Células-tronco mesenquimais (CTMs) estão entre os tipos de células-tronco encontradas a partir da fase fetal até a vida adulta de um indivíduo. As CTMs caracterizam-se pela morfologia similar à de fibroblastos associada à presença das proteínas de superfície celular CD73, CD90 e CD105, não apresentando expressão de marcadores hematopoiéticos, tais como CD34 e CD45. As CTMs são consideradas multipotentes e capazes de diferenciarem-se em osteoblastos, adipócitos e condroblastos. Além de humanos, as CTMs já foram isoladas de uma série de organismos modelo, dentre eles o camundongo e o frango doméstico (Gallus gallus). Apesar de pouco difundido nesse campo de estudo, o modelo G. gallus apresenta uma série de características que o torna uma alternativa interessante ao modelo murino. Nesse contexto, o objetivo deste trabalho foi isolar e caracterizar molecularmente as CTMs deincubação. Como resultado, obtiveram-se células com as características esperadas para uma CTM clássica. As CTMs isoladas apresentaram morfologia característica, expressão das proteínas de superfície CD73, CD90 e CD105 e ausência de marcadores hematopoiéticos. Além disso, as células mostraram-se capazes de diferenciarem-se em osteoblastos e pré-adipócitos. No entanto, as células isoladas de coração, apesar de apresentarem características de CTMs, foram incapazes de diferenciarem-se em adipócitos. A análise do perfil transcricional destas células, em comparação às obtidas de medula óssea, revelou que as mesmas superexpressam genes relacionados a morfogênese cardíaca, a angiogênese, a diferenciação de células de músculo cardíaco e a coagulação sanguínea. Considerando as características apresentadas pelas células isoladas de músculo cardíaco, existe a possibilidade de ter havido o isolamento de um tipo específico de célula-tronco cardíaca denominada de células derivadas de epicárdio (EDPCs – do inglês Epicardium derived cells). Desta forma, os resultados obtidos neste trabalho indicam que é possível isolar CTMs de medula óssea e músculo esquelético de fetos de frango. No entanto, as células obtidas de músculo cardíaco reúnem características de potenciais EPDCs e mais estudos são necessários para determinar a sua identidade. / Mesenchymal stem cells (MSC) are found in both fetal and adult individuals. MSC are characterized by their fibroblast-like morfology, the expression of the surface proteins like CD73, CD90 and CD105 and absence of hepatopoietic markers, such as CD34 e CD45. Besides, MSC are considered multipotent stem cells due to their capacity to differentiate into osteoblasts, adipocytes and chondroblasts. MSC have been already isolated from human being and several model organisms, as mice and chicken (Gallus gallus). Unfortunately, G. gallus is not widely applied for the study of MSC, but it can be an interesting alternative to the murine model. In this context, the aim of this work was to isolate and molecularly characterize MSC derived from bone marrow, cardiac and skeletal muscle of 18-19 days chicken fetuses. Cells isolated from bone marrow and skeletal muscle presented the expected characteristics for MSC. They expressed CD73, CD90 and CD105, but were negative for hematopoietic markers. Moreover, the cells were able to differentiate into osteoblastic and adipogenic lineages. Cells obtained from cardiac muscle presented the same molecular and morphological characteristics, except that they were not able to differentiate into adipocytes. Transcriptional profile analysis of cardiacderived cells revealed that they overexpress genes related to heart morphogenesis, angiogenesis processess, smooth muscle cells differentiation and blood coagulation. There is a possibility that cells isolated from cardiac muscle are of an specific type named epicardium derived cells (EPDCs). The results obtained in this work point that is possible to isolate MSC from bone marrow and skeletal muscle from chicken fetuses. Nevertheless, cells obtained from cardiac muscle gather characteristics of putative EPDCs and further studies are necessary to elucidate the real identity of cardicac muscle isolated cells.

Resumo não disponível

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2014. / Submitted by Ana Cristina Barbosa da Silva (annabds@hotmail.com) on 2014-11-24T17:46:13Z No. of bitstreams: 2 Luísa Helena Andrade da Silva.pdf: 7628021 bytes, checksum: a31f41f5e2db596b15e7495155ba2f09 (MD5) Luísa Helena Andrade da Silva.pdf: 7628021 bytes, checksum: a31f41f5e2db596b15e7495155ba2f09 (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva(patricia@bce.unb.br) on 2014-11-25T10:54:18Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Luísa Helena Andrade da Silva.pdf: 7628021 bytes, checksum: a31f41f5e2db596b15e7495155ba2f09 (MD5) Luísa Helena Andrade da Silva.pdf: 7628021 bytes, checksum: a31f41f5e2db596b15e7495155ba2f09 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-11-25T10:54:18Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Luísa Helena Andrade da Silva.pdf: 7628021 bytes, checksum: a31f41f5e2db596b15e7495155ba2f09 (MD5) Luísa Helena Andrade da Silva.pdf: 7628021 bytes, checksum: a31f41f5e2db596b15e7495155ba2f09 (MD5) / Introdução: A marcação e o rastreamento de células-tronco in vivo são técnicas não invasivas que permitem visualizar o deslocamento das células dentro do organismo e o quanto efetivamente elas migram para locais patologicamente afetados, a fim de aperfeiçoar terapias celulares. Alguns materiais comumente usados como marcadores de células-tronco são nanopartículas metálicas; entretanto, sabe-se que estes componentes podem ser prejudiciais para as células receptoras, tornando-se importante a realização de estudos preliminares de biocompatibilidade antes de marcar e rastreá-las in vivo. Objetivo: Verificar se nanopartículas de óxido de ferro e de ouro, ambas funcionalizadas com ácido 2,3-dimercaptosuccínico (DMSA), podem atuar como traçadores para células-tronco mesenquimais de polpa dental (pdCTMs), sem afetar sua fisiologia e, ao mesmo tempo, permitindo a visualização e rastreamento destas por microtomografia