Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2007. / Submitted by Priscilla Brito Oliveira (priscilla.b.oliveira@gmail.com) on 2009-10-19T18:58:32Z No. of bitstreams: 1 Dissert_Thais Lamounier.pdf: 8272407 bytes, checksum: 271d78cfe345a9ca63cc61fca349aa98 (MD5) / Approved for entry into archive by Tania Milca Carvalho Malheiros(tania@bce.unb.br) on 2009-10-20T14:03:21Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissert_Thais Lamounier.pdf: 8272407 bytes, checksum: 271d78cfe345a9ca63cc61fca349aa98 (MD5) / Made available in DSpace on 2009-10-20T14:03:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissert_Thais Lamounier.pdf: 8272407 bytes, checksum: 271d78cfe345a9ca63cc61fca349aa98 (MD5) Previous issue date: 2007 / As células T regulatórias (Treg) possuem um importante papel na supressão da resposta imune efetora de linfócitos T, mas as condições especiais de expressão ao antígeno que levam à geração dessas células, ainda não são bem conhecidas. Neste estudo, foram analisadas as populações celulares presentes em lesões granulomatosas obtidas de biópsias de pacientes com paracoccidioidomicose, tuberculose e sarcoidose. A análise imuno-histoquímica dos marcadores moleculares CD4, CD8, CD25, CTLA-4, CD20, CD75, CD3 e CD45RO, demonstrou que em todos os casos houve uma importante migração de células com fenótipo CD3+, CD45RO+, CD20+ e CD75+. Analisando estes marcadores observaram-se uma correlação positiva entre os marcadores CD3 e CD45RO e entre CD8, CD25 e CTLA-4. A expressão de CTLA-4 foi maior em lesões de linfonodo do que nas lesões pulmonares. A presença de possíveis células Treg nestas lesões pode ser CD8+, com capacidade de modular negativamente a resposta de células T. Porém, apesar do fenótipo CD4+CD25+ ser o mais descrito para as células Treg, outras populações celulares podem participar desta regulação, sendo necessário uma análise adicional de outros marcadores de superfície para caracterizar estas células T como regulatórias. _________________________________________________________________ ABSTRACT / Regulatory T cells have an important role in the suppression of the limphocytes T immune response , although the special conditions of expression to the antigen, that conduct to the generation of those cells, are not yet well-known. In this work, it was analysed the cellular population present in granulomatous lesions, obtained from the byopsies of patients with Paracoccidioidomycosis, Tuberculosis and Sarcoidosis cases. The Immunohistochemical analyisis of the molecule markers CD4, CD8, CD25, CTLA-4, CD20, CD75, CD3 AND CD45RO, have demonstrated, in all cases, an important migration of cells with the phenotypes CD3+, CD45RO+, CD20+ and CD75+. Analysing these markers, it was observed a positive correlation between the CD3 and the CD45RO and among the TCD8, CD25 and the CTLA-4. The expression of CTLA-4 was bigger in linphonode lesions cases than the ones with pulmonary lesions. The possible presence of Regulatory T cells in these lesions may be CD8+, with the capacity to negativity modulate the answer of T cells. However, despite the phenotype CD4+CD25+ be the most described in the regulatory T cells, other cellular populations may take part in this regulation, being necessary an additional analysis of different surface markers to characterize these T cells as regulatory.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:51:43Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo2892_1.pdf: 5502983 bytes, checksum: 9d6ee430e513460ac62f54bea9784b36 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2010 / Faculdade de Amparo à Ciência e Tecnologia do Estado de Pernambuco / Considerada uma das principais doenças infecciosas em saúde publica, a tuberculose (TB) alcança níveis de alta endemicidade em países em desenvolvimento. Em 2008, o Brasil ocupava o 19º lugar entre os 22 países considerados de maior incidência. Neste mesmo ano o Estado de Pernambuco apresentava o mais alto coeficiente de incidência da região Nordeste e a Cidade do Recife (PE) a capital brasileira com mais casos novos de TB. Nos últimos 20 anos, a incidência de TB na população de idosos com idade igual ou acima de 60 anos, residentes no Recife, permaneceu sempre alta ao longo dos anos. Com o envelhecimento da população brasileira, a doença TB pode vir a constituir um grave problema, principalmente se considerarmos que as taxas de letalidade tendem a aumentar com a idade. Apesar disso, poucos estudos investigando o comportamento da tuberculose nessa população têm sido realizados no Brasil. A presente dissertação constou de três estudos abordando a tuberculose no idoso. No primeiro, realizou-se uma revisão bibliográfica acerca dos estudos publicados sobre fatores imunológicos relacionados ao desenvolvimento da TB no idoso, particularmente o papel das células T regulatórias (T regs), e sua relação com a reatividade ao teste tuberculínico (TT). A revisão bibliográfica foi realizada mediante uma busca on-line nas bases de dados Medline-PubMed, Science-Direct, Lilacs, Bireme e Scielo, com foco nas publicações dos últimos dez anos, nos idiomas português e inglês. Os resultados do primeiro artigo demonstram que poucos estudos têm avaliado o nível das células T regs na população idosa e a informação sobre essas células nesse grupo é limitada e controversa. Concluíse com essa revisão que existe uma lacuna de informação no contexto da resposta ao TT e produção de células T regs em idosos com tuberculose. O segundo é um estudo tipo série de casos cujo objetivo foi descrever o padrão de reatividade ao TT e características dos indivíduos idosos com e sem TB doença e adultos com TB, assim como identificar o ponto de corte da curva ROC (Receiver Operating Characteristic) que melhor descrimina idosos com e sem TB doença. Foram estudados 87 pacientes residentes da cidade do Recife, no