Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2006. / Submitted by Priscilla Brito Oliveira (priscilla.b.oliveira@gmail.com) on 2009-11-19T11:34:30Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao Sergio Martin Aguiar.pdf: 2193468 bytes, checksum: 73f83e8b2ee3cc21959b2170c65029ec (MD5) / Approved for entry into archive by Carolina Campos(carolinacamposmaia@gmail.com) on 2010-02-04T16:25:02Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertacao Sergio Martin Aguiar.pdf: 2193468 bytes, checksum: 73f83e8b2ee3cc21959b2170c65029ec (MD5) / Made available in DSpace on 2010-02-04T16:25:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Sergio Martin Aguiar.pdf: 2193468 bytes, checksum: 73f83e8b2ee3cc21959b2170c65029ec (MD5) Previous issue date: 2006 / O pH ambiental desempenha um papel importante na fisiologia de inúmeros microrganismos, determinando níveis de transcrição de genes cujos produtos funcionam na fronteira celular ou em seu exterior. Na adaptação de Aspergillus nidulans a diferentes valores de pH o fator transcricional PacC tem um papel importante, sendo ativado por uma via de treansdução de sinal em respsta a pH neutro/básico. Homólogos ao gene pacC foram isolados em diversos outros fungos. Em fungos como a Candida albicans e Fusarium oxysporum, foi demonstrado que PacC está envolvido em mecanismos de patogenicidade. Paracoccidioides brasiliensis é um fungo dimórfico, endêmico na América Latina, podendo provocar severa micose sistêmica em humanos. No presente trabalho foi isolado e seqüenciado um gene de P. brasiliensis ortólogo ao pacC de A. nidulans. A seqüência obtida foi avaliada, in silico, quanto a sua organização estrutural. O gene apresenta 2837 nucleotídeos e quatro íntrons. A proteína predita é composta de 676 resíduos de aminoácidos, possuindo massa molecular de aproximadamente 72,4 kDa. Foi demonstrado que a proteína predita a partir do gene em estudo possui regiões conservadas presentes na maioria das seqüências orólogas já descritas na literatura científica, apresentando maior identidade com a proteína de Trichophyton rubrum (50,2%). O perfil de expressão do gene pacC após crescimento de P. brasiliensis em meios de cultura com pH ácido, neutro e básico, revelou a presença do transcrito nas três condições de cultivo., por meio de experimento de RT-PCR. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Environmental pH is important for several microorganisms physiology, intervening at the transcriptional level of gene products which act at the cellular surface or outside the cell. In the ascomycete Aspergillus nidulans, cellular adaptation to different pH values is provided by the PacC transcriptional factor, which is activated by a signal transduction pathway triggered by neutral or basic pH. Homologues to the pacC gene were isolated from different fungi. In Candida albicans and Fusarium oxysporum, the PacC factor is related to pathogenicity mechanisms. Paracoccidioides brasiliensis is a dimorphic fungus, endemic in Latin America, and cause a severe systemic mycosis in humans. In this work, a P. brasiliensis gene, homologous to A. nidulans pacC, was isolated and sequenced. DNA sequence was evaluated, in silico, concerning its structural organization. P. brasiliensis pacC gene presents 2937 nucleotides and four introns. The predicted protein is composed of 676 amino acid residues, with a molecular mass of 72.4 kDa. The putative PacC protein presents motifs conserved in the majority of the published homologous sequences. The highest identity is with Trichophyton rubrum PacC (50.2%). Expression analyses of P. brasiliensis pacC gene, after fungal growth in acidic, neutral and alkaline pH, demonstrated that it is transcribed in all the conditions assayed.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2006. / Submitted by wesley oliveira leite (leite.wesley@yahoo.com.br) on 2009-11-21T17:57:59Z No. of bitstreams: 1 Dissert Tatiana Karla dos Santos Borges.pdf: 2968588 bytes, checksum: d1737b7181d22a3495a13593d5cfbbba (MD5) / Approved for entry into archive by Joanita Pereira(joanita) on 2010-01-14T18:45:56Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissert Tatiana Karla dos Santos Borges.pdf: 2968588 bytes, checksum: d1737b7181d22a3495a13593d5cfbbba (MD5) / Made available in DSpace on 2010-01-14T18:45:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissert Tatiana Karla dos Santos Borges.pdf: 2968588 bytes, checksum: d1737b7181d22a3495a13593d5cfbbba (MD5) Previous issue date: 2006 / A malária é um dos problemas mais importantes de saúde pública mundial, devido sua grande morbi-mortalidade e sua ampla distribuição geográfica. As manifestações clínico-patológicas observadas na malária decorrem da hiperativação do sistema imunitário com produção aumentada de citocinas, particularmente do FNT, que participa da ativação do sistema imunitário e da defesa antiplasmódio, mas por outro lado, está envolvido nos mecanismos imunopatogênicos. A pentoxifilina é um inibidor da via de sinalização e transcrição do NF-B que promove a transcrição de vários componentes da resposta imune, inclusive