Trotz aller Fortschritte in Diagnostik und Behandlung bleibt die Therapie von BrustkrebspatientInnen – gerade bei tripelnegativen Mammakarzinomen, die nicht auf eine hormonelle Therapie ansprechen – eine Herausforderung. Eine wachsende Zahl von Belegen spricht dafür, dass Cadherine nicht nur in physiologischen Prozessen wie der Embryogenese, sondern auch in pathologischen Prozessen wie der Tumorprogression eine Rolle spielen, was diese Moleküle zu potenziellen Zielen einer targetspezifischen Tumortherapie macht. Im Mausmodell konnte bislang gezeigt werden, dass eine Herabregulierung von N-Cadherin das Mammakarzinomwachstum in vivo hemmt. N-Cadherin wird auch in humanem Brustkrebsgewebe aberrant exprimiert. In nur schwach invasiven Brustkrebszelllinien führte eine Überexpression von N-Cadherin in vitro zu einer Steigerung des migratorischen und invasiven Verhaltens der Zellen. In dieser Arbeit wurde an der humanen Mammakarzinomzelllinie SUM149PT der Einfluss einer Defizienz von N-Cadherin auf die Expression von E- und VE-Cadherin, sowie auf das Proliferations-, Migrations- und Invasionsverhalten der Zellen in vitro untersucht. Eine Charakterisierung der humanen Brustkrebszelllinien SUM149PT, der aus ihr hervorgegangenen mit shRNA transduzierten N-Cadherin-Knock-down-Klone und der Scramble-Kontrollen fand mittels Western Blot, RT-PCR, q-PCR und Immunfluoreszenzanalysen statt. Das Proliferationsverhalten der Zelllinien wurde mit Hilfe von Verdopplungszeitbestimmungen und Sphäroidversuchen analysiert. Um den Einfluss einer N-Cadherin-Defizienz auf die Migration zu untersuchen, wurden auf dem Prinzip der Boyden-Chamber basierende Versuche, sowie in vitro Wundheilungsversuche durchgeführt. Auch die Invasionsversuche basierten auf dem Prinzip der Boyden-Chamber. Eine zusätzliche Beschichtung mit Matrigel simulierte hier die extrazelluläre Matrix. Bei den Untersuchungen mittels Western Blot, RT-PCR und q-PCR wurde deutlich, dass die N-Cadherin defizienten Klone keine Veränderung in der E-Cadherin-Expression, jedoch interessanterweise eine starke Herabregulierung von VE-Cadherin aufweisen. Bei den Immunfluoreszenzanalysen wiesen SUM149PT und Scramble-Kontrollen eine Expression von N-Cadherin in der Zellmembran auf, während die N-Cadherin-defizienten Klone keine N-Cadherin-Expression zeigten. Wie schon in Western-Blot, RT-PCR und q-PCR zeigten die N-Cadherin defizienten Klone im Vergleich zu den SUM149PT und den Scramble-Kontrollen keine veränderte E-Cadherin-Expression. Bei Einsatz eines VE-Cadherin-Anitkörpers zeigten die N-Cadherin defizienten Klone keine Expression von VE-Cadherin, während SUM149PT und Scramble eine deutliche VE-Cadherin-Expression in der Zellmembran zeigten. Daraus lässt sich schließen, dass N-Cadherin möglicherweise die Expression von VE-Cadherin beeinflussen kann. In der Verdopplungszeitbestimmung ließen sich keine signifikanten Änderungen des Wachstumsverhaltens zwischen N-Cadherin defizienten Klonen und Kontrollzelllinien nachweisen. Um auch das dreidimensionale Wachstum der Zellen zu untersuchen, wurden Sphäroidversuche durchgeführt. Alle untersuchten Zelllinien bildeten stabile Sphäroide aus, die jedoch einen großen Saum an nicht integrierten Zellen aufwiesen. Es zeigte sich kein signifikanter Unterschied im Sphäroidwachstum zwischen N-Cadherin defizienten Klonen und Kontrollzelllinien. Die Herabregulierung von N-Cadherin scheint in humanen Mammakarzinomzelllinien in vitro keinen Einfluss auf das Wachstumsverhalten der Zellen zu haben. Im Boyden-Chamber-Assay zeigte sich, dass eine Herabregulierung von N-Cadherin bei der humanen Mammakarzinomzelllinie SUM149PT in vitro zu einer signifikanten Verringerung des Migrationspotenzials führt. Dieses Ergebnis wurde beim in vitro Wundheilungsversuch bestätigt. Hier zeigten die N-Cadherin defizienten Klone eine signifikant verringerte Flächenbedeckungsrate – also eine signifikant verringerte Geschwindigkeit mit der die aufeinander zuwanderndern Zellen eine freie Fläche bedecken – als die Kontrollzelllinien. Im Invasionsversuch zeigten die N-Cadherin defizienten Klone im Vergleich zu den Kontrollen eine hochsignifikant verringerte Invasivität. Eine Herabregulierung von N-Cadherin bei der humanen Mammakarzinomzelllinie SUM149PT führt also in vitro zu einer signifikanten Verringerung des Invasionspotenzials. Die Ergebnisse dieser Arbeit lassen den Schluss zu, dass N-Cadherin bei humanen Mammakarzinomzelllinien durch seinen positiven Einfluss auf Migration und Invasion der Zellen eine große Rolle beim Prozess des invasiven Wachstums und der Metastasierung spielt. Eine Anti-N-Cadherin-Therapie könnte auch bei BrustkrebspatientInnen, gerade mit tripelnegativen Mammakarzinomen, neue Möglichkeiten der Behandlung eröffnen.:Abkürzungsverzeichnis V 1 Einleitung 1 1.1 Tumorentstehung und -progression 1 1.2 Der Prozess der Metastasierung 4 1.2.1 Epithelial-mesenchymale Transition 4 1.3 Brustkrebs 7 1.3.1 Histologie und Klassifizierung 7 1.4 Cadherine 11 1.4.1 Klassische Cadherine 11 1.4.2 VE-Cadherin 13 1.4.3 N-Cadherin 14 2 Fragestellung 16 3 Material und Methoden 18 3.1 Material 18 3.1.1 Geräte 18 3.1.2 Verbrauchsmaterialien 20 3.1.3 Chemikalien, Reagenzien, Enzyme und Kits 22 3.1.4 Puffer, Ansätze und Gele 25 3.1.5 Antikörper 28 3.1.6 Primer 29 3.1.7 Zellkultur 30 3.1.8 Software 32 3.2 Methoden 33 3.2.1 Kultivierung der Zellen 33 3.2.2 Proteinisolierung und Western Blot 34 3.2.3 RNA-Isolierung und Polymerasekettenreaktion 36 3.2.4 Immunfluoreszenz 40 3.2.5 Untersuchung des Proliferationsverhaltens 41 3.2.6 Sphäroidversuch 43 3.2.7 Untersuchung des Migrationsverhaltens mittels Boyden-Chamber 44 3.2.8 Untersuchung des Migrationsverhaltens mittels in vitro Wundheilungsversuch 45 3.2.9 Untersuchung des Invasionsverhaltens 46 3.2.10 Statistische Analyse 49 4 Ergebnisse 50 4.1 Charakterisierung der N-Cadherin defizienten Klone 50 4.1.1 Untersuchung der E-, N- und VE-Cadherin-Expression auf mRNA-Ebene mittels RT-PCR und q-PCR 53 4.1.2 Untersuchung der E-, N- und VE-Cadherin-Expression auf Proteinebene mittels Western Blot 56 4.1.3 Untersuchung der E-, N- und VE-Cadherin-Expression und -Lokalisation mittels Immunfluoreszenzfärbung 57 4.2 Einfluss des N-Cadherin auf das Proliferationsverhalten 61 4.3 Einfluss des N-Cadherin auf die Sphäroidbildung 62 4.4 Einfluss des N-Cadherin auf das Migrationsverhalten 64 4.5 Einfluss des N-Cadherin auf das Invasionsverhalten 69 5 Diskussion 71 5.1 N-Cadherin-Defizienz hat keinen Einfluss auf die Expression und subzelluläre Lokalisation von E-Cadherin in der humanen Mammakarzinomzelllinie SUM149PT 72 5.2 N-Cadherin-Defizienz