Danazol, um andrógeno sintético, desenvolvido em 1970 para o tratamento da endometriose, tem aplicação controvérsia no pré-tratamento de mulheres com infertilidade sem causa aparente, abortos recorrentes e que seriam submetidas à fertilização com transferência de embrião. O conhecimento sobre a atuação deste medicamento sobre a incidência de células uNK, morfologia uterina e funções cognitivas após sua administração ainda são muito fragmentados e não conclusivos. Os objetivos deste trabalho foram avaliar os efeitos das diferentes concentrações do danazol no comportamento de camundongos prenhes, bem como, as possíveis alterações na implantação, viabilidade, perda embrionára, morfologia do útero e incidência dos subtipos de células uNK reativos para lectina DBA. Foram utilizadas noventa e três fêmeas da linhagem Swiss, obtidas do Biotério da Universidade Federal de Alfenas, tratadas durante 14 dias por meio de gavagem com água destilada + tween 1% (grupo controle) e com água destilada + tween 1% + danazol nas concentrações de 0,75; 7,5; ou 75 mg/kg. O tratamento nos animais foi suspenso por 4 dias e após este prazo as fêmeas foram acasaladas com os machos. O dia em que foi constatada a presença do tampão vaginal foi considerado o 1° dia de gestação. Os testes comportamentais foram realizados e os animais foram sacrificados no 6º, 8º, 10º, 12º e 15º dia de gestação (ddg). Os resultados obtidos mostraram que danazol na dosagem de 0,75 mg/Kg apresentou efeito ansiogênico em camundongos e diminuiu a retenção de memória de curto prazo no 10º ddg. Na concentração de 7,5 mg/Kg provocou aumento da retenção de memória a curto prazo e estado equivalente ao depressivo. A diminuição do tempo de exploração global, à medida que a concentração do hormônio foi aumentada sugere efeito dose dependente de danazol no estabelecimento de estado de sonolência e apatia em camundongos no 10º ddg. Danazol provocou atraso no período para sucesso da cópula, no entanto, aumentou a taxa de prenhez sem reduzir o número de corpus lúteos em todas as dosagens utilizadas. Nos camundongos tratados com a dosagem 7,5 mg/Kg de danazol foram observadas, a partir do 10º ddg, muitas células grandes e de morfologia equivalente às células trofoblásticas gigantes ao redor dos vasos que nutrem a decídua e o embrião, o que sugere que está droga aumenta a invasividade do trofoblasto a partir do período médio da prenhez. Danazol na concentração de 7,5 mg/Kg provocou aumento no número de células uNK, enquanto dosagens menores (0,75 mg/Kg) e maiores (75 mg/Kg) causaram diminuição neste número, demonstrando o efeito dose dependente de danazol no número de células uNK. A análise dos diferentes subtipos de uNK no útero mostrou que danazol aumenta a migração destas células, podendo prejudicar a proliferação celular em doses elevadas e acelerar a diferenciação celular em áreas próximas ao embrião. As maiores alterações relacionadas à ansiedade e memória observadas no 10º ddg, associadas às alterações morfológicas nos sítios de implantação embrionária e aumento na proliferação de células natural killer uterinas também neste período, demonstram a integração entre sistemas nervoso, endócrino e imunológico durante a prenhez e a ação dose-dependente de danazol modulando as respostas destes sistemas. / Danazol, a synthetic androgen, developed in 1970 for the treatment of endometriosis, has a controversial application on the pre-treatment of women with unexplained infertility, recurrent miscarriage, and the ones that would undergo fertilization with embryo transfer. The knowledge about the way this compound works after its administration on the incidence of uNK cells, uterine morphology and cognitive functions is still incomplete and inconclusive. Our objectives were to evaluate the effects of different concentrations of danazol on the behavior of pregnant mice, as well as possible changes in implantation, viability, embryonic loss, morphology of the uterus and the incidence of DBA lectin-reactive uNK cell subtype. Ninety-three Swiss female mice from Universidade Federal de Alfenas vivarium were treated for 14 days by gavage with either distilled water + 1% Tween (control) or distilled water + 1% Tween + 0.75, 7.5 or 75 mg/kg of danazol. Females were mated with males after suspension of treatment during four days. Day 1 of gestation was established as the day when the presence of vaginal plug was detected. Behavioral