do FNT, podendo modular algumas funções do sistema imunitário. Este trabalho avaliou a influência da pentoxifilina sobre a evolução da malária e sobre as funções dos macrófagos em camundongos susceptíveis ou não à malária cerebral. Foram estudados camundongos Balb/C e CBA infectados com 106 eritrócitos parasitados por Plasmodium berghei ANKA, tratados a partir do terceiro dia de infecção com 8 mg/kg/dia de pentoxifilina ou com NaCl 0,9%. Outros dois grupos não infectados foram tratados com 8 mg/kg/dia de pentoxifilina ou com NaCl 0,9%. No oitavo dia de infecção, o sangue foi obtido para a determinação do FNT e os macrófagos foram recuperados da cavidade peritoneal para avaliação, in vitro, das funções imunológicas. A capacidade fagocitária dos macrófagos peritoneais foi avaliada pelo teste de fagocitose em placa sendo determinado o índice fagocitário. A produção de óxido nítrico foi determinada pela reação de Griess. O peróxido de hidrogênio foi determinado pelo teste de oxidação do vermelho de fenol na presença de peroxidase. O FNT foi avaliado no soro e nos sobrenadantes das culturas dos macrófagos pelo teste imunoenzimático. Foi avaliada também a influência da pentoxifilina sobre a parasitemia, o hematócrito, o peso e a mortalidade. O tratamento com 8 mg/Kg/dia de pentoxifilina aumentou em um dia o início da morte e em três dias a sobrevida dos camundongos Balb/C e retardou a parasitemia em quinze dias em relação aos animais não tratados. Nos camundongos CBA, a pentoxifilina não alterou a parasitemia nem influenciou o início da morte, porém, aumentou em treze dias a sobrevida dos animais. Enquanto, os camundongos Balb/C infectados e tratados morreram a partir do décimo segundo dia com parasitemia de 52,4%, anemia com hematócrito de 12,2% e menor perda de peso; os camundongos CBA morreram a partir do oitavo dia com uma parasitemia de 7,3% e hematócrito de 43%, entretanto a pentoxifilina não influenciou a evolução do peso. Foi observado que o tratamento com a pentoxifilina estimulou o aumento da capacidade fagocitária dos macrófagos peritoneais dos camundongos Balb/C, por meio dos receptores para opsoninas, mas não alterou a fagocitose nos camundongos CBA. Observamos também que a produção de FNT é maior no sobrenadante das culturas de macrófagos peritoneais do que no soro e que a produção basal de FNT é maior nos camundongos Balb/C infectados e tratados do que nos camundongos CBA infectados e tratados. Observamos ainda que a pentoxifilina não alterou a produção de peróxido de hidrogênio pelos macrófagos peritoneais dos camundongos Balb/C e CBA infectados com Plasmodium berghei ANKA. Apesar do tratamento com pentoxifilina não ter alterado a produção basal ou estimulada de óxido nítrico nos camundongos Balb/C, a droga promoveu um aumento significante da produção basal de óxido nítrico nos camundongos CBA infectados pelo Plasmodium berghei ANKA. Nossos dados sugerem que as duas cepas de camundongos apresentam mecanismos imunopatogênicos diferentes e que a hiperativação do sistema imunitário que ocorre nas formas graves da malária está relacionado provavelmente com as características genéticas do indivíduo, que determinarão o tipo de evolução da doença. Demonstram também que a pentoxifilina não interferiu de modo significante na resposta do sistema imunitário envolvida na imunopatogenia nos camundongos Balb/C, não susceptíveis a forma cerebral da malária, melhorando inclusive alguns aspectos evolutivos da doença como a sobrevida e o retardo da parasitemia. Sugerem, portanto, que a utilização da pentoxifilina como terapêutica complementar às drogas antiplasmodiais, na dose de 8mg/kg/dia, antes das manifestações clínicas de gravidade, deve ser avaliada em seres humanos, com o objetivo de diminuir a grande morbidade e mortalidade da malária. ________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Malaria has global importance in health care due to its high prevalence, worldwide geographic distribution and high morbidity and mortality. The pathophysiology and clinical manifestations of the disease are manly caused by hiperactivation of immune system with high production of cytokines, mainly TNF, which may modulate several functions of the immune system. Furthermore, TNF is involved in anti-plasmodial defense. However, this cytokine may also participate in malaria immunopathology. Pentoxifylline is a phosphodiesterase inhibitor that has suppressive effect on TNF production by probably acting on NF-κB signaling pathway. It has been shown that this drug can modulate many functions of the immune system. This work aimed to evaluate the influence of pentoxifylline on malaria outcome and on macrophage functions of susceptible (CBA) and not susceptible (Balb/C) mice to cerebral malaria. The Balb/C and CBA mice were injected with 106 Plasmodium berghei ANKA infected-erythrocytes, and after three days mice were treated with 8mg/Kg/day of pentoxifylline or NaCl 0,9%. Two other not infected groups were treated the same way. On the eightieth day after infection, blood was collected and macrophages were obtained from peritoneal cavity to