führt zu deutlicher Herabregulierung der VE-Cadherin-Expression in der humanen Mammakarzinomzelllinie SUM149PT 73 5.3 N-Cadherin-Defizienz hat keinen Einfluss auf die Proliferation der humanen Mammakarzinomzelllinie SUM149PT 74 5.4 N-Cadherin-Defizienz hat keinen Einfluss auf die Sphäroidbildung der humanen Mammakarzinomzelllinie SUM149PT 74 5.5 N-Cadherin-Defizienz führt zu signifikant verringerter Migration der humanen Mammakarzinomzelllinie SUM149PT 75 5.6 N-Cadherin-Defizienz führt zu signifikant verringerter Invasion der humanen Mammakarzinomzelllinie SUM149PT 76 6 Zusammenfassung 79 7 Abbildungsverzeichnis 83 8 Tabellenverzeichnis 84 9 Literaturverzeichnis 85 10 Danksagung 104 / Breast cancer is the most common cancer type for women and the most frequent type after lung cancer overall. In spite of all improvements in clinical diagnostics and treatment, the therapy of patients with breast cancer remains a difficult task. Therefore it is important to find new strategies of treatment, especially for patients with triple negative breast cancer that does not respond to hormone therapy. There is growing evidence that cadherins are not only important in physiological processes like embryogenesis but also in pathological processes like tumour progression. A so called cadherin switch has been implicated in carcinogenesis, in particular the loss of E-cadherin and the upregulation of N-cadherin. Thus, these molecules are an interesting subject of studies and a potential target for specific cancer therapy. It was shown previously that efficient silencing of N-cadherin in murine breast cancer cells inhibits tumour growth in vivo. N-cadherin is also aberrantly expressed in human breast cancer tissue. An overexpression of N-Cadherin in breast cancer cells enhances tumour cell motility, migration and invasion in vitro. In this thesis the impact of N-cadherin deficiency on the expression level of E- and VE-cadherin as well as its effect on proliferation, migration and invasion behaviour of breast cancer cells in vitro was investigated. The human breast cancer cell line SUM149PT, its N-cadherin deficient clones and scramble controls were characterised by Western Blot, RT-PCR, q-PCR and immunofluorescence staining. To analyse the impact of N-cadherin on the proliferation behaviour doubling time proliferation assays and spheroid assays were performed. A Boyden chamber assay and an in vitro wound healing assay were performed to investigate the effect of N-cadherin deficiency on cell migration. Furthermore, a Boyden chamber assay with a coating of Matrigel was used to study the invasion potential of the N-cadherin deficient cell clones and control cell lines. The results of Western Blot, RT-PCR and q-PCR show that silencing of N-cadherin expression in SUM149PT cells had no influence on E-cadherin expression, but significantly decreased VE-cadherin expression. With immunofluscence staining it was evidenced that SUM149PT and scramble controls express N-cadherin in the cell membrane, whereas N-cadherin deficient clones do not show any N-cadherin expression. There was no difference seen in E-cadherin expression between N-cadherin deficient clones and control cell lines. While SUM149PT and scramble controls expressed VE-cadherin in the cell membrane, N-cadherin deficient clones did not express VE-cadherin. These results suggest that N-cadherin may have an influence on the expression of VE-cadherin. No significant alteration in proliferation behaviour between N-cadherin deficient clones and controls could be shown with the doubling time proliferation assay. To investigate the impact of N-cadherin on the three-dimensional growth spheroid assays were performed. All cell lines formed stable speroids, however fringes of many not incorporated cells were found. There was no difference in spheroidgrowth between N-cadherin deficient clones and control cell lines. No influence of N-cadherin on cell proliferation in vitro could be seen. With the help of Boyden chamber assays it was shown that silencing of N-cadherin in the human breast cancer cell line SUM149PT results in a significant decrease of migration potential in vitro. This was confirmed with an in vitro wound healing assay. N-cadherin deficient clones showed a significantly reduced surface coverage rate than SUM149PT and scramble controls. A significant decrease of invasive cells in N-cadherin deficient clones in comparison to the controls was revealed in invasion assays. Thus silencing of N-Cadherin in the human breast cancer cell line SUM149PT leads to a significantly decreased invasion potential in vitro. The results presented this thesis provide evidence that N-cadherin is involved in invasive tumour progression and metastasis of the human breast cancer cell line SUM149PT by promoting cell migration and invasion. Anti-N-cadherin strategies could thus be a potential target specific therapy of cancer patients, particularly with triple negative breast cancer.:Abkürzungsverzeichnis V 1 Einleitung 1 1.1 Tumorentstehung und -progression 1 1.2 Der Prozess der Metastasierung 4 1.2.1 Epithelial-mesenchymale Transition 4 1.3 Brustkrebs 7 1.3.1 Histologie und Klassifizierung 7 1.4 Cadherine 11 1.4.1 Klassische Cadherine 11 1.4.2 VE-Cadherin 13 1.4.3 N-Cadherin 14 2 Fragestellung 16 3 Material und Methoden 18 3.1 Material 18 3.1.1 Geräte 18 3.1.2 Verbrauchsmaterialien 20 3.1.3 Chemikalien, Reagenzien, Enzyme und Kits 22 3.1.4 Puffer, Ansätze und Gele 25 3.1.5 Antikörper 28 3.1.6 Primer 29 3.1.7 Zellkultur 30 3.1.8 Software 32 3.2 Methoden 33 3.2.1 Kultivierung der Zellen 33 3.2.2 Proteinisolierung und Western Blot 34 3.2.3 RNA-Isolierung und Polymerasekettenreaktion 36 3.2.4 Immunfluoreszenz 40 3.2.5 Untersuchung des Proliferationsverhaltens 41 3.2.6 Sphäroidversuch 43 3.2.7 Untersuchung des Migrationsverhaltens mittels Boyden-Chamber 44 3.2.8 Untersuchung des Migrationsverhaltens mittels in vitro Wundheilungsversuch 45 3.2.9 Untersuchung des Invasionsverhaltens 46 3.2.10 Statistische Analyse 49 4 Ergebnisse 50 4.1 Charakterisierung der N-Cadherin defizienten Klone 50 4.1.1 Untersuchung der E-, N- und VE-Cadherin-Expression auf mRNA-Ebene mittels RT-PCR und q-PCR 53 4.1.2 Untersuchung der E-, N- und VE-Cadherin-Expression auf Proteinebene mittels Western Blot 56 4.1.3 Untersuchung der E-, N- und VE-Cadherin-Expression und -Lokalisation mittels Immunfluoreszenzfärbung 57 4.2 Einfluss des N-Cadherin auf das Proliferationsverhalten 61 4.3 Einfluss des N-Cadherin auf die Sphäroidbildung 62 4.4 Einfluss des N-Cadherin auf das Migrationsverhalten 64 4.5 Einfluss des N-Cadherin auf das Invasionsverhalten 69 5 Diskussion 71 5.1 N-Cadherin-Defizienz hat keinen Einfluss auf die Expression und subzelluläre Lokalisation von E-Cadherin in der humanen Mammakarzinomzelllinie SUM149PT 72 5.2 N-Cadherin-Defizienz führt zu deutlicher Herabregulierung der VE-Cadherin-Expression in der humanen Mammakarzinomzelllinie SUM149PT 73 5.3 N-Cadherin-Defizienz hat keinen Einfluss auf die Proliferation der humanen Mammakarzinomzelllinie SUM149PT 74 5.4 N-Cadherin-Defizienz hat keinen Einfluss auf die Sphäroidbildung der humanen Mammakarzinomzelllinie SUM149PT 74 5.5 N-Cadherin-Defizienz führt zu signifikant verringerter Migration der humanen Mammakarzinomzelllinie SUM149PT 75 5.6 N-Cadherin-Defizienz führt zu signifikant verringerter Invasion der humanen Mammakarzinomzelllinie SUM149PT 76 6 Zusammenfassung 79 7 Abbildungsverzeichnis 83 8 Tabellenverzeichnis 84 9 Literaturverzeichnis 85 10 Danksagung 104

