium bovis (23%) and Staphylococcus spp (15%). As according to the resulted obtained, coliforms agents found on the water, used in the milking, weren't present on the analysis of the milk samples of quarter presenting clinic or subclinic mastitis on the respective farms, showing that there wasnþt an association between water quality and mastitis occurrence. / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:30:22Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2005Bitstream added on 2014-06-13T19:19:05Z : No. of bitstreams: 1 medeiros_mim_me_botfmvz.pdf: 365649 bytes, checksum: 3760bb0be00006a38f4bc2722ba441ef (MD5) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / Este trabalho objetivou pesquisar a relação entre os microrganismos patogênicos isolados e identificados em água utilizada na ordenha, com o isolamento e identificação dos mesmos em amostras de leite, de quartos mamários apresentando mastite clínica ou subclínica nas mesmas propriedades. Foram utilizadas 16 propriedades rurais leiteiras, escolhidas aleatoriamente, na região de Cerqueira César - SP, que utilizavam ordenha mecânica. A água utilizada na ordenha foi classificada em relação à presença de coliformes totais e fecais, como: dentro dos padrões ou fora dos padrões de potabilidade humana. Nos resultados obtidos, 94% das amostras foram classificadas como fora dos padrões em relação a coliformes totais e fecais. Os microrganismos identificados foram: Escherichia coli (51%), Enterobacter spp (25%), Enterobacter cloacae (8%) Edwardsiella tarda (8%) e Klebsiella oxytoca (8%). Em relação ao leite, foram analisadas 373 amostras provenientes de vacas em lactação, com mastite clínica (n=19; 5%) e subclínica (n=354; 95%). Os animais com mastite subclínica foram identificados pela contagem de células somáticas (CCS), utilizando-se o aparelho eletrônico (Somacount 300, Bentley), onde a média observada foi de 1.631 x 103 células/mL. Os principais microrganismos identificados foram: Staphylococcus aureus (30%), Corynebacterium bovis (23%) e Staphylococcus spp (15%). Conforme os dados obtidos, os agentes coliformes encontrados na água, utilizada na ordenha, não estavam presentes nas análises das amostras de leite dos quartos mamários com mastite clínica ou subclínica das respectivas propriedades, demonstrando não haver associação entre a qualidade da água e a ocorrência de mastite. / The aim of present study was to research the relation between isolated and identified pathogenic microorganisms on the water utilized in milking with isolation and identification of the ones on milk samples of teats showing clinic or subclinic mastitis. Sixteen milk farms were chose in a randomized way, in Cerqueira Cesar - SP town, that used mechanical milking. Water of the farms was classified in relation to presence of totals and fecal coliforms such as: in the standard or out of the standard of human potability. On the results obtained, 94% of the samples were classified as being out of the standards related to total and fecal coliforms. The identified microorganisms were Escherichia coli (51%), Enterobacter spp (25%), Enterobacter cloacae (8%), Edwardsiella tarda (8%) and Klebsiella oxytoca (8%). Related to the milk samples, 373 samples by cows in sukling were analyzed, presenting clinic mastitis (n=19; 5%) and subclinic mastitis (n=354; 95%). Animals presenting subclinic mastitis were identified by count of somatic cells (CSC), utilizing electronic equipment (Somacount 300 - Bentley), where the mean found was 1.631 thousand cells/mL. The main identified microorganisms were Staphylococcus aureus (30%), Corynebacterium bovis (23%) and Staphylococcus spp (15%). As according to the resulted obtained, coliforms agents found on the water, used in the milking, weren't present on the analysis of the milk samples of quarter presenting clinic or subclinic mastitis on the respective farms, showing that there wasnþt an association between water quality and mastitis occurrence.