assess, in vitro, immunological functions. Phagocytosis was evaluated by phagocytic index. Nitric oxide production was evaluated by Griess reaction. Hydrogen peroxide production was evaluated by phenol red oxidation. TNF production was assessed in serum and supernatant of peritoneal macrophage cultures by immunoassay test. Influence of pentoxifylline on parasitemia, hematocrit, body weight and mortality were assessed. Pentoxifylline increased in one day the beginning of death and in three days the survival time and delayed the increase of parasitemia in fifteen days in the Balb/C mice. Pentoxifylline did not influence parasitemia and neither influenced the beginning of death of the CBA mice. However, this drug increased thirteen days the survival time of these animals. While, infected-treated Balb/C mice began to die on twelfth day post-infection with 52,4% of parasitemia, 12,2% of hematocrit and less weight body loss, infected-treated CBA mice began to die on eighties day postinfection with 7,3% of parasitemia and 43% of hematocrit. Although pentoxifylline enhanced the phagocytic capacity of the Balb/C peritoneal macrophages by opsoninreceptors, it did not influence the phagocytosis of the CBA mice in both groups. TNF production by peritoneal macrophages was higher than TNF serum levels. Furthermore, the production of TNF by the infected-treated Balb/C group was higher than that produced by CBA group. Pentoxifylline did not influence hydrogen peroxide and nitric oxide production by macrophages of both CBA and Balb/C mice, except for Plasmodium berghei ANKA infected-treated CBA mice, in which the treatment increased the production of this cytokine. Our findings suggest that both CBA and Balb/c mice show different immunopathological mechanisms and that the hiperactivation of immune system seems to be related to individual genetic features, which may determinate the malaria outcome. Moreover, pentoxifylline therapy did not influence the disease outcome and immune response of mice not susceptible to cerebral malaria (Balb/C), but it improved some features of the disease, such as survival and parasitemia. Our data suggest that pentoxifylline associated to antiplasmodial therapy, before clinical manifestations of severity of the disease, should be evaluated to reduce the morbidity and mortality of severe human malaria.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2006. / Submitted by wesley oliveira leite (leite.wesley@yahoo.com.br) on 2009-11-25T16:14:58Z No. of bitstreams: 1 Dissert Thiago Machado Mello de Sousa.pdf: 1918195 bytes, checksum: 76ffa4fe871a3a0f8ce3aff26c2c0b09 (MD5) / Approved for entry into archive by Carolina Campos(carolinacamposmaia@gmail.com) on 2010-01-14T19:06:01Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissert Thiago Machado Mello de Sousa.pdf: 1918195 bytes, checksum: 76ffa4fe871a3a0f8ce3aff26c2c0b09 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-01-14T19:06:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissert Thiago Machado Mello de Sousa.pdf: 1918195 bytes, checksum: 76ffa4fe871a3a0f8ce3aff26c2c0b09 (MD5) Previous issue date: 2006 / As proteínas recombinantes de interesse terapêutico vêm ganhando cada vez mais espaço na indústria farmacêutica e atualmente já movimentam um mercado anual de cerca de 50 a 60 bilhões de dólares em todo o mundo. As células de mamíferos são as hospedeiras de expressão preferencialmente escolhidas no caso de proteínas que requerem um grau sofisticado de processamento pós-traducional, sendo crescente a iniciativa de identificação de novas linhagens de células, especialmente humanas, como sistemas alternativos de expressão às células utilizadas. Nosso grupo de pesquisa tem interesse na produção de antígenos para seleção de anticorpos com potencial neutralizante, especialmente os antígenos de superfície do envelope viral de HIV-1, agente etiológico da pandemia mundial de AIDS, que atualmente apresenta mais de 40 milhões de infectados. O presente trabalho teve por objetivo a avaliação preliminar das células de ducto de glândula submandibular humana (HSG) como sistema de expressão heteróloga alternativo às células de ovário de hamster chinês (CHO-K1). Comparativamente, foi avaliada a eficiência de transfecção, assim como a de expressão transiente do anticorpo quimérico anti-Z-DNA Z22, na forma recombinante de fragmento FvFc pelas duas linhagens celulares. Outro objetivo foi a produção de versões recombinantes das glicoproteínas virais de HIV-1. Os resultados apontaram as células HSG como um bom sistema alternativo para a produção de proteínas heterólogas secretadas, especialmente quando transfectadas por co-precipitação com fosfato de cálcio, sendo ainda necessários alguns ajustes, uma vez que os choques osmóticos com glicerol e DMSO, considerados pontencializadores da transfecção, mostraram-se tóxicos da forma como foram executados. Foram amplificados e clonados em vetor de expressão para células de mamíferos os segmentos gênicos correspondentes a quatro versões recombinantes das glicoproteínas do envelope viral de HIV-1 (gp160, gp140, gp120 e gp41+PS), subtipo C que, de acordo com as nossas análises, utiliza CCR5 como co-receptor. Até o presente momento, não foi possível a detecção das glicoproteínas recombinantes, expressas de forma transiente em células CHO-K1, sendo necessários ajustes, principalmente na etapa de transfecção. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Recombinant therapeutic proteins have become more and more important in the pharmaceutical industry, and nowadays they are responsible for an injection of about 50 to 60 million dollar a year into the worldwide market. Animal cell cultures are the preferential expression systems for those proteins which require extensive posttranslational modifications. In this view, the identification of alternative expression systems is an issue of increasing concern, specially considering human cell lines. Our research group has been interested in the production of antigens to be used for the selection of neutralizing antibodies, particularly those antigens derived from the envelope surface of HIV-1, the etiologic agent of the pandemic infection of AIDS, which nowadays affects more than 40 million people. This work aimed the preliminary evaluation of the human salivary gland duct cells (HSG) as a heterologous expression system alternative to the Chinese hamster ovary cells (CHO-K1). The transfection efficiency for both cell lines was comparatively evaluated, as well as the transient expression of the anti-Z-DNA Z22 chimeric antibody, as a recombinant FvFc fragment. Another objective was the production of recombinant versions of HIV-1 glycoproteins. Our results pointed out to the HSG cells as a good alternative system for the production of secreted heterologous proteins, specially when transfected by co-precipitation with calcium phosphate. Some adjusts are still needed, considering that the glycerol and DMSO osmotic shocks, generally considered as transfection pontentializers, proved to be toxic in the employed protocol. The genic fragments corresponding to four recombinant versions of the HIV-1 envelope glycoproteins (gp160, gp140 gp120 and gp41+PS), subtype C, were amplified and cloned in a mammal cells expression vector. According to our analysis, this virus subtype uses CCR5 as co-receptor. So far, it was not possible to detect the recombinant glycoproteins expressed in a transient form in the CHO-K1 cells. In order to achieve this objective, some adjustments are still necessary, specially concerning the transfection protocol.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Química, Programa de Pós-Graduação em Química, 2010. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2011-06-03T16:23:15Z No. of bitstreams: 1 2010_FelipeFeitosaOliveira.pdf: 1843561 bytes, checksum: c6c6d374ac69e9591a81a33ec3a3d3b5 (MD5) / Approved for entry into archive by Daniel Ribeiro(daniel@bce.unb.br) on 2011-06-10T18:49:57Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_FelipeFeitosaOliveira.pdf: 1843561 bytes, checksum: c6c6d374ac69e9591a81a33ec3a3d3b5 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-06-10T18:49:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_FelipeFeitosaOliveira.pdf: 1843561 bytes, checksum: c6c6d374ac69e9591a81a33ec3a3d3b5 (MD5) / Este trabalho descreve a síntese, caracterização e aplicação de novos sistemas fluorescentes utilizando compostos do tipo 2-(2’-hidroxifenil) benzazóis acoplados com o núcleo 2,1,3-benzotiadiazola. Os novos sistemas fluorescentes foram sintetizados utilizando um acoplamento do tipo Buchwald-Hartwig e foram plenamente caracterizados. Suas características físico-físicas, com ênfase na foto-física, foram investigadas e suas propriedades como sondas fluorescentes foram determinadas. Para isso foram realizadas titulações espectrofotométricas e espectrofluorimétricas utilizando dsDNA e a proteína BSA. Além disso, estudos de variação de pH e de voltametria cíclica foram realizados para testar sua estabilidade em diferentes condições. Por fim, os sistemas foram aplicados em estudos de live-cell imaging, comprovando sua eficácia como marcadores seletivos de dsDNA nuclear em sistemas biológicos utilizando células-tronco humanas. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The present work describes the synthesis, characterization and application of new systems using fluorescent compounds such as 2 - (2'-hydroxyphenyl) benzazoles coupled with 2,1,3-benzothiadiazole core. The new fluorescent systems were synthesized using Buchwald-Hartwig cross coupling reaction and were fully characterized. Physical chemical properties, especially photophysical properties, were investigated and the applications as fluorescent probes were investigated. To achieve this goal, it was performed spectrophotometric and spectrofluorimetric titrations using dsDNA and BSA protein. Moreover, studies of pH-dependence and cyclic voltammetry were conducted to test the stability under different conditions. Finally, the systems were applied in live-cell imaging experiments, proving the effectiveness and selectivity as nuclear dsDNA staining dyes for biological systems using human stem-cells.

