Made available in DSpace on 2016-02-26T13:34:39Z (GMT). No. of bitstreams: 2 melise_silveira_ioc_mest_2014.pdf: 2936486 bytes, checksum: f73183e180b237b1d6dc63c0c0afa155 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016-02-23 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / O surgimento de bactérias Gram-negativas resistentes à drogas tem sido progressivo e alarmante. Entre os patógenos de particular importância está Pseudomonas aeruginosa multirresistentes à drogas (MDR). Um clone epidêmico de P. aeruginosa MDR produtor da metalo-\03B2-lactamase SPM-1, chamado clone SP (ST277), tem sido encontrado em diferentes estados brasileiros. O gene blaSPM-1 foi descrito em uma estrutura genética chamada ISCR4, responsável pela sua mobilização e expressão. Além do gene blaSPM-1, tem sido descrito, neste clone, a presença de um integron de classe I carreando genes de resistência (In163) e um elemento genético ISCR14 carreando uma metilase de RNAr 16S (rmtD), que confere resistência a altas concentrações de aminoglicosídeos. Este tipo de associação resulta em um perfil de resistência extremamente preocupante. Assim, este estudo teve como objetivo investigar a contexto genético dos genes blaSPM-1 e rmtD, além de caracterizar mutações em genes cromossomais associados a multirresistência a antimicrobianos em amostras de P. aeruginosa pertencentes ao clone ST277, através de Sourthen blot e sequenciamento de nova geração. A partir de 50 amostras de P. aeruginosa MDR isoladas entre 2007 e 2010, foram selecionadas 13 amostras pertencentes ao ST277 (através de MLST) que apresentaram positividade para blaSPM-1 e/ou rmtD e In163 (através de PCR), sendo 12 do clone SP (A) e uma de um clone diferente, M, através de PFGE. Através de restrição do DNA com as enzimas de restrição SpeI e XbaI, e posterior hibridação com sondas dos genes alvos (blaSPM-1, rmtD e In163) foi possível observar que os genes alvos encontravam-se em fragmentos distintos e que a amostra do clone M apresentou um perfil de hibridação diferentes das demais amostras demonstrando a ocorrência de vários rearranjos na mesma, indicando uma maior distância evolutiva A partir destes resultados, selecionamos 6 amostras para sequenciamento total do genoma utilizando a plataforma de sequenciamento MiSeq da Illumina. Através de sucessivas análises - que incluíram os contigs gerados na montagem de novo, montagens por referência e alinhamentos par a par- chegamos a uma região de 239.648pb onde estavam contidos o In163 e o ISCR14 carreando rmtD, inseridos em uma ilha genômica incorporada ao cromossomo bacteriano. O gene blaSPM-1 inserido no ISCR4 foi encontrado em uma região de 13.959pb, que incluía genes relacionados a plasmídios e transposons, contudo ainda não sabemos se esse elemento está incorporado ao cromossomo, ou livre em forma de plasmídio. Através da análise das mutações em genes cromossômicos associados a resistência à antimicrobianos, encontramos mutações nos genes oprD, ampD, mexZ, mexS, mexT, gyrA e parC que foram comuns às 6 amostras sequenciadas do ST277. Isso explicaria o fenótipo MDR nas amostras negativas para rmtD e/ou blaSPM-1. Além disso, como estas amostras foram isoladas em estados e anos distintos, acreditamos que essas mutações sejam características do ST277, o que pode ser um dos fatores associados a distribuição epidêmica deste clone no Brasil / The development of antimicrobial resistance among Gram - negative pathogens has been progressive and relentless. A pathogen of particular concern is multidrug - resistant (MDR) Pseudomonas aeruginosa . An epidemic clone of MDR P. aeruginosa producing the metall o - β - lactamase SPM - 1, named SP clone (ST277), has been found in different Brazilian states. The bla SPM - 1 gene has been described in a genetic structure called ISCR4, responsible for its mobilization and expression. Besides the bla SPM - 1 gene, it has been des cribed in this clone, a classe I integron (In163) carrying resistance genes and the genetic element ISCR14 carrying a 16S rRNA metilase ( rmtD ), that confers resistance to high concentrations of aminoglycosides. This kind of association