L'osteogènesi és un procés del desenvolupament dels vertebrats controlat per molècules senyalitzadores que proporcionen a les cèl·lules mesenquimals la informació necessària per a diferenciar al llinatge osteogènic.D´entre aquestes, les citoquines de la família BMP (Bone Morphogenetic Protein) estan implicades en nombrosos aspectes del desenvolupament sent especialment importants en el desenvolupament de l'os. La unió d'aquestes BMPs als seus receptors inicia diferents vies de transducció de senyal que es classifiquen com a dependents o independents de Smads. S'ha comprovat en cultius cel·lulars com les BMP estimulen l'expressió de factors de transcripció específics d'osteoblasts com són Runx2 i Osterix, així com marcadors de la diferenciació osteoblàstica com la Fosfatasa Alcalina, el Col·lagen tipus I o l'Osteocalcina.Els objectius que ens vam platejar foren:- Identificació de les vies de transducció de senyals induïdes per BMP-2 ialtres mecanismes moleculars involucrats en l'activació d'Osterix.a) Anàlisi de la regió promotora d'osterix i identificació de les regions de resposta a BMP-2.b) Identificació dels factors de transcripció que s'uneixen a aquestes regions i estudi de la seva regulació en resposta a BMP-2.-Establiment de clons estables induïbles que ens permetin estudiar in vivo la regulació transcripcional d'Osterix.-Estudi d'altres gens modulats transcripcionalment per BMP-2 i la seva implicació en l'osteogènesi.El primer pas de la recerca fou aïllar dues seqüències del promotor d'osterix que es troben molt conservades entre humans i ratolins i clonar-les en un vector pGL2 que codifica per un gen reporter luciferasa. Mitjançant la transfecció i la deleció d'aquestes construccions vam observar una seqüència de 55 parells de bases a la regió més proximal que és la responsable de la resposta a BMP-2.Mitjançant mutagènesi vam identificar una seqüència homeobox palindròmica (TAATTA) que és la responsable de la inducció d'osterix per BMP-2. La proteïna Dlx5, un factor de transcripció involucrat en l'osteogènesi, és capaç d'unir-se i activar el promotor d'osterix en aquesta seqüència. Aquesta observació es complementà amb estudis del patró d'expressió temporal d'aquests gens en que es comprovà que l'activació de Dlx5 per BMP-2 precedeix temporalment a la d'Osterix. Mitjançant experiments de sobreexpressió i silenciació en cèl·lules C2C12 descrivim que Dlx5 és imprescindible per a l'expressió d'Osterix en resposta a BMP-2. No obstant, els experiments de sobreexpressió també indicaven que la BMP-2 té un efecte additiu a Dlx5 que ens permeté deduir que algun altre mecanisme havia d'estar implicat en l'activació d'Osterix per BMP-2.Descartada una possible interacció de Dlx5 amb les proteïnes Smad, vam investigar les vies independents de Smads i observàrem que la proteïna p38-MAPK, que també és activada en resposta a BMP-2, és important per a l'activació d'Osterix induïda per BMP-2. Usant una variant constitutivament activa de MKK6, capaç d'activar p38, i SB203580, que és un inhibidor específic d'aquesta via, vam confirmar la fosforilació de Dlx5 per acció de p38 i que aquesta és funcional. Per tal de confirmar aquestes observacions sobre el promotor del gen osterix endogen, es realitzaren experiments d'immunoprecipitació de cromatina (ChIP) que confirmaren la unió de Dlx5 al promotor d'osterix in vivo que s´incrementa en presència de MKK6 constitutivament activa. També vam observar l'acetilació de la histona H3 en presència de Dlx5 i el paper sinèrgic de l'activitat histona actetil-transferasa de la proteïna p300.Així doncs, descrivim que Dlx5 integra les vies dependents i independents de Smad en la regulació d'Osterix. A més d'aquests resultats, s'ha estudiat el paper de Msx2 i p53 en la repressió de l'expressió d'Osterix i s'ha identificat un nou gen reprimit per BMP-2 que sembla estar implicat en la regulació del patró d'expressió d'aquest gen. / Commitment of mesenchymal cells to the osteoblast phenotype is controlled by a specific set of transcription factors activated by signals and regulatory pathways. Among them, Bone Morphogenetic Protein 2 (BMP-2) signalling has been shown to be involved in bone formation.Binding of BMP-2 to its type I and type II receptors induces both Smad dependent and Smad independent signal transduction pathways. BMPs are able to induce osteogenic factors like Runx2 or Osterix, as well as bone phenotype markers such are Alkaline Phosphatase, Collagen or Osteocalcin.The main objectives for this thesis are:-Identification of the signal transduction pathways induced by BMP-2 and other molecular mechanisms involved in Osterix activation.a) Analysis of the osterix promoter region and identification of the BMP-2 responsive regions.b) Identification of the transcription factors that binds to these regions and study of its regulation by BMP-2. -To obtain stable inducible clones which allow us to study the Osterix transcriptional activity in vivo.-To study other BMP-2 modulated genes and its possible role in the osteogenesis.Our results demonstrate that induction of Dlx5 by BMP-2 mediates Osterix transcriptional activation. First, BMP-2 induction of Dlx5 precedes the induction of Osterix. Second, Dlx5 binds to the BMP-responsive sequences that we indentified in the Osterix promoter. Third, Dlx5 overexpression and knock-down assays demonstrate its role in activating Osterix expression in response to BMP-2.Furthermore, we show that Dlx5 is a novel substrate for p38-MAPK in vitro and in vivo and that phosphorylated Dlx5 increases the transactivation potential of Dlx5. Thus, BMP activates expression of Osterix through the induction of Dlx5 and its further transcriptional activation by p38-mediated phosphorylation.In addition, we studied the repressive role of Msx2 and p53 in the Osterix promoter, and indentified a possible new gene involved in the regulation of the Osterix's expression pattern.