Dissertação (mestrado)-Universidade de Brasília, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2011 / Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2012-03-29T12:38:55Z No. of bitstreams: 1 2011_TatianeAraujoCosta.pdf: 899665 bytes, checksum: e7e2f53d213af3d0544e32927e5f28f7 (MD5) / Approved for entry into archive by Elzi Bittencourt(elzi@bce.unb.br) on 2012-03-29T14:31:21Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_TatianeAraujoCosta.pdf: 899665 bytes, checksum: e7e2f53d213af3d0544e32927e5f28f7 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-03-29T14:31:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_TatianeAraujoCosta.pdf: 899665 bytes, checksum: e7e2f53d213af3d0544e32927e5f28f7 (MD5) / Paracoccidioides brasiliensis, agente etiológico da paracoccidioidomicose, é um fungo termodimórfico e sua patogenicidade está ligada ao processo de transição dimórfica e a alterações na parede celular. Em P. brasiliensis, os principais polímeros que compõem a parede celular são a 1,3-?-glicana e a 1,3-?-glicana, responsáveis pela forma e integridade estrutural. Neste estudo investigou-se a região promotora do gene de 1,3-?-glicana sintase (PbFKS1). Foram encontrados na região regulatória de PbFKS1 dois sítios consensuais para a ligação do fator transcricional CreA, envolvido na repressão por glicose, e dois sítios de interação para o fator PacC, relacionado à regulação da expressão gênica mediada pelo pH extracelular em fungos. Experimentos de retardo de mobilidade eletroforética (EMSA) foram realizados com três sondas fluorescentes distintas: Pbfks1 (I), que apresenta um dos sítios CreA; Pbfks1 (II), que representa um sítio para PacC e Pbfks1 (III), na qual estão presentes um sítio para CreA e um sítio para PacC espaçados por sete nucleotídeos. Foram empregados, nos experimentos de EMSA, proteínas recombinantes contendo os domínios de ligação ao DNA de CreA e de PacC fusionados à glutationa-S-transferase, e extratos protéicos totais de P. brasiliensis nas fases de micélio e de levedura, crescido em pH ácido (5,0), neutro (7,0) ou alcalino (9,0). Os resultados de EMSA indicaram que os sítios de CreA do gene PbFKS1 não foram reconhecidos pela proteína rCreA-GST. Quando da incubação com extratos protéicos totais obtidos de células leveduriformes ou miceliais, houve a formação de complexos DNA-proteína, mas esses não envolviam o sítio de reconhecimento de CreA. Os experimentos realizados com as duas sondas que apresentam o motivo de reconhecimento de PacC indicaram a formação de complexos entre a proteína rPacC-GST e o motivo de reconhecimento específico. Os ensaios feitos com extratos protéicos totais resultaram na detecção de interação DNA-proteína específica no sítio PacC apenas na forma de levedura, cultivada em pH neutro ou alcalino. Os dados obtidos nesse trabalho indicam que o fator transcricional PacC possa estar envolvido na regulação da expressão do gene PbFKS1 quando do crescimento leveduriforme, forma celular em que ocorre no hospedeiro infectado. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Paracoccidioides brasiliensis, the etiological agent of paracocciodioidomycosis, is a thermodimorphic funjgs. Pathogenicity is linked to modifications of the cell wall during the dimorphic transition. P. brasiliensis major cell wall polymers are 1,3-β-glican and 1,3-α-glican, which are responsible for structural form and integrity. In this study the promoter region of the 1,3-β-glican synthase (PbFKS1) gene was investigated. In the PBFKS1 regulatory region we found two consensus binding sites for the CreA transcription factor PacC, which is related to the gene expression regulation mediated by extracellular ph in fungi. Electrophoretic mobility shift assays (EMSAs) were performed with tree distinct fluorescent probes: Pbfs1 (I), which presents one of the CreA recognition sites; Pbfs1 (I), wich represents a PacC are spaced by binding site; and Pbfks 1 (III), in wich one site for CreA and one for PAcC are spaced by seven nucleitides. For the EMSAs, we employed recombinant proteins containing the CreA or the PacC DNA-binding domaun fused to glutathione-S-transfere (rCreA-GST and rPacC-GST, respectively), as well as total proteins extractus obtained from P. brasiliensis mycelium and yeast cells grown in acidic (5.0), neutral (7.0) or alkaline (9.0) Ph. EMSAs results indicated that the CreA binding sites present in the PbFKS1 gene regulatory region were not recognized by the rCreA-GST protein. When probes were incubated with total protein extracts obtained either from yeast or mycelium cells, DNA-protein complxes were formed ; nevertheless, these complexes did not invole the CreA specific recognition site.Experiments performed with the two PacC probes indicated the formation of complexes between rPacC-GST and the Specific DNA_protein interactions in the PAcC binding site only in the yeast phase grown in neutral or alkaline ph.The data obtained in the work indicative that the transcriptions factor PacC can be involved in the regulations of PbFSk1 gene expression during the yeast phase growth, which is the cell form that occurs in the infected host.