results in an extrem ely worrisome profile of resistance. Thus, this work aimed to investigate the genetic background of bla SPM - 1 and rmtD genes and to characterize mutations in chromosomal genes associated with multidrug resistance in P. aeruginosa isolates belonging to ST277 clone, using Sourthen blot and next - generation sequencing. From 50 MDR P. aeruginosa isolates recovered from 2007 to 2010,there were selected 13 bla SPM - 1 and /or rmtD - positive isolates (by PCR) belonging to ST277 (by MLST), 12 f rom SP (A) clone and one from a different PFGE clone (M). By DNA digestion with Spe I and Xba I restriction enzymes, and subsequent hybridization with probes for target genes ( bla SPM - 1 , rmtD and In163 ), it was observed that the target genes were in separate fragments, and that the M clone isolate showed a different profile compared with the other isolates, indicating various rearrangements, suggesting a greater evolutionary distance. With these results, 6 isolates were selected for whole genome sequencing by Illumina MiSeq platform. Through successive analyzes – which included de novo assembly contigs, map to reference assemblies and pairwise alignments - we came up to a 239648pb region containing the In163 and ISCR14 inserted into a genomic island incorporated into bacterial chromosome. The bla SPM - 1 gene was inserted into ISCR4, found in a 13950pb region, which included genes related to plasmids and transposons, however we do not know whether this element s chromosomal or plasmidial . Through analysis of chromoso mal genes mutations associated with multidrug resistance, we found mutations in oprD, ampD, mexZ, mexS, mexT, gyrA e parC genes, which were common to the 6 ST277 isolates sequenced. This would explain the MDR phenotype in bla SPM - 1 and/or rmtD negative isol ates. Furthermore, since these microorganisms were isolated in different years and states, we believe these mutations are ST277 characteristic, which may be one of the factors associated with the epidemic characteristics of this clone

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, 2006. / Submitted by Fernanda Weschenfelder (nandaweschenfelder@gmail.com) on 2009-11-05T14:48:13Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao Lucia Passarinho.pdf: 248951 bytes, checksum: 898f767b3cd88f3b5f4338eac121dd9d (MD5) / Approved for entry into archive by Gomes Neide(nagomes2005@gmail.com) on 2010-11-05T12:52:14Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertacao Lucia Passarinho.pdf: 248951 bytes, checksum: 898f767b3cd88f3b5f4338eac121dd9d (MD5) / Made available in DSpace on 2010-11-05T12:52:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Lucia Passarinho.pdf: 248951 bytes, checksum: 898f767b3cd88f3b5f4338eac121dd9d (MD5) Previous issue date: 2006 / INTRODUÇÃO: Mesmo com a Constituição brasileira definindo o país como um Estado laico, observa-se grande dificuldade de transição entre o Estado confessional, seguido até o Século XIX, e a secularidade pública hoje requerida. OBJETIVO: Estudar as implicações religiosas relacionadas com as Propostas de Emenda Constitucional (PECs) e Projetos de Lei (PLs) e os respectivos apensos, cujos conteúdos estejam relacionados direta ou indiretamente com a temática da clonagem terapêutica humana. METODOLOGIA: Foram analisados as PECs e PLs em tramitação no Congresso Nacional brasileiro entre os anos 2001 e 2005 e que continham as palavras-chave células-tronco, clonagem humana, clonagem terapêutica e embriões humanos. RESULTADOS: Foram identificadas três PECs e cinco PLs neste contexto. Todas as PECs são contrárias ao uso de embriões humanos e definem o início da vida desde a sua concepção. Com relação aos PLs, verifica-se que: um projeto permite o uso de células-tronco por meio da técnica de clonagem terapêutica; um segundo projeto autoriza pesquisas com embriões transferidos para o útero materno e abortados espontaneamente; os três restantes proíbem as pesquisas com embriões humanos em qualquer situação ou estágio de desenvolvimento. DISCUSSÃO: A análise das proposições revelou que dos oito projetos analisados, seis possuem conteúdo