Los microRNAs (miRNAs) son unas pequeñas moléculas de RNA (20-25nt) que no codifican para proteína, sin embargo actúan inhibiendo la traducción a proteína de RNAs mensajeros mediante la unión a su región UTR 3'. Se ha visto que estos miRNAs juegan un papel esencial en la regulación de la diferenciación celular y en el mantenimiento del estado pluripotente en las células madre. De la misma manera se los ha visto desregulados en múltiples tumores, llegando a ser considerados en algunos casos oncogenes o genes supresores de tumores.En la presente tesis se realizado un análisis de la expresión de miRNAs maduros en dos modelos tumorales diferentes: por un lado se ha analizado el patrón de expresión de miRNAs en tejido tumoral y normal de pacientes afectos de cáncer colorectal y en muestras de colon embrionario humano de embriones de 7-12 semanas de desarrollo. Por otro lado se ha analizado el patrón de expresión de miRNAs en ganglios de pacientes afectos de linfoma de Hodgkin clásico y en ganglios normales. Para ello se han analizado un total de 156 miRNAs maduros mediante stem-loop RT-PCR y PCR a tiempo real(TaqMan). La validación de los resultados se ha realizado mediante el uso de líneas celulares (DLD1 de cáncer colorectal, y L-428, HD-MY-Z y L-1236 de linfoma de Hodgkin) y mediante hibridación in situ de miRNAs con sondas de tipo LNA(Exiqon) en la plataforma automática Bond Max (Vision Biosystems).En el análisis del cáncer colorectal y la embriogénesis del colon se ha detectado una expresión solapada de miRNAs entre la mucosa colónica embrionaria y el cáncer colorectal. Se ha determinado una firma de miRNAs que caracteriza al cáncer colorectal de estadio I y II. Se ha definido también el patrón de expresión de miRNAs durante la embriogénesis del colon. Además hemos demostrado que el cluster de miRNAs miR-17-92 y su proteína diana E2F1 comparten un patrón de expresión común entre la embriogénesis del colon humano y la carcinogénesis colorectal, actuando en la regulación del proceso de proliferación celular. En este sentido, la hibridación in situ confirmó la sobreexpresión de miR-17-5p en la base de las criptas colónicas, en el compartimiento proliferativo. Por otro lado, en el estudio del patrón de expresión de miRNAs en el linfoma de Hodgkin clásico (LHc), se ha encontrado una firma de 25 miRNAs que caracterizan a este LHc. Entre estos miR-21, miR-134 y miR-138 mediante hibridación in situ se los ha detectado en el citoplasma de las células de Hodgkin/Reed Sternberg (H/RS). La validación de los 25 miRNAs en las líneas celulares ha demostrado que 20 son expresados por las líneas celulares y únicamente 5 son de expresión exclusiva del microambiente reactivo. Por otro lado se han definido 32 miRNAs que permiten discriminar entre el subtipo histológico esclerosis nodular, del subtipo celularidad mixta, de los cuales 11 mostraban diferencias que caracterizaban a las células tumorales de un tipo u otro. Además se analizó si la presencia del virus de Epstein Barr (EBV) estaba alterando el patrón de miRNAs en los pacientes de LHc EBV+ respecto a los EBV-, y se encontraron un conjunto de 10 miRNAs diferencialmente expresados entre los dos grupos de pacientes. Finalmente se vio que miR-138 estaba sobreexpresado en estadios iniciales (I-II) y se infraexpresaba en estadios avanzados (III-IV).Los miRNAs se deben considerar como moléculas claves tanto en la embriogénesis del colon, como en la transformación neoplásica del epitelio colónico, así como en el LHc, pudiendo ser utilizadas en un futuro como herramienta terapéutica. / MicroRNAs (miRNAs) are negative regulators of gene expression that play an important role in hematopoiesis and tumorigenesis and have been shown to be essential to regulate cell differentiation and maintenance of the pluripotent cell state.To date, no evidence has linked miRNA expression in embryonic and tumor tissue. We assessed the expression of mature miRNAs in human embryonic colon tissue and in colorectal cancer and paired normal colon tissue. Overlapping miRNA expression was detected between embryonic colonic mucosa and colorectal cancer. We demonstrated that miR-17-92 cluster and expression of its target E2F1 share a common pattern between human colon embryogenesis and colonic carcinogenesis, regulating the proliferation process. In this sense, in situ hybridization assay confirmed the overexpression of miR-17-5p in the crypt progenitor compartment. miRNAs pathways must be considered to be included as major players contributing to both embryonic development and neoplastic transformation of colonic epithelium. In other hand, we analyzed miRNA expression in classic Hodgkin lymphoma (cHL) and the influence of Epstein-Barr virus (EBV) infection on the miRNA expression profiles. The expression of 157 miRNAs in lymph nodes from 49 cHL patients and 10 reactive lymph nodes (RLNs) was analyzed by real-time polymerase chain reaction (PCR). Hierarchic clustering revealed 3 well-defined groups: nodular sclerosis cHL, mixed cellularity cHL, and RLNs. A distinctive signature of 25 miRNAs differentiated cHL from RLNs, and 36 miRNAs were differentially expressed in the nodular sclerosis and mixed cellularity subtypes. These results were validated in a set of 30 cHLs and 5 RLNs, and in 3 cHL cell lines. miR-96, miR-128a, and miR-128b were selectively down-regulated in cHL with EBV. Our findings suggest that miRNAs play an important role in the biology of cHL and may be useful in developing therapies targeting miRNAs.