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, 2013. / Submitted by Larissa Stefane Vieira Rodrigues (larissarodrigues@bce.unb.br) on 2014-11-05T11:13:14Z No. of bitstreams: 1 2013_PaulaLorenaGrangeiraSouto.pdf: 1190405 bytes, checksum: 29802022a038de84ea7e1b6c4dc4ba06 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2014-11-05T16:22:43Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_PaulaLorenaGrangeiraSouto.pdf: 1190405 bytes, checksum: 29802022a038de84ea7e1b6c4dc4ba06 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-11-05T16:22:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_PaulaLorenaGrangeiraSouto.pdf: 1190405 bytes, checksum: 29802022a038de84ea7e1b6c4dc4ba06 (MD5) / O bovino Pantaneiro é uma raça localmente adaptada que se desenvolveu no bioma Pantanal brasileiro ao longo de quase 500 anos sob pressão de seleção natural. Estudos acerca de animais localmente adaptados são essenciais para nortear as ações dos programas de conservação de recursos genéticos animais. Assim, o objetivo deste trabalho foi correlacionar o perfil eletroforético bidimensional das proteínas do plasma seminal com a congelabilidade do sêmen de touros Pantaneiros. Utilizou-se ejaculados de dezoito touros Pantaneiros, divididos em dois grupos: de melhor e de pior congelabilidade. As amostras de sêmen pré- criopreservação foram avaliadas quanto à motilidade, vigor e morfologia espermática e as amostras de sêmen pós-criopreservação, avaliadas quanto à cinética pelo CASA, morfologia, integridade de membrana e acrossoma. As amostras de plasma seminal foram obtidas por centrifugação do sêmen e as proteínas seminais separadas por meio de eletroforese bidimensional em géis de poliacrilamida (SDS-PAGE), corados com Coomassie coloidal G- 250 e analisados por meio do aplicativo PDQuest™. Foram detectados 277 spots nos mapas bidimensionais do plasma seminal de reprodutores Pantaneiros. Nove spots apresentaram associações consistentes e significativas com os parâmetros seminais pós-criopreservação. Destes spots, cinco apresentaram diferença (P<0,05) entre os grupos de melhor e pior congelabilidade do sêmen. A análise multivariada apontou cinco spots correlacionados positivamente com os parâmetros de boa congelabilidade do sêmen. Houve diferenças no perfil proteico do plasma seminal entre os reprodutores de melhor e de pior congelabilidade do sêmen e a análise dos géis revelou uma heterogeneidade nos perfis individuais. Devido à associação dos spots 8305, 9217, 2603, 3514 e 2227 a proteínas encontradas em amostras de sêmen de alta congelabilidade e também relacionadas a eventos benéficos sobre as funções espermáticas, sugere-se que a presença dos mesmos está ligada à melhor congelabilidade do sêmen de touros Pantaneiros. ________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The Pantaneiro cattle is a locally adapted breed that has been developed in the brazilian Pantanal biome over almost 500 years under the pressure of natural selection. Studies on locally adapted breeds are essential to guide the actions of the programs for conservation of animal genetic resources. The aim of this study was to correlate the two-dimensional electrophoretic profile of seminal plasma proteins with semen freezability from Pantaneiro bulls. We used ejaculates from eighteen Pantaneiro bulls divided into two groups: best and worst freezability. The sperm parameters motility, viability and morphology were evaluated before cryopreservation and also were evaluated after cryopreservation and further were evaluated CASA kinetics, integrity membrane and acrosome. Seminal plasma samples were obtained by semen centrifugation and seminal proteins were separated by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). The gels were stained with colloidal Coomassie G-250 and analyzed using the PDQuest™. Were detected 277 spots in two-dimensional maps of the seminal plasma of Pantaneiro bulls. Nine spots showed consistent and significant associations with semen parameters after cryopreservation. Five these spots showed differences (P<0.05) between freezability groups. The multivariate analysis showed five spots positively correlated with the semen parameters for good freezability. There were differences in the seminal plasma protein profile between bulls of best and worst semen freezability. The analysis of the gels also revealed heterogeneity in individual profiles. Due the association of spots 8305, 9217, 2603, 3514 and 2227 with proteins found in animals with high freezability of semen and it relating to beneficial events on sperm functions, it is suggested that their presence is linked to better semen freezability of Pantaneiro bulls.