período de janeiro de 2008 a dezembro de 2009. Os resultados do artigo 2 mostra que ao comparar a média em milímetros do valor do TT dos três grupos, essas são diferentes e a diferença foi estatisticamente significante (p=0,001). Além disso, ter idade entre 60 a 69 anos, ser do sexo masculino, está desnutrido, beber e fumar são características presentes no idoso com TB. A curva ROC identificou o ponto de corte de 5 mm como aquele que apresenta os valores de sensibilidade (0,61) e especificidade (0,78) mais elevados para discriminar os idosos com TB doença dos idosos sem TB doença. Com base nos resultados encontrados, sugerimos que o critério de positividade do TT nos indivíduos idosos seja revisto. O objetivo do terceiro estudo foi verificar a correlação entre os níveis de células T regs e a reatividade ao TT em idosos e adultos com TB e idosos sem TB. A expressão de FOXP3 por PCR em tempo real foi realizada em 61 pacientes, enquanto que quantificação das células Treg por citometria de fluxo em 25. Ao analisar a correlação do TT e células T regs observou-se que só houve correlação estatisticamente significativa no grupo de adultos com TB doença. Verificou-se ainda, uma correlação positiva entre o TT e os níveis de FOXP3 nos grupos de adultos e idosos com TB e uma correlação negativa no grupo de idosos sem TB. Os resultados encontrados no artigo 3 indicam uma diminuição dos níveis de células T regulatórias na circulação periférica de pacientes idosos com TB em atividade, sugerindo existir uma imunodepressão nesse grupo que pode ser responsável pela menor reatividade ao TT quando comparado aos adultos com tuberculose

As células T regulatórias (Tregs) suprimem a população de células T efetoras e podem capacitar células tumorais a evadir a resposta imune do hospedeiro. Além disso, estas células têm sido correlacionadas com angiogênese em alguns tipos de câncer. O objetivo deste estudo foi avaliar a frequência de células Tregs e sua correlação com angiogênese em carcinomas espinocelulares (CEC) de boca. Amostras de um total de 61 pacientes com CEC de boca, localizados no lábio e na língua e assoalho bucal obtidos dos Departamentos de Patologia dos Hospitais de Base e Estadual da cidade de Bauru, São Paulo, Brasil, no período de 2005 a 2012 foram analisados quanto às características clínicas e demográficas. Avaliou-se também, o índice histopatológico de malignidade e a expressão imunoistoquímica de células Tregs (FOXP-3), densidade microvascular intratumoral (MVD) e VEGF-A. A associação da marcação do anticorpo anti-FOXP-3 e as variáveis clínicas e microscópicas foram avaliadas através do teste qui quadrado. A análise estatística da expressão dos marcadores entre CECs de lábio e CECs de Língua e assoalho bucal foi realizada através do teste t. As correlações entre a frequência de células Treg e MVD, células Tregs e VEGF-A, foram obtidas através do coeficiente de correlação de Pearson, bem como a correlação entre MVD e VEGF-A. Não houve associação da expressão de FOXP-3 com as características clínicas, demográficas e índice de malignidade tumoral. Foram observados valores similares da frequência de células Tregs, índices de MVD e expressão de VEGF-A em CECs de lábio e CECs de língua e assoalho bucal. Uma correlação positiva entre a frequência de células Tregs e a MVD foi observada, embora não estatisticamente significativa (P-valor=0,682). Além disso, uma correlação positiva estatisticamente significativa foi detectada entre a frequência de células Tregs e a expressão de VEGF-A (P-valor=0,029). Não foi observada correlação entre a MVD e a expressão de VEGF-A. Estes resultados sugerem que embora exista uma associação entre a frequência de células Tregs e a angiogênese em CECs de boca, a expressão de FOXP-3 parece não estar associada ao desenvolvimento tumoral. / Regulatory T (Treg) cells suppress effector T-cell populations and can enable tumor cells to evade the host immune response. Moreover, Tregs cells have been correlated with angiogenesis in certain types of cancers. The aim of this study was to evaluate the frequency of Treg cells and its correlation with angiogenesis in oral squamous cell carcinomas (OSCC), as well as its implication on growth and tumor aggressiveness. Samples from a total of 61 patients with OSCC, located on the lip and tongue and floor of the mouth were analyzed for clinical and demographic characteristics. The histopathological malignancy index and immunoexpression of Treg cells (FOXP-3), IMD (CD105) and VEGF-A were also evaluated. The association of FOXP-3 expression and the clinical and microscopic changes were evaluated using the chi square test. Statistical analysis of the expression of markers between SCCs lip and SCCs of the tongue and floor of the mouth was performed using the t test. Pearsons rank correlation was performed to evaluate the correlation between the frequencies of both, Tregs cells and VEGF-A expression and Tregs cells and IMD determinations, as well as between VEGF-A expression and IMD values. There was no association of FOXP-3 expression with clinical and demographic characteristics, and tumor malignancy index. Similar values were observed for the frequency of Treg cells, IMD values and VEGF-A expression in OSCCs of the lip and tongue and floor of mouth. A positive correlation between FOXP-3 expression with IMD values was also detected, however, statistically that was non-significant (P-value=0.682). Furthermore, a significant positive correlation was observed between the frequency of tumor-infiltrating Tregs with VEGF-A expression (P-value=0.029). No correlation was observed between IMD values and with VEGF-A expression. These results suggest that although there is an association between the frequency of Treg cells and angiogenesis in OSCC, FOXP-3 expression was not associated with increased tumor aggressiveness.