que proíbe o uso de embriões humanos, a partir de incisivas justificativas religiosas. Dos dois restantes, um deles permite a clonagem de embriões humanos para fins terapêuticos e o outro abre espaço conciliatório para discussão da matéria. CONCLUSÃO: Todas as três PECs analisadas e três dos cinco PLs apresentam forte conteúdo religioso e nenhuma base científica tanto nos conteúdos legislativos como nos pronunciamentos parlamentares adicionais. O Estado laico deve ser rigorosamente neutro com relação às diferentes confissões religiosas, não permitindo a imposição de valores morais não compartilhados por todos os representantes de uma sociedade pluralística. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / INTRODUCTION: Even though the Brazilian Constitution defines the nation as a laic State, a great difficulty has been observed in the transition from the confessional State, following up to the XIX Century, to the public secularity presently required. OBJECTIVE: To study the religious implications related to the Constitutional Amendment Bills (PEC) and the Legislative Bills (PL), as well as the respective attached documents, which contents are related, either directly or indirectly, to the human therapeutic cloning issue. METHODOLOGY: Both, the PECs and the PLs under consideration in the Brazilian National Congress between 2001 and 2005, which incorporated the keywords: stem cells; human cloning; therapeutic cloning; and human embryos, were analyzed. RESULTS: Three PECs and five PLs were identified within this context. All the PECs are against the use of human embryos defining the onset of live since its conception. As far as the PLs are concerned, it was verified that: one legislative bill allows the use of stem cells by means of the therapeutic cloning technique; the second one authorize research with embryos transferred to the motherly uterus and aborted spontaneously; and the remaining three forbid the research with human embryos in any situation and development stage. DISCUSSION: The analysis of the propositions revealed that, from the eight projects which were investigated, six have contents that forbid the use of human embryos based on incisive religious justifications. From the remaining two, one of them allows the cloning of human embryos for therapeutic purposes and the other opens a space for a conciliatory discussion of the subject. CONCLUSION: All the three PECs analyzed and three of the five PLs presented a strong religious content and no scientific reason, on both the legislation itself as well as the additional parliamentarians’ pronunciations. The laic state must be rigorously neutral regarded to the different religious believes, not allowing the imposition of moral values which are not common sense among all representatives of a pluralistic society.

O produto do gene thi1 de Arabidopsis thaliana está provavelmente envolvido na biossíntese de tiamina (vitamina B1) e na proteção do DNA organelar contra danos. Estudos sobre a biossíntese da tiamina em plantas sugerem uma localização plastidial para este mecanismo, o que está de acordo com a existência de um peptídeo de trânsito cloroplástico (TP) na região N-terminal de THI1. Por outro lado, em leveduras a tiamina é sintetizada em mitocôndrias. Interessantemente, o cDNA de thi1 de A. thaliana complementa uma cepa de levedura com disrupção no gene homólogo thi4. A análise da seqüência de aminoácidos de THI1 revelou a presença de uma região capaz de formar uma estrutura do tipo a-hélice anfifílica, freqüentemente encontrada em preseqüências mitocondriais, localizada logo após o peptídeo de trânsito cloroplástico. O papel desta região na localização da proteína THI1 nas mitocôndrias foi comprovado a partir de ensaios envolvendo construções de genes quiméricos (contendo ou não a putativa seqüência de direcionamento mitocondrial) e um gene repórter (uidA). Estas construções foram introduzidas em plantas de tabaco e a localização da atividade GUS foi determinada nas frações subcelulares das plantas transgênicas. Análise direta da presença de THI1 nas mitocôndrias e cloroplastos de Arabidopsis foi realizada