L'intégrase (IN) est une enzyme essentielle du cycle réplicatif des rétrovirus, qui catalyse l'intégration de l'ADN viral rétrotranscrit dans le génome de la cellule cible. Des données structurales, précédemment obtenues par notre équipe, ont conduit à la conception rationnelle de molécules susceptibles de bloquer l'IN sous une forme oligomérique inactive. Des tests d'intégration concertée in vitro ont permis d'étudier leur effet sur l'activité enzymatique de l'IN.Le porc est porteur d'un Gammaretrovirus endogène appelé Porcine Endogenous RetroVirus (PERV), susceptible d'être transmis à l'homme lors d'une xénotransplantation. L'étude structurale de l'IN du virus recombinant PERV-A/C a pour but de mieux comprendre son fonctionnement et de guider le développement rationnel d'inhibiteurs limitant le risque de xénozoonose. J'ai modélisé l'intasome de l'IN de PERV-A/C en complexe avec le raltégravir, un médicament utilisé comme traitement anti-VIH. J'ai ensuite mis au point des protocoles de purification permettant d'étudier le domaine carboxy-terminal (Carboxy Terminal Domain ou CTD) de l'IN de PERV-A/C isolé et en complexe avec le CTD du cofacteur cellulaire humain Brd2. L'enveloppe SAXS de ce complexe a été déterminée. En parallèle, une étude par histone array, réalisée avec le CTD seul de l'IN de PERV-A/C, a révélé un profil de spécificité pour des queues d'histones H2B et H3 portant des modifications post-traductionnelles / Integrase (IN) is an essential enzyme in retroviral replicative cycle, which catalyzes the integration of the viral DNA into the target cell genome. Structural data previously obtained by our team led to rational design of molecules likely to block IN in an inactive oligomeric form. In vitro concerted integration assays made it possible to study their effect on IN enzymatic activity. Pig has an endogenous gammaretrovirus called Porcine Endogenous RetroVirus (PERV) which can be transmitted to humans during xenotransplantation. The aim of the structural study of the recombinant virus PERV-A/C IN is to better understand its mechanism and thus guide the rational design of inhibitors limiting xenozoonosis risk. I modeled the PERV-A/C IN intasome in complex with raltegravir, a drug used for HIV treatment. Then I developed purification protocols to study the isolated and complexed PERV-A/C IN Carboxy-Terminal Domain (CTD) with the human cellular cofactor Brd2. The SAXS envelope of the complex was determined. In parallel, a histone array study, performed with the PERV-A/C IN CTD alone, revealed a specificity profile for modified H2B and H3 histone tails

Influenza B virus is a major human pathogen causing highly contagious respiratory disease. It accounts for approximately ~30% of influenza virus infection per year. The effector domain of the NS1 protein of influenza B virus (NS1B protein), encompassing the carboxy terminal two thirds of the protein, suppresses interferon-β (IFN-β) synthesis in virus-infected cells by unknown mechanism(s). The induced IFN-β mediates innate immunity. To elucidate the mechanism by which the NS1B effector domain suppresses the production of IFN-β, we identified cellular proteins that interact with the NS1B effector domain. Two approaches were used. The approach that succeeded employed the transfection into cells of plasmids expressing the NS1B effector domain containing two affinity tags. After double affinity purification, co-purified cellular proteins were identified by mass spectrometry. We identified Brd2 as a cellular protein that interacts with the NS1B protein. We established that Brd2 specifically binds to the NS1B effector domain in vitro, in vivo, and in virus-infected cells. Serial mutagenesis experiments showed the phenylalanine at position 171 (F171) of the NS1B protein is essential for Brd2 binding. To determine the function of the interaction of Brd2 with the NS1B protein, we