En aquest treball hem estudiat marcadors relacionats amb el desenvolupament embrionari del colon humà com són "Sonic hedgehog" i els membres de la família CEACAM comparant els seus nivells d'expressió en mostres de colon humà embrionari, teixit tumoral i teixit normal del propi pacient de pacients diagnosticats de càncer colorectal."Sonic hedgehog" (Shh) és un morfogen que s'expressa durant les etapes inicials de l'embriogènesi. Te un paper important en les primeres fases de l'organogènesi de cervell, pulmó, pàncrees i de l'aparell gastrointestinal. Shh també presenta expressió en molts tumors d'origen endodèrmic, però el seu paper en el desenvolupament del càncer colorectal no estava encara estudiat.En el present treball hem realitzat un anàlisi morfològic de colons embrionaris , detecció per inmunohistoquímica i RT-qPCR per examinar l'expressió de Shh en colons d'entre 7 i 11 setmanes de desenvolupament així com també en teixit tumoral i normal del mateix pacient, de 63 pacients diagnosticats de càncer colorectal.Els nostres resultats ens indiquen que l'expressió de Shh comença durant la setmana 7 de desenvolupament embrionari i es detecta a la zona de l'endoderma intestinal adjacent al mesènquima. Els nivells més elevats d'expressió de mRNA Shh es detecten a la setmana 9 de desenvolupament i mitjançant inmunohistoquímica, localitzem aquesta expressió tant a epiteli intestinal com a la zona del mesènquima.Nivells baixos es detecten durant la setmana 11 de desenvolupament i, mitjançant inmunohistoquímica, aquesta expressió es detecta de manera lleu a la base de les criptes i en teixit muscular.En colon humà embrionari, l'expressió de Shh és elevada en el moment de l'organització de l'endoderma embrionari (setmana 9) i l'expressió de Shh és baixa en el moment de la diferenciació del teixit del colon (setmana 11).Mitjançant RT-qPCR veiem que els nivells de mRNA Shh en teixit tumoral són molt més elevats que els obtinguts en el cas del teixit normal (p=0.00001). Elevats nivells d'expressió s'associen amb estadis inicials (I-II) del desenvolupament d'un càncer colorectal (p=0.02).Shh pot tenir un paper important tant en l'organització embrionària del colon humà com en les primeres etapes del desenvolupament d'un càncer colorectal.Els membres de la família CEACAM (CEACAM1, CEACAM3, CEACAM4, CEACAM5, CEACAM67 i CEACAM8) són proteïnes de membrana que participen en processos d'immunitat i adhesió.Mitjançant RT-qPCR detectem expressió de CEACAM1, CEACAM5, CEACAM6 i CEACAM7 en embrions d'entre 7 i 11 setmanes de desenvolupament. Els nivells de CEACAM6 van augmentant progressivament a mida que augmenta l'edat de l'embrió; és a dir, els seus nivells augmenten a mida que va augmentant el grau de diferenciació cel·lular de les cèl·lules que formen el colon humà embrionari.En el cas de l'anàlisi d'expressió de CEACAM5 observem que existeixen diferencies significatives entre els nivells d'expressió en teixit tumoral respecte al teixit normal (p=0.00008) i valors significatius respecte al temps a la progressió (p=0.001) i supervivència (p=0.006). / We have studied some markers related with colon development in human embryos, Shh and CEA family members, to compare their mRNA expression levels in human embryonary colon samples with adult tumor and matched normal tissue from patients affected by colorectal cancer. Sonic hedgehog (Shh) is a morphogene expressed during the early phases of embryogenesis and in the foregut development. It plays an important role in the organogenesis of the brain, lung, pancreas and gastrointestinal system. Shh is also expressed in several tumors of endodermic origin. In the present study, we used morphological analysis, real-time quantitative PCR, and immunohistochemical staining to examine Shh expression in the colon of human embryos of 7 to 11 weeks. Our results show that Shh begins to be expressed in the human colon at 7 weeks, when it is found only in the cells of the endodermal epithelium. The highest levels of Shh expression are observed at 9 weeks, in the endodermal epithelium and in the mesenchyme. At 11 weeks, the colon is morphologically differentiated, and only low levels of Shh expression are detected at the base of the colon crypts. We conclude that in the human embryonic colon, Shh is upregulated at the time of the greatest structural organization and downregulated when the colon has acquired greater morphological differentiation. We used real-time quantitative PCR to assess Shh mRNA expression levels in tumor and matched normal tissue from 57 colorectal cancer patients and correlated the results with patient clinicopathological characteristics. Shh expression levels were higher in tumor tissue than in normal tissue from the same patient (P=0.00001). Higher levels of Shh expression were associated with early stage disease (P=0.02). Shh overexpression may influence the development of colorectal cancer.CEA family members are membrane proteins involved in immunity and adhesion. Using RT-qPCR we have detected expression of CEACAM1, CEACAM5, CEACAM6, CEACAM7 in colon of human embryos between 7-11 weeks of development. mRNA CEACAM6 level increases progressively with embryonic age. CEACAM5 analysis show that high mRNA levels in tumor tissues compared with levels in normal tissues of the same patient are related with a low progression of the tumor and a higher survival.