Der erste Teil der vorliegenden Arbeit ist ein Review über die unterschiedlichen Studien aus den letzten zwanzig Jahren, die sich mit der Thematik: psychische Komorbidität bei (Brust-) Krebs auseinandersetzen. Die thematische Auseinandersetzung erfolgte zum Großteil in Form von Querschnittstudien. Das Fortbestehen der psychischen Komorbidität über Monate oder auch Jahre, nach dem Zeitpunkt der Diagnosestellung, ist erst in jüngster Zeit in das Blickfeld der Wissenschaft gerückt. Der zweite Teil der Arbeit beschäftigt sich mit der Untersuchung verschiedener soziodemographischer und krankheitsspezifischer Faktoren und deren Einfluß auf die psychische Komorbidität. Die untersuchte Patientinnengruppe sind Frauen mit Brustkrebs. Das verwendete Screeninginstrument ist die Hospital Anxiety and Depression Scale (HADS). Die Identifizierung der soziodemographischen und krankheitsspezifischen Faktoren, die psychische Komorbidität beeinflussen, ist ein noch junges Forschungsgebiet. Die Identifikation dieser Faktoren ist wichtig für die Erkrankten, um Chronifizierungsprozesse seelischen Leiden vorzubeugen. Das Ziel sollte sein, die psychische Komorbidität frühzeitig zu erkennen und zu behandeln. Dadurch kann die Lebensqualität der Frauen mit Brustkrebs gesteigert werden. Durch Fragebögen beispielsweise, als sekundär präventive Maßnahme, kann die psychische Komorbidität frühzeitig erkannt und therapiert werden. Ein zusätzlicher und nicht unerheblicher Aspekt ist dabei eine mögliche Kostenersparnis im Gesundheitswesen.

ZUSAMMENFASSUNG Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades Dr. med. Titel: Kosmetisches Ergebnis und Lebensqualität nach brusterhaltender Operation und unterschiedlicher Bestrahlung des Mammakarzinoms eingereicht von Katharina Schirm angefertigt an der Universitätsklinik für Strahlentherapie und Radioonkologie, Leipzig betreut von Prof. Dr. med. R.-D. Kortmann eingereicht im April 2013 Das Mammakarzinom ist die häufigste Krebserkrankung der Frau. Die Therapie des lokal begrenzten Mammakarzinoms hat in den letzten 30 Jahren enorme Fortschritte gemacht. Die 10-Jahres-Überlebenswahrscheinlichkeit beträgt heute bei günstiger Tumorkonstellation (pT1 N0 M0) mehr als 90% [1]. Bei immer besser werdenden Heilungschancen erreichen daher eine gute Therapieverträglichkeit, das kosmetische Ergebnis und die Lebensqualität einen immer größeren Stellenwert. In dieser Untersuchung wurden 65 brusterhaltend operierte, rezidivfreie Mammakarzinompatientinnen mit einem mittleren Alter von 65 Jahren zum Untersuchungszeitpunkt und einem medianen follow up von 59,1 Monaten hinsichtlich 2er Hypothesen untersucht. Hypothese 1: „Das kosmetische Ergebnis nach brusterhaltender Mammakarzinomtherapie wird von der adjuvanten Bestrahlungstechnik (WBI ohne Boost, WBI mit 10,0 Gy percutanem Boost, WBI mit 16,0 Gy percutanem Boost, WBI mit interstitiellem Boost und alleinige interstitielle PBI) beeinflusst.“ Hypothese 2: „Die Lebensqualität nach brusterhaltender Mammakarzinomtherapie wird vom kosmetischen Ergebnis beeinflusst.“ Das kosmetische Ergebnis wurde auf einer 4 Punkte-Skala von „sehr gut“, „gut“, „zufriedenstellend, ordentlich“ bis „unzufrieden, schlecht“ von den Patientinnen selbst und dem untersuchenden Arzt bewertet. Zusätzlich wurden von jeder Patientin 3 standardisierte Fotos angefertigt. Diese wurden von 4 weiblichen und 4 männlichen Ratern aus unterschiedlichen Berufsgruppen beurteilt. Erstmals konnte neben der Interraterübereinstimmung (Fleiss Kappa) auch die Rangfolge der Kosmetikbewertungen beachtet werden (Konkordanzkoeffzient Kendall´s W). So wurden Abweichungen von „sehr gut“ zu „gut“ zwischen den Ratern weniger gravierend als die Abweichung von „sehr gut“ zu „unzufrieden“ gewertet. Die Erfassung der subjektiven Lebensqualität erfolgte mit Hilfe der EORTC QLQ-C30 und BR-23 [30] Fragebögen. Zum Vergleich dienten die Lebensqualitätsreferenzdaten gesunder Frauen im Alter von 16-92 Jahre (n=968) bzw. im Alter von 60-69 Jahren (n=197) aus dem Leipziger Raum [35]. Die subjektive Bewertung des kosmetischen Ergebnisses durch die Patientinnen fiel überwiegend sehr gut bis gut aus (44,6% sehr gut, 41,5% gut). Die ärztliche Kosmetikbewertung war insgesamt etwas schlechter als die der Patientinnen (21,5% sehr gut, 36,9% gut). Die Interrater-Übereinstimmung war schwach (κ=0,145). Auch die 8 Betrachter sowie die 8 Betrachter und der Arzt zeigten nur eine schwache Interrater-Übereinstimmung (mκ=0,24 - 0,25). Unter der Berücksichtigung der Rangfolge der Kosmetikbewertunegn (Konkordanzkoeffizeint Kendall´s W) konnte allerdings eine hohe Übereinstimmung der 8 Rater und des Arztes ermittelt werden (W=0,699). Hinsichtlich des kosmetischen Ergebnisses wurden Patientinnen mit alleiniger interstitieller Teilbrustbestrahlung (PBI) am besten bewertet (83,3% sehr gut – gut, p=0,048). Dabei ist kritisch zu erwähnen, dass diese Patientengruppe nur kleine Tumoren und keinen Lymphknotenbefall (11 x T1, 1 x T2, 12x N0) hatte. Eine percutane Boostbestrahlung führt zu signifikant (p=0,030) höheren (Grad III-IV) akute Nebenwirkungen (10 Gy pBoost 4 von 10), 16 Gy pBoost (2 von 9). Signifikant (p=0,040) mehr Fibrosen und Narbenveränderungen I.