Las células hepáticas estrelladas (CHE) representan entre 5-8% del total de las células hepáticas y un 13% del total de las células sinusoidales. Se encuentran situadas en el espacio de Disse (espacio virtual entre las células endoteliales y el parénquima). En el hígado normal, presentan un fenotipo quiescente, morfológicamente se caracterizan por la presencia de vacuolas intracitoplasmaticas que contienen vitamina A. En el hígado normal funcionalmente están implicadas en: la regulación del recambio de la matriz extracelular, secreción de una variedad de citoquinas y factores de crecimiento, control del diámetro de los sinusoides y almacenamiento de vitamina A. En situaciones de lesión celular las CHE sufren un proceso de activación y se transforman en un fenotipo tipo miofibroblasto, adquiriendo características propias de este linaje: una elevada capacidad proliferativa, sintética y contráctil. En este estado de activación las CHE están implicadas en procesos de fibrogenesis, al ser las principales productoras de matriz extracelular, en procesos inflamatorios, debido a su capacidad de secretar al medio mediadores solubles de la inflamación (ej. quimioquinas, factores de crecimiento hematopoyetico, etc.) y en procesos de contracción, las CHE son capaces de contraerse o relajarse en respuesta a diferentes sustancias vasoactivas. Nuestro objetivo fue identificar nuevas moléculas expresadas en la superficie CHE y posteriormente estudiar su posible papel funcional en procesos fisopatologicos como la inflamación, fibrogenesis y contracción. Para alcanzar tal objetivo la estrategia que seguimos fue la producción de anticuerpos monoclonales que reconociesen proteínas de la membrana expresadas principalmente en CHE.Los resultados obtenidos fueron los siguientes:1.1. Producción de anticuerpos monoclonales: Obtuvimos una panel de 13 anticuerpos monoclonales contra la CHE. El estudio lo centramos en los anticuerpos 5.520, 8.9 y 14.27, ya que por datos preliminares de citometría de flujo e inmunohistoquimica, fueron los mas específicos.1.2. Identificación de proteínas; Purificamos la proteína reconocida por el anticuerpo 14.27 y por espectrometría de masas (MALDI-TOF), pudimos identificar que proteína estaba reconociendo, se trato del CD38.1.3. Clonaje del CD38 de rata y transfección en células COS: Para acabar de confirmar que el anticuerpo 14.27 estaba reconociendo la molécula CD38. El CD38 de rata fue clonado a partir del mRNA procedente de un cultivo primario de CHEs. Posteriormente se subclono en un vector de expresión y se transfectaron células COS. Los experimentos demostraron que el anticuerpo reconocía el CD38 expresado en células COS.1.4. Caracterización bioquímica del anticuerpo anti-CD38 (14.27): A partir de lisados de cultivos primarios de CHE, el anticuerpo 14.27 inmunoprecipitó la molécula CD38. El anticuerpo también pudo detectar el CD38 mediante Western-Blott. 1.5. Estudio de la expresión del CD38: mediante un esudio inmunohistoquimico realizados con secciones de hígado procedente de ratas sanas, pre-tratadas con LPS y cirróticas, se determinó la distribución del CD38 en el hígado. Su localización fue mayoritariamente sinusoidal. Estudios "in Vitro" y "in vivo" demostraron que la expresión del CD38 en CHE aumentaba tras su activación.1.6. Estudios funcionales demostraron que el anticuerpo anti-CD38 (14.27):1.6.1. Funciona como un anticuerpo agonista al inducir la movilización de calcio en CHE.1.6.2. Induce la secreción de IL-6 tanto en CHEs activadas como en CHEs quiescentes (independiente estado de activación)1.6.3. Induce la expresión de las moléculas de adhesión I-CAM, V-CAM y N-CAM en CHE activadas pero no en CHE quiescente (dependiente estado de activación)1.6.4. Produce un aumento de la presión portal en ratas.1.6.5. Induce la contracción de CHE en cultivo, la fosforilación de la cadena ligera de la miosina y la reorganización de citoesqueleto. (datos pre-liminares).1.6.6. Media la regulación del colageno I, metaloproteinasa II (MMP-2) y del inhibidor de metaloproteinasas I (TIMP-I) (datos pre-liminares).Estos resultados indican el posible papel del CD38 en la inflamación, contracción y fibrogenesis.

El objetivo de este trabajo ha sido el estudio de dos factores genéticos implicados en la diferenciación de las neuronas GABAérgicas de proyección estriatales: Nolz1 e Ikaros. Además se ha estudiado el potencial de estos factores de transcripción en la diferenciación de células madre neurales in vitro hacia un fenotipo estriatal para entender mejor los mecanismos que regulan la aparición de este tipo de neuronas.Hemos demostrado que Nolz1 es un gen que interviene en la especificación de los precursores neurales de la SVZ de la eminencia ganglionar lateral (LGE), los llamados progenitores basales. Las células Nolz1 positivas provienen de precursores positivos para Gsh2, y su expresión contribuye a la aparición de la señalización de ácido retinoico en el núcleo estriado durante el desarrollo. Nolz1, además, regula la vía de Notch en precursores neurales i promueve la aparición de precursores oligodendrogliales mediante un mecanismo no autónomo en la LGE. Por otra parte, demostramos que la isoforma de Ikaros Ik1 es esencial para la correcta generación de las neuronas encefalinérgicas estriatales a partir de la diferenciación de precursores neurales Dlx2 positivos de la LGE. Mostramos que Ik1 es necessario para sacar de ciclo los precursores que formarán el núcleo estriado mediante el incremento de los niveles del inhibidor de ciclinas p21. En consonancia con esta observación, la falta de Ikaros durante el desarrollo, afecta la neurogénesis tardía en el estriado. Esto se traduce en que el animal deficiente de Ikaros presenta un núcleo estriado más pequeño debido a una disminución en el número de neuronas de proyección encefalinérgicas de la matriz. Así, Nolz1 e Ikaros intervienen en diferentes momentos del desarrollo estriatal, siendo el papel de Nolz1 anterior y centrado en el control de precursores neurales, y el de Ikaros algo posterior, centrado en la diferenciación de neuronas estriatales de proyección encefalinégicas / The main goal of this work has been the study of two genetic factors implied in the differentiation of the striatal GABAergic projection neurons: Nolz1 and Ikaros. Moreover, we have studied the potential of these transcription factors to direct the differentiation of neural stem cells in vitro towards a striatal phenotype, in order to understand some aspects of the generation of this kind of neurons.We have demonstrated that the action of Nolz1 is involved in the specification of the neural precursors which reside in the SVZ ol the lateral ganglionic eminencie (LGE), the so-called basal progenitors. The cells positive for Nolz1 come from Gsh2 positive neural precursors, and its expression contributes to the inititation of a source of retinoic acid signalling within the striatum during development. Nolz1, in addition, regulates the Notch pathway in neural precursors an promotes the appearance of oligodendrocyte precursors in the LGE by a non-autonomous mechanism. On the other hand, we demostrate that the Ikaros isoform Ik1 is essential for the correct generation of the striatal enkephalinergic neurons from the differentiation of Dlx2 positive neural precursors of the LGE. We show that Ik1 is necessary for the cell-cycle exit of the neural precursors which will populate the striatum by the increase of the cyclin inhibitor p21. According with this observation, Ikaros absence during development specifically affects late striatal neurogenesis.This is translated in the adult Ikaros deficient animal in a reduced striatum due to a reduced number of matrix enkephalinergic projection neurons. Thus, Nolz1 and Ikaros exhert its actions during different times in striatal development, being Nolz1 role earlier and focused in the control of neural precursors, and Ikaros role occurs later, focused in the differentiation of the enkephalinergic projection neurons.