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, 2007. / Submitted by Natália Cristina Ramos dos Santos (nataliaguilera3@hotmail.com) on 2009-10-16T13:56:17Z No. of bitstreams: 1 Dissert_ReginaldoVieiradeSouxa.pdf: 671043 bytes, checksum: 847820a52781eb05975638a844332018 (MD5) / Approved for entry into archive by Gomes Neide(nagomes2005@gmail.com) on 2010-06-23T22:07:25Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissert_ReginaldoVieiradeSouxa.pdf: 671043 bytes, checksum: 847820a52781eb05975638a844332018 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-06-23T22:07:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissert_ReginaldoVieiradeSouxa.pdf: 671043 bytes, checksum: 847820a52781eb05975638a844332018 (MD5) Previous issue date: 2007-06 / Com o aprimoramento das técnicas de reprodução assistida, a produção de embriões in vivo (TE) e in vitro (PIV), tem crescido consideravelmente e por conseqüência, a demanda por metodologia eficaz de identificação do sexo desses embriões. Este trabalho teve por objetivo avaliar um sistema de identificação do sexo (Diagnóstico pré-implantacional do sexo) de embriões bovinos produzidos em programas comerciais de TE e PIV. Os embriões produzidos in vivo (n=609) foram coletados de animais das raças Holandesa e Jersey, sete dias (D7) após a Inseminação Artificial (IA) nos estágios de mórula compacta (Mc), blastocisto inicial (Bi), blastocisto (Bl) e blastocisto expandido (Bx). Os embriões foram divididos em dois grupos: Grupo TE-B, constituído por embriões biopsiados e Grupo TE-C, constituído por embriões intactos (controle). Para o experimento de produção in vitro, foram utilizados embriões de bovinos da raça Gir (n=318), nos estágios de blastocisto inicial Bi, Bl e Bx, em D-6,5. Os embriões foram divididos em dois grupos: Grupo PIV-B, constituído por embriões biopsiados e Grupo PIV-C, constituído por embriões intactos (controle). Os embriões dos Grupos TE-B (n=380) e PIV-B (n=91) foram submetidos à micromanipulação por microssecção para retirada da biopsia. Os embriões biopsiados foram cultivados até o final do processo de identificação do sexo e então transferidos para receptoras síncronas. Os embriões do Grupo TE-C (n=229) e PIV-C (n=227) foram transferidos íntegros para receptoras síncronas no mesmo momento dos biopsiados. As receptoras foram submetidas à ultra-sonografia aos 30 (TE) e 60 (TE e PIV) dias após as inovulações para diagnóstico de gestação e confirmação do sexo, respectivamente. Para a identificação do sexo dos embriões biopsiados, as respectivas biopsias foram submetidas às técnicas de PCR e eletroforese em gel de agarose. Na reação, foram utilizados 2 pares de oligonucleotídeos iniciadores (primers), sendo um específico para o cromossomo Y e o outro para um gene autossômico (controle da reação que amplifica uma seqüência de DNA específica em ambos os sexos). Para a comparação das taxas de gestação aos 60 dias, entre os grupos e respectivos controles, foi utilizado o teste do quiquadrado (χ2) e não houve diferenças entre os grupos, com TE-B =206/380 (54,21%), TE-C = 128/229 (55,89%); PIV-B =24/91 (26,37%) e PIV-C=45/227 (19,82%). Das gestações confirmadas que tiveram suas respectivas biopsias submetidas à sexagem, 133 do Grupo TE-B, e 20 do Grupo PIV-B, foram avaliadas por ultra-sonografia aos 60 dias após as inovulações sendo que 124 (93,23%) e 19 (95%), respectivamente, tiveram sexo coincidente com aquele atestado pela PCR. O resultado deste trabalho indicou que o procedimento de retirada de biopsia de embriões produzidos in vivo e in vitro não interfere na viabilidade dos mesmos, e que a metodologia utilizada é viável para identificação do sexo dos embriões em programas comerciais de transferência de embriões. __________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / With the advance of the assisted reproductive techniques, the use of in vivo (ET) and in vitro embryo production (IVP) has increased considerable, which has lead to a demand for an efficient method for embryo sexing. The present study aimed to evaluate the effect of the micromanipulation of ET and IVP embryos on their viability and to test, in field conditions, a methodology embryo sexing. In vivo produced embryos (n=609) were collected from