As células T regulatórias (Tregs) suprimem a população de células T efetoras e podem capacitar células tumorais a evadir a resposta imune do hospedeiro. Além disso, estas células têm sido correlacionadas com angiogênese em alguns tipos de câncer. O objetivo deste estudo foi avaliar a frequência de células Tregs e sua correlação com angiogênese em carcinomas espinocelulares (CEC) de boca. Amostras de um total de 61 pacientes com CEC de boca, localizados no lábio e na língua e assoalho bucal obtidos dos Departamentos de Patologia dos Hospitais de Base e Estadual da cidade de Bauru, São Paulo, Brasil, no período de 2005 a 2012 foram analisados quanto às características clínicas e demográficas. Avaliou-se também, o índice histopatológico de malignidade e a expressão imunoistoquímica de células Tregs (FOXP-3), densidade microvascular intratumoral (MVD) e VEGF-A. A associação da marcação do anticorpo anti-FOXP-3 e as variáveis clínicas e microscópicas foram avaliadas através do teste qui quadrado. A análise estatística da expressão dos marcadores entre CECs de lábio e CECs de Língua e assoalho bucal foi realizada através do teste t. As correlações entre a frequência de células Treg e MVD, células Tregs e VEGF-A, foram obtidas através do coeficiente de correlação de Pearson, bem como a correlação entre MVD e VEGF-A. Não houve associação da expressão de FOXP-3 com as características clínicas, demográficas e índice de malignidade tumoral. Foram observados valores similares da frequência de células Tregs, índices de MVD e expressão de VEGF-A em CECs de lábio e CECs de língua e assoalho bucal. Uma correlação positiva entre a frequência de células Tregs e a MVD foi observada, embora não estatisticamente significativa (P-valor=0,682). Além disso, uma correlação positiva estatisticamente significativa foi detectada entre a frequência de células Tregs e a expressão de VEGF-A (P-valor=0,029). Não foi observada correlação entre a MVD e a expressão de VEGF-A. Estes resultados sugerem que embora exista uma associação entre a frequência de células Tregs e a angiogênese em CECs de boca, a expressão de FOXP-3 parece não estar associada ao desenvolvimento tumoral. / Regulatory T (Treg) cells suppress effector T-cell populations and can enable tumor cells to evade the host immune response. Moreover, Tregs cells have been correlated with angiogenesis in certain types of cancers. The aim of this study was to evaluate the frequency of Treg cells and its correlation with angiogenesis in oral squamous cell carcinomas (OSCC), as well as its implication on growth and tumor aggressiveness. Samples from a total of 61 patients with OSCC, located on the lip and tongue and floor of the mouth were analyzed for clinical and demographic characteristics. The histopathological malignancy index and immunoexpression of Treg cells (FOXP-3), IMD (CD105) and VEGF-A were also evaluated. The association of FOXP-3 expression and the clinical and microscopic changes were evaluated using the chi square test. Statistical analysis of the expression of markers between SCCs lip and SCCs of the tongue and floor of the mouth was performed using the t test. Pearsons rank correlation was performed to evaluate the correlation between the frequencies of both, Tregs cells and VEGF-A expression and Tregs cells and IMD determinations, as well as between VEGF-A expression and IMD values. There was no association of FOXP-3 expression with clinical and demographic characteristics, and tumor malignancy index. Similar values were observed for the frequency of Treg cells, IMD values and VEGF-A expression in OSCCs of the lip and tongue and floor of mouth. A positive correlation between FOXP-3 expression with IMD values was also detected, however, statistically that was non-significant (P-value=0.682). Furthermore, a significant positive correlation was observed between the frequency of tumor-infiltrating Tregs with VEGF-A expression (P-value=0.029). No correlation was observed between IMD values and with VEGF-A expression. These results suggest that although there is an association between the frequency of Treg cells and angiogenesis in OSCC, FOXP-3 expression was not associated with increased tumor aggressiveness.

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2013-10-11T17:20:48Z No. of bitstreams: 1 Jorge Sadao Nihei.pdf: 1524347 bytes, checksum: eb6417af423845038169df9f7824ead9 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-10-11T17:20:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Jorge Sadao Nihei.pdf: 1524347 bytes, checksum: eb6417af423845038169df9f7824ead9 (MD5) Previous issue date: 2013 / Universidade Federal da Bahia. Salvador, BA, Brasil / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / A infecção pelo Trypanosoma cruzi (T. cruzi) resulta em uma resposta imune que controla a predominância do parasito, mas é incapaz de eliminá-lo completamente, levando a persistência do parasito. A gravidade da doença de Chagas está correlacionada com a persistência do parasito nos tecidos musculares, neurais e intestinais. A função imunorregulatória das células T reguladoras em limitar a resposta imune poderia ser explorada no sentido de erificar a sua quantidade e qualidade no modelo experimental de infecção por T. cruzi. O principal objetivo deste projeto foi estudar a participação e influência dos linfócitos Treg sobre os mecanismos de resistência a infecção por T. cruzi, principalmente sobre a geração/manutenção de células T CD4+ e CD8+ memória efetora e central. Para tal, foi realizado um estudo comparativo da importância dos linfócitos T, e alterações das células Treg na infecção experimental por T. cruzi, de animais susceptíveis (C57Bl/6) e resistentes (BALB/c) nos dias 10, 20 e 30 apos a infecção. Adicionalmente, com o objetivo de investigar o papel das células T reguladoras, foi realizada a neutralização da citocina IL-2, com o tratamento in vivo com anti-IL-2 monoclonal (clone JES6-1A12), em animais C57Bl/6, durante a infecção com a cepa Tulahuen de T. cruzi. A análise da cinética de infecção (10, 20 e 30 dias) revelou que os animais resistentes (BALB/c) apresentaram maior expansão de células T efetoras CD4+ e CD8+ no baço e no tecido muscular esquelético. Os dados coletados demonstram que o tratamento com anti-IL-2 resultou em diminuição significativa da população de células T CD4+CD25+Foxp3+ nos animais infectados, comparado ao grupo infectado e tratado com imunoglobulina de rato. A diminuição das células Treg nestes animais resultou em alterações importantes nos mecanismos efetores como, por exemplo: o aumento da expansão das células T CD4+ e CD8+ efetoras e a produção de citocinas pró-inflamatórias e anti-inflamatórias no baço e tecido muscular esquelético. O reflexo destas alterações foi relacionado à diminuição da parasitemia e da mortalidade dos animais. Desta forma, as células Treg parecem exercer um controle da resposta imune efetora ao T. cruzi no sentido de tentar controlar a disseminação do patógeno e, ao mesmo tempo, impedir a destruição tecidual decorrente de uma exacerbação da resposta imune. Portanto, sugere-se que as células Treg estariam participando da resposta imune ao T. cruzi no sentido de modular a resposta imune efetora. / The Trypanosoma cruzi (T. cruzi) infection results in an immune response that controls the parasite prevalence, but is unable to eliminate it completely, leading to infection persistence. The severity of Chagas’ disease is correlated with the parasite persistence