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2013. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2014-03-27T13:38:08Z No. of bitstreams: 1 2013_TainaMacheriniMarques.pdf: 3539369 bytes, checksum: acd0b0410a6aa4e6814cb34fa6dd6edd (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2014-03-27T13:59:25Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_TainaMacheriniMarques.pdf: 3539369 bytes, checksum: acd0b0410a6aa4e6814cb34fa6dd6edd (MD5) / Made available in DSpace on 2014-03-27T13:59:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_TainaMacheriniMarques.pdf: 3539369 bytes, checksum: acd0b0410a6aa4e6814cb34fa6dd6edd (MD5) / MicroRNAs circulantes são encontrados em todos os fluidos corporais e podem ser associados com a modulação do microambiente tumoral e progressão de doenças. Na presença de células cancerosas, componentes presentes no microambiente normal, tornam-se desregulados, promovendo a sobrevivência celular, a progressão da doença e resistência às drogas. Vários microRNAs atuam como participantes no processo de desenvolvimento de leucemia, quer aumentando ou diminuindo os níveis de expressão. Aqui, mostramos dados onde microRNAs circulantes foram identificados no soro de medula óssea de pacientes com leucemia linfoide aguda (LLA). Foram investigados, por smallRNA seq a presença de microRNAs no microambiente do tumor em amostras de soro de quatro pacientes, colhidos ao diagnóstico (fase um) e durante o seguimento do tratamento quimioterápico (fase dois e três). No total, foram identificados 946 microRNAs conhecidos, apenas os microRNAs com o mínimo de cinco leituras por milhões em uma das fases foram consideradas, totalizando 391 microRNAs. Após a análise estatística, somente microRNAs com diferença de expressão entre as fases de tratamento com um valor de p em 0,05 foram considerados. Entre eles, 258 apresentaram número de leituras com diferença significativa entre a fase um e a fase dois, 199 entre a fase um e três e 237 comparando fase dois e três. Os seis microRNAs com diferença mais significativa entre as fases foram relacionados em outras doenças com a atuação como proto-oncogenes, progressão, invasão, angiogênese, metástase tumoral, inibição de apoptose e promotor de crescimento celular. O miR-486-5p foi o maior em quantidade de leituras (reads) e aquele com a maior diferença significativa entre as fases, diminuindo durante o tratamento, com exceção do paciente com recidiva da doença. Sugerindo que este microRNA 486-5p, possa ser utilizado como biomarcador associado ao resultado do tratamento. O microRNA 423, descrito como participante no crescimento celular, possibilitou a estratificação entre os grupos de risco, indicando sua possível utilização como marcador na classificação de risco dos pacientes. Esse estudo é o primeiro a relacionar os microRNAs circulantes em microambiente tumoral durante as etapas de tratamento quimioterápico e a sugerir o uso como biomarcadores. ______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Circulating microRNAs have been found in all body fluids and could be associated with modulation of tumor microenvironment and progression of diseases. In the presence of cancer cells, components present in normal microenvironment, become deregulated, promoting cell survival, disease progression and drug resistance. Several microRNAs act as participants in the process of development leukemia either increasing or decreasing the expression levels. Here, we show data where circulating microRNAs were found in bone marrow serum from acute lymphoblastic leukemia (ALL) patients. We investigated, by smallRNA seq the presence of microRNAs in tumor microenvironment from four patients, collected diagnosis (phase one) and during sequence chemotherapy treatment (phase two and three). In totally, 946 known microRNAs were identified, only microRNAs with minimum of five reads per million in one of phases were considered, totaling 391 microRNAs. After statistical analysis, only microRNAs with expression difference between treatment phases with a p value under 0,05 were considered. Among them, 258 presented significant difference expression between phase one and two, 199 between phase one and three and 237 comparing phase two to three. The six more different expressed microRNAs have been linked with other diseases acting as proto-oncogenes, progression, invasion, angiogenesis, tumor metastasis, inhibition apoptosis and cell growth promoter. The miR-486-5p was the largest in number reads and the one with the most significant difference between the phases, decreasing during treatment, except for patients with relapsed disease. Suggesting that this microRNA 486-5p could be used as biomarker associated to treatment outcome. The microRNA 423, described as participating in cell growth, was able stratify risk among groups, indicating its possible use as a biomarker in the risk classification. This study is the first to relate the circulating microRNAs in the tumor microenvironment during the stages of chemotherapy and suggested their use as biomarkers.