Les cèl·lules de llevat, al igual que les cèl·lules eucariotes d'organismes superiors, responen a situacions d'estrès extracel·lular activant la via de les MAP quinases, les quals transdueixen el senyal activant l'expressió de gens necessaris per a mantenir l'homeostasi cel·lular.Evidències experimentals recents ens indiquen que la nova quinasa Srk1, identificada en el nostre grup en cèl·lules de llevat, participa tant en la resposta a estrès cel·lular com en la regulació del cicle cel·lular (López-Avilés S, Grande M, Gonzalez M, Helgesen AL, Alemany V, Sánchez-Piris M, Bachs O, Millar JB, and Aligue R (2005). Inactivation of the Cdc25 phosphatase by the stress-activated Srk1 kianse in fission yeast. Mol Cell, 17, 49-59). Pel que fa al paper de la Srk1 en el cicle cel·lular normal, hem descrit que actua inhibint la transició g2/M mitjançant la fosforilació inhibidora de la fosfatsa CDc25, promovent la seva unió a una proteïna 14-3-3 (Rad24 en S. pombe) i la seva posterior exclusió del nucli tal i com s'havia descrit per a la quinasa de checkpoint Chk1. Pel que fa al paper de la Srk1 en resposta a estrès, estudis paral·lels duts a terme pel grup de la Dra. Quinn van descriure que la Srk1 és fortament induïda en resposta a estrès i que sota aquestes condicions és fosforilada de manera depenent de la MAPK Sty1. Amb la finalitat de determinar la naturalesa d'aquesta fosforilació i la seva rellevància en la resposta a estrès vam realitzar una sèrie d'assajos de fosforilació in vitro que demostren que la Srk1 és fosforilada i activada en la T463 per la MAP quinasa Sty1. A més a més, hem observat que l'activitat i estabilitat de la Srk1 depèn de la presència de la MAP quinasa, ja que en absència de Sty1 la Srk1 no és activa i es degrada via proteasoma. Per altra banda, hem establert el paper de la Srk1 en resposta a estrès: és la responsable d'aturar el cicle cel·lular en la transició G2/M per tal d'evitar que les cèl·lules continuin dividint-se fins que s'hagin adaptat a l'estrès imposat. Aquesta funció la realitza a través de la fosforilació de la Cdc25, promovent la seva unió a Rad24 i exclusió del nucli. A més a més, hem descrit que la fosforilació de la Srk1 per la MAPK és necessària per a que les cèl·lules responguin correctatment a l'estrès.Finalment, experiments recents indiquen un nou paper de la Srk1 controlant negativament la via de les MAP quinases de resposta a estrès. Hem observat que en absència de Srk1, Sty1 es manté fosforilada durant períodes de temps molt més llargs, fet que suggereix un paper en el mecanisme de silenciament de la via un cop la font d'estrès ha desaparegut o la cèl·lula s'ha adaptat a ella. Els nostres resultats indiquen que la Srk1 fosforila la T225 de la MAPKK Wis1 afectant la seva unió amb la MAPK Sty1, de manera que s'afavoreix la defosforilació per les fosfatses Pyp1 i Pyp2 i s'evita una possible reactivació de la via que resultaria tòxica per a la cèl·lula. / Activation and regulation of the Srk1 kinase in stress response in Schizosaccharomyces pombeControl of cell cycle progression by stress-activated protein kinases (SAPKs) is essential for cell adaptation to extracellular stimuli. The Schizosaccharomyces pombe SAPK Sty1/Spc1 orchestrates general changes in gene expression in response to diverse forms of cytotoxic stress. Here we show that Sty1/Spc1 is bound to its target, the Srk1 kinase, when the signaling pathway is inactive. In response to stress, Sty1/Spc1 phosphorylates Srk1 at threonine 463 of the regulatory domain, inducing both activation of Srk1 kinase, which negatively regulates cell cycle progression by inhibiting Cdc25, and dissociation of Srk1 from the SAPK, which leads to Srk1 degradation by the proteasome.Moreover, we have found a possible role for the Srk1 kinase in the inhibition of the MAPK pathway through a negative feedback mechanism. As srk1 gene is highly induced in response to several types of stress in a Sty1-dependent manner, it seems to be necessary to downregulate the pathway. Our results suggest that Srk1 phosphorylates Wis1 at threonine 225 to impair its binding with the MAPK Sty1, in order to avoid the reactivation of the stress response pathway. Therefore, Sty1 will be dephosphorylated and inactivated by the tyrosine phosphatases Pyp1 and Pyp2. The importance of these results lays on the inactivation of a MAPK pathway by a kinase.

L'objectiu d'aquesta tesi doctoral ha estat el d'estudiar el comportament in vivo de les cèl·lules mare mesenquimàtiques derivades de teixit adipós (hAMSC), implantades en animals vius durant períodes extensos de temps, per a determinar la seva funcionalitat com a cèl·lules vehicle per a la teràpia gènica en tumors i per a la reparació de teixits.Per a dur a terme aquest objectiu es van marcar permanentment les cèl·lules hAMSC amb un vector lentivíric que contenia dos gens traçadors. Per una banda contenia el gen de la proteïna verda fluorescent (GFP) que ens va permetre la selecció de les cèl·lules marcades mitjançant la separació de cèl·lules activada per fluorescència, i per altra, el gen de la luciferasa de Photinus Pyralis (PLuc) que ens va permetre el seguiment no invasiu in vivo mitjançant la bioluminescència no invasiva (BLI). Aquestes cèl·lules, marcades i seleccionades, es van injectar en ratolins immunodeprimits on es van mantenir durant 8 mesos. Durant aquest període de temps, es va observar que aquestes cèl·lules es mantenien estables, que no formaven tumors i que no presentaven desequilibris cromosòmics greus.Posteriorment vam observar que les cèl·lules hAMSC també podien viure en tumors de pròstata (PC-3), inoculats en els músculs dels ratolins immunodeprimits, durant llargs períodes de temps i mantenir-se de manera estable. La detecció simultània de les cèl·lules tumorals i de les hAMSC va ser possible gràcies al marcatge de les cèl·lules amb diferents luciferases, la PLuc i la luciferasa