-III. Grades nach LENT-SOMA traten nach percutaner Bestrahlung der gesamten Brust und anschließender interstitieller Boostbestrahlung auf (20 von 24). Für das kosmetische Ergebnis spielen die Tumorgröße, die Anzahl der befallen Lymphknoten und das Operationsausmaß eine entscheidende Rolle. Die 5 verglichenen Bestrahlungskonzepte waren in dieser Untersuchung kritisch betrachtet hinsichtlich des kosmetischen Ergebnisses gleichwertig, die Hypothese „Das kosmetische Ergebnis nach brusterhaltender Mammakarzinomtherapie wird von der adjuvanten Bestrahlungstechnik (WBI ohne Boost, WBI mit 10,0 Gy percutanem Boost, WBI mit 16,0 Gy percutanem Boost, WBI mit interstitiellem Boost und alleinige interstitielle PBI) beeinflusst“ hat sich nicht bestätigt. Die Globaleinschätzung der Gesundheit und Lebensqualität fiel im untersuchten Kollektiv nach abgeschlossener Mammakarzinomtherapie durchschnittlich gut aus (MW 66,0 ± 22,4) und zeigte im Vergleich zu gleichaltrig gesunden Frauen kaum Unterschiede. Auch die Funktionsskalen und Symptomskalen wurden mit ausgezeichnet bis gut bewertet, zeigten im Vergleich zu gleichaltrigen gesunden Frauen (60-69 Jahre) aber signifikant schlechtere Bewertungen der Rollenfunktion / Arbeitsfähigkeit (p=0,017), sozialen Funktion (p=0,018), Schlafstörungen (p=0,035) und Kurzatmigkeit (p=0,016). Ein signifikanter Zusammenhang zwischen der Lebensqualität und dem kosmetischen Ergebnis fand sich nur bei der ärztlichen Kosmetikbeurteilung und dem Lebensqualitätsteilbereich Sexualfunktion. Die Hypothese „Die Lebensqualität nach brusterhaltender Mammakarzinomtherapie wird vom kosmetischen Ergebnis beeinflusst“ kann somit nur im Teilbereich Sexualfunktion und auch nur in der kosmetischen Bewertung durch den Arzt bestätigt werden. Für die objektive Erfassung des kosmetischen Ergebnisses ist eine weitere Entwicklung und Etablierung objektiver, einheitlicher und durchgängig anwendbarer Messverfahren notwendig. Dabei sollten auch präoperative Bewertungen und Fotodokumentationen mit einbezogen werden. Letztlich spielen aber die Heilung, die Zufriedenheit und das Wohlbefinden der Patientinnen die entscheide Rolle. Die Erfassung der Nebenwirkungen und subjektiven Lebensqualität spielt daher im klinischen Alltag eine wichtige Rolle.:INHALTSVERZEICHNIS ABBILDUNGSVERZEICHNIS I ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS VII 1 EINLEITUNG 1 1.1 Epidemiologie 1 1.2 Therapie 3 1.3 Ziel dieser Arbeit 5 2 MATERIAL UND METHODEN 7 2.1 Versuchsplanung 7 2.2 Patienteneinschluss 8 2.3 Datenerhebung 9 2.3.1 Ablauf 9 2.3.2 Patientencharakteristika 10 2.3.2.1 Altersverteilung 10 2.3.2.2 Menopausenstatus 10 2.3.2.3 Body Mass Index (BMI) 10 2.3.2.4 Brustgröße 11 2.3.2.5 Nachbeobachtungszeit 11 2.3.2.6 Rezidivfreiheit 11 2.3.2.7 Sekundärmalignomrate 11 2.3.2.8 Familienstand 12 2.3.3 Tumorcharakteristika 12 2.3.3.1 Histologie 12 2.3.3.2 TNM Stadien 12 2.3.3.3 Grading 14 2.3.3.4 Rezeptorstatus 14 2.3.3.5 Her-2-Status 15 2.3.3.6 Risikoklassifizierung nach St. Gallen 2007 15 2.3.3.7 Tumorlokalisation 16 2.3.4 Therapie 17 2.3.4.1 Operationstechniken 17 2.3.4.2 2. Operation 17 2.3.4.3 Axilladissektion 17 2.3.4.4 Endokrine Therapie 17 2.3.4.5 Chemotherapie 18 2.3.4.6 Antikörpertherapie 18 2.3.4.7 Bestrahlungskonzepte 18 2.3.5 Nebenwirkungen 20 2.3.5.1 Akute Nebenwirkungen 20 2.3.5.2 Späte Nebenwirkungen 20 2.4 Beurteilung der Kosmetik 23 2.4.1 Beurteilung der Kosmetik durch den Untersucher 23 2.4.2 kosmetische Selbsteinschätzungen der Patientinnen 23 2.4.3 Beurteilung der Kosmetik durch die Rater 24 2.5 Beurteilung der Lebensqualität 26 2.5.1 EORTC-Fragenbögen 26 2.5.2 Referenzdaten zur Lebensqualität 26 2.6 Statistische Analyse 27 3 ERGEBNISSE 29 3.1 Patienteneinschluss 29 3.2 Patientencharakteristika 30 3.2.1 Altersverteilung 30 3.2.2 Menopausenstatus 30 3.2.3 Body Mass Index (BMI) 30 3.2.4 Brustgröße 31 3.2.5 Nachbeobachtungszeit 31 3.2.6 Rezidivfreiheit 32 3.2.7 Sekundärmalignomrate 32 3.2.8 Familienstand 33 3.3 Tumorcharakteristika 34 3.3.1 Histologie 34 3.3.2 TNM Stadien 34 3.3.3 Grading 36 3.3.4 Rezeptorstatus 36 3.3.5 Her-2-Status 37 3.3.6 Risikoklassifizierung nach St. Gallen 2007 37 3.3.7 Tumor-Lokalisation 37 3.4 Therapie 38 3.4.1 Operationstechniken 38 3.4.2 2. Operation 38 3.4.3 Axilladissektion 38 3.4.4 Endokrine Therapie 39 3.4.5 Chemotherapie 39 3.4.6 Antikörpertherapie 39 3.4.7 Bestrahlungskonzepte 39 3.5 Nebenwirkungen 44 3.5.1 Akute Nebenwirkungen 44 3.5.2 Späte Nebenwirkungen 44 3.5.2.1 Schuppung / Rauheit 44 3.5.2.2 Teleangiektasien 45 3.5.2.3 Fibrosen / Narbenveränderungen 46 3.5.2.4 Atrophien / Kontraktionen 46 3.5.2.5 Brustvolumendifferenzen 47 3.5.2.6 Mamillenstand 48 3.5.2.7 Brachiales Lymphödem und Armbeweglichkeit 48 3.5.2.8 Ein- und Austrittsstellen der Brachytherapiekatheter 48 3.6 Kosmetik 49 3.6.1 Kosmetikbewertung 49 3.6.2 Vergleich der Bestrahlungskonzepte 55 3.6.3 Vergleich der Einflussfaktoren und Nebenwirkungen 59 3.7 Lebensqualität 69 3.7.1 Globaleinschätzung 69 3.7.2 Funktionsskalen 71 3.7.3 Symptomskalen 75 4 DISKUSSION 79 4.1 Patientenkollektiv 79 4.2 Kosmetik 80 4.2.1 Testverfahren zur Beurteilung der Kosmetik 80 4.2.2 Kosmetisches Ergebnis und Einfluss der Bestrahlung 83 4.2.3 andere Einflussfaktoren auf das kosmetische Ergebnis 86 4.3 Lebensqualität 96 4.3.1 Testverfahren zur Beurteilung der Lebensqualität 96 4.3.2 Lebensqualität und kosmetisches Ergebnis 97 4.3.3 Lebensqualität rezidivfreier Patientinnen und gesunder Frauen 98 4.3.4 Mammakarzinomspezifische Lebensqualität und andere Einflussfaktoren 101 4.4 Kritische Diskussion 105 4.5 Ausblick 108 5 ZUSAMMENFASSUNG 109 6 LITERATURVERZEICHNIS 113 7 ANHANG 127 7.1 Datenerfassungsbogen 127 7.2 Patientenfragebogen 132 7.3 Studienübersicht 140 DANKSAGUNG 141 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 142 CURRICULUM VITAE 143

Obesity is a known risk factor for breast cancer. Since obesity rates are constantly rising worldwide, understanding the molecular details of the interaction between adipose tissue and breast tumors becomes an urgent task. To investigate potential molecular changes in breast cancer cells induced by co-existing adipocytes, we used a co-culture system of different breast cancer cell lines (MCF-7 and T47D: ER+/PR+/HER2- and MDA-MB-231: ER-/PR-/HER2-) and murine 3T3-L1 adipocytes. Here, we report that co-culture with adipocytes revealed distinct changes in global gene expression pattern in the different breast cancer cell lines. Our microarray data revealed that in both ER+ cell lines, top upregulated genes showed significant enrichment for hormone receptor target genes. In triple-negative MDA-MB-231 cells, co-culture with adipocytes led to the induction of pro-inflammatory genes, mainly involving genes of the Nf-κB signaling pathway. Moreover, co-cultured MDA-MB-231 cells showed increased secretion of the pro-inflammatory interleukins IL-6 and IL-8. Using a specific NF-κB inhibitor, these effects were significantly decreased. Finally, migratory capacities were significantly increased in triple-negative breast cancer cells upon co-culture with adipocytes, indicating an enhanced aggressive cell phenotype. Together, our studies illustrate that factors secreted by adipocytes have a significant impact on the molecular biology of breast cancer cells.:1. Einleitung ......................................................................................................... 