generated a recombinant virus encoding an NS1B protein in which F at position 171 was replaced by an alanine. The F171A mutant virus was attenuated, and unlike the wild-type virus, induced the synthesis of IFN-β mRNA. IRF3, a key transcription factor for transcription of the IFN-β gene, was activated in mutant virusinfected cells, but not in wild-type virus-infected cells. Transfection assays implicated the activation of the TBK1 kinase as the step in IRF3 activation that is induced in mutant virus-infected cells. We interpreted these results as showing that Brd2 binding to the NS1B protein is required for suppressing IRF3 activation and IFN-β induction. Attempts at further confirmation by depletion of endogenous Brd2 using RNA interference were not successful because of inefficient knock-down efficiency and nonspecific IFN-β induction. A further complication is that another bromodomain protein, Brd4, interacts with the NS1B protein and could compensate for depletion of Brd2. / text

La voie de réparation NER implique une cascade de complexes protéiques dont le senseur des dommages de l’ADN (XPC/HR23B). Des mutations dans les gènes de la NER (TTD-A, XPA-G, XPV, CSA et CSB), sont associées à des maladies génétiques humaines dont le Xeroderma Pigmentosum (XP), la Trichothiodystrophie (TTD) et le syndrome de Cockayne (CS). L’ensemble des symptômes des patients ne peut être expliqué seulement par un défaut de la réparation de l’ADN. Or depuis quelques années, il a été prouvé que les facteurs de la NER sont aussi impliqués lors de la transcription. Dans le cadre de ma thèse, je me suis particulièrement intéressé à la protéines XPC en déterminant son rôle transcriptionnel à l’échelle génomique afin de mieux comprendre les conséquences de sa dérégulation dans un contexte pathologique. En ce sens, mon second objectif a été de caractériser au niveau moléculaire l’étiologie de nouveaux patients XP en analysant de manière combinée les évènements moléculaires de la NER et la transcription associés à XPC. Nos différentes approches expérimentales ont permis d’identifier au niveau génomique un ensemble de gènes sont les promoteurs sont régulés aussi bien positivement que négativement par XPC dans un contexte RAR dépendant. De plus, nous montrons que XPC interagit avec KAT2A contenu dans le complexe ATAC, ainsi que qu’avec le facteur de transcription E2F1, le facteur de remodelage de la chromatine BRD2 et le variant d’histone H2A.Z. Via KAT2A, ce complexe va acétyler non seulement H2A.Z mais également H3K9 au niveau des promoteurs ciblés par E2F1. / NER involves a cascade of protein complexes including the DNA damage sensor (XPC/HR23B). Mutations in NER genes (TTD-A, XPA-G, XPV, CSA and CSB) are associated with human genetic diseases including Xeroderma pigmentosum (XP), Trichothiodystrophy (TTD) and Cockayne Syndrome (CS). All the symptoms can only be explained by a defect of the DNA repair. However all the symptoms can only be explained by a defect of the DNA repair. However, it has been proven that NER factors are also involved in transcription. As the genomic scale to better understand the consequences of its deregulation in a pathological context. In this sense, my second goal has been to characterize at the molecular level the etiology of new XP patients by analyzing in a combined way the molecular events of the NER and the transcription associated with XPC. Our different experimental approaches have made it possible to identify at genomic level a set of gene whose promoters are regulated both positively and negatively by XPC in a dependent RAR context. In addition, we show that XPC interacts with KAT2A contained in the ATAC complex, as well as with the transcription factor E2F1, the chromatin remodeling factor BRD2, and the histone variant H2A.Z. Via KAT2A, this complex will acetylate not only H2A.Z but also H3K9 at promoters targeted by E2F1.