computadorizada em um modelo murino de fibrose pulmonar. Métodos: a) A toxicidade de ambas as nanopartículas sobre as pdCTMs foi avaliada através de ensaios de viabilidade celular com MTT e Azul de Tripan; das análises morfológicas das células marcadas em microscopia de luz; e da análise em microscopia eletrônica de transmissão (MET). b) A visualização e mensuração da interiorização das nanopartículas Fe-DMSA foi realizada por meio da técnica de coloração "Azul da Prússia" e pela dosagem colorimétrica deste corante, respectivamente. A visualização e quantificação do uptake das nanopartículas Au-DMSA foi realizada por análise em microscopia confocal e por espectrometria de emissão óptica com plasma acoplado indutivamente (ICP-OES), respectivamente. c) Verificou-se se houve alterações de parâmetros fisiológicos como: diferenciação osteogênica e adipogênica; taxas de proliferação; e supressão linfocitária nas pdCTMs marcadas com as nanopartículas. d) Empregou-se o modelo murino de fibrose pulmonar, induzida por bleomicina, para dar suporte teórico sobre a migração das pdCTMs marcadas quando inoculadas por duas vias de administração: intravenosa e intranasal. e) Testou-se o uso da Fe-DMSA e da Au-DMSA como traçadores de pdCTMs, verificando a eficiência de detecção destas, em microtomografia computadorizada. Após a inoculação de 5x10? células marcadas em camundongos, estes foram analisados diariamente no equipamento. Resultados: Não houve redução estatisticamente significativa da viabilidade das pdCTMs e não foram detectados, em microscopia de luz, sinais característicos de morte celular na presença do Fe-DMSA e Au-DMSA, em todas as concentrações testadas. Fotos obtidas por MET comprovaram a presença destas nanopartículas no citoplasma celular: observou-se as Au-DMSA e as Fe-DMSA associadas a algumas organelas, principalmente mitocôndrias, provocando alterações ultraestruturais nestas. Assim, estas imagens sugerem toxicidade mitocondrial e formação de corpos apoptóticos, principalmente nas pdCTMs expostas ao Fe-DMSA. Os testes de mensuração de interiorização indicaram uma quantidade média de 17 picogramas (pg) de Fe-DMSA em cada célula e4pg de Au-DMSA/célula. Também não houve alterações significativas das taxas de adipogênese e osteogênese; das curvas de crescimento e da inibição de proliferação linfocitária entre pdCTMs marcadas e nãomarcadas. Apesar da biocompatibilidade entre as nanopartículas e as células, tanto o Au- DMSA quanto o Fe-DMSA não puderam ser detectados no microtomógrafo, após serem incorporados pelas pdCTMs. Conclusões: Embora assegurado, em termos de biocompatibilidade, o uso de Fe-DMSA e Au-DMSA como marcadores de pdCTMs, estas nanopartículas metálicas mostraram não ser adequadas para visualização e rastreamento in vivo das células por microtomografia, tendo em vista que não foram detectadas pelo equipamento, nas concentrações testadas. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Introduction: Labeling and Tracking stem cells in vivo are noninvasive techniques that allow visualizing the movement of cells within the body and how effectively they migrate to pathologically affected sites, in order to improve cellular therapies. Some materials commonly used as stem cells markers are metallic nanoparticles; however, it is known that these components can be prejudicial to receptor cells, hence it is important to perform preliminary biocompatibility studies before label and track them in vivo. Objective: Assess if iron oxide and gold nanoparticles, both functionalized with 2,3-dimercaptosuccinic (DMSA) acid, can act as tracers for mesenchymal stem cells from dental pulp (dpMSCs), without affecting their physiology and, at the same time, allowing the visualization and tracking of these in a computed microtomography apparatus, based on an experimental model of pulmonary fibrosis. Methodology: a) The toxicity of both nanoparticles on dpMSCs was assessed by MTT and Trypan Blue viability assays; by morphological analysis of labeled cells under light microscopy; and by analysis in transmission electron microscopy (TEM). b) The visualization and measurement of nanoparticles Fe-DMSA uptake were performed by "Prussian Blue" staining technique and by colorimetric dosage of this dye, respectively. Visualization and uptake quantification of Au-DMSA nanoparticles were performed by confocal microscopy and analysis by optical emission spectrometry with inductively coupled plasma (ICP-OES), respectively. c) Changes in physiological parameters, such as osteogenic and adipogenic differentiation; proliferation rates; and lymphocyte suppression, were checked in labeled dpMSCs. d) A murine model of pulmonary fibrosis, induced by bleomycin, was employed to give theoretical support about the labeled dpMSCs’ migration when inoculated by two routes of administration: intravenous and intranasal. e) After inoculation of 5x10 ⁵ labeled cells in mice, these were analyzed daily in the microtomograph in order to detect uptaken Fe-DMSA and Au-DMSA, checking their efficiency as tracers of dpMSCs. Results: There was no statistically significant reduction in the dpMSCs viability and characteristic signs of cell death were not detected by light microscopy analysis, after Fe-DMSA and Au-DMSA uptake, at all concentrations tested. Photos obtained by TEM confirmed the presence of these nanoparticles in the cytoplasm: Fe-DMSA and Au-DMSA were observed associated to some organelles, especially mitochondria, causing structural changes there. Hence mitochondrial toxicity and formation of apoptotic bodies was observed, especially in dpMSCs exposed to Fe DMSA. The uptake measurement tests indicated an average amount of 17 picograms (pg) of Fe-DMSA per cell and 4 pg of Au-DMSA per cell. There were also no significant changes in adipogenesis and osteogenesis; growth curves and inhibition of lymphocyte proliferation between labeled and unlabeled dpMSCs. Although the biocompatibility between both nanoparticles and cells was proved, Fe-DMSA as well as Au-DMSA could not be detected in microtomograph after being incorporated by dpMSCs. Conclusions: In terms of biocompatibility, the use of Fe-DMSA and Au-DMSA as tracers for dpMSCs was assured. However, these metal nanoparticles shown to be not suitable for visualization and tracking of these cells in vivo by computed microtomography, considering that they were not detected by the equipment, at the concentrations tested.