via imunolocalização. Também foram fornecidas evidências que as duas isoformas organelares são codificadas por um único transcrito nuclear. Experimentos de transcrição/tradução in vitro indicaram a ocorrência de dois produtos da tradução a partir de códons de iníciação em fase de leitura. Mutações sítio-específicas na seqüência de thi1 acoplados à experimentos usando a proteína fluorescente verde (GFP) mostraram que a tradução no primeiro AUG determina a localização da proteína nos cloroplastos, enquanto que a tradução no segundo AUG é responsável pelo endereçamento da proteína às mitocôndrias. A análise do contexto para início da tradução revelou que a região em torno do primeiro AUG é mais favorável para a tradução do mRNA de thi1. Além disso, observou-se a presença de uma forte estrutura em "grampo de cabelo" próximo ao segundo códon AUG, indicando um contexto subótimo capaz de interferir na tradução. Estas observações confirmaram os dados obtidos a partir da tradução in vitro na qual a iniciação se dá preferencialmente no primeiro AUG o que pode sugerir uma maior necessidade da proteína nos plastídeos. / Arabidopsis thaliana thi1 gene product is probably involved in both thiamine biosynthesis as well as protection of organellar DNA from damage. Studies of thiamine biosynthesis in plants suggest a plastid location for the pathway, which is in agreement with the predicted THI1 N-terminal chloroplastic transit peptide (TP). On the other hand, thiamine is synthesized in mitochondria in yeast cells. Interestingly, A. thaliana thi1 cDNA complements a yeast strain disrupted for the homologous thi4 gene. Analysis of THI1 amino acid sequence revealed the presence of a putative amphiphilic a-helix, which is typical for mitochondrial presequences, located downstream of the chloroplast transit peptide. The role of this sequence on mitochondrial import has been shown by chimeric gene constructs (carrying or not the putative mitochondrial presequence) and the uidA reporter gene. These constructions have been introduced into tobacco plants and the GUS activity has been measured in subcellular fractions of transgenic plants. Direct analysis of THIp in mitochondria and chloroplasts has been done via ImmunoGold labelling experiments. Additional evidence suggested that the two organellar isoforms were encoded by a single nuclear transcript. In vitro transcription/translation experiments revealed the presence of two translational products by a differential usage of two in-frame translational start codons. Coupling site-specific mutations on THI1 encoding sequence with green fluorescent protein (GFP) gene fusions showed that translation initiation in the first AUG directs translocation of THI1 to plastids. However, when translation initiates from the second AUG THI1 is addressed to mitochondria. Analysis of the translation efficiency of thi1 mRNA revealed that the best context for translation initiation is present at the first AUG. In addition, it has been shown a suboptimal context at the second AUG and a strong stem-and-loop structure which is likely to slow translation. These observation confirm the in vitro translation data in which translation occurs preferentially in the first AUG, what could suggest a higher requirement of the protein in plastids.

Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2012-07-23T17:30:57Z No. of bitstreams: 1 nathalia_p_souza_ioc_bp_0044_2011.pdf: 3450828 bytes, checksum: 39e189593b548a342a469c1a2132d938 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-07-23T17:30:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 nathalia_p_souza_ioc_bp_0044_2011.pdf: 3450828 bytes, checksum: 39e189593b548a342a469c1a2132d938 (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / Os membros da família Trypanosomatidae são parasitos flagelados que podem infectar vertebrados e ou invertebrados, e de acordo com o tipo e número de hospedeiros são classificados como parasitas monoxênicos ou heteroxênicos. Neste trabalho realizamos a comparação da detecção de transcritos entre Trypanosoma cruzi clone CL-Brener, espécie heteroxênica, e Blastocrithidia