Durante a respiração celular, cerca de 1 a 3% do oxigênio metabolizado produz espécies reativas de oxigênio (ERO). Entretanto, para defender o organismo do efeito dessas espécies, existem vários sistemas antioxidantes, dependendo do organismo, da célula ou do tecido em questão. A Vitamina A (retinol) e seu derivados exercem uma infinidade de efeitos em diversos processos biológicos, destacando-se a embriogênese, visão, regulação de processos inflamatórios, crescimento, proliferação e diferenciação de células normais e neoplásicas. Embora o potencial antioxidante da vitamina A e carotenóides tenha sido descrito primeiramente, sabe-se hoje que, sob diferentes condições, essas moléculas podem se comportar de uma maneira pró-oxidante. Por isso, atualmente são melhores descritas como moléculas redox ativas. Apesar dos nossos trabalhos anteriores demonstrarem um efeito pró-oxidante do retinol em culturas de células de Sertoli, o mecanismo exato pelo qual esse efeito é verificado permanece a ser elucidado. Uma vez que o ácido retinóico (AR) é o metabólito mais ativo do retinol, foram verificados os efeitos da suplementação de AR em culturas de células de Sertoli, com o objetivo de verificar se os efeitos anteriormente observados com o retinol devem-se à metabolização do mesmo a AR. Nossos resultados mostraram que o AR em baixas doses não aumentou os níveis de TBARS. Além disso, na concentração de 1 nM o AR foi capaz de diminuir os níveis de TBARS. Entretanto, quando as células foram tratadas com altas doses de AR foi observado um aumento destes níveis, além de uma diminuição da viabilidade celular. Uma vez que altas doses de AR induziram um aumento na lipoperoxidação e diminuíram a viabilidade celular, nós decidimos investigar somente os efeitos de doses fisiológicas (nM) de AR. Foram dosadas as atividades da SOD, CAT e GPx em células de Sertoli tratadas com AR. A atividade da SOD encontrou-se aumentada em todas as doses testadas. A atividade da GPx mostrou-se aumentada nas células tratadas com 0,1 nM, 1 nM e 10 nM e a atividade da CAT aumentou somente com 1 nM de AR. Esses resultados sugerem que o AR em doses fisiológicas aumenta a atividade das enzimas antioxidantes, protegendo, assim, as células do estresse oxidativo, como pode ser observado nos índices de lipoperoxidação e viabilidade celular. Todavia, o mecanismo pelo qual o AR induz a geração de ERO é desconhecido. Então nós decidimos verificar a ação anti ou pró-oxidante in vitro do AR. Na concentração suprafisiológica de 10 M, AR foi capaz de degradar a 2-deoxiribose, um substrato específico do radical hidroxil, sugerindo que a auto-oxidação do mesmo é capaz de gerar radicais livres. Além disso, o potencial antioxidante total do AR foi avaliado: altas concentrações de AR (1–10 M) aumentaram a geração de radicais livres. Esses resultados demonstram, pela primeira vez, que o ácido retinóico é capaz de gerar radicais livres e sugerem, pelo menos em parte, que alguns efeitos induzidos por AR podem ser mediados por ERO geradas a partir da degradação espontânea do ácido retinóico. Classicamente, os efeitos biológicos dos retinóides estão relacionados à sua conversão em ácido retinóico através da modulação da expressão de genes. Entretanto, recentes trabalhos têm demonstrado que os retinóides possuem ações biológicas que não envolvem sua interação com receptores nucleares. Assim, alguns autores sugerem que o mecanismo de regulação dos retinóides também seja por modificação do estado redox celular. As concentrações de AR utilizadas nesse trabalho variaram de faixa do fisiológico até a do farmacológico. Sabe-se que as células de Sertoli sintetizam AR a partir do retinol circulante; isso pode ser uma das explicações dos efeitos observados em células de Sertoli tratadas com altas doses de retinol, uma vez que a metabolização de grandes concentrações de retinol poderia acarretar uma grande formação de ácido retinóico.

Glicoesfingolipídios (GSL) são constituintes da membrana plasmática e possuem bases de cadeia longa (bases esfingóides) como componente estrutural lipídico. Açúcares podem ser adicionados à ceramida sintetizada de novo (rota 1), sintetizada pela reciclagem da esfingosina (rota 2) e em GSL reciclados através do Golgi (rota 3). A serina palmitoiltransferase (SPT) é a enzima marca-passo e catalisa o primeiro passo na biossíntese de novo destes componentes. A linhagem celular GRX, representativa das células estreladas hepáticas, expressa o fenótipo miofibroblástico e pode ser induzida in vitro a adquirir o fenótipo lipocítico. Ambos fenótipos possuem gangliosídios da série-a (GM2, GM1 e GD1a) bem como o seu precursor GM3, que são expressos como doublets em HPTLC (bandas 1 e 2, respectivamente). Para o estudo da biossíntese dos GSL neste modelo biológico, foram determinadas as condições ideais para a atividade da SPT, e foi avaliada sua atividade na fração microssomal nos dois fenótipos. Também foi determinada a contribuição de cada rota de biossíntese para as duplas bandas. As células foram pré-incubadas com 5mM de -cloroalanina (inibidor da SPT) ou com 25M de fumonisina B1 (inibidor da ceramida sintase) e então, [U-14C]galactose foi adicionada no meio de cultura na presença contínua dos inibidores. Culturas controles (sem inibidores) foram realizadas simultaneamente. Os lipídios foram extraídos, os gangliosídios purificados em colunas Sep-Pack C18 e analisados por HPTLC, a qual foi revelada por auto-radiografia e após, submetida à análise densitométrica. Em ambos fenótipos, a síntese de novo, a reciclagem da esfingosina e a reciclagem pelo Golgi contribuem com a biossíntese dos GSL No miofibroblasto, os doublets dos gangliosídios complexos (GD1a e GM1) são, principalmente, sintetizados pelas rotas de reciclagem; enquanto as bandas do GM2 e do GM3 têm uma participação importante da síntese de novo. No lipócito, as rotas de reciclagem são as mais importantes. Contudo, no lipócito, ambas bandas do GM2 e a banda 2 do GM3 apresentam considerável síntese pela rota de novo. Esta rota tem uma contribuição menor no lipócito do que no miofibroblasto, o que está de acordo com os níveis da atividade da SPT detectados nestes fenótipos. Isto sugere que os fenótipos miofibroblasto e lipócito utilizam pools de ceramida distintos para a síntese de seus GSL e que apresentam importantes diferenças entre as rotas biossintéticas, o que pode se refletir no seu comportamento celular.