in the muscle, neural and bowel tissues. The immunorregulatory function of regulatory T cells in limiting the immune response could be exploited in order to verify its quantity and functional activities in an experimental model of T. cruzi infection. The main objective of this project was to study the participation and influence of Treg lymphocytes on the mechanisms of resistance to T. cruzi infection, mainly on generation and maintenance of central/effector memory T cells. In the first step, it was conducted a comparative study of the importance of T lymphocytes and alterations of Treg cells in experimental T. cruzi infection in susceptible (C57BL/6) and resistant (BALB/c) animals for 10, 20 and 30 days of infection. Additionally, in order to investigate the role of regulatory T cells, it was performed the neutralization of the cytokine IL-2, with the in vivo treatment with anti-IL-2 monoclonal antibody (clone JES6-1A12) of C57Bl/6 animals during infection with Tulahuen strain of T. cruzi. The analysis of the kinetics of infection (10, 20 and 30 days) revealed that the resistant animals (BALB/c) showed greater expansion and effector activity of the CD4+ and CD8+ splenic T cells and skeletal muscle tissue. The collected data demonstrate that the treatment with anti-IL-2 resulted in significant reduction of CD4+CD25+Foxp3+ T cells population in infected animals, compared to those infected and untreated. The decrease of Treg cells in those animals resulted in significant changes in the effector mechanisms such as: an increase in expansion of CD4+ and CD8+ T effector cells, and production of pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokines in the spleen and skeletal muscle tissue. The reflection of these changes was verified by the decrease in parasitemia and mortality of the animals. Thus, Treg cells seem to have control of the effector immune response to T. cruzi in trying to control the spread of the pathogen and, at the same time, preventing tissue destruction due to an exacerbation of the immune response. Therefore, it is suggested that Treg cells would be participating in the immune response to T. cruzi by modulating the effector immune response.

Diversos dados na literatura têm demonstrado a participação de linfócitos B-1 em diferentes fenômenos imunológicos, tanto na resposta imune inata quanto na resposta imune adaptativa. Para melhor entendermos a ativação da resposta imune eficaz contra fungos patogênicos, pesquisamos a interação entre os linfócitos B-1 e o Paracoccidioides brasiliensis (P. brasiliensis), uma vez que este expressa moléculas antigênicas que podem ser reconhecidas pelo sistema imune. Utilizamos preparação antigênica do P. brasiliensis obtida de sua superfície leveduriforme denominada de CFA (antígeno livre da parede do fungo) e células leveduriforme do fungo. Observou-se que a maioria das células do sobrenadante da cultura celular de 4 dias de células totais aderentes peritoneais eram constituídos por linfócitos B-1; estas células expressam altos níveis de MHC-II (100%) e CD80 (90%). Contudo, não houve expressão significativa da molécula co-estimuladora CD86. Pela análise fenotípica, os linfócitos B-1 podem atuar como células apresentadoras de antígeno pois expressam CD80, CD86 e MHC-II; então realizamos o ensaio de proliferação celular utilizando linfócitos B-1 como células apresentadoras de antígenos e observamos proliferação celular de linfócitos TCD4+ significativa. Em relação às citocinas, analisamos a secreção de IL-10 e TNF-α do sobrenadante da cultura de linfócitos B-1 sem nenhum estímulo e observamos que estas células secretam tanto IL-10 quanto TNF-α; após estímulo de CFA, os valores aumentam significantemente. Analisamos a expressão de TLR-2, TLR-4, MyD88 e IL-10, por RT-PCR, dos linfócitos B-1 na presença de CFA. Encontramos expressão de TLR-2, MyD88 e IL-10 nas células com e sem estímulo. Analisamos a migração dos linfócitos B-1 da cavidade peritoneal de camundongos BALB/c após estímulo intraperitoneal (ip) com leveduras de PB. Decorridas 5 horas, foi observada grande diminuição dos linfócitos B-1 na cavidade peritoneal, que permanecia por 24 horas e 7 dias pós-infecção. Para melhor compreendermos a migração dos linfócitos B-1, foram utilizados camundongos CBA/N Xid (desprovidos de linfócitos B-1), cujo o peritônio foi reconstituído com linfócitos B-1, sendo infectados ip com leveduras de P brasiliensis. Os resultados demonstram que, após a infecção, os linfócitos B-1 migram da cavidade peritoneal para o baço. Também, observou-se aumento no número de células T com fenótipo de célula regulatória (CD4+CD25+Foxp3+). Nossos resultados sugerem que a elevada produção de IL-10 por células B-1, mediada provavelmente pela ligação de TLR-2, juntamente com a capacidade dos linfócitos B-1 em ativar linfócitos T, com a capacidade de migrar do peritônio para o baço e ativar células T regulatórias, poderia favorecer a sobrevivência do fungo no hospedeiro. / Innumerous data published in the literature have shown the involvement of B-1 cells in different immunological phenomena, both in the innate immnune response and the adaptive immune response. To better understand the activation of effective immune response against pathogenic fungi, we researched the interaction between B-1 cells and Paracoccidioides brasiliensis (P. brasiliensis), since it expresses that antigenic molecules can be recognized by the immune system. We used antigenic preparation of P. brasiliensis obtained from the surface of yeast called CFA (cell free antigen) and yeast cells of the fungus. It was observed that most cells in the cell culture supernatant 4 days of total adherent peritoneal cells consisted of B-1 cells, these cells express high levels of MHC-II (100%) and CD80 (90%). However, no significant expression of co-stimulatory molecule CD86 was observed. After phenotypic analysis, the B-1 cells can act as anyigen-presenting cells because they express C80, CD86 and MHC-II, then realized proliferation assay using B-1 cells as antigen presenting cells inducing was performed, and our results showed the significant proliferation of CD4 T cells. Regarding cytokines, we analyzed the IL-10 secretion and TNF-α in culture supernatant of B-1 cells without stimulation and found that these cells secrete both IL-10 and TNF-α, after stimulation of CFA. We analyzed the expression of TLR-2, TLR-4, MyD88 and IL-10 by RT-PCR, of the B-1 cells in the presence of CFA. We found expression of TLR-2, MyD88 and IL-10 cells with and without stimulus. We analyzed the migration of peritoneal B-1 cells after intraperitoneal (ip) infection with yeast from P. brasiliensis. After 5 hours, high decrease of B-1 cells in the peritoneal cavity was observed, which remained for 24 hours and 7 days post-infection. To better understand the migration of B-1 cells, we used mice CBA/N Xid (destitute of B-1 cells), reconstituted with B-1 cells, and infected with yeast P. brasiliensis. The results show that after the infection, the B-1 cells migrate from the peritoneal cavity to the spleen. Also, there was an increase in the number of T cells with regulatory cell phenotype (CD4+CD25+Foxp3+). Our results suggest that high production of IL-10 by B-1 cells, probably mediated by the binding of TLR-2, along with the ability of B-1 cells in activating T lymphocytes, with the ability to migrate from the peritoneum to the spleen and activate T regulatory cells, could favor the survival of the fungus in the host.