de Renilla reniformis (RLuc). D'aquí es va concloure que aquestes cèl·lules eren vehicles segurs per a la teràpia cel·lular.Per portar a terme una teràpia gènica citotòxica en tumors, les cèl·lules hAMSC es van marcar amb un gen suïcida (timidina quinasa), de manera que gràcies a la mort d'aquestes cèl·lules suïcides quan s'administrava la prodroga (Ganciclovir) es produïa un efecte adjacent sobre les cèl·lules veïnes tumorals, fet que provocava la reducció dels tumors fins a un 98,5%. Amb la visualització dels dos tipus cel·lulars va ser possible determinar la dosi necessària de cèl·lules suïcides per obtenir un efecte adjacent major. A més, també es va poder quantificar la modulació del creixement que produïen les cèl·lules hAMSC en diferents tumors injectats de manera ortotòpica.Paral·lelament, el procediment de la BLI també ens va permetre determinar canvis en l'expressió d'un gen, el col·lagen 2 (COL2A1), el qual té un paper clau durant la condrogènesi: Les cèl·lules hAMSC es van transduir permanentment amb el gen de la PLuc, dirigit a partir del promotor específic del COL2A1, i es va observar una inducció de l'expressió de l'aquesta luciferasa, acompanyada també d'un canvifenotípic característic dels condròcits, quan es diferenciaven in vitro al llinatge condrogènic. Per tal de poder fer un seguiment in vivo, no invasiu, aquestes cèl·lules marcades es van transduir també amb la luciferasa RLuc, expressada constitutivament, per tal que fos l'indicador de la proliferació d'aquestes cèl·lules. Les cèl·lules hAMSC doblement marcades i sembrades en matrius d'os desmineralitzat (DBM) implantades subcutàniament en ratolins immunodeprimits van demostrar diferents patrons de diferenciació condrogència d'acord amb els resultats de les anàlisis histològiques. Aquest model, doncs facilitaria el desenvolupament de combinacions entre cèl·lules progenitores i esquelets per a la reparació de teixits. / The aim of this thesis was to study the behaviour of the human mesenchymal stromal cells derived from adipose tissue (hAMSCs) implanted in animals during prolonged time to determine their functionality as vehicles for genetic therapy in tumours and for tissue regeneration.For this purpose the hAMSCs were labelled by a permanent transduction with lentiviral vectors for the expression of two reporter gens. The green fluorescent protein (GFP) gene which proved to be useful for the enrichment of labelled cells, histological analysis and recovery of cells from tissue implants and the Photinus pyralis luciferase (PLuc) gene which allowed us the long term monitoring with the non-invasive bioluminescence imaging (BLI).The labelled and selected hAMSCs were injected in immunosupressed mice and maintained during 8 months. During this period, cells maintained a steady state and no detectable chromosomal abnormalities nor tumours formed during the 8 months of residence in the host's tissues.We also observed that hAMSCs could live long periods when implanted within PC-3 tumours, inoculated in the thighs of immunosupressed mice. The use of two luminescent reporters, allowed the simultaneous and independently monitoring in real time of two different cells populations implanted in the same anatomical site of the animal. Thus, from these observations we conclude that the hAMSCs could be safe vehicles for cell therapy.In order to perform a citotoxic gene therapy in PC-3 tumours, hAMSCs were labelled with a suicide gene (thymidine kinase). The addition of the prodrug (Gangiclovir) produced the death of these cells and killing of the neighbouring tumour cells (Bystander effect). This bystander effect produced a reduction of the tumours treated with suicide cells of 98.5% comparing with the control ones. The use of BLI and the dual labelling allowed us to optimize the ratio of the suicide vehicles to tumour cells to obtain a major bystander effect. Furthermore it was possible to quantify the tumour growth modulation produced by the injection of hAMSCs within different types of tumour cells.BLI procedures allowed us to analyze changes in gene expression and monitor cell differentiation in a live animal model of cartilage and bone formation.

El trasplantament d'illots pancreàtics és una teràpia emergent per la curació de la diabetis mellitus. Una de les limitacions radica en la baixa disponibilitat d'òrgans i l'elevada demanda existent, que queda agreujada amb l'elevat nombre d'illots que són necessaris per restablir la normoglucèmia del pacient. Estudis recents del nostre grup, han mostrat que en els primers dies després del trasplantament hi ha un augment de l'expressió d'IL-1beta en els empelts d'illots.La hipòtesi de treball és que la citocina proinflamatòria, IL-1, està implicada en la fallada del trasplantament. Designant la sobreexpressió d'IL-1Ra com l'estratègia a seguir per millorar el pronòstic del trasplantament singènic d'illots pancreàtics. Per tant, l'objectiu general de l'estudi va ser determinar si la sobreexpressió d'IL-1Ra en els illots pancreàtics protegeix les cèl·lules beta pancreàtiques dels efectes deleteris d'IL-1 en els illots i millora el pronòstic del trasplantament.L'estudi dels efectes d'IL-1beta i de la sobreexpressió d'IL-1Ra in vitro es va realitzar amb un cultiu primari d'illots de rata que van ser exposats durant 48h a 5.5 o 22.2 mM de glucosa en presència o absència de 50U/ml d'IL-1beta. I la inserció del gen exogen a les cèl·lules dels illots es va fer utilitzant un adenovirus V recombinant.La proliferació de les cèl·lules beta (determinada per incorporació de BrdU) va disminuir dràsticament quan es van exposar els illots a 50 U/ml d'IL-1beta, tant a 5.5 mM com a 22.2 mM de glucosa. Aquest efecte d'IL-1beta va quedar completament abolit per la sobreexpressió d'IL-1Ra en els illots que havien estat infectats amb l'adenovirus que codificava per l'antagonista, a les dues concentracions de glucosa utilitzades.L'apoptosi de les cèl·lules beta (determinada per immunohistoquímica mitjançant la tècnica del TUNEL i per citometria de flux, marcant les cèl·lules amb anexina V i iodur de propidi) estava significativament augmentada en els illots exposats a IL-1beta, però no en els illots que sobreexpressaven IL-1Ra.L'estudi dels efectes de la sobreexpressió d'IL-1Ra en els illots trasplantats es va realitzar utilitzant un model de trasplantament singènic. Grups de 500 illots control (no infectats) o que sobreexpressaven IL-1Ra van ser trasplantats sota la càpsula renal de rates Lewis diabètiques. 