Resum:Les síndromes de càncer colorectal (CCR) hereditari representen entre un 3% i un 5% de tots els casos de CCR i inclouen tots aquells individus amb un elevat grau d'agregació familiar. La més freqüent és la síndrome de Lynch, causada per la presència de mutacions en els gens reparadors del DNA, majoritàriament MLH1 i MSH2. La poliposi adenomatosa familiar (FAP) és la segona en incidència, es caracteritza per l'aparició de pòlips precursors a la neoplàsia colorectal i la seva causa principal és la presència de mutacions en el gen supressor tumoral APC. En els últims anys s'ha descobert que els grans reordenaments d'aquests gens són responsables de la malaltia en una part de les famílies que pateixen aquestes síndromes. A més, estudis d'expressió d'aquests gens en línia germinal han demostrat l'existència de desequilibris al·lèlics tant en famílies portadores de mutacions com en famílies on no es detecten mutacions en el DNA. L'objectiu d'aquesta tesi és l'estudi de la dosi en la dels gens MLH1, MSH2 i APC, implicats en la síndrome de Lynch i la FAP. D'aquesta forma, hem analitzat la dosi tant a nivell de DNA (grans reordenaments) com a nivell d'RNA (expressió específica d'al·lel), sempre treballant amb línia germinal de pacients. Els resultats aquí recollits permeten millorar l'estratègia de diagnòstic molecular de les famílies amb síndrome de Lynch i FAP que són ateses al nostre centre, al mateix temps que la comprensió del procés tumorogènic. / Hereditary colorectal cancer (CRC) syndromes represent about 3% to 5% of all cases of CRC and include all those individuals with high familiar aggregation. The most frequent syndrome is Lynch syndrome, caused by the presence of mutations in the mismatch repair (MMR) genes, mostly MLH1 and MSH2. Familiar adenomatous polyposis (FAP) is the second in incidence, is characterized by precursor polyps and its mainly caused by mutations in the tumoral suppressor gene APC. Recently, it has been discovered that gross rearrangements of these genes are responsible of these two syndromes. Also, expression analyses of these genes in the germline have demonstrated the existence of allelic imbalances in both families carrying pathogenic mutations and families without detected mutations. Our aim was to study de dose of MLH1, MSH2 and APC genes in the germline of Lynch syndrome and polyposis families, respectively. To that end, we analyzed the dose at DNA level (gross rearrangements) and at RNA level (allele-specific expression) of these patients. The results summarized in this thesis permit improving the molecular diagnostic strategy in Lynch syndrome and FAP families, and also improve the knowledge of the tumorogenic process.