tests were performed and the animals were sacrificed at 6th, 8th, 10th, 12th and 15th gestation days (gd). The data showed that 0.75 mg/kg of danazol caused an anxiogenic effect on mice and decreased the retention of short-term memory in the 10th gd. 7.5 mg/kg of this drug increased the retention of short-term memory and developed a depression-like state on the animals. The fact that gradual increase on hormone concentration caused gradual decrease on the global exploration time suggests a dose-dependent effect of danazol on establishing a state of somnolence and apathy in mice in the 10th ddg. Danazol caused a delay on time of successful mating, however, it increased the rate of pregnancy without reducing the number of corpus luteum in all dosages used. In mice treated with 7.5 mg/kg of danazol, many large cells with a trophoblast-like morphology were observed around vessels that nourish the decidua and the embryo starting at 10th gd, what suggests that this drug increases the invasiveness of the trophoblast starting in the middle period of pregnancy. 7.5 mg/kg of danazol increased the number of uNK cells, whereas the lowest (0.75 mg/ kg) and the highest (75 mg / kg) doses caused a decrease in this number, demonstrating a dose dependent effect of danazol on the number of uNK cells. The analysis of different subtypes of uNK cells in the uterus showed that danazol increases the migration of these cells and can also impair cell proliferation on higher doses. It also suggests that danazol can stimulate cell differentiation in areas close to the embryo. The major changes related to anxiety and memory observed in the 10th gd, associated with morphological changes in the sites of embryo implantation and increase in proliferation of uterine natural killer cells in this period, demonstrate the integration between the nervous, endocrine and immune systems during pregnancy and the dose-dependent action of danazol in the modulation of these systems. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

Em muitos mamíferos, é notado um influxo de linfócitos no início da gestação, que é acompanhado por um processo de proliferação, diferenciação e migração destas células. Em camundongos estes linfócitos se distribuírem na região mesometrial de cada sítio de implantação (SIE). Estudos imunocitoquímicos indicaram que estes linfócitos são células Natural Killer, porém, sua morfologia e comportamento peculiar sugerem que elas representam uma subpopulação de NK específica do útero durante a gestação, sendo portanto denominadas células Natural Killer uterinas (uNK). A função conhecida para estas células em camundongos é a liberação de citocinas como IFN- que leva à dilatação das artérias espiraladas deciduais e manutenção da integridade decidual, contribuindo, portanto, para o desenvolvimento normal da decídua e da placenta. A infecção intra-uterina foi reconhecida como a causa primária de partos prematuros e corrobora para o desenvolvimento de leucomalácia periventricular e displasia broncopulmonar. Estudo recente em camundongos prenhes demonstrou que a injeção intra-uterina de LPS de E.coli provoca aumento da expressão de Fosfodiesterase 4B (PDE4B) e da atividade fosfodiestrase na interface materno-fetal, aumento nas concentrações de TNF-α, IL-1β, IL-6 e IL-10 no líquido amniótico o que induz o parto prematuro e a diminuição da viabilidade fetal. É esperado que a administração de LPS promova o aumento sistêmico e central de citocinas próinflamatórias, e que o animal responda com alterações endócrinas, imunológicas e comportamentais com o fito de favorecer o restabelecimento da homeostasia. Nesse contexto, o presente trabalho buscou avaliar os efeitos comportamentais da administração de LPS em camundongos, bem como os efeitos no útero prenhe e nas células uNK desses animais por meio do estudo morfológico, citoquímico e estereológico. O estabelecimento do comportamento febril foi identificado a partir da segunda hora após a administração de LPS, e esse evento ocorreu concomitante ao estabelecimento do comportamento análogo à ansiedade. Foi possível identificar nos animais tratados o comportamento de apatia e redução na capacidade exploratória, que somados ao comportamento depressivo, estabelecido após 1 hora da aplicação do LPS, fazem parte das alterações que constituem o comportamento doentio. O tratamento provocou também alterações no ambiente uterino, de tal forma