500 illots són una massa beta clarament insuficient per restablir la normoglucèmia, així doncs els animals d'ambdós grups es van mantenir hiperglucèmics durant tot l'estudi. Els empelts es van recuperar després de 3, 10 i 28 dies del trasplantament i es van processar per fer estudis histològics.La sobreexpressió d'IL-1Ra en els illots trasplantats va fer augmentar significativament la proliferació de les cèl·lules beta dels empelts de 3, 10 i 28 dies i va protegir parcialment les cèl·lules beta de l'increment d'apoptosi detectat després del trasplantament, tant a curt com a llarg termini. L'àrea individual de les cèl·lules beta estava augmentada de manera similar tant en els empelts d'illots control com en els illots que sobreexpressaven IL-1Ra als 10 i 28 dies d'evolució. Finalment, la sobreexpressió d'IL-1Ra resultà en una recuperació de la massa beta inicialment trasplantada.Per tal d'estudiar si els efectes beneficiosos de la sobreexpressió d'IL-1Ra aconseguien reduir el nombre d'illots necessaris per restablir la normoglucèmia, es va trasplantar una massa beta marginal (800 illots) d'illots control i Ad-IL-1Ra a animals diabètics. El 100% dels animals trasplantats amb illots Ad-IL-1Ra eren normoglucèmics després de 14 dies del trasplantament i només un 40% dels animals trasplantats amb illots control assoliren l'euglucèmia en aquest dia.En aquest treball es mostra que la citocina proinflamatòria IL-1beta indueix clarament apoptosi a les cèl·lules beta dels illots de rata en cultiu i inhibeix dràsticament la replicació d'aquestes cèl·lules. La sobreexpressió d'IL-1Ra protegeix les cèl·lules beta dels efectes deleteris d'aquesta citocina i amplifica la resposta replicativa de les cèl·lules beta exposades a concentracions altes de glucosa. La sobreexpressió d'IL-1Ra en els illots augmenta la replicació de les cèl·lules beta trasplantades, les protegeix de l'apoptosi induïda després del trasplantament, i preserva la massa beta inicialment trasplantada. Els efectes beneficiosos de la sobreexpressió d'IL-1Ra observats en els illots trasplantats permeten reduir el nombre d'illots necessaris per restablir la normoglucèmia dels animals diabètics.Aquests resultats suggereixen que la IL-1 juga un paper important en l'evolució dels empelts d'illots, ja que el seu bloqueig implica una millora dels illots trasplantats. / BACKGROUND AND AIMS: IL-1beta could contribute to the dramatic beta cell loss that takes place after islet transplantation. It is known that exposure to sustained hyperglycemia has a deleterious effect on transplanted islets. Moreover, it has been recently reported that IL-1beta expression is increased in islets exposed to high glucose levels. IL-1Ra is a naturally occurring inhibitor of IL-1 action and its overexpression protects pancreatic islets from the deleterious effects of IL-1â on beta cell replication, apoptosis and function. The aim of this study was to determine whether viral gene transfer of the IL-1Ra gene into rat islets ex vivo could have a beneficial effect on beta cell replication and mass of transplanted islets.METHODS:Lewis rat islets were infected for 2h with 6.25 × 106 pfu of Ad-IL-1Ra and streptozotocin-diabetic Lewis rats were transplanted with 500 Ad-IL-1Ra infected islets (Ad-IL-1Ra group) or 500 uninfected islets (control group) under the kidney capsule. Grafts were removed 3 (n = 12), 10 (n = 12) and 28 (n = 12) days after transplantation and beta cell replication, apoptosis and mass were determined.RESULTS:500 islets is an insufficient mass to restore normoglycemia and therefore, all animals but one (IL-1Ra group) remained hyperglycemic until the end of the study. Beta cell replication (determined by BrdU incorporation) was significantly increased in Ad-IL-1Ra group on days 3 (0.78 ± 0.23%), 10 (1.15 ± 0.16%) and 28 (1.22 ± 0.2%) after islet transplantation compared to beta cell replication in normal pancreas (0.24 ± 0.04%; p< 0.05). In contrast, in control group, beta cell replication was not increased on day 3 after transplantation (0.41 ± 0.11%), and although it increased on day 10 (0.89 ± 0.18%; p< 0.01) it was reduced again on day 28 (0.59 ± 0.10%) in agreement with previous reports of limited beta cell replication with persistent hyperglycemia. Beta cell apoptosis (determined by TUNEL method) was significantly increased in transplanted islets from both groups compared to pancreas. Although Ad-IL-1Ra group showed lower beta cell apoptotic levels than control group, differences did not reach statistical significance. The initially transplanted â-cell mass (1.34 ± 0.03 mg) was similarly reduced in both control (0.32 ± 0.06 mg) and Ad-IL-1Ra groups (0.45 ± 0.10 mg) (p<0.001) on day 3 after transplantation. In Ad-IL-1Ra islet grafts, beta cell mass increased after 10 (1.04 ± 0.091 mg; p< 0.010) and 28 (0.8 ± 0.24 mg) days of transplantation. In contrast, beta cell mass of control group was also increased on day 10 after transplantation (0.69 ± 0.12 mg), but it dropped again on day 28 (0.41 ± 0.05 mg) paralleling with the evolution of beta cell replication in this group. CONCLUSIONS:Islets overexpressing IL-1Ra showed an increased beta cell replication and a preserved beta cell mass after transplantation, that was maintained even after longterm exposure to hyperglycemia.