Die Photoparoxysmale Reaktion (PPR) oder Photosensitivität ist elektrophysiologisch durch eine synchronisierte Erregungssteigerung des visuellen Kortex infolge intermittierender Lichtreize gekennzeichnet. Familienstudien belegen, dass die PPR eine genetisch komplexe Disposition aufweist. Visuell induzierte Anfälle treten bei bis zu 10% der Kinder mit Epilepsien auf. Besonders häufig (bis zu 30%) ist die PPR mit den idiopathisch generalisierten Epilepsien (IGE) assoziiert. Die PPR repräsentiert somit einen geeigneten Endophänotyp, um die pathogenetische Komplexität der IGE zu reduzieren und auf einfachere Phänotyp-Genotyp-Beziehungen zurückzuführen. Die Aufgabenstellung der vorliegenden Arbeit war die molekulargenetische Identifizierung von PPR-Determinanten und die Untersuchung des genetischen Zusammenhanges dieser Determinanten mit den häufigen IGE. Dazu wurden die Familien in zwei distinkte, phänotypisch homogenere Subgruppen unterteilt. Bei 25 Familien mit photosensitiver IGE fand sich ein signifikanter IGE/PPR-Locus in der Region 13q31, während sich bei 19 Familien mit PPR und visuell induzierten Anfällen ohne IGE ein signifikanter PPR-Locus im Bereich 6p21 eingrenzen ließ. Ein positionell und funktionell interessantes Kandidatengen für den 6p21-Locus ist das Gen BRD2 (Bromodomain-containing Protein 2). Für die juvenile myoklonische Epilepsie (JME) wurde in der Region 6p21.3 ein Genort kartiert und ein Kopplungsungleichgewicht zwischen BRD2 Polymorphismen und JME nachgewiesen. Ca. 30% der JME Patienten sind photosensitiv. Unsere Studie ergab eine signifikante Assoziation von sechs BRD2-Polymorphismen mit PPR, die auf eine Beteiligung des BRD2 Gens an der Pathogenese der PPR hinweisen. / Photosensitivity or photoparoxysmal response (PPR) is an electroencephalographic (EEG) trait characterized by an abnormal visual sensitivity of the brain in reaction to intermittent photic stimulation. Family and twin studies provide unequivocal evidence that PPR is genetically determined. Seizures triggered by visual stimuli occur in up to 10% of patients with epilepsies in childhood. PPR is frequently (30%) associated with idiopathic generalized epilepsies (IGE). By focusing on epilepsy-related EEG patterns such as PPR, which can be evoked in the EEG laboratory independent of obvious clinical expression of seizures, PPR represents a suitable endophenotype to search for susceptibility loci involved in cortical hyperexcitability and epileptogenesis. We carried out a genome wide linkage scan to map susceptibility loci for PPR and to explore their genetic relationship with idiopathic generalized epilepsy (IGE). To dissect PPR-related traits, we defined two distinct subgroups of families differing in their familial background on IGE. Our analyses provided significant evidence for linkage to the region 13q31 in PPR/IGE families, in which PPR was strongly associated with IGE, and significant evidence for linkage to the region 6p21 in PPR-families with predominantly pure PPR. The locus on 13q31 seems to confer susceptibility to photosensitive IGE, whereas the locus on 6p21 may predispose to PPR itself. The linkage region on 6p21 harbors a high-ranking candidate gene: BRD2 (bromodomain containing protein2). Linkage disequilibrium mapping in the candidate region 6p21.3 revealed strong associations between polymorphisms of the gene BRD2 and juvenile myoclonic epilepsy (JME), which exhibits PPR in 30% of JME patients. We found associations between PPR and six BRD2 polymorphisms. Considering the strong clinical association of JME and PPR, the present results support evidence that PPR and JME share epileptogenic pathways, for which BRD2 might be an underlying susceptibility gene.

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Les rétrovirus sont des virus à ARN, enveloppés présents dans de nombreuses espèces animales de rente, chez les animaux de compagnie et chez l'homme. Une des particularités des rétrovirus concerne l'intégration du génome viral au sein du génome de la cellule infectée; cette intégration est réalisée par une enzyme virale, l'intégrase. Le projet de cette thèse vise à mieux comprendre le fonctionnement de cette enzyme notamment en identifiant des facteurs cellulaires interagissant avec celle-ci, facteurs qui pourraient être des agents favorisant le processus intégratif ou, au contraire, des agents restrictifs. Les intégrases de deux modèles de rétrovirus ont été utilisées dans cette étude : L'intégrase de RAV1, un rétrovirus exogène aviaire du genre des alpharétrovirus appartenant au sous-groupe A de la famille des ASLV. Cette enzyme virale est largement étudiée soit au niveau structural ou fonctionnel, mais les données concernant ses partenaires cellulaires sont rares et insuffisantes. La seconde intégrase est celle du PERV A/C, un rétrovirus endogène porcin du genre gammarétrovirus. Aucune information sur cette enzyme n'a été décrite jusqu'à présent. Ces deux enzymes, en fusion avec une étiquette 6xHistidine, ont