culicis, como representante dos tripanossomatídeos monoxênicos, ambos submetidos a tensões físicas, químicas e nutricionais. A questão proposta é se duas espécies de tripanossomatídeos com estilos de vida distintos respondem à mesma pressão ambiental (tensão em meio de cultivo) com os mesmos genes. Para tanto foi realizado o crescimento de ambas as espécies em diferentes condições de tensão, como alterações de temperatura, variações de pH, redução de nutrientes do meio, adição de agentes químicos ao meio, entre outros. O perfil dos transcritos, obtidos, através de RT-PCR com iniciador arbitrário selecionado (RNA fingerprinting), foi comparado entre a condição padrão de crescimento (controle) e as condições alteradas entre as duas espécies. Com isso, foram observados comportamentos distintos dos tripanossomatídeos nas condições físicas impostas, como os extremos de temperaturas. Com esta abordagem metodológica que deve apontar os genes que mais respondem as condições de estresse nas células, obtivemos uma representação do momento transcricional dos protozoários. Foram gerados 722 ESTs após o sequenciamento de fragmentos transcritos de T. cruzi e B. culicis sob tensão, além de ESTs da condição padrão (controle) de B. culicis. Foi observada alta transcrição de genes de proteínas de superfície (mucinas, trans-sialidades, gp63, etc) sob tensão tanto em T. cruzi como B. culicis, além de proteínas regulatórias da expressão gênica em menor quantidade. Ambas as espécies apresentaram trans splicing de duas formas diferentes, através da utilização de sítios adicionais (AG), antes da ORF, ou splicing alternativo ao gerar transcritos internos às ORFs. Concluímos com isso que tripanossomatídeos de espécies e estilos de vida distintos compartilham apenas poucos genes quando em condições de estresse. Grande parte dos transcritos mostraram-se específicos para cada espécie. / Os membros da família Trypanosomatidae são parasitos flagelados que podem infectar vertebrados e ou invertebrados, e de acordo com o tipo e número de hospedeiros são classificados como parasitas monoxênicos ou heteroxênicos. Neste trabalho realizamos a comparação da detecção de transcritos entre Trypanosoma cruzi clone CL-Brener, espécie heteroxênica, e Blastocrithidia culicis, como representante dos tripanossomatídeos monoxênicos, ambos submetidos a tensões físicas, químicas e nutricionais. A questão proposta é se duas espécies de tripanossomatídeos com estilos de vida distintos respondem à mesma pressão ambiental (tensão em meio de cultivo) com os mesmos genes. Para tanto foi realizado o crescimento de ambas as espécies em diferentes condições de tensão, como alterações de temperatura, variações de pH, redução de nutrientes do meio, adição de agentes químicos ao meio, entre outros. O perfil dos transcritos, obtidos, através de RT-PCR com iniciador arbitrário selecionado (RNA fingerprinting), foi comparado entre a condição padrão de crescimento (controle) e as condições alteradas entre as duas espécies. Com isso, foram observados comportamentos distintos dos tripanossomatídeos nas condições físicas impostas, como os extremos de temperaturas. Com esta abordagem metodológica que deve apontar os genes que mais respondem as condições de estresse nas células, obtivemos uma representação do momento transcricional dos protozoários. Foram gerados 722 ESTs após o sequenciamento de fragmentos transcritos de T. cruzi e B. culicis sob tensão, além de ESTs da condição padrão (controle) de B. culicis. Foi observada alta transcrição de genes de proteínas de superfície (mucinas, trans-sialidades, gp63, etc) sob tensão tanto em T. cruzi como B. culicis, além de proteínas regulatórias da expressão gênica em menor quantidade. Ambas as espécies apresentaram trans splicing de duas formas diferentes, através da utilização de sítios adicionais (AG), antes da ORF, ou splicing alternativo ao gerar transcritos internos às ORFs. Concluímos com isso que tripanossomatídeos de espécies e estilos de vida distintos compartilham apenas poucos genes quando em condições de estresse. Grande parte dos transcritos mostraram-se específicos para cada espécie.