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2012. / Submitted by Elna Araújo (elna@bce.unb.br) on 2012-07-13T21:03:09Z No. of bitstreams: 1 2012_RobertoFrancoTeixeiraCorrea.pdf: 2720649 bytes, checksum: b945bd8be445442134dfe63f5b6e8f6b (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2012-07-16T12:25:31Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_RobertoFrancoTeixeiraCorrea.pdf: 2720649 bytes, checksum: b945bd8be445442134dfe63f5b6e8f6b (MD5) / Made available in DSpace on 2012-07-16T12:25:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_RobertoFrancoTeixeiraCorrea.pdf: 2720649 bytes, checksum: b945bd8be445442134dfe63f5b6e8f6b (MD5) / Bacillus thuringiensis é uma bactéria Gram-positiva que produz proteínas formadoras de cristal ou δ-endotoxinas que compreendem as toxinas Cry, com atividade inseticida específica, e Cyt, com atividade citolítica inespecífica. Diferentes δ-endotoxinas mostram-se específicas para diferentes insetos-alvos. Esta especificidade deve-se a receptores de membrana distintos nas células do intestino dos insetos e à presença de diferentes proteases próprias dos insetos, necessárias para ativação proteolítica da prótoxina produzida na fase de esporulação do B. thuringiensis. Os genes cry4Aa, cry11A e cyt2Ba foram amplificados por PCR a partir das estirpes de Bacillus thuringiensis subsp. israelensis, S-1989 ou S-1806. Os produtos das PCR foram clonados em um vetor de expressão em B. thuringiensis, pSVP27A. O gene cyt2Ba foi também clonado em vetores de transferência para construção de baculovírus recombinantes para expressão da proteína Cyt2Ba nativa ou fusionada à proteína Poliedrina. Estirpes de B. thuringiensis acristalíferas foram usadas para expressão individual das proteínas. Após purificação e solubilização das proteínas heterólogas, as memsmas foram ativadas com tripsina ou suco gástrico de Spodoptera frugiperda, para a realização de ensaios de atividade em culturas de células de Lepidoptera, Diptera e mamífero. Foram usados, nos ensaios de citotoxicidade, 20 μg/mL de cada toxina Cry individual ou em combinações e 20 μg/mL ou 5 μg/mL da toxina Cyt2Ba. Atividades tóxicas das toxinas heterólogas ativadas por tripsina foram detectadas para todas as linhagens de células de insetos testadas, fato que não ocorreu após ativação das mesmas toxinas com suco gástrico de S. frugiperda. Para células humanas, apenas Cyt2Ba mostrou-se tóxica. Entretanto, a combinação entre Cyt2Ba e as toxinas Cry4Aa e Cry11A apresentou citotóxicidade maior que Cyt2Ba isoladamente, o que pode sugerir que Cyt2Ba funcione como receptor para Cry4Aa e Cry11A em células humanas. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Bacillus thuringiensis is a Gram-positive bacterium that produces crystal forming proteins, δ-endotoxins, which consist of Cry toxins harboring specific insecticidal activity, and Cyt toxins that contain non-specific cytolytic activity. Different δ-endotoxins are specific to different target insects. This specificity is due to distinct membrane receptors on the surface of the insect´s midgut cells and to the presence of different host´s proteases, which are necessary to proteolytic activation of the protoxin expressed during B. thuringiensis sporulation phase. The cry4Aa, Cry11A and cyt2Ba genes were amplified from Bacillus thuringiensis subsp. israelensis Brazilian strains, S-1989 or S-1806 by PCR. The PCR products were cloned into the B. thuringiensis expression vector, pSVP27A. The cyt2Ba gene was also cloned into transfer vectors to allow construction of recombinant baculoviruses, in order to express the native Cyt2Ba protein, or Cyt2Ba fusioned to the Polyhedrin protein. Acrystaliferous B. thuringiensis strains were used for the expression of the proteins individually. After purification and solubilization of the heterologous proteins, toxin activation by either trypsin or Spodoptera frugiperda´s gastric juice was carried out to perform citotoxicity assays using Lepidopteran, Dipteran and human cultured cells. Each Cry toxin was used at the concentration of 20 μg/mL, while Cyt2Ba was used at two different concentrations: 20 μg/mL or 5 μg/mL. Cytotoxic activities of the trypsin activated heterologous proteins were detected to all insect cell lines tested, but when the same proteins were digested by S. frugiperda´s gastric juice, no toxic activities were detected. Only Cyt2Ba was shown to be toxic to the human cells tested. Nevertheless, the combination of Cyt2Ba and both Cry4Aa and Cry11A toxins yelded a higher toxicity than that produced by Cyt2Ba isolatedly, which could suggest that Cyt2Ba could be functioning as a receptor for Cry4Aa and Cry11A on the surface of human cells.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2012-09-20T14:42:51Z No. of bitstreams: 1 2012_ThiagoMachadoMellodeSousa.pdf: 9146808 bytes, checksum: 6df4980d0f83f0be7d1a74e005ab3541 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2012-09-28T12:56:46Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_ThiagoMachadoMellodeSousa.pdf: 9146808 bytes, checksum: 6df4980d0f83f0be7d1a74e005ab3541 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-09-28T12:56:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_ThiagoMachadoMellodeSousa.pdf: 9146808 bytes, checksum: 6df4980d0f83f0be7d1a74e005ab3541 (MD5) / O pH ambiental é um sinal importante para fisiologia de fungos, intervindo na regulação da transcrição de vários genes. Em fungos filamentosos e leveduras, PacC é um importante fator transcricional que regula a expressão de genes tanto em pH ácido como alcalino. A produção de enzimas envolvidas na bioconversão de biomassa vegetal é regulada principalmente no nível da transcrição. No entanto, o envolvimento da via de regulação por pH na expressão