Linfomas pertencem a um grupo de neoplasias que tem em comum a origem em células linforreticulares, sendo a forma anatômica gastrointestinal a mais prevalente na espécie felina. A maioria dos animais responde inicialmente ao tratamento, contudo, sabe-se que o desequilíbrio no sistema imune, de modo geral, pode facilitar a ocorrência e a disseminação das neoplasias. Para equilibrar a atividade do sistema imune, as células com função regulatória (Tregs) são fundamentais e por isso, alvo de diversas pesquisas isoladamente ou associadas a outros marcadores, como a IL-17A e o CD8, já que tanto as Tregs quanto os linfócitos Th17 originam-se de uma mesma célula T progenitora. Assim, alterações na relação Treg/Th17 podem levar à supressão na produção de linfócitos T CD8, invertendo a relação Tregs/CD8. Também há indícios de que as Tregs alterem a função efetora de células T contra neoplasias em seres humanos e em cães. Foram objetivos deste estudo avaliar as características do linfoma gastrointestinal em felinos, a proliferação celular por meio do índice mitótico e do marcador Ki-67, a expressão imunoistoquímica de CD4, CD8, CD25 (IL-2R), FOXP3 e IL-17A e correlacionar a expressão desses marcadores com o tipo celular, imunofenótipo, resposta ao tratamento e sobrevida global. Para análise estatística foram utilizados os testes de Mann-Whitney, Kruskal-Wallis, Quiquadrado de Pearson, de correlação de Spearman e a curva Kaplan-Meyer. Dos 47 gatos, 85% apresentaram a forma linfocítica de células T, com mediana de sobrevida de 24 meses; 15% apresentaram a forma linfoblástica de células B ou T, com mediana de sobrevida de 5 meses. A expressão de Ki-67 foi mais evidente naqueles pacientes com linfoma linfoblástico de células B ou T se comparado ao linfocítico de células T, com mediana de 40,5% e 8,2%, respectivamente e p=0,002. Na análise dos marcadores do sistema imune, não foi observada marcação de IL-2R. Não houve diferença significante na expressão de IL-17 e FOXP3 entre os tipos celulares e imunofenótipo, bem como não houve correlação entre FOXP3 e IL-17 e entre FOXP3 e CD8. Considerando somente os casos de linfoma linfocítico de células T, na análise do padrão de remissão parcial (n=12) versus completa (n=27), constatou-se diferença significante quanto à sobrevida (p&lt;0,0001) e CD8 (p&#61;0,015). Na análise de sobrevida, o tratamento com L-asparaginase, clorambucil e prednisolona, os níveis de albumina sérica iguais ou maiores que 2,5g/dL e o ganho de peso no início do tratamento foram preditores de maior tempo de sobrevida. Pode-se concluir que o linfoma linfocítico de células T foi o mais prevalente na espécie felina, envolvendo principalmente o intestino delgado e com um tempo mediano de sobrevivência de 24 meses; a expressão de ki-67 foi melhor marcador para determinar a proliferação celular se comparada ao índice mitótico; a expressão de FOXP3 foi baixa e não se relacionou à resposta terapêutica e ao tempo de sobrevida. Na análise específica dos casos de linfoma linfocítico de células T, não houve correlação entre FOXP3/IL-17 e FOXP3/CD8, enquanto que a baixa expressão de CD8 correlacionou-se a maior sobrevida naqueles pacientes em remissão completa / Lymphomas belong to a group of neoplasia that have in common the origin in lymphoreticular cells, and gastrointestinal is the most prevalent anatomical form in feline species. Most animals initially respond to treatment, however, it is known that the imbalance in the immune system generally may facilitate the occurrence and spread of tumors. To balance the activity of immune system, cells with regulatory function (Treg) are essential and therefore the target of many researches, alone or in combination with other markers such as IL-17A and CD8, as well Tregs as Th17 lymphocytes originate from a same progenitor T-cell. Thus, the relation between Treg / Th17 is important since changes in this relation can lead to suppressed production of CD8&#43; T lymphocytes, inverting the relation Treg/CD8. There is also evidence that Tregs alter the effector function of T cells against tumors in human beings and dogs. The objectives of this study was to evaluate the characteristics of gastrointestinal (GI) lymphoma in cats, cell proliferation by mitotic index and Ki-67 marker, immunohistochemical expression of CD4, CD8, CD25 (IL-2R), FOXP3 and IL-17A and correlate the expression of these markers on the cell-type, immunophenotype, response to treatment and overall survival. Statistical analysis was performed by Mann-Whitney test, Kruskal-Wallis test, Pearson\'s Chi-squared test, Spearman correlation and Kaplan-Meier curve. Of the 47 cats, 85% showed lymphocytic T cells, with a median survival of 24 months; and 15% had lymphoblastic B or T cells, with a median survival of 5 months. Ki-67 expression was most evident in patients with lymphoblastic B- or T-cell lymphoma compared to lymphocytic T cell lymphoma, with a median of 40.5% and 8.2%, respectively and p &#61 0.002. In the analysis of immune system markers, immunostaing was not observed IL-2R. There was no significant difference in IL-17A and FOXP3 expression between cell-type and immunophenotypes, as well as no correlation between FOXP3 and IL-17A and between FOXP3 and CD8. Considering only the cases of lymphocytic T-cell lymphoma, there was a significant difference in survival time (p <0.0001) and CD8 expression (p &#61; 0.015) considering partial (n &#61; 12) versus complete remission (n &#61; 27). In survival analysis, treatment A (L-asparaginase, chlorambucil and prednisolone), as well as serum albumin levels equal or higher than 2.5g/dL and weight gain after 30 days of treatment were predictive of increased survival time. As conclusion, lymphocytic T-cell lymphoma was more prevalent in feline species, mainly involving the small intestine and with a median survival of 24 months. Ki-67 expression was better marker to determine cell proliferation than mitotic index. FOXP3 expression was low and did not correlate to therapeutic response and survival time in GI lymphoma. In the specific analysis of lymphocytic T-cell lymphoma, there was no correlation between FOXP3/IL-17A and FOXP3/CD8, while low CD8 expression was correlated with increased survival in patients in complete remission