El càncer colorectal (CCR) és una de les neoplàsies més prevalents en els països occidentals, i un dels tumors en el que els factors genètics juguen un paper fonamental en el seu desenvolupament. Així, l'anomenat CCR hereditari, entès com aquelles formes degudes a l'alteració de gens d'alta penetrança, suposa entre el 3-5% de tots els casos. Tot i que suposen un percentatge baix de forma global, l'elevada prevalença del CCR, i les conseqüències catastròfiques de les síndromes hereditàries, converteixen el diagnòstic d'aquestes malalties en un objectiu fonamental a la pràctica clínica, justificant la creació d'unitats específiques. El diagnòstic d'una síndrome hereditària té conseqüències potencialment beneficioses, no només pel pacient, sinó també pels familiars, podent realitzar un diagnòstic presimptomàtic. Per tant, el primer pas consisteix en identificar als individus o pacients que potencialment poden tenir una malaltia hereditària, per tal de poder realitzar en ells els estudis moleculars necessaris pel diagnòstic. Les síndromes hereditàries associades al CCR es divideixen des d'un punt de vista fenotípic en síndromes polipòsiques, com la poliposi adenomatosa familiar, i en síndromes no polipòsiques, encapçalades per la síndrome de Lynch, algunes formes de CCR associat al gen MYH i l'anomenat CCR hereditari tipus X. Mentre que a la pràctica clínica el diagnòstic de les síndromes polipòsiques és senzill donada la seva expressivitat clínica, el diagnòstic de les formes no polipòsiques representa un repte constant pel clínic, donat que en moltes ocasions el fenotip pot ser indistingible del CCR esporàdic. La síndrome de Lynch constitueix la forma més freqüent de CCR hereditari. L'estratègia diagnostica es basa en els criteris revisats de Bethesda, que tenen com objectiu identificar aquells pacients amb una major probabilitat de ser portadors d'una mutació germinal als gens reparadors de l'ADN, en els que estaria indicat avaluar la presència d'alteració del sistema de reparació de l'ADN en el tumor mitjançant l'estudi d'inestabilitat de microsatèl.lits o tinció per immunohistoquímica de les proteïnes reparadores de l'ADN. Encara que aquests criteris han demostrat ser una estratègia efectiva, han estat àmpliament criticats degut a la seva complexitat, i la necessitat d'avaluar el tumor, que en ocasions no és possible. Recentment, han aparegut diferents models predictius de mutació germinal en els gens reparadors de l'ADN, basats en la història personal, familiar i molecular. Aquests models, entre els que es troba l'anomenat PREMM1,2, ofereixen una aproximació quantitativa de la probabilitat de ser portador de mutacions, de forma que en funció de la magnitud d'aquesta, l'actitud preventiva i l'estratègia molecular podria ser diferent. No obstant, l'avaluació d'aquests models en una sèrie de pacients amb CCR de base poblacional no s'ha realitzat fins el moment. Per altra banda, el CCR associat al gen MYH és una síndrome de recent descripció, en el que a diferència de la síndrome de Lynch, la informació de les manifestacions fenotípiques i el risc de CCR associat a la presència de mutacions és molt reduïda. Així, tot i que els pacients amb mutacions bial.lèliques solen presentar una forma de poliposi adenomatosa, fins en un 30% no presenten adenomes associats al CCR. A més, el risc de CCR associat a mutacions monoal.lèliques és controvertit. Basant-se en el projecte EPICOLON, un estudi multicèntric de base poblacional que va recollir tots els pacients amb CCR incidents a Espanya durant els anys 2000-2001, la present tesi doctoral aprofundeix en la caracterització i identificació de la síndrome de Lynch i el CCR associat al gen MYH, aportant informació rellevant i novedosa al respecte. / Colorectal cancer (CRC) is the second most common cancer in most developed countries. Although it is assumed that up to 20-25% of cases develop as a result of inherited genetic factors, known genes predisposing to this malignancy account for less than 5%. Hereditary CRC is traditionally divided into polyposic syndromes, such as familial adenomatous polyposis, and non polyposic syndromes, such as Lynch syndrome. Early diagnosis of these hereditary forms is crucial since intensive cancer screening and prophylactic surgery have been shown to reduce the incidence and mortality of CRC. Moreover, appropriate presymptomatic testing can be offered to reduce mortality among at-risk family members, and relatives not at risk can avoid unnecessary intensive surveillance. However, heterogeneity of non polyposic syndromes complicates early recognition, which is critical and often difficult. In parallel with this difficulty, diagnostic criteria continue to evolve as understanding and characterization of these syndromes improve. Indeed, identification of Lynch syndrome can be done by molecular pre-screening using microsatellite instability analysis and/or immunostaining in combination or not with clinical criteria. Nevertheless, Lynch syndrome identification is moving toward more refined algorithms and multivariable models which combine personal and familial data in order to obtain a quantitative estimation of the risk. Following this direction, the PREMM1,2 model provides a new and easy-to-use model to predict mutations in the MLH1/MSH2 genes. Whereas the model accurately discriminates gene mutation carriers in the subset of individuals at moderate to high risk for Lynch syndrome, its usefulness in an unselected CRC population is unknown. Furthermore, efficacy of the PREMM1,2 model in combination with tumor MMR testing has not yet been assessed. On the other hand, whereas it has conclusively demonstrated that biallelic MYH mutations confer a significant risk for colorectal cancer (CRC), the influence of monoallelic mutations remains controversial. In this sense, characterization of MYH-associated CRC is critical to identify individuals who may benefit from preventive strategies.Using data from the EPICOLON study, a prospective, multicenter, population-based cohort of CRC patients in Spain, the present Doctoral Thesis study in depth the characterization and identification of non polyposic hereditary colorectal syndromes.