de enzimas lignocelulolíticos não tem sido extensivamente estudado. Nosso grupo havia demonstrado anteriormente que o deuteromiceto termofílico Humicola grisea var. thermoidea é um potente produtor de celulases, apresentando um considerável potencial biotecnológico para bioconversão de resíduos agrícolas. Nossos resultados sustentam a existência de uma via de regulação por pH para as glicosil hidrolases em H. grisea. Neste trabalho, foram realizadas análises quantitativas por RT-PCR em tempo real para vários transcritos de H. grisea. O perfil transcricional de oito genes codificadores de enzimas lignocelulolíticas (cbh1.1, cbh1.2, egl1, egl2, egl3, egl4, bgl4 e xyn1) e de dois fatores de transcrição (pacC e creA) foi avaliado na presença de glicose ou de bagaço de cana-de-açúcar em condições de pH ácido e alcalino. A análise por qRT-PCR revelou uma indução forte e precoce de quase todos os genes de enzimas lignocelulolíticas, de uma maneira sinérgica quando o fungo foi cultivado com a fonte de carbono complexa e em condições alcalinas (pH 8,0). A única exceção foi egl4, que foi induzido por pH ácido. Um padrão oposto para a expressão dos dois fatores transcricionais foi observado. Enquanto pacC foi induzido em condições alcalinas e fortemente reprimido na presença de glicose, creA foi induzido por glicose e reprimido em condições alcalinas. Os dados de perfil de transcrição, combinados com a análise da ligação in vitro de PacC e CreA aos promotores dos genes analisados, apóiam a repressão por carbono, mediada por CreA, e a via de regulação por pH, mediada por PacC em H. grisea. Além disso, ensaios de mobilidade eletroforética (EMSAs) com o promotor de pacC mostraram que, in vitro, PacC e CreA competem pelo mesmo sítio de ligação. Tomados em conjunto, estes dados corroboram as hipóteses de que PacC possa ser o mediador da regulação influenciada pelo pH e de que a repressão por glicose, possivelmente atribuída a CreA, é capaz de sobrepujar a ação indutória do pH alcalino. Temos ainda evidências de que CreA também esteja envolvido na repressão de PacC, estabelecendo uma interação entre os dois sistemas regulatórios. O foco do segundo capítulo desse trabalho foi a produção e caracterização de Xyr1 (regulador de xilanases 1), que é o principal fator transcricional que atua na regulação da expressão dos genes codificadores de xilanases em Trichoderma reesei. Os resultados apresentados mostraram a bem sucedida produção heteróloga da versão completa da proteína Xyr1, algo até então inédito entre reguladores de xilanases em fungos filamentosos. Nossas análises empregando técnicas de interação DNA-proteína e géis nativos indicaram que Xyr1 pode naturalmente formar homodímeros em solução. Contudo, a dimerização não é fundamental para a interação com o DNA, o que implica em uma dinâmica complexa de ligação ao promotor do gene xyn1. São possíveis as formas de monômero, dímero e interação com ambos os motivos do sítio palindrômico. A capacidade de dimerização do fator fortalece a proposição de modulação adicional da atividade de Xyr1 por meio de possíveis interações proteína-proteína com outros fatores transcricionais, sendo candidatas as proteínas Ace1 e Ace2. O papel de modificações pós-traducionais tem sido apontado como crucial na regulação mediada por Xyr1. Mostramos que a fosforilação possivelmente está envolvida na regulação da atividade de Xyr1, sendo necessária para a interação DNA-proteína in vitro, mas sem afetar a formação de dímeros. Apresentamos ainda indícios de modulação alostérica de Xyr1 que depende tanto da interação com o DNA quanto, possivelmente, com carboidratos, o que torna mais complexo este modelo de regulação. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Environmental pH is an important signal in fungal physiology, acting at transcriptional regulation of several genes. In filamentous fungi and yeasts, the PacC zinc-finger transcription factor regulates gene expression in response to changes of external pH. The production of enzymes involved in plant cell wall breakdown is regulated mainly at the transcriptional level. Nonetheless, the involvement of the pH-related regulatory pathway in the lignocellulolytic enzymes expression has not been extensively studied. We have demonstrated that the thermophilic deuteromycete Humicola grisea var. thermoidea is a potent cellulases producer, presenting a considerable potential for agricultural wastes bioconversion processes. Previous results of our group support the existence of a pH regulatory pathway in H. grisea var. thermoidea. In this work, we have performed a time course transcription analysis of several H. grisea genes by quantitative real time RT-PCR. Eight enzyme genes (cbh1.1, cbh1.2, egl1, egl2, egl3, egl4, bgl4 and xyn1), and two transcription factors genes (pacC and creA) were analyzed in the presence of simple (glucose) or complex (sugarcane bagasse) carbon source, in acid and alkaline medium conditions. The qRT-PCR analyses revealed an early and strong induction of almost all glycoside hydrolase genes transcription, in a synergistic way, when the mycelia were grown in the presence of the complex carbon source, under alkaline conditions (pH 8.0). The only exception was egl4, which was acid-induced. An opposite pattern was observed for the expression of the two transcription factors. While pacC was induced in alkaline conditions and strongly repressed in presence of glucose, creA was induced by glucose and repressed in alkaline conditions. The transcriptional profile data combined with the analysis of the in vitro binding of PacC and CreA transcription factors to the promoters support the CreA-mediated carbon repression and the PacC-related pH regulation of H. grisea cellulase and xylanase encoding genes. Moreover, electrophoretic mobility shift assays (EMSAs) employing the upstream regulatory sequences of pacC showed that an in vitro interaction occurs between the proteins PacC and CreA on the pacC upstream regulatory sequence, with both factors competing for the same binding site. Taken together, this data corroborate our