Holstein and Jersey females. Embryo at compact morula (Mc), initial blastocyst (Bi), blastocyst (Bl) and expanded blastocyst (Bx) stage on Day 7 post insemination (D-7) were allocated into two groups: Group ET-B, biopsied embryos and Group ET-C, intact embryos (control). For the in vitro production experiment embryos of Gir breed females were used (n=318) at the initial blastocyst (Bi), blastocyst (Bl) and expanded blastocyst (Bx) stage at Day 6,5 post insemination. Embryos were distributed into two groups: Group IVP-B, biopsied embryos and Group IVP-C, intact embryos (control). Embryos from both groups ET-B (n=380) and IVP-B (n=91) were submitted to micromanipulation by section, for biopsy removal. Biopsied embryos were cultured until the end of the process of sex identification and then were transferred for synchronized recipients. Embryos from the groups ET-C (n=229) and IVP-C (n=227) were transferred intact to the synchronized recipients. All the recipients were evaluated by ultrasonography 30 (ET) and 60 (ET, IVP) days after inovulation, for pregnancy and sex identification. For embryo sex identification the biopsies were submitted to PCR and agarose gel electrophoresis. In the PCR reaction 2 primers were used, one specific for Y chromosome and the other for a bovine autossomic gene. To compare pregnancy rates at 60 days between the groups and their respective controls a Chi-square(χ2) analysis was used. No differences were observed for pregnancy rates between groups, being ET-B = 206/380 (54.21%), ET-C = 128/229 (55.89%); IVP-B = 24/91 (26.37%) and IVP-C = 45/227 (19.82%). Of the confirmed pregnancies that had their biopsies (ET-B = 133 and IVP-B = 20) submitted to sex identification, 124 (93.23%) and 19 (95%) had the same sex in the PCR reaction and in the ultrasonography evaluation at 60 days. The results of the present study indicated that biopsy removal did not affect the viability of the in vivo and in vitro embryos. In addition, the methodology used for embryo sex identification is suitable to be used in embryo transfer commercial programs.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, 2011. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2011-10-07T14:47:24Z No. of bitstreams: 1 2011_DeniseFerreiraCaldeira.pdf: 838817 bytes, checksum: 8324f7a9f376b731e330a1af342b8f6e (MD5) / Approved for entry into archive by Camila Mendes(camila@bce.unb.br) on 2011-10-16T17:25:21Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_DeniseFerreiraCaldeira.pdf: 838817 bytes, checksum: 8324f7a9f376b731e330a1af342b8f6e (MD5) / Made available in DSpace on 2011-10-16T17:25:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_DeniseFerreiraCaldeira.pdf: 838817 bytes, checksum: 8324f7a9f376b731e330a1af342b8f6e (MD5) / A utilização de nanopartículas magnéticas no sêmen permite o incremento de técnicas de reprodução assistida para a realização transgênese e seleção espermática. Para tanto, é importante conhecer o comportamento da celular espermática em contato com as nanopartículas magnéticas para que possam ser utilizadas em larga escala nas diferentes biotécnicas da reprodução. A resposta espermática após contato com fluído magnético contendo nanopartículas de maghemita recoberta com DMSA foi avaliada com o intuito de determinar a toxicidade do nanomaterial. Sêmen bovino descongelado, após passagem pelo gradiente de Percoll, foi incubado a 37,5 ºC em meio SP-TALP+ (BSA 1,5%)adicionado de fluido magnético (FM) com concentrações finais de 0,06, 0,03 e 0,015 mg de Fe/mL. O grupo controle, sem adição de FM, foi incubado apenas com meio SP-TALP+. Durante a incubação avaliou-se a cinética espermática através do sistema CASA a cada 15 minutos durante duas horas, bem como na terceira e quarta horas de incubação. No início da incubação (zero hora), na segunda e na quarta horas também foram avaliadas a integridade da membrana plasmática e a reação acrossomal por meio da associação de corantes fluorescentes (iodeto de propídio e FITC-PNA). Ao final do período de incubação, o sêmen remanescente de cada tratamento foi fixado para análise em microscópio eletrônico de transmissão (MET). Observou-se que para os parâmetros do CASA, integridade da membrana e reação acrossomal não houve influencia da nanopartícula na resposta do sêmen ao longo do período de incubação, independente da concentração utilizada. Na análise da MET não foram observados danos ultraestruturaisàs células espermáticas após contato com o FM. Também não foi observado internalização das nanopartículas em nenhum grupo tratado com FM. Desta forma, o FM contendo nanopartículas de maghemita recobertas com DMSA pode ser utilizado em contato direto com o sêmen para o incremento das técnicas de reprodução assistida, uma vez que não há alteração na função e estrutura espermática nas condições testadas. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The use of magnetic nanoparticles in semen allows the improvement of assisted reproduction techniques to achieve transgenesis and sperm selection. Therefore, it is important to know the sperm cell behavior after exposure to magnetic nanoparticles, to achieve their use in different biotechnologies of reproduction in large scale. The sperm response after exposure to magnetic fluid containing maghemite nanoparticles coated with DMSA was evaluated in order to determine the toxicity of the nanomaterial. After passage through the Percoll gradient, frozenthawed bull semen was incubated at 37.5 °C in SP-TALP+ medium (1.5% BSA) added to the magnetic fluid (MF) with final concentrations of 0.06, 0.03 and 0.015 mg Fe/mL. The control group, without MF, was just incubated with SP-TALP+ medium. During incubation the sperm kinetic pattern was assessed using CASA system, the assessments were performed every 15 minutes during two hours, as well as in the third and fourth hours of incubation. At the beginning of the incubation (hour zero), as well as in the second and fourth hours the sperm plasma membrane integrity and acrosome reaction were evaluated through the combination of fluorescent dyes (propidium iodide and FITC-PNA).In the ETM analysis, sperm cells ultrastructural damage were not observed after exposure to the MF. The uptake of nanoparticles by the spermatozoa was also not observed in any group treated with MF. Thus, the MF containing maghemite nanoparticles coated with DMSA can be used in semen in order to improve the assisted reproduction techniques, since there is no change in sperm function and structure under the conditions tested.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, 2011. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2011-11-01T11:35:24Z No. of bitstreams: 1 2011_IsabelaReboucasBessa.pdf: 1322125 bytes, checksum: 4474d6fb57a2955d26b304bb4411576e (MD5) / Approved for entry into archive by Leila Fernandes (leilabiblio@yahoo.com.br) on 2011-12-13T11:20:22Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_IsabelaReboucasBessa.pdf: 1322125 bytes, checksum: 4474d6fb57a2955d26b304bb4411576e (MD5) / Made available in DSpace on 2011-12-13T11:20:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_IsabelaReboucasBessa.pdf: 1322125 bytes, checksum: 4474d6fb57a2955d26b304bb4411576e (MD5) / O objetivo do presente estudo foi estudar o perfil da expressão de genes candidatos para a aquisição da competência durante o crescimento ovocitário em bovinos utilizando ovócitos de diferentes tamanhos provenientes de várias categorias de folículos. Os genes candidatos foram selecionados por estarem possivelmente envolvidos com a aquisição da competência (BMP15, OOSP1, H1FOO, H2A, H3A, H4, SLBP, DNMT1, DNMT3B, HAT, HDAC e SUV39H1). Para determinar o tamanho dos ovócitos a serem utilizados, foi realizado um pré- experimento, em que os folículos pré-antrais foram classificados orfologicamente, agrupados em diferentes categorias em primordial, primário, secundário inicial e secundário final. Após a classificação, os ovócitos de cada folículo foram individualmente isolados e medidos. Folículos pré-antrais e antrais foram isolados de ovários de vacas Nelore (Bos taurus indicus), por dissociação mecânica utilizando o Tissue Chopper. Para o isolamento dos ovócitos, os folículos foram expostos à colagenase tipo II (0,5 mg/ml) e então submetidos a sucessivas pipetagens. Os ovócitos foram medidos através do programa Motic images Plus 2.0 e classificados de acordo com seu diâmetro nas seguintes categorias: 1) ovócitos de folículos primordiais: diâmetro de até 20 μm; 2) ovócitos de folículos primários: 25 a 35 μm; 3) ovócitos de folículos secundários iniciais: 40 a 60 μm e 