4 1.1 Übergewicht und Adipositas – die Volkskrankheit des 21. Jahrhunderts ........ 4 1.2 Fettgewebe – Fett ist nicht gleich Fett ........................................................... 5 1.3 Fehlfunktionen des Fettgewebes bei Adipositas ............................................ 6 1.4 Der Zusammenhang zwischen Adipositas und Krebs ..................................... 7 1.4.1 Adipositas und die Tumormikroumgebung .................................................. 7 1.4.2 Adipositas-induzierte Inflammation und Krebs ............................................. 9 1.4.3 Die Insulin-IGF1-Achse................................................................................11 1.4.4 Östrogen-Synthese in adipösem Fettgewebe ............................................12 1.4.5 Tumorzellmetabolismus ..............................................................................12 1.5 Ziele der Arbeit ............................................................................................. 14 2 Publikation ...................................................................................................... 15 3 Zusammenfassung der Arbeit ......................................................................... 29 4 Literaturverzeichnis.......................................................................................... 34 5 Anlagen ........................................................................................................... 43 5.1 Supplemental Material .................................................................................. 43 5.1.1 Supplemental Figures ................................................................................45 5.1.2 Supplemental Tables ..................................................................................51 5.2 Erklärung über den wissenschaftlichen Beitrag des Promovenden zur Publikation ......................................................................................................... 66 5.3 Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen und Symbole ............................ 67 5.4 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit .............................. 69 5.5 Lebenslauf ................................................................................................... 70 5.6 Publikationsverzeichnis ................................................................................ 72 5.7 Vorträge und Posterpräsentationen mit publizierten Abstracts ..................... 73 5.8 Danksagung ................................................................................................. 74

Das Mammakarzinom ist weltweit die häufigste krebsbedingte Todesursache bei Frauen. Fortschritte in der Therapie ermöglichen zwar eine Verlängerung der Lebens- dauer, jedoch kommt es dadurch vermehrt zur Bildung von Metastasen im zentralen Nervensystem (ZNS). Die Diagnostik und Behandlung von ZNS-Metastasen sind be- grenzt und die Lebensqualität sowie Lebensdauer der Betroffenen nimmt bei zerebraler Metastasierung rapide ab. Ziel aktueller Forschungsprojekte ist daher, Biomarker zu identifizieren, die Hinweise auf eine Brustkrebserkrankung oder Metastasierung liefern. So soll eine kostengünstige, risikoarme und minimalinvasive Methode etabliert werden, die zuverlässige Daten über die Prognose und dementsprechende Therapien erbringt. Diese Arbeit hatte daher die Absicht, mithilfe von qPCR Expressionsprofile von miRNAs aus Serumproben von Brustkrebspatientinnen zu erstellen und deren Funktion als prog- nostische Biomarker für eine Metastasierung ins ZNS zu erweisen. Anhand von Metas- tasierung und Rezeptorstatus wurden die Proben in Untergruppen eingeteilt und statis- tisch mit einer gesunden Kontrollgruppe verglichen. Insgesamt zeigte sich bei 26 miRNAs eine signifikante Dysregulation der Expression bei mindestens einer der Untergruppen. Insbesondere bei ZNS-Metastasen war das Expres- sionsmuster bei miRNA-122-5p, miRNA-296-5p, miRNA-490-3p und miRNA-576-3p sig- nifikant erhöht, während die Expression von miRNA-130a-3p, miRNA-148b-3p und miRNA-326 signifikant reduziert war. Basierend auf den Übereinstimmungen unserer Er- gebnisse mit den Daten bisheriger Forschungsprojekten wiesen vier miRNAs eine po- tenzielle Funktion als Biomarker für Metastasen auf: miRNA-122-5p, miRNA-490-3p und miRNA-130a-3p, miRNA-326. Bei ZNS-Metastasen zeigten besonders miRNA-122-5p und miRNA-490-3p statistisch relevante Veränderungen. Um den Einfluss von miRNAs auf den gesamten Körper darzustellen, wurde mithilfe ver- schiedener Datenbanken nach entsprechenden Zielgenen und Signalwegen für die 26 identifizierten miRNAs recherchiert. Neben dem Einfluss auf Stoffwechselwege und Er- krankungen, zeigte sich bei acht Targets ein Zusammenhang mit der Entstehung von Krebs. Ergänzend zur Identifikation von miRNA-Expressionsprofilen wurden Zellkulturversuche mit zerebralen Endothel- (cerebEND) und Brustkrebszellen (4T1) durchgeführt. Verwendet wurden zwei cerebEND- und eine 4T1-Zellreihe von Mäusen, von denen eine ce- rebEND-Kultur zuvor in der Arbeitsgruppe Burek mit einem miRNA-210-Vektor trans- fiziert wurde. Studien belegen den Einfluss von miRNA-210 auf den mitochondrialen Stoffwechsel, Angiogenese, Reaktionen auf DNA-Schäden, Apoptose und Zellüberleben sowie auf die Proteine BRCA1, PARP1 und E-Cadherin und schreiben ihr damit eine Funktion in der Krebsentstehung und Metastasierung zu. Zur Bestimmung der Proliferation und Aktivität der transfizierten cerebEND-210-Zellen im Verhältnis zur unbehandelten Kontrolle, wurden BrdU-Proliferationsassays und MTT- Assays mit verschiedenen Zellzahlen durchgeführt. Bei der Untersuchung der Prolifera- tion zeigte sich in beiden Versuchen eine erhöhte Aktivität der cerebEND-210-Zellen, da miRNA-210 vermutlich auch hier das Zellüberleben gesichert hat. Zudem wurde die An- heftung der Brustkrebszellen an den zerebralen Endothelzellen im Adhäsionsversuchs überprüft. Hierbei wurde eine Abnahme der Adhäsion der cerebEND-210-Zellen beo- bachtet. Vermutet wird eine Veränderung des Phänotyps der Rezeptorbindungen der cerebEND-210-Zellen. Die Ergebnisse der Zellkulturversuche dienen als Grundlage für weitere Experimente. / Breast cancer is the most common cause of cancer-related death in women worldwide. Although advances in therapy allow for increased longevity, this