previous evidences, supporting the existence of a pH transcriptional regulatory pathway in H. grisea, mediated by PacC. Moreover, PacC is probably transcriptionally auto-regulated and may be subject to the carbon repression mechanism mediated by CreA. The second chapter of this work describes the production and characterization of Xyr1 (xylanase regulator 1), which is the main transcription factor that acts regulating the expression of xylanase encoding genes in Trichoderma reesei. The results showed the successful heterologous production of the full version of Xyr1, something never previously described for xylanases regulators in filamentous fungi. Our analyses employing techniques of DNA-protein xviii interactions and native gels indicated that Xyr1 can form homodimers in solution. Nevertheless, dimerization is not essential for the interaction with DNA, suggesting a complex binding dynamics to the xyn1 promoter region (as monomer, dimer and interacting with both palindromic binding sites). The dimerization capacity of Xyr1f strengthens the proposition of an additional modulation for this factor activity, probably by protein-protein interactions with other transcription factors, such as Ace1 and Ace2. A crucial role for post-translational modifications was proposed for gene regulation mediated by Xyr1. We initially showed that phosphorylation has a possible role in the regulation of Xyr1 activity, being necessary for the DNA-protein interactions in vitro, but not affecting the dimer formation. Additionally, we present evidence suggesting an allosteric modulation of Xyr1, dependent on interactions, both with DNA and carbohydrates, which adds an additional degree of complexity to this regulatory model.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Bioética, 2012. / Submitted by Marília Freitas (marilia@bce.unb.br) on 2013-01-29T15:13:03Z No. of bitstreams: 1 2012_NatanMonsoresdeSa.pdf: 2634629 bytes, checksum: 64416fa9ad41de97cdc914bad9d7a25a (MD5) / Approved for entry into archive by Marília Freitas(marilia@bce.unb.br) on 2013-01-31T13:29:38Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_NatanMonsoresdeSa.pdf: 2634629 bytes, checksum: 64416fa9ad41de97cdc914bad9d7a25a (MD5) / Made available in DSpace on 2013-01-31T13:29:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_NatanMonsoresdeSa.pdf: 2634629 bytes, checksum: 64416fa9ad41de97cdc914bad9d7a25a (MD5) / O objetivo desta tese é a investigação da circulação de conteúdos morais acoplados ao discurso biotecnocientífico, em particular, aqueles discursos sobre a utilização de células-tronco em pesquisas e terapias veiculados pela mídia televisiva. A partir da compreensão que a reflexão bioética é a análise das dimensões éticas dos discursos em/sobre biotecnociência, buscou-se avaliar o papel e as práticas argumentativas de diferentes interlocutores sociais, quando se manifestam publicamente sobre questões da biomedicina regenerativa. O pano de fundo conceitual para análise se baseia nas noções de discurso e de sua circulação por Foucault e Maingueneau, assim como na análise do papel da mídia por Bourdieu. O desenho metodológico do trabalho é documental e se deu em dois momentos centrais: análise de conteúdo, segundo Bardin; e análise de discurso, segundo a tradição francesa. Escolheu-se 317 matérias televisivas entre 1998 e 2010 dos quatro principais telejornais da Rede Globo de Televisão. Os programas selecionados tiveram seus roteiros transcritos e submetidos às análises. A análise de conteúdo demonstrou que há a utilização preferencial de termos que reforçam conflitos religiosos ou políticos, assim como pares de oposição (morte/vida; saúde/doença) que podem ser indícios de organização ideológica dos discursos midiáticos em prol da utilização de célula-tronco. A mítica de resultados, também frequente, pode induzir a sociedade a uma aceitabilidade maior das pesquisas sem uma avaliação imparcial de todas as consequências. Numa segunda etapa, realizou-se análise de discurso de uma subamostra do corpus, onde demonstrou-se que a abertura da estrutura comunicacional à diversidade moral não parece ser plena, já que parece haver um compromisso valorativo com o desenvolvimento das pesquisas com células-tronco (discurso biotecnofílico). A investigação evidenciou que a principal estratégia discursiva dos enunciadores do campo da biotecnociência no corpus foi a antecipação dos lucros pelo discurso de um saber já fechado e cheio de certezas, conduzindo a um fenômeno de alienação do risco. O modelo hipercrítico de bioética que foi adotado aponta para a necessidade de desenvolver-se atitude crítica em relação aos discursos morais circulantes, como caminho possível para desconstruir qualquer forma de biopolítica negativa, garantindo a autonomia em decidir de forma livre e esclarecida, que não pode ser sobrepujada por qualquer forma de lucro no mercado simbólico das moralidades. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The aim of this thesis is investigate the circulation of moral contents attached to biotechnoscientific discourse, in particular, the television mediated discourses on use of stem cells in research and therapies. From understanding that bioethical reflection is an analysis of discourses ethical dimensions in/on biotechnoscience, we evaluated the role and argumentative practices of different social actors, when they speech about regenerative biomedicine. The background to conceptual analysis is based on Foucault´s and Maingeneau´s notions of discourse, as well as Bourdieu´s notion of media role. The methodological design of study is documental and has two key moments: content analysis (Bardin), and discourse analysis (French tradition). We chose 317 TV reports between 1998 and 2010 from the four major newscasts of Globo TV. The selected programs have had their scripts transcribed and submitted to analysis. The content analysis showed that there is preferential use of terms that reinforce religious or political conflicts, as well as opposing pairs (life / death, health / disease) that may be evidence of ideological organization of