Trabalhos recentes na literatura demonstraram que proteínas do citoesqueleto, mais especificamente os microfilamentos de actina, estão correlacionadas com a promoção e manutenção do estresse oxidativo, bem como modulação de processos mitocondriais. Trabalhos do nosso grupo caracterizaram que o tratamento com retinol (vitamina A) em células de Sertoli cultivadas era capaz de induzir a produção de espécies reativas de oxigênio (ERO), desbalanço na atividade de enzimas antioxidantes, com conseqüente promoção de estresse oxidativo. Radicais livres produzidos pelo tratamento com retinol, também foram capazes de induzir uma transformação pré-neoplásica, modulação de eventos recombinatórios, modulação de enzimas envolvidas na divisão celular como ornitina decarboxilase (ODC), progressão de ciclo celular e apoptose. O tratamento com retinol também foi capaz de, por uma via radical livre dependente, induzir a divisão de células de Sertoli terminalmente diferenciadas e não-proliferativas, com a conseqüente formação de focos proliferativos. Uma vez que o citoesqueleto participa de muitos dos processos relatados (proliferação, transformação e apoptose), e trabalhos recentes na literatura correlacionam estresse oxidativo com proteínas do citoesqueleto, nós decidimos avaliar a influencia do citoesqueleto e suas proteínas na produção e manutenção do estresse oxidativo gerado pelo tratamento com retinol. O primeiro capítulo dessa dissertação caracteriza uma modulação radical livre dependente do citoesqueleto das células de Sertoli tratadas com retinol, onde uma proteção/adaptação do citoesqueleto foi observada frente ao ambiente pró oxidativo gerado pelo retinol. Neste primeiro capítulo nós também sugerimos que a adaptação observada poderia ser relacionada com um possível papel de condução de elétrons pelos filamentos de actina. O segundo capítulo dessa dissertação demonstra uma dependência da correta organização dos filamentos de actina para a produção/manutenção do estresse oxidativo gerado pelo tratamento com retinol. Juntamente, o segundo capítulo apresenta uma explicação para a teoria de condução de elétrons pelos filamentos de actina, onde é descrito como esse fenômeno poderia ocorrer. Os resultados apresentados nessa dissertação sugerem que os microfilamentos de actina são essenciais para a produção/manutenção do estresse oxidativo gerado pelo tratamento com retinol, e que essa dependência pode ser explicada por uma nova função fisiológica de biocondutor de elétrons. / Recent works presented in the literature have shown that cytoskeleton proteins, specifically actin microfilaments, are correlated with promotion and maintenance of oxidative stress, and mitocondrial functions modulations. Works of our research group have characterized that retinol treatment in cultived Sertoli cells was able to induce reactive oxygen species (ROS) production, antioxidant enzymes activity imbalance, resulting in oxidative stress production. Free radicals produced by retinol treatment, were also able to induce pre neoplasic transformation, modulation of recombinatory events, modulation of enzymes involved in cell division such as ornitina decarboxilase (ODC), cell cycle progression and apoptosis. Retinol treatment was also able by a free radical-dependent way, induce the division of terminate differentiated and non proliferative Sertoli cells, resulting in proliferative focus formation. Once cytoskeleton participates of many of the related process (proliferation, transformation and apoptosis), and recent works presented in the literature correlated oxidative stress with cytoskeleton proteins, we decided evaluated the cytoskeleton influence in the production and maintenance of oxidative stress generated by retinol treatment. The first chapter presented in this manuscript characterizes a cytoskeleton modulation free radical-dependent in the Sertoli cells treated with retinol, where a cytoskeleton adaptation/protection was observed in response to a pro oxidative environment produced by retinol. In this first chapter we also suggested that the adaptation observed could be related with a possible function of electrons conductions through actin microfilaments. The second chapter of this manuscript shows an actin microfilaments dependence to production/maintenance of oxidative stress generated by retinol treatment. Together, the second chapter shows an explanation of the electron conduction theory through actin microfilaments, where a description of the electron conduction process is presented. The results presented in this manuscript suggest that actin microfilaments are essential to production/maintenance of oxidative stress generated by retinol treatment, and that this dependence could be explained by a new physiologic function of electron bioconductor.

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