results in increased metastasis to the central nervous system (CNS). Diagnosis and treatment of CNS metastases are limited and the quality of life and lifespan of those affected decreases rapidly with cerebral metastasis. Therefore, the goal of current research projects is to identify biomarkers that provide evidence of breast cancer disease or metastasis. Thus, a low-cost, low-risk, and minimally invasive method should be established that yields reliable data on prognosis and corresponding therapies. Therefore, this work aimed to use qPCR to establish expression profiles of miRNAs from serum samples of breast cancer patients and prove their function as prognostic biomarkers for metastasis to the CNS. Based on metastasis and receptor status, samples were divided into subgroups and statistically compared with a healthy control group. Overall, 26 miRNAs showed significant dysregulation of expression in at least one of the subgroups. Specifically, in CNS metastases, the expression pattern of miRNA-122-5p, miRNA-296-5p, miRNA-490-3p and miRNA-576-3p was significantly increased, while the expression of miRNA-130a-3p, miRNA-148b-3p and miRNA-326 was significantly decreased. Based on the agreements of our results with the data of previous research projects, four miRNAs showed potential function as biomarkers of metastasis: miRNA-122-5p, miRNA-490-3p and miRNA-130a-3p, miRNA-326. In CNS metastases, miRNA-122-5p and miRNA-490-3p in particular showed statistically relevant changes. To demonstrate the influence of miRNAs on the whole body, we searched for corresponding target genes and signaling pathways for the 26 identified miRNAs using various databases. In addition to their influence on metabolic pathways and diseases, eight targets were found to be associated with the development of cancer. Complementary to the identification of miRNA expression profiles, cell culture experiments were performed with cerebral endothelial (cerebEND) and breast cancer (4T1) cells. Two cerebEND and one 4T1 cell lines from mice were used, one cerebEND culture of which was previously transfected with a miRNA-210 vector in the Burek group. Studies demonstrate the influence of miRNA-210 on mitochondrial metabolism, angiogenesis, DNA damage responses, apoptosis and cell survival, as well as on BRCA1, PARP1 and E-cadherin proteins, thus attributing it a function in carcinogenesis and metastasis. To determine the proliferation and activity of the transfected cerebEND-210 cells relative to the untreated control, BrdU proliferation assays and MTT assays were performed with different cell numbers. Proliferation assays showed increased activity of cerebEND-210 cells in both experiments, as miRNA-210 presumably ensured cell survival in this case as well. In addition, the attachment of breast cancer cells to cerebral endothelial cells was examined in the adhesion assay. Here, a decrease in adhesion of cerebEND-210 cells was observed. A change in the phenotype of receptor binding of cerebEND-210 cells is suspected. The results of the cell culture experiments serve as a basis for further experiments.

Die mitochondriale Entkopplung ist ein effektiver Weg, um die Thermogenese und basale metabolische Rate einer Zelle anzuheben. Im Versuchsaufbau mit malignen Zellen führte dies zu einer Apoptose. 2,4-DNP als spezifischer Entkoppler der Atmungskette zeigte in diesem Zusammenhang mittels LDH-Analysen an HACAT-, PA1-, BT20 und MDA-MB 231- Zellen eine dosisabhängige Wirkung auf die Zellproliferation in allen verwendeten Zelllinien, unter den verwendeten Tumorzellen am eindrucksvollsten bei den Ovarialkarzinom Zellen. Allen Zellarten gemeinsam war dabei eine Wachstumshemmung abhängig von der Länge der Inkubationszeit. Die mikrokalorimetrischen Analysen wurden an HACAT-, BT20- und MDA-MB 231- Zellen durchgeführt. Eine höhere 2,4-DNP-Konzentration führte dabei ebenfalls zu einer gesteigerten Wärmefreisetzung, wobei eine positive Korrelation zwischen Einwirkdauer und Wärmefreisetzung bestand. Eine signifikante Zytotoxizität ließ sich bei hohen DNP-Konzentrationen und bei langer Inkubationszeit in den PA1- und MDA-MB 231- Zelllinien nachweisen. MDA-MB 231- Zellen reagierten dabei besonders sensibel. In der aktuellen Tumortherapie bietet die Kombination von Alterationen der mitochondrialen und glykolytischen Abläufen neben den gängigen Behandlungsoptionen einen vielversprechenden Therapieansatz (8, 28). Durch den Einsatz von mitochondrialen Entkopplern als Ergänzung zu den herkömmlichen Therapieschemata könnte effektiv in den metabolischen Stoffwechsel der Zellen eingegriffen und neben der Tumorzellproliferation auch die Regression positiv beeinflusst werden. Das Ziel wäre, eine kontrollierte Apoptose bei möglichst wenigen systemischen Nebenwirkungen auszulösen. Hierzu werden im Rahmen der optimalen Dosisfindung für den Einsatz von 2,4-DNP jedoch weitere Versuchsansätze mit Inkubationszeiten von mindestens 48h benötigt. / Mitochondrial uncoupling is an effective way to raise the thermogenesis and basal metabolic rate of a cell. In the experimental setup with malignant cells, this led to apoptosis. In this context 2,4-DNP as a specific uncoupler of the respiratory chain showed a dose-dependent effect on cell proliferation in all cell lines used by means of LDH analyses on HACAT, PA1, BT20 and MDA-MB 231 cells. Among the used tumor cells this effect was most impressively documented in ovarian carcinoma cells. Common to all cell types was a growth inhibition dependent on the length of the incubation period. Microcalorimetric analyses were performed on HACAT, BT20, and MDA-MB 231 cells. A higher 2,4-DNP concentration also resulted in increased heat release, with a positive correlation between exposure time and heat release. Significant cytotoxicity was detected at high DNP concentrations and with long incubation times in the PA1 and MDA-MB 231 cell lines. MDA-MB 231 cells reacted particularly sensitively. In current tumor therapy, the combination of alterations of mitochondrial and glycolytic pathways offers a promising therapeutic approach in addition to current treatment options (8, 28). The use of mitochondrial uncouplers as an adjunct to conventional therapeutic regimens could effectively interfere with cell metabolism and positively influence regression in addition to tumor cell proliferation. The goal would be to induce controlled apoptosis with as few systemic side effects as possible. For this, however, further experimental approaches with incubation times of at least 48h are needed in the context of optimal dose finding for the use of 2,4-DNP.