media discourse in favor of stem cells. The mythology of results, also common, may lead society to a greater acceptance of research without an impartial assessment of all consequences. In a second step, a discourse analysis was performed for a subsample of corpus, where was showed that the opening of communicational structure to moral diversity is limited, was a preferential commitment to development of research on stem cells field (biotecnophilic discourse). We found that main discursive strategy of speakers from the field of biotechnology was an anticipation of profits, by discourse of a well established knowledge, leading to a risk transfer phenomenon. The hypercritical model of bioethics that was adopted led us to a need: to develop a critical attitude towards the circulation of moral discourses as a possible path to deconstruct any forms of negative biopolitics, ensuring the autonomy to decide in a free and enlightened way, which cannot be overcome by any form of profit in morals symbolic market.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2012. / Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2013-02-21T14:50:31Z No. of bitstreams: 1 2012_AlexandreGoesMartini.pdf: 1227912 bytes, checksum: a552481b12c0726dc8184f1dc14f0019 (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2013-02-21T15:18:15Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_AlexandreGoesMartini.pdf: 1227912 bytes, checksum: a552481b12c0726dc8184f1dc14f0019 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-02-21T15:18:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_AlexandreGoesMartini.pdf: 1227912 bytes, checksum: a552481b12c0726dc8184f1dc14f0019 (MD5) / As Células Mesangiais – CM participam do controle da filtração glomerular, da depuração de substâncias e produção da matriz extracelular. A proliferação das CMs e aumento de matriz estão associados à fisiopatogenia das glomerulopatias. Sabe-se que o Fator de Necrose Tumoral – TNF-α induz proliferação mesangial e que as Tiazolidinedionas – TZDs, agonistas dos Receptores Proliferadores Peroxisomais Ativados gama – PPARγ, utilizados no tratamento da diabetes mellitus, melhoram a resistência à insulina e são eficazes na prevenção da progressão de doença renal em diferentes modelos experimentais. Esta proteção parece ser secundária ao efeito anti-inflamatório das TZDs. Infelizmente, estes ligantes também apresentam efeitos colaterais indesejáveis, tais como ganho de peso, edema e cardiotoxicidade. Recentemente, foi desenvolvido um novo agonista parcial de PPARγ, o GQ-16 que apresenta atividade anti-diabética semelhante a outras TZDs, mas sem induzir ganho de peso ou edema. Desta forma, o presente estudo tem como objetivo investigar se o GQ-16 diminui a proliferação mesangial induzida por TNF-α. Nossos resultados mostram que o GQ-16 reduz significativamente a proliferação celular induzida pelo TNF-α, em um padrão de curva dose resposta, semelhante à rosiglitazona e pioglitazona, além de reduzir a atividade transcricional do promotor do TNF-α, também em um padrão de curva dose resposta. Foi avaliado o efeito anti-fibrótico, pela expressão de mRNA de TGF-β e, embora nossos resultados não tenham apresentado significância estatística, foram similares à rosiglitazona. Concluímos que o GQ-16 é um modulador seletivo de PPARγ e apresenta um efeito antiproliferativo, antiinflamatório e, possivelmente, antifibrótico semelhante à rosiglitazona. ____________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Mesangial cells – MC participate in the control of glomerular filtration, clearance of substances and extracellular matrix production. The proliferation of MCs and increased extracellular matrix are associated with the pathogenesis of glomerulopathies. It is known that the tumor necrosis factor – TNF-α induces mesangial proliferation and thiazolidinediones – TZDs, agonists of peroxisomal proliferator activated receptor gamma – PPARγ used in the treatment of diabetes mellitus, improve insulin resistance and are effective in preventing the progression of renal disease in different experimental models. This protection seems to be secondary to the anti-inflammatory effect of thiazolidinediones. Unfortunately, these ligands also have undesirable side effects such as weight gain, edema and cardiotoxicity. Recently, it was developed a new PPARγ partial agonist, the GQ-16, which has similar anti-diabetic activity to other thiazolidinediones, but without inducing weight gain or edema. Thus, this study aims to investigate whether the GQ-16 decreases mesangial proliferation induced by TNF-α. Our results show that the GQ-16 significantly reduces cell proliferation induced by TNF-α in a standard dose response curve, similar to rosiglitazone and pioglitazone, in addition to reducing the transcriptional activity of the promoter of TNF-α, also in a standard dose response curve. We evaluated the anti-fibrotic effect through the mRNA expression of TGF-β and although our results do not have statistical significance, were similar to rosiglitazone. We conclude that GQ-16 is a selective modulator of PPARγ and presents an antiproliferative, antiinflammatory and possibly antifibrotic effect similar to rosiglitazone.