Les cèl·lules estan exposades a diferents estímuls mecànics al llarg de la seva vida. Actualment s'accepta que les forces mecàniques juguen un paper important en funcions crítiques cel·lulars com ara la proliferació, diferenciació, mobilitat cel·lular, apoptosi, síntesi de proteïnes i DNA i expressió gènica, entre d'altres. Les cèl·lules pulmonars estan exposades a forces mecàniques derivades de la respiració, flux sanguini i tensió superficial. En concret, les cèl·lules epitelials que envolten les vies aèries estan exposades a forces de tensió i compressió durant el cicle respiratori. Per altra banda, forces anormals exercides sobre teixits pulmonars contribueixen a moltes situacions patològiques. Així, per exemple, la deformació mecànica indueix la proliferació de cèl·lules epitelials alveolars, jugant un paper important en el manteniment de la integritat de l'epiteli especialment durant processos de reparació després de dany pulmonar. Durant l'aplicació de diferents estratègies de ventilació mecànica, tractament bàsic en els pacient amb dany pulmonar agut (ALI) i la seva forma més severa, el síndrome d'afecció respiratòria aguda (ARDS), s'ha observat un augment en la producció de mediadors inflamatoris com la trombina i el trencament de la barrera alveolocapil·lar que contribueix en el dany pulmonar induït pel ventilador i en la formació d'edema pulmonar. Un altre exemple de forces mecàniques exercides sobre el teixit respiratori, i en concret en la via aèria superior, és l'induït pel ronc, el qual té lloc quan el teixit de la via aèria superior es relaxa i comença a vibrar. Aquesta situació és experimentada típicament per pacients que pateixen apnea/hipoapnea o la síndrome de resistència en la via aèria superior. Actualment hi ha evidències fisiològiques i histològiques, i estudis moleculars que exhibeixen inflamació en pacients amb trastorns respiratoris de la son.En aquesta tesi s'ha estudiat el paper de diferents estímuls mecànics en dues condicions patològiques. En un cas s'ha estudiat com la vibració pot induir una resposta inflamatòria en cèl·lules epitelials bronquials a través de la sobreexpressió de la citoquina IL-8. Més concretament, s'ha dissenyat un novedós model experimental que ens permet tastejar si l'aplicació d'un estímul mecànic vibratori amb una freqüència i amplitud similars a les sofertes pels teixits de la via aèria superior quan es ronca és capaç d'induir una desposta inflamatòria a nivell cel·lular. L'estudi s'ha focalitzat en avaluar si la vibració dispara una resposta inflamatòria caracteritzada per la sobreexpressió d'interluquina 8 (IL-8) a través de les vies de senyalització de la proteïna kinasa activada per mitògen (MAPK), tal com suggereix quan les cèl·lules estan subjectes a una deformació del substrat. L'altre estudi s'ha centrat en estudiar com un estímul mecànic de deformació o estirament juntament amb un mediador inflamatori, en aquest cas la trombina, poden alterar les propietats mecàniques de les cèl·lules epitelials i contribuir al trencament de la barrera alveolocapil·lar agreujant la formació d'edema pulmonar

EN CATALÀ DE LA TESI DOCTORAL"Importància de l'adhesió al substrat en la mecànica cel·lular: Implicacions en neutròfils i cèl·lules endotelials microvasculars".En organismes multicel·lulars complexos com els humans, el comportament de cèl·lules individuals ve dictat en gran mesura per les interaccions amb la matriu extracel·lular (ECM). La ECM és una xarxa de proteïnes filamentoses (com ara col·lagen, fibronectina o laminina) que proporciona un substrat físic per l'adhesió cel·lular. L'adhesió a la ECM està mitjançada bàsicament per les integrines, que són un tipus de proteïnes responsable de la transmissió a l'interior de la cèl·lula tant de senyals bioquímiques com de forces. El grau d'adhesió entre cèl·lules i el seu substrat, i la forma cel·lular que en resulta, han estat reconeguts com un factor determinant en l'expressió gènica i proteica i en funcions cel·lulars com la diferenciació o la proliferació. Remarcablement, s'ha determinat que aquesta regulació de la funció cel·lular depèn de la forma cel·lular independentment del grau d'enllaç entre integrines i ECM, suggerint que algun factor apart de la senyalització bioquímica és el responsable de llegir la informació associada amb l'adhesió cèl·lulasubstrat i de provocar una certa resposta en la funció cel·lular.Un factor que podria ser responsable de detectar l'adhesió cèl·lula-substrat és la mecànica cel·lular. Certament, s'ha vist que un increment en l'extensió cel·lular (àrea que ocupa una cèl·lula sobre un substrat) està associat amb un increment de la polimerització d'actina, de la fosforil·lació de la cadena lleugera de la miosina (MLC), de la duresa cel·lular i de la contractilitat. Les cèl·lules podrien doncs respondre a canvis en la forma cel·lular incrementant la tensió mecànica del citoesquelet i activant vies de mecanotransducció, probablement involucrant la familia de GTPases Rho. Tanmateix, aquesta hipòtesi no ha estat directament verificada, i altres paràmetres (com ara la forma del nucli) podrien estar involucrats. Addicionalment, encara no existeix un estudi global que analitzi com l'adhesió al substrat (i la forma cel·lular resultant) afecta la mecànica de les cèl·lules, i quines implicacions té això en la funció cel·lular.L'objectiu d'aquesta tesi ha estat l'estudi del paper de l'adhesió al substrat en la mecànica cel·lular per dos tipus cel·lulars relacionats amb el sistema respiratori, que constitueix l'àrea d'interès del nostre grup de recerca. El primer d'aquests tipus cel·lulars ha estat els neutròfils, un tipus de cèl·lules generalment no adherents però que s'activen i s'endureixen en contacte amb cèl·lules endotelials o amb un substrat com el vidre. La mecànica de neutròfils en els seus estats passiu i activat juga un paper clau a l'hora de determinar la funció dels neutròfils en resposta a estímuls inflamatoris. Tanmateix, actualment no està clar si la mecànica de neutròfils es correspon a la d'una gota líquida o si exhibeix esmorteïment estructural. Els canvis induïts per l'activació en la mecànica de neutròfils tampoc estan clars. Per clarificar aquestes qüestions, es va mesurar la reologia de neutròfils en funció de l'adhesió al substrat, posant èmfasi en les seves implicacions en la funció d'aquestes cèl·lules en els capil·lars de la microvasculatura dels pulmons. El segon tipus cel·lular estudiat va ser el de les cèl·lules endotelials, també provinents de capil·lars de la microvasculatura dels pulmons. En aquest cas, el treball es va orientar a entendre com la forma cel·lular (controlada a través de la tecnologia coneguda com a microestructuració o "micropatterning") afecta la mecànica i la proliferació cel·lular. La comprensió de com la forma cel·lular controla la proliferació es crucial per entendre el procés de l'aniogènesi o formació de nous vasos sanguinis, el qual es dóna essencialment durant la formació embrionària i en processos patològics com la formació de tumors. Aquest estudi ens va permetre avaluar el paper de la mecànica cel·lular en la proliferació de cèl·lules endotelials i determinar la seva importància relativa. En ambdós estudis, la mecànica cel·lular va ser avaluada mitjançant la mesura del mòdul complex elàstic G* amb microscopia de forces atòmiques (AFM) seguint un procediment ja descrit. G* proporciona informació tant sobre l'elasticitat cel·lular (duresa) com sobre la viscositat, i pot ser mesurat amb AFM per un ampli rang de freqüències. Això permet una caracterització precisa de la reologia cel·lular i una avaluació de la tensió interna del citoesquelet a través de la mesura de duresa.