4) ovócitos de folículos secundários finais; 65 a 85 μm. Para a obtenção dos ovócitos oriundos de folículos antrais incompetentes e competentes, foram utilizadas as medidas de 100 a 120 μm e acima de 128 μm respectivamente. O RNA total foi extraído de 4 pools de 25 ovócitos, de cada categoria de folículo, e os transcritos dos genes foram quantificados por qPCR. Os valores de expressão dos genes alvos foram normalizados pela expressão do gene constitutivo CYC A. Os resultados foram analisados através do teste não paramétrico Kruskall Wallis, para comparar os tamanhos de folículos e ovócitos e avaliar o efeito do tamanho do ovócito na quantidade de expressão gênica. O nível de significância considerado foi P<0,05. Os resultados mostraram que os transcritos da H2A, H3, H4 e SUV39H1 não diferiram (P>0,05) entre os grupos de ovócitos de folículos antrais e pré-antrais. A expressão da OOSP1, SLBP, BMP15, H1FOO, DNMT1, DNMT3B e HAT foram menores (P<0,05) em ovócitos préantrais quando comparados com os de folículos antrais. A H3A foi o único gene em que foi detectado a expressão de RNAm em ovócito de folículo primordial. De todos os genes estudados, apenas a HDAC apresentou diferença significativa entre ovócitos de folículos antrais competentes e incompetentes. Os resultados sugerem que o acúmulo dos estoques dos genes analisados ocorre antes do estágio final da folículogênese e provavelmente não são marcadores para a competência. A HDAC foi o único gene que pode estar relacionado à competência do ovócito, pois mostrou uma diminuição (P<0,05) no nível de transcrito nos grupos de ovócitos competentes quando comparados com o grupo de antrais iniciais (1a 3mm). ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The aim of this present study was investigate the expression profile of candidates genes for the acquisition of competence during oocyte growth in bovine using oocytes from different sizes obtained from several follicle categories. The candidate genes were selected to be possibly involved in competence (BMP15, OOSP1, H1FOO, H2A, H3A, H4, SLBP, DNMT1, DNMT3B, HAT, HDAC e SUV39H1). A pre-experiment was conducted to classify the follicles according to their categories in primordial, primary, small secondary and final secondary follicles. Then the oocytes were individually isolated and measured. Preantral and antral follicles were isolated from ovaries of Nelore (Bos taurus indicus) cows by mechanical dissociation using a Tissue Chopper. To isolate the oocytes, follicles were exposed to collagenase type II solution (0.5 mg/ml) and then submitted to successive pipetting. The oocytes were measured with Motic Images Plus 2.0 program and classified according to their diameter into the following categories: 1) oocytes from primordial follicle: diameter < 20 μm; 2) oocytes from primary follicles: 25 to 35 μm; 3) oocytes from small secondary follicles: 40 to 60 μm; 4) oocytes from final secondary follicles: 65 to 85 μm; 5) oocytes from early antral follicles: 100 to 120 μm; and 6) oocytes from final antral follicles: > 128 μm. Total RNA was extracted from 4 pools of 25 oocytes from each category of follicles using Rneasy Plus® kit, subjected to reverse transcription reaction and genes quantified by qPCR. Target gene expression was normalized using CYC A. Data were analyzed using Kruskal-Wallis test for values which were not normally distributed. Level of significance was considered P<0.05. The results show that the transcripts of H2A, H3A, H4 e SUV39H1 did not differ significantly between groups, showing the same pattern from preantral to antral follicles. For OOSP1, SLBP, BMP-15, H1FOO, DNMT1, DNMT3B and HAT, the pattern of expression was lower in oocytes from preantral follicles when compared to antral follicles. The H3A was the only gene in which expression was detected in oocytes from primordial follicles. From all the studied genes, only HDAC differed significantly between incompetent and competent oocytes. These results suggest that the stocks of transcripts of the studied genes are accumulated before the final phase of folliculogenesis. The HDAC was the only gene in which expression could be related to oocyte competence since it showed a decrease (P<0.05) in transcript levels from final antral oocytes (competent) compared to small antral group.