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2006. / Submitted by Kathryn Cardim Araujo (kathryn.cardim@gmail.com) on 2009-10-06T18:17:33Z No. of bitstreams: 1 2008_ClaudiaNaterciaLimaAcacio.pdf: 4227660 bytes, checksum: b0625c204a8bf3bfe5e6a673711b582a (MD5) / Approved for entry into archive by Gomes Neide(nagomes2005@gmail.com) on 2010-10-20T14:08:21Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008_ClaudiaNaterciaLimaAcacio.pdf: 4227660 bytes, checksum: b0625c204a8bf3bfe5e6a673711b582a (MD5) / Made available in DSpace on 2010-10-20T14:08:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008_ClaudiaNaterciaLimaAcacio.pdf: 4227660 bytes, checksum: b0625c204a8bf3bfe5e6a673711b582a (MD5) Previous issue date: 2008 / Avanços nas técnicas de cultura de células têm possibilitado o isolamento e precisa caracterização de baculovírus mutantes. A maioria desses mutantes é derivada do vírus AcMNPV (Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus), principalmente pela sua facilidade de propagação e estabilidade em cultura de células. Durante a rotina de purificação de um baculovírus recombinante, dois vírus mutantes derivados de AcMNPV, o vSynlitx1B12P (MutPolh) e o vSynlitx1G4 (MutApo) foram isolados (dados não publicados). A infecção pelo MutPolh não resultava na produção de poliedros e diferia da infecção tipo selvagem pela presença de massas protéicas dispersas no citoplasma. Para explicar esse fenótipo, o vírus MutPolh foi previamente investigado e análises moleculares revelaram uma mutação pontual no gene da poliedrina. Esse gene é altamente conservado entre os baculovírus e mudanças em sua seqüência nucleotídica podem levar à formação de poliedros mutantes, morfologicamente distintos do tipo-selvagem. O outro vírus mutante, o MutApo, mostrou induzir rápida e massiva morte nas células por ele infectadas. Esse mutante também foi investigado através de técnicas moleculares e foi encontrada uma inserção de DNA interrompendo um gene inibidor de apoptose (p35). Neste trabalho analisaram-se os efeitos citopatológicos desses dois mutantes em células de inseto das linhagens Sf-21 e Tn-5B. Estudos estruturais e ultraestruturais confirmaram os resultados das análises moleculares prévias feitas para esses mutantes. As observações ultra-estruturais feitas em células infectadas pelo MutPolh submetidas a imunomarcação mostraram que os agregados protéicos encontrados no citoplasma dessas células eram, de fato, acúmulo de poliedrina não cristalizada. Ainda, o mutante MutApo mostrou induzir eventos característicos da apoptose nas células dessas linhagens. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Advances in cell culture techniques allowed the isolation and precise characterization of baculoviruses mutants. The majority of these mutants is derived from the virus AcMNPV, mainly due to its facility of propagation and stability in cell culture. During the purification routine of a recombinant baculovirus, two mutants derived from AcMNPV, vSynlitx1B12P (MutPolh) and vSynlitx1G4 (MutApo) were isolated (unpublished). The insect cell by the MutPolh did not result in polyhedra production and differed from wild-type infection by the presence of proteinaceous masses dispersed in the cytoplasm. To explain this phenotype, the virus MutPolh was previously investigated and molecular analysis revealed a point mutation in the polyhedrin gene. This gene is highly conserved among baculoviruses and changes in its nucleotide sequence may lead to mutant polyhedra, morphologically different from the wild-type. The other mutant virus, MutApo, was show to induce quick and massive cell death in infected cells. This mutant was also investigated and was found a DNA insertion interrupting an inhibitor of apoptosis gene (p35). In this work, the cytopathologic effects induced by these two mutants in Sf-21 and Tn-5B insect cell lines were analyzed. Structural and ultrastructural studies confirmed the findings of the molecular analysis previously done for these mutants. The observation of MutPolh-infected cells revealed that the proteinaceous aggregates found in the cytoplasm were, actually, accumulation of uncrystalized polyhedrin. Observations of cells infected by the MutApo mutant also confirmed previous information, showing that this mutant induces characteristic apoptosis events in these insect cell lines.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, 2007. / Submitted by Natália Cristina Ramos dos Santos (nataliaguilera3@hotmail.com) on 2009-10-15T11:39:02Z No. of bitstreams: 1 Dissert_NatanMonsoresSa_parcial.pdf: 380585 bytes, checksum: 6fa4e76352040f88239a508b0e6d01dc (MD5) / Approved for entry into archive by Marília Freitas(marilia@bce.unb.br) on 2010-02-09T22:22:08Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissert_NatanMonsoresSa_parcial.pdf: 380585 bytes, checksum: 6fa4e76352040f88239a508b0e6d01dc (MD5) / Made available in DSpace on 2010-02-09T22:22:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissert_NatanMonsoresSa_parcial.pdf: 380585 bytes, checksum: 6fa4e76352040f88239a508b0e6d01dc (MD5) Previous issue date: 2007 / O propósito deste estudo é a discussão dos elementos que compõem o atual debate sobre a biomedicina regenerativa, apontando os avanços e fragilidades na pesquisa com células-tronco no mundo e, particularmente, no contexto brasileiro, a fim de delimitar as variáveis bioéticas implicadas neste campo das ciências biomédicas. Para tal, fez-se uma recursão ao estado de arte técnico da pesquisa, bem como ao panorama ético-epistemiológico em que se situa, de modo a facilitar a compreensão das nuances do debate no Brasil. A metodologia de escolha para realização deste trabalho baseia-se na análise, avaliação e integração de informações disponíveis sobre o tema, na tentativa de explicar o atual contexto brasileiro (metodologia analítica). A análise do material obtido permite situar os questionamentos sobre células-tronco em três esferas: os desafios biológicos, os problemas técnicos e as questões bioéticas. Destaca-se que a incipiência da pesquisa no Brasil torna necessária a discussão pública sobre as conseqüências das aplicações da biomedicina regenerativa, isto é, a urgência em se estabelecer com clareza protocolos de pesquisas em terapias celulares. Partindo de pressupostos da complexidade Bioética, isto é, considerando que o pensamento bioético complexo seja capaz de considerar a pletora de influências recebidas, conclui-se também a necessidade de discutir os aspectos bioéticos desta nova área através de uma abordagem baseada nos princípios de cautela e responsabilidade, a fim de salvaguardar os direitos dos sujeitos vulneráveis envolvidos nas pesquisas. ______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The purpose of this study is to discuss the elements of the current debate on the regenerative biomedicine, highlighting progress and fragilities in stem cells research around the world, particularly in Brazilian context, in order