Beta-Hydroxybutyrat (3OHB) ist ein physiologischer Ketonkörper,wie er zum Beispiel im Rahmen einer ketogenen Diät als alternativer Energielieferant produziert wird. Außerdem ist 3OHB ein Modulator von Zellhämostase und zahlreichen Signalwegen. Ziel dieser Arbeit war, zu untersuchen ob 3OHB die Polarisation von Makrophagen beeinflusst und ob er deren Interaktion mit Sphäroiden aus Brustkrebszellen beeinflusst wird. Die Makrophagen-Subtypen (M0, M1 und M2) wurden aus THP1-Zellen polarisiert. Die Subtypen wurden auf den Oberflächenmarker CCR7, sowie auf das Protein Indolamin-2,3-Dioxygenase (IDO) untersucht. Außerdem wurde die Expression von Monocarboxylat-Transportern 1 und 4 (MCT1, MCT4) und die Expression von G-Protein-gekoppelten-Rezeptoren 41, 43 und 109A (GPR41, GPR43, GPR109A) untersucht. In den Tests zur Gen- und Proteinexpression konnte festgestellt werden, das die Transporterproteine und Oberflächenrezeptoren, die zur Verwertung von 3OHB und zu einer möglichen Beeinflussung der Zellen durch 3OHB notwendig sind, bei den Makrophagen-Subtypen vorhanden sind. Das Gelingen der Polarisation wurde zumindest für die M1‑Fraktion durch den durchgeführten IDO‑Versuch gesichert. Des Weiteren wurde eine mögliche Beeinflussung des Zytokinspektrums der Fraktionen durch die Polarisation, sowie durch unterschiedliches Angebot an Sauerstoff und Anwesenheit von 3OHB untersucht. Die Zusammenschau der experimentellen Ergebnisse lässt die Aussage zu, dass 3OHB eine immunmodulierende Wirkung auf die getesteten Makrophagen-Fraktionen hat. Weitere Schlussfolgerungen unserer Versuche waren nicht immer eindeutig, und zum Teil widersprechen sie den Ergebnissen aus bisherigen Studien, was die Komplexität der Interaktionen zwischen Zyto- und Chemokinen, Makrophagen-Subtypen und beeinflussenden Faktoren verdeutlicht, sodass man von einer Übertragbarkeit der in vitro Ergebnisse auf eine in vivo Situation aktuell nicht ausgehen kann. Zusätzlich wurden die vier Fraktionen auf ihr Migrations-und Invasionsverhalten untersucht, letzteres anhand von Sphäroiden aus der Brustkrebszelllinie BT20. Diese scheinen unter Einfluss von 3OHB ebenfalls moduliert, wobei hier noch vielfältige Möglichkeiten der weiteren Austestung dieser Annahme bestehen. / Beta-hydroxybutyrate (3OHB) is a physiological ketone body that is produced, for example, as part of a ketogenic diet as an alternative source of energy. In addition, 3OHB is a modulator of cell hemostasis and numerous signaling pathways. The aim of this work was to investigate whether 3OHB influences the polarization of macrophages and whether it affects their interaction with spheroids from breast cancer cells. The macrophage subtypes (M0, M1 and M2) were polarized from THP1 cells. The subtypes were analyzed for the surface marker CCR7, as well as for the protein indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO). In addition, the expression of monocarboxylate transporters 1 and 4 (MCT1, MCT4) and the expression of G-protein-coupled receptors 41, 43 and 109A (GPR41, GPR43, GPR109A) were examined. The tests on gene and protein expression showed that the transporter proteins and surface receptors required for the utilization of 3OHB and for a possible influence of 3OHB on the cells are present in the macrophage subtypes. The success of the polarization was ensured, at least for the M1 fraction, by the IDO experiment. Furthermore, a possible influence on the cytokine spectrum of the fractions by the polarization, as well as by different supply of oxygen and presence of 3OHB was investigated.The summary of the experimental results allows the conclusion that 3OHB has an immunomodulating effect on the tested macrophage fractions.Further conclusions of our experiments were not always clear and partly contradict the results of previous studies, which illustrates the complexity of the interactions between cyto- and chemokines, macrophage subtypes and influencing factors, so that a transferability of the in vitro results to an in vivo situation cannot be assumed at present. In addition, the four fractions were examined for their migration and invasion behavior, the latter using spheroids from the BT20 breast cancer cell line.These also appear to be modulated under the influence of 3OHB, although there are still many possibilities for further testing this assumption.

Anhand einer Analyse von deutschen Zeitungsartikeln, welche sich jeweils mit den Themen Brust- oder Lungenkrebs beschäftigen, wird in dieser Dissertation die Bedeutung von Prävention herausgearbeitet. Im Fokus der Fragestellung steht hierbei, wie sehr die Gesamtberichterstattung beider Krankheiten durch das Thema Prävention beeinflusst wird, ob ihre Prävention vorwiegend als positiv oder kritisch bewertet wird und wie sich die Präventionsschwerpunkte bei Brust- und Lungenkrebs unterscheiden. Hierzu werden 1020 Zeitungsartikel aus zwei Tageszeitungen und einem Wochenmagazin Themenbereichen zugeordnet und quantitativ verglichen. Anschließend werden die Artikel, bei denen der thematische Schwerpunkt auf der Prävention liegt, mittels einer Frameanalyse qualitativ ausgewertet.

Bei der adjuvanten Immuntherapie soll das Immunsystem von Tumorpatienten gezielt gegen Mikrometastasen aktiviert werden, die nach der operativen Entfernung des Primärtumors im Körper verbleiben. Tumor-assoziierte Antigene (TAA) spielen dabei die zentrale Rolle. Um der Heterogenität eines Tumors in der Expression einzelner TAAs Rechnung zu tragen, werden in modernen Vakzinierungsstrategien Pools von verschiedenen TAAs eingesetzt. Für das Mammakarzinom sind aber bislang nur wenige TAAs bekannt. Auf der Suche nach unbekannten Genen mit Mamma- bzw. Mammakarzinom-restringierter Expression in der Transkriptomdatenbank GeneExpress® wurde ein EST gefunden, das nur in 2 % der getesteten weibl. Normalgewebe ohne Mamma mit einer marginalen mittleren Expression von 16 FE (Fluoreszenzeinheit) detektiert wurde, aber in 63 % der Mammanormalgewebe (159 FE) und in 61 % der Mammakarzinome (339 FE) exprimiert wurde. Das korrespondierende UniGene-Cluster gab erste Hinweise auf die Zugehörigkeit dieses neuen Gens zu der Cytochrom P450 (CYP) Familie. Durch computergestützte Homologievergleiche mit verwandten Mitgliedern dieser Familie in Kombination mit RT-PCR konnte die cDNA-Sequenz dieses neuen CYP ermittelt werden: Durch Amplifikation der Gesamtlängen-cDNA wurden drei Transkripte in der Mammakarzinomzelllinie SK-BR-3 gefunden, die von zwei neuen CYP Genen stammen, CYP4Z1 und dem Pseudogen CYP4Z2P. Die cDNA von CYP4Z1 