A) INTRODUCCIÓ:Membres de la superfamilía de TGF-&#946; regulen una varietat de processos biològics, com inhibició del creixement, diferenciació, formació del patró embriònic i inducció d'apoptosi. Aquest lligants secretats s'uneixen i activen uns receptors serin/threonin quinasa tipus I i II. Aquests receptors activats fosforilen i activen unes proteïnes SMADs intracel·lulars, les quals transloquen a nucli regulant l'exprressió de gens diana. A més, al TGF-beta se li ha atribuit un paper com a factor proangiogènic "in vivo". "In vitro", s'ha observat que TGF-beta inhibeix la proliferació de les cèl·lules endotelials en cultius de dues dimensions, però que indueix la formació de capilars quan les cèl·lules endotelials es cultiven en tres dimensions dins de gels de col·làgen.A partir de cèl·lules endotelials cultivades en tres dimensions es va generar una col·lecció de cDNAs, en absència (condicions basals) o en presència de TGF durant un tractament de 4 hores. Posteriorment, aquests gens es van seqüenciar i analitzar per Northern Blot en cèl·lules endotelials en condicions basals i tractades amb TGF-&#946;. Mitjançant aquesta tècnica es va aconseguir aïllar gens induïts o reprimits per TGF-&#946;. Entre aquests gens induïts es va trobar la F-box28.Una de les vies de degradació de proteïnes més comú és la via de la ubiquitina/proteasoma. Aquesta via està formada per tres enzims: l'E1, que és l'encarregat d'activar les molècules d'ubiquitina; l'E2, que és l'enzim conjugador de les molècules d'ubiquitina;, i les E3 ubiquitines lligases, la funció principal de les quals és la de reconèixer el substrat específic que serà ubiquitinat, i degradat posteriorment pel complexe del proteasoma. Dins de la família d'E3 ubiquitines lligases trobem el complex tipus SCF. Aquest complex proteic està format per quatre subunitats molt ben conservades: Cul1, Rbx1, Skp1 y una proteïna F-box. Rbx1 y Cul1 formen un centro catalític que participa en el reclutament d'E2. La proteïna F-box és qui reconeix específicament el substrat diana i l'uneix. Finalment, Skp1, és una proteïna adaptadora, la funció de la qual és la de unir la F-box a Cul1.En aquest treball, ens hem plantejat l'estudi d'una nova E3 ubiquitina lligasa, la F-box28, que es va identificar en un primer moment com un gen estimulat per TGF-&#946;1 en cèl·lules endotelials 1G11. Aquest treball planteja la caracterizació d'aquesta proteïna, així com la identificació de la seva funció en relació a l'acció de TGF-&#946;.B) OBJECTIUS1) Estudi de l'expressió d'F-box28 i la seva localització cel·lular.2) Estudi de la F-box28 com a E3 ubiquitina lligasa, de la seva regulació i de la seva vida mitja.3) Estudi de les possibles funcions d'F-box28 i la seva implicació en la regulació del cicle cel·lular.4) Estudi dels possibles substrats candidats de la F-box28.C) RESULTATS1) La proteïna identificada per PCR-substractiva com a F-box28 és una nova proteïna que pertany al complex E3 ubiquitina lligasa tipus SCF, ja que hem vist que interacciona con les proteïnes Cul1 y Skp1.2) La F-box28 presenta una expressió baixa en estat basal i la seva expressió és induïda pel factor TGF-&#946;1, a nivell d'mRNA i de proteïna, en cèl·lules endotelials 1G11 i en cèl·lules HeLa.3) La F-box28 és una proteïna de localització nuclear gràcies a una seqüència NLS en el seu extrem C-terminal.4) La F-box28 és una proteïna inestable de 4-5 hores de vida mitja que és regulada a través del proteasoma. 5) La sobreexpressió d'F-box28 en cèl·lules HeLa causa una parada parcial en la fase G1 del cicle cel·lular. Aquest efecte requereix la seva localització nuclear i podria ser mediat per la seva interacció amb la ciclina A i la disminució dels nivells d'aquesta. / THESIS SUMMARY:"F-BOX28 CHARACTERIZATION: A NEW E3 UBIQUITIN LIGASE IMPLICATED IN THE CELL CYCLE REGULATION"A) INTRODUCTIONProteins are targeted for degradation by the ubiquitin/proteasome pathway by covalent modification that requires the coordinated reactions of three enzymes: the ubiquitin ligase which is referred to as an E3, and operates in conjunction with an E1 ubiquitin-activating enzyme and an E2 ubiquitin-conjugating enzyme. There is one major E1 enzyme, shared by all ubiquitin ligases, which uses ATP to activate ubiquitin for conjugation and transfers it to an E2 enzyme. The E2 enzyme interacts with a specific E3 partner and transfers the ubiquitin to the target protein. The E3, which may be a multi-protein complex, is, in general, responsible for targeting ubiquitination to specific substrate proteins.There are different ubiquitin ligase complexes involved in recognition and ubiquitination of specific target proteins. One of these is the SCF complex. SCF contains three core subunits, and a number of less critical components: the F-box, which recognizes specifically the target protein; Skp1 that is a bridging protein and is essential in the recognition and binding of the F-box; Cul1 that forms the major structural scaffold of the SCF complex; and Rbx1 which participate in the transferral of the ubiquitin to the target protein. The SCF complex has important roles in the ubiquitination of proteins involved in the cell cycle as well as having a role in the marking various other cellular proteins for destruction.In the present work we have studied a new E3 ubiquitin ligase, F-box28, which was identified as an stimulated gene by TGF-&#946;1 in 1G11 endothelial cells. In this study we determine the characterization of F-box28 and their possible role regarding to TGF-&#946;1.B) OBJECTIVES1) Expression study of F-box28 and their cellular localization.2) Study of F-box28 as an E3 ubiquitin ligase, their regulation and stability.3) Functional study of F-box28 and its role regarding regulation of cell cycle.4) Study of the F-box28 substrates.C) RESULTS1) F-box28 is a new protein that belongs to the ubiquitin ligase complex SCF.2) F-box28 mRNA and protein responds to TGF-&#946;1 stimulation in 1G11 endothelial and HeLa cells.3) F-box28 is a nuclear protein with a NLS sequence in their C-terminal end. 4) F-box protein has an average life of 4-5 hours and it is regulated through the proteasome complex.5) The F-box28 overexpression in HeLa cells induce a partial G1 cell cycle arrest. This effect requires their nuclear localization and it could be mediated through their interaction with cyclin A and the decrease levels of this cyclin.