to define bioethical and biomedical variables. For this purpose, has been a recursion to the state of art of research, as well as the ethical and epistemological issues, to improve the Brazilian’s debate. The methodology of choice was based on analysis, evaluation and integration of available data, in an attempt to explain the current Brazilian context (analytical methodology). The analysis of the material allows locating the questions about stem cells in three spheres: the biological challenges, the technical problems and bioethical issues. The incipience of this research in Brazil become necessary public discussion about the consequences regenerative biomedicine use, ie, the urgency to establish clear protocols to cellular therapies. Whereas the bioethical complexity, that considering the complex bioethical thought is able to think the plethora of influences, is concluded that is necessary to discuss the bioethical aspects of this new area through an approach based on the principles of caution and responsibility, in order to safeguard the rights of vulnerable subjects involved in the research.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2006. / Submitted by Natália Cristina Ramos dos Santos (nataliaguilera3@hotmail.com) on 2009-10-31T15:56:28Z No. of bitstreams: 1 2006_Daniele Scandiucci de Freitas.pdf: 1694002 bytes, checksum: 03cb9b1c64473673bc10bc56a5f75888 (MD5) / Approved for entry into archive by Gomes Neide(nagomes2005@gmail.com) on 2010-10-27T14:45:56Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2006_Daniele Scandiucci de Freitas.pdf: 1694002 bytes, checksum: 03cb9b1c64473673bc10bc56a5f75888 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-10-27T14:45:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2006_Daniele Scandiucci de Freitas.pdf: 1694002 bytes, checksum: 03cb9b1c64473673bc10bc56a5f75888 (MD5) Previous issue date: 2006 / As plantas normalmente são hospedeiras de mais de um patógeno. O maracujazeiro, por exemplo, é infectado por diversos vírus, bactérias e fungos, que limitam consideravelmente a sua produção. Devido a isso, o uso dos sistemas de controle de doenças que confiram amplo espectro de resistência é cada vez mais necessário. Trabalhos recentes demonstraram que plantas de fumo ou tomate expressando genes anti-apoptóticos são resistentes a estresses abióticos e a vários patógenos necrotróficos, isto é, patógenos que matam a célula da planta hospedeira como parte do seu processo de infecção. Neste trabalho, os genes p35 e iap-3 de baculovirus foram separadamente introduzidos no genoma de plantas de maracujá usando biobalística. Os genes estrangeiros estavam sob o comando transcricional dos promotores 35S ou UBQ3. As plantas transgênicas foram regeneradas e selecionadas pela presença do transgene usando a técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR) e/ou Southern blot. Somente plantas p35+ foram selecionadas pela análise por PCR e/ou Sothern-blot. Onze plantas regeneradas mostraram a presença do gene p35. Análises transcricionais de plantas regeneradas mostraram a presença de transcritos específicos para o gene p35 em 9 delas. As plantas regeneradas, contendo o gene p35, foram inoculadas com o vírus Cowpea aphid-borne mosaic virus (CABMV), a bactéria Xanthomonas axonopodis pv passiflorae, e o herbicida glufosinato (Syngenta). Nenhuma das plantas mostrou resistência ao CABMV. Plantas regeneradas (p35+) continham menos da metade do número de lesões detectadas nas plantas não-transgênicas, quando inoculadas com X. axonopodis pv. passiflorae e algumas plantas p35+ mostraram tolerância aumentada ao herbicida glufosinato, quando comparadas às plantas não-trangênicas. Além disso, no presente trabalho, é demonstrado que um promotor de baculovírus (promotor IE-1) é ativo em células vegetais e que, promotores usados em biotecnologia de plantas (UBQ e 35S) são também, ativos em células de inseto quando analisados em ensaios transientes de expressão onde o gene repórter luciferase (rluc) de Renilla reniformis estava sob o comando transcricional de cada promotor. _____________________________________________________________________________ ABSTRACT / Plants are usually hosts for more than one pathogen. The passion flower, for example, can be infected by a many virus, bactéria and fungi, which limit fruit yield considerably. Due to this, the use of diseases control systems that allow a wide range of disease resistance is needed. Recent work have shown that tobacco or tomato plants containing anti-apoptotic genes were more resistant to abiotic stresses and several necrotrophic pathogens, which are pathogens that kill the plant host cell as part of their infection process. In this work, the p35 and iap-3 genes from baculoviruses were separetely introduced into the genome of passion fruit plants by biobalistics. The foreign genes were under the transcriptional control of the 35S or UBQ3 promoters. The transgenic plants were regenerated and screened for the presence of the transgene by PCR and/or Southern blot. Only p35+ plants were confirmed by PCR and/or Sothern-blot analysis. Eleven regenerated plants showed the presence of the p35 gene. Transcriptional analysis of regenerated plants showed the presence of specific p35 transcripts in 9 of them. Regenerated plants containing the p35 gene were inoculated with the cowpea aphid-borne mosaic virus (CABMV), the bacterium Xanthomonas axonopodis pv passiflorae, and the herbicide, glufosinate, (Syngenta). None of the plants showed resistance to CABMV. Regenerated plants (p35+) showed less than half of local lesions showed by non-transgenic plants when inoculated with X. axonopodis and some p35+ plants showed increased tolerance to the glufosinate herbicide when compared to non-transgenic plants. Furthermore, we have shown that a baculovirus promoter (IE-1 promoter) is active in plant cells and promoters used in plant biotechnology (UBQ and 35S) are also active in insect cells by transient expression assays using the luciferase gene (rluc) from Renilla reniformis under the transcriptional control of each promoter.