Linfomas pertencem a um grupo de neoplasias que tem em comum a origem em células linforreticulares, sendo a forma anatômica gastrointestinal a mais prevalente na espécie felina. A maioria dos animais responde inicialmente ao tratamento, contudo, sabe-se que o desequilíbrio no sistema imune, de modo geral, pode facilitar a ocorrência e a disseminação das neoplasias. Para equilibrar a atividade do sistema imune, as células com função regulatória (Tregs) são fundamentais e por isso, alvo de diversas pesquisas isoladamente ou associadas a outros marcadores, como a IL-17A e o CD8, já que tanto as Tregs quanto os linfócitos Th17 originam-se de uma mesma célula T progenitora. Assim, alterações na relação Treg/Th17 podem levar à supressão na produção de linfócitos T CD8, invertendo a relação Tregs/CD8. Também há indícios de que as Tregs alterem a função efetora de células T contra neoplasias em seres humanos e em cães. Foram objetivos deste estudo avaliar as características do linfoma gastrointestinal em felinos, a proliferação celular por meio do índice mitótico e do marcador Ki-67, a expressão imunoistoquímica de CD4, CD8, CD25 (IL-2R), FOXP3 e IL-17A e correlacionar a expressão desses marcadores com o tipo celular, imunofenótipo, resposta ao tratamento e sobrevida global. Para análise estatística foram utilizados os testes de Mann-Whitney, Kruskal-Wallis, Quiquadrado de Pearson, de correlação de Spearman e a curva Kaplan-Meyer. Dos 47 gatos, 85% apresentaram a forma linfocítica de células T, com mediana de sobrevida de 24 meses; 15% apresentaram a forma linfoblástica de células B ou T, com mediana de sobrevida de 5 meses. A expressão de Ki-67 foi mais evidente naqueles pacientes com linfoma linfoblástico de células B ou T se comparado ao linfocítico de células T, com mediana de 40,5% e 8,2%, respectivamente e p=0,002. Na análise dos marcadores do sistema imune, não foi observada marcação de IL-2R. Não houve diferença significante na expressão de IL-17 e FOXP3 entre os tipos celulares e imunofenótipo, bem como não houve correlação entre FOXP3 e IL-17 e entre FOXP3 e CD8. Considerando somente os casos de linfoma linfocítico de células T, na análise do padrão de remissão parcial (n=12) versus completa (n=27), constatou-se diferença significante quanto à sobrevida (p&lt;0,0001) e CD8 (p&#61;0,015). Na análise de sobrevida, o tratamento com L-asparaginase, clorambucil e prednisolona, os níveis de albumina sérica iguais ou maiores que 2,5g/dL e o ganho de peso no início do tratamento foram preditores de maior tempo de sobrevida. Pode-se concluir que o linfoma linfocítico de células T foi o mais prevalente na espécie felina, envolvendo principalmente o intestino delgado e com um tempo mediano de sobrevivência de 24 meses; a expressão de ki-67 foi melhor marcador para determinar a proliferação celular se comparada ao índice mitótico; a expressão de FOXP3 foi baixa e não se relacionou à resposta terapêutica e ao tempo de sobrevida. Na análise específica dos casos de linfoma linfocítico de células T, não houve correlação entre FOXP3/IL-17 e FOXP3/CD8, enquanto que a baixa expressão de CD8 correlacionou-se a maior sobrevida naqueles pacientes em remissão completa / Lymphomas belong to a group of neoplasia that have in common the origin in lymphoreticular cells, and gastrointestinal is the most prevalent anatomical form in feline species. Most animals initially respond to treatment, however, it is known that the imbalance in the immune system generally may facilitate the occurrence and spread of tumors. To balance the activity of immune system, cells with regulatory function (Treg) are essential and therefore the target of many researches, alone or in combination with other markers such as IL-17A and CD8, as well Tregs as Th17 lymphocytes originate from a same progenitor T-cell. Thus, the relation between Treg / Th17 is important since changes in this relation can lead to suppressed production of CD8&#43; T lymphocytes, inverting the relation Treg/CD8. There is also evidence that Tregs alter the effector function of T cells against tumors in human beings and dogs. The objectives of this study was to evaluate the characteristics of gastrointestinal (GI) lymphoma in cats, cell proliferation by mitotic index and Ki-67 marker, immunohistochemical expression of CD4, CD8, CD25 (IL-2R), FOXP3 and IL-17A and correlate the expression of these markers on the cell-type, immunophenotype, response to treatment and overall survival. Statistical analysis was performed by Mann-Whitney test, Kruskal-Wallis test, Pearson\'s Chi-squared test, Spearman correlation and Kaplan-Meier curve. Of the 47 cats, 85% showed lymphocytic T cells, with a median survival of 24 months; and 15% had lymphoblastic B or T cells, with a median survival of 5 months. Ki-67 expression was most evident in patients with lymphoblastic B- or T-cell lymphoma compared to lymphocytic T cell lymphoma, with a median of 40.5% and 8.2%, respectively and p &#61 0.002. In the analysis of immune system markers, immunostaing was not observed IL-2R. There was no significant difference in IL-17A and FOXP3 expression between cell-type and immunophenotypes, as well as no correlation between FOXP3 and IL-17A and between FOXP3 and CD8. Considering only the cases of lymphocytic T-cell lymphoma, there was a significant difference in survival time (p <0.0001) and CD8 expression (p &#61; 0.015) considering partial (n &#61; 12) versus complete remission (n &#61; 27). In survival analysis, treatment A (L-asparaginase, chlorambucil and prednisolone), as well as serum albumin levels equal or higher than 2.5g/dL and weight gain after 30 days of treatment were predictive of increased survival time. As conclusion, lymphocytic T-cell lymphoma was more prevalent in feline species, mainly involving the small intestine and with a median survival of 24 months. Ki-67 expression was better marker to determine cell proliferation than mitotic index. FOXP3 expression was low and did not correlate to therapeutic response and survival time in GI lymphoma. In the specific analysis of lymphocytic T-cell lymphoma, there was no correlation between FOXP3/IL-17A and FOXP3/CD8, while low CD8 expression was correlated with increased survival in patients in complete remission