kodiert für ein 505 As großes Protein, das aufgrund von Homologien einer neuen Subfamilie innerhalb der CYP4 Familie zugeordnet werden kann. Sowohl die Sequenz als auch die vorhergesagte Sekundärstruktur zeigen alle charakteristischen Merkmale eines funktionellen Mitglieds dieser Familie. Aufgrund einer Nonsensemutation in Exon 8 kodiert die cDNA von CYP4Z2P (1436 bp) für ein verkürztes, nichtfunktionelles P450 von 340 As, das zu 96% identisch mit P450 4Z1 ist. Außerdem wurde in SK-BR-3 eine Spleißvariante von CYP4Z1 identifiziert. CYP4Z1 (50,8 kb) und CYP4Z2P (57,3 kb) liegen auf Chromosom 1p33-p34.1 und bestehen aus 12 Exons mit konservierten Exon-Intron-Grenzen. CYP4Z2P ist aus einer inversen Duplikation von CYP4Z1 hervorgegangen. Mittels Realtime RT-PCR mit cDNA von 17 Normalgeweben von gepoolten Spendern und von Mammakarzinomen konnte die auf Brustdrüsengewebe restringierte Expression beider Gene demonstriert werden: Die Expression von CYP4Z1 war in Mammakarzinomgewebe 3,6-mal höher als in Mammanormalgewebe, 60-mal höher als in Lunge und 84-mal höher als in Leber. Alle anderen getesteten weibl. Normalgewebe zeigten eine noch geringere Expression. Ein ähnlich stringentes Expressionsprofil ergab die Analyse von CYP4Z2P, allerdings mit einer deutlich niedrigeren Expressionsstärke. Das Mamma-restringierte Expressionsverhalten von CYP4Z1 wurde durch einen ?Cancer-Profiling-Array? (241 Tumor-/Normalgewebepaare von 13 Gewebetypen) bestätigt. Damit konnte gezeigt werden, dass CYP4Z1 bei 52 % der getesteten 50 Brustkrebspatientinnen im Tumor versus peritumoralem Normalgewebe überexprimiert war. Mit einem spezifischen Kaninchen-Antiserum konnte die Expression von P450 4Z1 Protein sowohl in CYP4Z1-transduzierten Zelllinien als auch in Mammagewebeproben mittels Western-Blot nachgewiesen werden. Konfokale Laser-Scanning Mikroskopie von MCF-7 Zellen, die das Fusionsprotein CYP4Z1-EGFP exprimierten, und die subzelluläre Fraktionierung der CYP4Z1-Transduktanten zeigten P450 4Z1 als integrales Membranprotein des endoplasmatischen Retikulums (ER). Für die Lokalisation und die Zurückhaltung im ER ohne Recycling aus dem Prä-Golgiapparat sind die ersten 32 As erforderlich, was Studien mit unterschiedlichen Deletionsmutanten aus der N-terminalen Sequenz von 4Z1 zeigten. Die Entdeckung eines neuen Mamma-spezifisch exprimierten P450 Enzyms eröffnet neue Möglichkeiten sowohl in Hinsicht auf eine Immuntherapie von Brustkrebs als auch für die Entwicklung neuer Chemotherapeutika, die spezifisch durch P450 4Z1 am Tumorort umgesetzt werden können.

Bei der adjuvanten Immuntherapie soll das Immunsystem von Tumorpatienten gezielt gegen Mikrometastasen aktiviert werden, die nach der operativen Entfernung des Primärtumors im Körper verbleiben. Tumor-assoziierte Antigene (TAA) spielen dabei die zentrale Rolle. Um der Heterogenität eines Tumors in der Expression einzelner TAAs Rechnung zu tragen, werden in modernen Vakzinierungsstrategien Pools von verschiedenen TAAs eingesetzt. Für das Mammakarzinom sind aber bislang nur wenige TAAs bekannt. Auf der Suche nach unbekannten Genen mit Mamma- bzw. Mammakarzinom-restringierter Expression in der Transkriptomdatenbank GeneExpress® wurde ein EST gefunden, das nur in 2 % der getesteten weibl. Normalgewebe ohne Mamma mit einer marginalen mittleren Expression von 16 FE (Fluoreszenzeinheit) detektiert wurde, aber in 63 % der Mammanormalgewebe (159 FE) und in 61 % der Mammakarzinome (339 FE) exprimiert wurde. Das korrespondierende UniGene-Cluster gab erste Hinweise auf die Zugehörigkeit dieses neuen Gens zu der Cytochrom P450 (CYP) Familie. Durch computergestützte Homologievergleiche mit verwandten Mitgliedern dieser Familie in Kombination mit RT-PCR konnte die cDNA-Sequenz dieses neuen CYP ermittelt werden: Durch Amplifikation der Gesamtlängen-cDNA wurden drei Transkripte in der Mammakarzinomzelllinie SK-BR-3 gefunden, die von zwei neuen CYP Genen stammen, CYP4Z1 und dem Pseudogen CYP4Z2P. Die cDNA von CYP4Z1 kodiert für ein 505 As großes Protein, das aufgrund von Homologien einer neuen Subfamilie innerhalb der CYP4 Familie zugeordnet werden kann. Sowohl die Sequenz als auch die vorhergesagte Sekundärstruktur zeigen alle charakteristischen Merkmale eines funktionellen Mitglieds dieser Familie. Aufgrund einer Nonsensemutation in Exon 8 kodiert die cDNA von CYP4Z2P (1436 bp) für ein verkürztes, nichtfunktionelles P450 von 340 As, das zu 96% identisch mit P450 4Z1 ist. Außerdem wurde in SK-BR-3 eine Spleißvariante von CYP4Z1 identifiziert. CYP4Z1 (50,8 kb) und CYP4Z2P (57,3 kb) liegen auf Chromosom 1p33-p34.1 und bestehen aus 12 Exons mit konservierten Exon-Intron-Grenzen. CYP4Z2P ist aus einer inversen Duplikation von CYP4Z1 hervorgegangen. Mittels Realtime RT-PCR mit cDNA von 17 Normalgeweben von gepoolten Spendern und von Mammakarzinomen konnte die auf Brustdrüsengewebe restringierte Expression beider Gene demonstriert werden: Die Expression von CYP4Z1 war in Mammakarzinomgewebe 3,6-mal höher als in Mammanormalgewebe, 60-mal höher als in Lunge und 84-mal höher als in Leber. Alle anderen getesteten weibl. Normalgewebe zeigten eine noch geringere Expression. Ein ähnlich stringentes Expressionsprofil ergab die Analyse von CYP4Z2P, allerdings mit einer deutlich niedrigeren Expressionsstärke. Das Mamma-restringierte Expressionsverhalten von CYP4Z1 wurde durch einen ?Cancer-Profiling-Array? (241 Tumor-/Normalgewebepaare von 13 Gewebetypen) bestätigt. Damit konnte gezeigt werden, dass CYP4Z1 bei 52 % der getesteten 50 Brustkrebspatientinnen im Tumor versus peritumoralem Normalgewebe überexprimiert war. Mit einem spezifischen Kaninchen-Antiserum konnte die Expression von P450 4Z1 Protein sowohl in CYP4Z1-transduzierten Zelllinien als auch in Mammagewebeproben mittels Western-Blot nachgewiesen werden. Konfokale Laser-Scanning Mikroskopie von MCF-7 Zellen, die das Fusionsprotein CYP4Z1-EGFP exprimierten, und die subzelluläre Fraktionierung der CYP4Z1-Transduktanten zeigten P450 4Z1 als integrales Membranprotein des endoplasmatischen Retikulums (ER). Für die Lokalisation und die Zurückhaltung im ER ohne Recycling aus dem Prä-Golgiapparat sind die ersten 32 As erforderlich, was Studien mit unterschiedlichen Deletionsmutanten aus der N-terminalen Sequenz von 4Z1 zeigten. Die Entdeckung eines neuen Mamma-spezifisch exprimierten P450 Enzyms eröffnet neue Möglichkeiten sowohl in Hinsicht auf eine Immuntherapie von Brustkrebs als auch für die Entwicklung neuer Chemotherapeutika, die spezifisch durch P450 4Z1 am Tumorort umgesetzt werden können.