été donc produites en bactérie, et en cellules d'insecte puis purifiées sur colonne d'affinité en FPLC. Leurs activités catalytiques ont été testées in vitro. Ces tests permettent de valoriser la capacité de l'intégrase à exercer principalement les 2 fonctions dont elle est responsable in vivo, le clivage en 3' et le transfert de brins, et une activité qu'elle exerce exclusivement in vitro, la désintégration. Les protéines pures et actives ont ensuite servies à la vérification de leur interaction avec une protéine cellulaire, Brd2. La technique 'Far western blot' a ainsi permis de valider l'interaction entre l'intégrase de PERV et la protéine cellulaire, puis d'identifier les domaines de l'intégrase et de Brd2 impliqués dans cette interaction. A terme, l'identification de ce facteur cellulaire et la validation de son rôle dans le processus intégratif permettront de mieux comprendre ce processus particulier développé par les rétrovirus et pourront conduire au développement d'inhibiteurs dirigés contre cette interaction

Les rétrovirus sont des virus à ARN, enveloppés présents dans de nombreuses espèces animales de rente, chez les animaux de compagnie et chez l’homme. Une des particularités des rétrovirus concerne l’intégration du génome viral au sein du génome de la cellule infectée; cette intégration est réalisée par une enzyme virale, l’intégrase. Le projet de cette thèse vise à mieux comprendre le fonctionnement de cette enzyme notamment en identifiant des facteurs cellulaires interagissant avec celle-ci, facteurs qui pourraient être des agents favorisant le processus intégratif ou, au contraire, des agents restrictifs. Les intégrases de deux modèles de rétrovirus ont été utilisées dans cette étude : L’intégrase de RAV1, un rétrovirus exogène aviaire du genre des alpharétrovirus appartenant au sous-groupe A de la famille des ASLV. Cette enzyme virale est largement étudiée soit au niveau structural ou fonctionnel, mais les données concernant ses partenaires cellulaires sont rares et insuffisantes. La seconde intégrase est celle du PERV A/C, un rétrovirus endogène porcin du genre gammarétrovirus. Aucune information sur cette enzyme n’a été décrite jusqu’à présent. Ces deux enzymes, en fusion avec une étiquette 6xHistidine, ont été donc produites en bactérie, et en cellules d’insecte puis purifiées sur colonne d’affinité en FPLC. Leurs activités catalytiques ont été testées in vitro. Ces tests permettent de valoriser la capacité de l’intégrase à exercer principalement les 2 fonctions dont elle est responsable in vivo, le clivage en 3’ et le transfert de brins, et une activité qu’elle exerce exclusivement in vitro, la désintégration. Les protéines pures et actives ont ensuite servies à la vérification de leur interaction avec une protéine cellulaire, Brd2. La technique ‘Far western blot’ a ainsi permis de valider l’interaction entre l’intégrase de PERV et la protéine cellulaire, puis d’identifier les domaines de l’intégrase et de Brd2 impliqués dans cette interaction. A terme, l’identification de ce facteur cellulaire et la validation de son rôle dans le processus intégratif permettront de mieux comprendre ce processus particulier développé par les rétrovirus et pourront conduire au développement d’inhibiteurs dirigés contre cette interaction / A critical step for retroviral replication is the stable integration of the provirus genome into the genome of its host; this integration is realized by a viral enzyme, the integrase. The aim of this work was to better understand the functioning of the integrase, particularly, by identifying host factors that might interact with it, and which could be factors favoring the integration process or, restrictive factors. Therefore, we used two models of retroviral integrases: The integrase of RAV1, an alpharetrovirus belonging to the subgroup A of the family of ALSV. Although this viral enzyme is widely studied, still not enough data are available about its cellular cofactors. The second enzyme studied here is the integrase of PERV, a gammaretrovirus. No studies of either PERV integrase activities in vitro or of proteins interacting with this viral enzyme have been available until now. In the present study, we have expressed the PERV and ALSV integrases as fusion proteins with a 6xHistidine Tag in both Escherichia coli and insect SF9 cells. After that, we analysed their ability to mediate catalytic activities (3’-end processing, strand transfer and disintegration) in vitro. We also investigated the interaction of these two viral enzymes with the cellular protein Brd2, using the Far western blot method. Our results validate Brd2 as a cofactor of PERV integrase and point to the important role of particular domains of the PERV integrase and Brd2 in mediating the interaction. Finally, this study contibute to a better understanding of the precise interaction between cellular proteins and integrase, and may lead in the future to the development of protein-protein interaction inhibitors