Diversos dados na literatura têm demonstrado a participação de linfócitos B-1 em diferentes fenômenos imunológicos, tanto na resposta imune inata quanto na resposta imune adaptativa. Para melhor entendermos a ativação da resposta imune eficaz contra fungos patogênicos, pesquisamos a interação entre os linfócitos B-1 e o Paracoccidioides brasiliensis (P. brasiliensis), uma vez que este expressa moléculas antigênicas que podem ser reconhecidas pelo sistema imune. Utilizamos preparação antigênica do P. brasiliensis obtida de sua superfície leveduriforme denominada de CFA (antígeno livre da parede do fungo) e células leveduriforme do fungo. Observou-se que a maioria das células do sobrenadante da cultura celular de 4 dias de células totais aderentes peritoneais eram constituídos por linfócitos B-1; estas células expressam altos níveis de MHC-II (100%) e CD80 (90%). Contudo, não houve expressão significativa da molécula co-estimuladora CD86. Pela análise fenotípica, os linfócitos B-1 podem atuar como células apresentadoras de antígeno pois expressam CD80, CD86 e MHC-II; então realizamos o ensaio de proliferação celular utilizando linfócitos B-1 como células apresentadoras de antígenos e observamos proliferação celular de linfócitos TCD4+ significativa. Em relação às citocinas, analisamos a secreção de IL-10 e TNF-&#945; do sobrenadante da cultura de linfócitos B-1 sem nenhum estímulo e observamos que estas células secretam tanto IL-10 quanto TNF-&#945;; após estímulo de CFA, os valores aumentam significantemente. Analisamos a expressão de TLR-2, TLR-4, MyD88 e IL-10, por RT-PCR, dos linfócitos B-1 na presença de CFA. Encontramos expressão de TLR-2, MyD88 e IL-10 nas células com e sem estímulo. Analisamos a migração dos linfócitos B-1 da cavidade peritoneal de camundongos BALB/c após estímulo intraperitoneal (ip) com leveduras de PB. Decorridas 5 horas, foi observada grande diminuição dos linfócitos B-1 na cavidade peritoneal, que permanecia por 24 horas e 7 dias pós-infecção. Para melhor compreendermos a migração dos linfócitos B-1, foram utilizados camundongos CBA/N Xid (desprovidos de linfócitos B-1), cujo o peritônio foi reconstituído com linfócitos B-1, sendo infectados ip com leveduras de P brasiliensis. Os resultados demonstram que, após a infecção, os linfócitos B-1 migram da cavidade peritoneal para o baço. Também, observou-se aumento no número de células T com fenótipo de célula regulatória (CD4+CD25+Foxp3+). Nossos resultados sugerem que a elevada produção de IL-10 por células B-1, mediada provavelmente pela ligação de TLR-2, juntamente com a capacidade dos linfócitos B-1 em ativar linfócitos T, com a capacidade de migrar do peritônio para o baço e ativar células T regulatórias, poderia favorecer a sobrevivência do fungo no hospedeiro. / Innumerous data published in the literature have shown the involvement of B-1 cells in different immunological phenomena, both in the innate immnune response and the adaptive immune response. To better understand the activation of effective immune response against pathogenic fungi, we researched the interaction between B-1 cells and Paracoccidioides brasiliensis (P. brasiliensis), since it expresses that antigenic molecules can be recognized by the immune system. We used antigenic preparation of P. brasiliensis obtained from the surface of yeast called CFA (cell free antigen) and yeast cells of the fungus. It was observed that most cells in the cell culture supernatant 4 days of total adherent peritoneal cells consisted of B-1 cells, these cells express high levels of MHC-II (100%) and CD80 (90%). However, no significant expression of co-stimulatory molecule CD86 was observed. After phenotypic analysis, the B-1 cells can act as anyigen-presenting cells because they express C80, CD86 and MHC-II, then realized proliferation assay using B-1 cells as antigen presenting cells inducing was performed, and our results showed the significant proliferation of CD4 T cells. Regarding cytokines, we analyzed the IL-10 secretion and TNF-&#945; in culture supernatant of B-1 cells without stimulation and found that these cells secrete both IL-10 and TNF-&#945;, after stimulation of CFA. We analyzed the expression of TLR-2, TLR-4, MyD88 and IL-10 by RT-PCR, of the B-1 cells in the presence of CFA. We found expression of TLR-2, MyD88 and IL-10 cells with and without stimulus. We analyzed the migration of peritoneal B-1 cells after intraperitoneal (ip) infection with yeast from P. brasiliensis. After 5 hours, high decrease of B-1 cells in the peritoneal cavity was observed, which remained for 24 hours and 7 days post-infection. To better understand the migration of B-1 cells, we used mice CBA/N Xid (destitute of B-1 cells), reconstituted with B-1 cells, and infected with yeast P. brasiliensis. The results show that after the infection, the B-1 cells migrate from the peritoneal cavity to the spleen. Also, there was an increase in the number of T cells with regulatory cell phenotype (CD4+CD25+Foxp3+). Our results suggest that high production of IL-10 by B-1 cells, probably mediated by the binding of TLR-2, along with the ability of B-1 cells in activating T lymphocytes, with the ability to migrate from the peritoneum to the spleen and activate T regulatory cells, could favor the survival of the fungus in the host.