O produto do gene thi1 de Arabidopsis thaliana está provavelmente envolvido na biossíntese de tiamina (vitamina B1) e na proteção do DNA organelar contra danos. Estudos sobre a biossíntese da tiamina em plantas sugerem uma localização plastidial para este mecanismo, o que está de acordo com a existência de um peptídeo de trânsito cloroplástico (TP) na região N-terminal de THI1. Por outro lado, em leveduras a tiamina é sintetizada em mitocôndrias. Interessantemente, o cDNA de thi1 de A. thaliana complementa uma cepa de levedura com disrupção no gene homólogo thi4. A análise da seqüência de aminoácidos de THI1 revelou a presença de uma região capaz de formar uma estrutura do tipo a-hélice anfifílica, freqüentemente encontrada em preseqüências mitocondriais, localizada logo após o peptídeo de trânsito cloroplástico. O papel desta região na localização da proteína THI1 nas mitocôndrias foi comprovado a partir de ensaios envolvendo construções de genes quiméricos (contendo ou não a putativa seqüência de direcionamento mitocondrial) e um gene repórter (uidA). Estas construções foram introduzidas em plantas de tabaco e a localização da atividade GUS foi determinada nas frações subcelulares das plantas transgênicas. Análise direta da presença de THI1 nas mitocôndrias e cloroplastos de Arabidopsis foi realizada via imunolocalização. Também foram fornecidas evidências que as duas isoformas organelares são codificadas por um único transcrito nuclear. Experimentos de transcrição/tradução in vitro indicaram a ocorrência de dois produtos da tradução a partir de códons de iníciação em fase de leitura. Mutações sítio-específicas na seqüência de thi1 acoplados à experimentos usando a proteína fluorescente verde (GFP) mostraram que a tradução no primeiro AUG determina a localização da proteína nos cloroplastos, enquanto que a tradução no segundo AUG é responsável pelo endereçamento da proteína às mitocôndrias. A análise do contexto para início da tradução revelou que a região em torno do primeiro AUG é mais favorável para a tradução do mRNA de thi1. Além disso, observou-se a presença de uma forte estrutura em "grampo de cabelo" próximo ao segundo códon AUG, indicando um contexto subótimo capaz de interferir na tradução. Estas observações confirmaram os dados obtidos a partir da tradução in vitro na qual a iniciação se dá preferencialmente no primeiro AUG o que pode sugerir uma maior necessidade da proteína nos plastídeos. / Arabidopsis thaliana thi1 gene product is probably involved in both thiamine biosynthesis as well as protection of organellar DNA from damage. Studies of thiamine biosynthesis in plants suggest a plastid location for the pathway, which is in agreement with the predicted THI1 N-terminal chloroplastic transit peptide (TP). On the other hand, thiamine is synthesized in mitochondria in yeast cells. Interestingly, A. thaliana thi1 cDNA complements a yeast strain disrupted for the homologous thi4 gene. Analysis of THI1 amino acid sequence revealed the presence of a putative amphiphilic a-helix, which is typical for mitochondrial presequences, located downstream of the chloroplast transit peptide. The role of this sequence on mitochondrial import has been shown by chimeric gene constructs (carrying or not the putative mitochondrial presequence) and the uidA reporter gene. These constructions have been introduced into tobacco plants and the GUS activity has been measured in subcellular fractions of transgenic plants. Direct analysis of THIp in mitochondria and chloroplasts has been done via ImmunoGold labelling experiments. Additional evidence suggested that the two organellar isoforms were encoded by a single nuclear transcript. In vitro transcription/translation experiments revealed the presence of two translational products by a differential usage of two in-frame translational start codons. Coupling site-specific mutations on THI1 encoding sequence with green fluorescent protein (GFP) gene fusions showed that translation initiation in the first AUG directs translocation of THI1 to plastids. However, when translation initiates from the second AUG THI1 is addressed to mitochondria. Analysis of the translation efficiency of thi1 mRNA revealed that the best context for translation initiation is present at the first AUG. In addition, it has been shown a suboptimal context at the second AUG and a strong stem-and-loop structure which is likely to slow translation. These observation confirm the in vitro translation data in which translation occurs preferentially in the first AUG, what could suggest a higher requirement of the protein in plastids.

Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2012-09-19T13:39:08Z No. of bitstreams: 1 renato_s_junior_ioc_bp_0048_2011.pdf: 2131023 bytes, checksum: c67826382b4b8b6c00b329a3f8c712d2 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-09-19T13:39:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 renato_s_junior_ioc_bp_0048_2011.pdf: 2131023 bytes, checksum: c67826382b4b8b6c00b329a3f8c712d2 (MD5) Previous issue date: 2011 / Universidade Federal Fluminense. Centro de Estudos Gerais. Instituto de Biologia. Niteroi, RJ, Brasil / A família Trypanosomatidae inclui parasitas de uma grande variedade de vertebrados, invertebrados (principalmente insetos), plantas e algumas espécies de protozoários, sendo, depois do nematóides, os de maior distribuição de hospedeiros na natureza. No presente trabalho, um novo isolado foi obtido por coprocultivo de trato intestinal de Leptoglossus stigma Herb, 1784 (Hemiptera, Coreidae), capturado no município de Itaguaí/RJ. O isolado original e três clones (obtidos por citometria de fluxo) foram depositados na "Coleção de Flagelados do Laboratório de Transmissores de Leishmanioses." Um clone foi caracterizado por diversas abordagens em comparação com espécies de referência de diferentes gêneros. Foi analisado o crescimento em meio de cultivo em intervalos de 24 h, entre 48-144 h, a diferenciação celular e a morfometria dos principais estágios evolutivos encontrados. A análise de isoenzimas foi realizada utilizando-se os seguintes sistemas: GPI, PGM, 6PGDH, HK, ACON, MPI, FUM, IDH, MDH e ACON. RAPD-PCR foi realizado utilizando-se 6 iniciadores, conjuntamente com outros tripanosomatídeos. Os dados destas análises foram processados numericamente e submetidos à análise computacional utilizando-se o coeficiente de associação Jaccard e o algoritmo de agrupamento UPGMA. Realizou-se seqüenciamento do amplicon do gene de SSU rRNA e o fragmento analisado foi alinhado com vinte e uma seqüencias depositadas no GenBank, gerando uma árvore filogenética resultante do pareamento. O conjunto de resultados deste trabalho sugere que a amostra obtida constitui nova espécie, pertencendo a um novo gênero, nomeada Vickermania itaguaiensis. / The Trypanosomatidae family includes parasites of a wide variety of vertebrates, invertebrates (mainly insects), plants and some species of protozoa, and after the nematodes, the highest distribution of hosts in nature. In this study, an isolate was obtained by coproculture from Leptoglossus stigma Herb, 1784 (Hemiptera, Coreidae) intestinal tract, captured in the city of Itaguaí/RJ. The original isolate and clones (obtained by flow cytometry) were deposited in the "Coleção de Flagelados do Laboratório de Transmissores de Leishmaniose". One clone was characterized by several approaches in comparison with the reference species of different genus. Growth was analyzed in culture medium at 24 h intervals between 48-144 h, cell differentiation and morphometric parameters of the main evolutionary stages matches. The isoenzyme analysis was performed using the following systems: GPI, PGM, 6PGDH, HK, ACON, MPI, FUM, IDH, MDH and ACON. RAPD-PCR was performed using 6 primers, together with other trypanosomatids. The analysis of these data were numerically processed and submitted to computer analysis using the Jaccard association coefficient and UPGMA clustering algorithm. We carried out sequencing of the amplicon from SSU rRNA gene and the fragment analyzed was aligned with twenty-one sequences deposited in GenBank, generating a phylogenetic tree resulting from the pairing. The result set of this work suggests that the sample obtained represents a new species belonging to a new genus, named Vickermania itaguaiensis.

Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2012-12-03T17:48:36Z No. of bitstreams: 1 frederico_m_r_silva_ioc_bcm_0032_2005.pdf: 983631 bytes, checksum: c53725cd06ca616bc0df79ce5088aa9f (MD5) / Made available in DSpace on 2012-12-03T17:48:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 frederico_m_r_silva_ioc_bcm_0032_2005.pdf: 983631 bytes, checksum: c53725cd06ca616bc0df79ce5088aa9f (MD5) Previous issue date: 2005 / Universidade Estácio de Sá. Campus Arcos da Lapa. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / No Brasil, apenas uma cepa disseminada, o clone epidêmico brasileiro (BEC) de MRSA, foi amplamente caracterizada, apresentando o cassete estafilocócico de resistência à meticilina (SCCmec) IIIA de 67 Kb e multirresistência antibiótica. Entretanto, novos clones de MRSA não-multirresistentes com alta virulência têm sido descritos em infecções comunitárias e hospitalares em vários países. Estes clones abrigam SCCmec curtos, com cerca de 24 Kb, portanto mais eficiente na transferência, replicação e tradução. Este estudo objetiva descrever o background genético dos clones de S. aureus envolvidos em infecções no Rio de Janeiro/RJ. Foram coletadas 139 amostras de S. aureus (54 MRSA), isoladas de pacientes de sete hospitais e de um laboratório de patologia clínica. As amostras foram submetidas a análises moleculares por diversos métodos. Com a análise por Multilocus Restriction Fragment Typing (MLRFT), caracterização do tipo de SCCmec e a presença de genes para leucocidina Panton-Valentine (PVL), juntamente com o perfil de resistência antimicrobiana, definiu-se 37 cepas representativas que foram posteriormente submetidos ao sequenciamento por Multilocus Sequence Typing (MLST) e caracterizados por Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE). A combinação de todas as abordagens permitiu o agrupamento dos isolados em 22 grupos clonais. O genótipo prevalente correspondeu à cepa nosocomial MRSA/BEC e foi caracterizada pelo RTF-BAAACAC / Sequence Type (ST) 239/SCCmec IIIA / Pulsotipo A / PVL negativo / multirresistência antibiótica. Outros 5 grupos clonais apresentaram cepas de MSSA e MRSA não-MDR com SCCmecs curtos. Quinze RFTs apresentaram somente cepas de MSSA com grande diversidade genotípica entre si, sendo 27,4% dessas PVL-positivas. Algumas cepas MRSA não-MDR PVL-positivas foram agrupadas em dois genótipos: RFT-AAAAAAA (ST-1) e RFT–BBBBBAB (ST-30), com SCCmec IVa e IV, respectivamente. Essas são características de clones comunitários disseminados pelo mundo, porém foram encontradas em MRSA hospitalares. De forma interessante, amostras pertencentes ao ST-30 foram identificadas como de origem hospitalar. Entretanto, um isolado foi derivado de infecção comunitária, demonstrando compartilhamento de cepas entre comunidade e hospital. A presença de SCCmecs curtos em cepas MRSA não-MDR direciona à possível emergência de novos clones resistentes. Os perfis heterogêneos de MRSA encontrados no Brasil reforçam a dinâmica da estrutura genética populacional deste patógeno e a importância de procedimentos de tipagem molecular para definir as relações entre isolados nosocomiais e comunitários. / In Brazil, a solely strain has been found disseminated, the Brazilian Epidemic Clone (BEC) of MRSA, was detected, characterized by the presence of a 67Kb staphylococcal chromosomal cassette of methicillin resistance (SCCmec) IIIA and antibiotic multiresistance. However, new non-multiresistant highly virulent MRSA strains have been described in community and nosocomial infections in several countries. These clones harbor a smaller SCCmec of around 24Kb and therefore more efficient in transferring, replication and translation. This study aim to describe the genetic background of S. aureus clones associated to infections in Rio de Janeiro/RJ. One hundred and thirty nine S. aureus samples were collected (54 MRSA isolates) from patients from seven hospitals and from a clinical pathology laboratory. These samples were submitted to molecular analyses by several methods. Multilocus Restriction Fragment Typing (MLRFT), SCCmec typing and the presence of the Panton-Valentine Leucocidin (PVL) genes, in association with the antimicrobial resistance profile, defined 37 representative isolates that were further submitted to DNA sequencing by Multilocus Sequence Typing (MLST) and also characterized by Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE). The combination of all approaches allowed the clustering of the isolates into 22 clonal groups. The most prevalent genotype corresponded to MRSA/BEC nosocomial strain and was characterized as RFT-BAAACAC, Sequence Type (ST) 239, SCCmec IIIA, Pulsotype A, PVL-negative and antibiotic multiresistance. The other 5 clonal groups presented MSSA and non-MDR MRSA strains with smaller SCCmecs. Fifteen RFTs presented only MSSA strains with large genotypic diversity being 27,4% of the MSSA samples PVL-positives. Some PVL-positive non-MDR MRSA strains were clustered into two genotypes: RFT-AAAAAAA (ST-1) and RFT–BBBBBAB (ST-30), with SCCmec IVa and IV, respectively. These are characteristics of community isolates worldwide disseminated, however they are found in nosocomial MRSA strains. Notably, in this study, samples characterized as ST-30 was identified, in its majority, from hospital origin. However, an isolate was derived from community infection, depicting sharing among community and hospital settings. The presence of shorter SCCmecs in non-MDR MRSA strains leads to the posible emergence of new resistant clones. The heterogeneous MRSA profiles found in Brazil reinforce the dynamics of the genetic population structure of this pathogen and the importance of molecular typing procedures to define the relationship among nosocomial and community strains.