Carrapatos são artrópodes hematófagos de distribuição cosmopolita que têm grande importância médica e veterinária devido ao efeito deletério direto causado por se fixarem e sugarem seus hospedeiros, como também por serem importantes vetores de doenças para o homem e para os animais domésticos. Sabendo que carrapatos permanecem fixos em seus hospedeiros por longos períodos de tempo sem serem rejeitados, é possível inferir que esses ácaros possuam um arsenal de mecanismos que atuem no controle da resposta imune do hospedeiro. De fato, diversos trabalhos têm demonstrado que carrapatos são capazes de modular a resposta imune de seus hospedeiros através de componentes presentes na saliva, que são inoculados durante o repasto sangüíneo. Assim, este trabalho procurou investigar se carrapatos exercem a modulação da resposta imune do hospedeiro através do recrutamento de células T regulatórias CD4+CD25+ (Tregs), com a intenção de conter uma resposta inflamatória / imune prejudicial à sua alimentação. Para isso, células isoladas de amostras de pele e linfonodos de camundongos BALB/c infestados com carrapatos Rhipicephalus sanguineus foram analisadas quanto à expressão das moléculas de superfície CD4, CD25, CTLA-4, CD45RB, GITR e CD103 (fenótipo de células Tregs), por citometria de fluxo. Adicionalmente, as células obtidas dos linfonodos foram avaliadas quanto à expressão de mensagem para o fator de transcrição Foxp3 (característico da função regulatória), por PCR quantitativo. Paralelamente, saliva de R. sanguineus foi inoculada na orelha de animais da mesma linhagem, a fim de se comparar o infiltrado celular com o obtido na pele dos camundongos infestados com carrapatos. Os resultados mostraram que as infestações não alteraram a percentagem de células T CD4+CD25+ nem a expressão de moléculas associadas ao fenótipo de células Tregs nas células infiltradas na lesão de fixação dos carrapatos ou nos linfonodos em comparação a camundongos controles. Também não se verificou aumento da expressão do gene para Foxp3 nos linfonodos em nenhum dos grupos analisados. Por outro lado, a inoculação de saliva na orelha de camundongos induziu um aumento significativo da população de células T CD4+, porém estas também não apresentavam fenótipo regulatório, sugerindo que o mecanismo de imunomodulação exercido pelos carrapatos sobre seus hospedeiros não é mediado por essas células. Resultados adicionais mostraram que a saliva de carrapatos reduziu significativamente a percentagem de células dendríticas nas orelhas dos camundongos, sugerindo que carrapatos podem estar modulando a resposta imune de seus hospedeiros por diminuírem o repovoamento da pele com células dendríticas, as quais são essenciais na vigilância imune dos tecidos periféricos. / Ticks are bloodsucking arthropods that feed on vertebrates and are responsible for serious global economic losses both through the effects of blood sucking and as vectors of pathogens. A tick?s bloodmeal lasts for several days, during which it remains fixed to the host and avoids rejection by local inflammatory and immunological reactions. This status is achieved by the escape mechanisms ticks have evolved. In fact, many studies have demonstrated that ticks modulate the host immune response through salivary compounds inoculated during their bloodmeals. This study investigated if during bloodfeeding ticks can recruit regulatory T cells in an attempt to modulate the host immune response and to control inflammatory responses that could be harmful to tick feeding. BALB/c mice were infested with Rhipicephalus sanguineus, the skin at feeding sites and the regional lymph nodes were collected, and the cells forming the local infiltrates were analyzed by flow cytometry for simultaneous expression of CD4, CD25, CTLA-4, CD45RB, GITR and CD103 molecules. Additionally, expression of mRNA for Foxp3 was measured in the lymph node cells. Tick saliva was also inoculated into the ears of BALB/c mice in order to compare the local cellular infiltrate with that elicited by artificial infestation. Control animals were sham infested. The results show that, relative to sham-infested tissues, tick infestations did not alter the percentage of CD4+CD25+ T cells present at the site of their attachment or in draining lymph nodes. Infestations also did not increase the expression of Foxp3 in skin and lymph nodes. On the other hand, saliva inoculated into the ear induced a significant increase in the number of CD4+ T lymphocytes recruited to the site of inoculation, although these cells did not express a regulatory phenotype. These results suggest that the modulation of the host immune response by ticks does not involve CD4+CD25+ T cells. Additional results showed that tick saliva reduced the percentage of dendritic cells in the skin of infested mice. This finding indicates that ticks may modulate the host immune response by diminishing the repopulation of skin with dendritic cells, which are essential for maintaining surveillance of peripheral tissues for incoming antigens.