que foi possível identificar um significativo aumento de células uNK imaturas na região do miométrio dos SIE. Além disso, o tratamento levou à diminuição da quantidade de células uNK maduras e senescentes nas três regiões estudadas dos SIE concomitante ao aumento de células uNK que possuíam padrão alterado na expressão de N-actilgalactosamina nos seus grânulos e superfície. O período onde foram encontradas tais alterações acompanhou o período onde houve perda na marcação de perforina, sugerindo a ocorrência de degranulação. A imunocitoquímica demonstrou que o tratamento com LPS parece ter induzido a despolimerização dos filamentos contrateis de α-actina causando relaxamento nos vasos que irrigam o ambiente uterino. / In mammalian, there is a lymphocyte influx in early pregnancy, which is accompanied by proliferation, differentiation and migration of these cells. These lynphocites distribute in mesometrial region of each embryo implantation site (EIS). Immunocytochemical studies indicated that these cells are Natural Killer cells, but their peculiar morphology and behavior suggest that they represent a uterus specific NK subpopulation during pregnancy called uterine Natural Killer cells (uNK). The known function for these cells in mice is cytokines releasing such as IFN- leading to decidual spiral arteries dilation and maintaining decidual integrity, contributing to normal development of decidua and placenta. Intrauterine infection was recognized as primary cause of preterm labor and supports the periventricular leukomalacia and bronchopulmonary dysplasia development. Recent study in pregnant mice showed that E.coli LPS intra-uterine injection causes increased expression of Phosphodiesterase 4B (PDE4B) and fosfodiestrase activity in maternal-fetal interface, increased TNF-α, IL-1β, IL-6 and IL-10 concentrations in amniotic fluid which leads to premature delivery and reduced fetal viability. It is expected that LPS administration promotes systemic and central proinflammatory cytokines increasing, and that the animal responds with endocrine, immune and behavioral disorders with the aim of promoting homeostasis restoration. In this context, the present study evaluated the behavioral effects of LPS administration in mice and the effects on pregnant uterus and uNK cells of these animals through morphological, cytochemical and stereological study. The feverish behavior establishment was identified from second hour after LPS administration, and this event was concomitant with anxiety-like behavior establishment. It was possible to identify treated animals apathy behavior, reduction in exploratory capacity and depressive behavior drawn 1 hour after LPS application as part of sickness behavior. The treatment also caused changes in the intrauterine environment, so that we could identify a significant increase of immature uNK cells in myometrium region of EIS. Furthermore, the treatment decreased the amount of mature and senescent uNK cells in the three EIS studied regions, concomitantly with the increasing granules and surface N-actilegalactosamine expression altered uNK cells. These changes were accompanied by the perforin labeling loss and a reduction on blood vessel α-actin labeling, suggesting respectively the uNK cell citotoxicity (perforin releasing) and actin contractile filament despolymerization causing relaxation of blood vessels that supplies the decidua and embryo. / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais - FAPEMIG

Orientador: Erick da Cruz Castelli / Resumo: O gene KIR2DL4 codifica um importante receptor de células Natural Killer (NK). O único ligante de KIR2DL4 conhecido é a molécula HLA-G, expressa principalmente na placenta, modulando a ação das células NK durante a gestação. O gene KIR2DL4 parece ser bastante variável, quando considerado os bancos de dados que armazenam suas sequências conhecidas, porém não está claro o nível de diversidade deste gene em populações reais e heterogêneas. Polimorfismos presentes no gene KIR2DL4 poderiam influenciar a interação entre KIR2DL4 e HLA-G, modificando a ação das células NK. Neste estudo exploramos a variabilidade genética de KIR2DL4 em 157 indivíduos oriundos do Estado de São Paulo/Brasil. Devido à alta similaridade de sequências entre os genes KIR, erros de genotipagem são esperados quando se utiliza sequenciamento de segunda geração. Por este motivo, desenvolvemos uma abordagem para classificar cada leitura com base em sequências KIR conhecidas, endereçando-as ao gene mais provável. Também utilizamos o painel SNPforID 34-plex para avaliar a ancestralidade dessas amostras. Considerando o segmento completo desse gene, indo da região 5’URR até a 3’UTR, com aproximadamente 13kb, o gene KIR2DL4 se mostrou pouco polimórfico, com 152 pontos de variações identificados (MAF 1%). Esses pontos de variação estão organizados em 32 haplótipos estendidos que codificam 13 proteínas diferentes. Foram encontrados 11 haplótipos na região promotora, sendo que 8 possuem MAF maior que 1%. Na região codif... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: KIR2DL4 is the most unusual Killer Cell Immunoglobulin-Like receptor (KIR) family member in terms of structure, expression, and signaling properties. The only known KIR2DL4 ligand is HLA-G, and polymorphisms might disrupt this interaction. KIR2DL4 variability is not well explored in admixed populations. Here we explored KIR2DL4 exon variability in 157 individuals from the State of São Paulo/Brazil. Because of sequence similarity with other KIR genes, it is expected genotyping errors when using secondgeneration sequencing. We developed an approach to score each read based on known KIR sequences, addressing them to the most likely locus. We evaluated the SNPforID 34-plex panel to assess ancestry. The methodology was applied to survey the variability of a very admixed population, such as Brazilian, counting with 157 samples of São Paulo State. Considering a segment of about 13-kb, KIR2DL4 gene was conserved with few different and frequent sequences. Overall, 152 variable sites were detected, arranged in 32 haplotypes codifying 13 protein. We found 11 promoter haplotypes, 8 with a frequency greater than 1%. In the coding region we detected 70 haplotypes, four of which correspond to 50% of the coding sequences (KIR2DL4 * 0080204, * 008105, * 001, * 005). In the 3'UTR region, 14 haplotypes were identified with MAF greater than 1%. The KIR2DL4 coding region was the most variable segment. We observed that KIR2DL4 variability is strongly influenced by the sample ancestry background. K... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

A sepse é caracterizada por ser um processo inflamatório sistêmico devido a uma infecção, levando a lesão pulmonar aguda, síndrome do desconforto respiratório agudo e a falência múltipla dos orgãos. São achados histopatológicos da sepse: edema intersticial e alveolar, acúmulo de neutrófilos e macrófagos, hemorragia, lesão endotelial e do epitélio alveolar, e colapso alveolar. Acredita-se que a prolactina, hormônio produzido nas células lactotróficas da hipófise interfira no processo inflamatório, ora estimulando-o, ora inibindo-o. Além da relação direta com a lactação, este hormônio tem sido considerado um importante modulador do sistema imune, estimulando a proliferação e a sobrevivência celular. No presente estudo, buscou-se determinar os aspectos morfofuncionais do pulmão comprometido pela sepse induzida pela ligação e perfuração do ceco (CLP) em ratos com hiperprolactinemia induzida por sulpiride, um antagonista da dopamina. O presente estudo mostrou que os ratos pré-tratados com salina e submetidos a CLP, desenvolveram o padrão morfológico da sepse como por exemplo, aumento nas células inflamatórias com predomínio dos polimorfonucleares (neutrófilos), edema intersticial e colapso alveolar. Além disso, o presente estudo mostrou que a sepse induzida por CLP produziu diminuição da pressão arterial média bem como queda em alguns parâmetros ventilatórios como por exemplo, volume corrente e volume pulmonar em ratos não anestesiados. Interessante observação foi que grupos de ratos pré-tratados com sulpiride e submetidos a CLP apresentaram um maior comprometimento nos achados morfológicos bem como uma potencialização na queda do volume corrente durante a análise ventilatória. O presente estudo sugere que a hiperprolactinemia deve ser atentamente observada, pela estreita relação com o agravamento do processo inflamatório provocado por uma infecção pré-existente, que resultaria no aumento do número de óbitos em pacientes sépticos. / Sepsis is characterized as a systemic inflammatory process due to an infection, leading to acute lung injury, acute respiratory distress syndrome and multiple organs failure. Histopathological findings of sepsis are: interstitial and alveolar edema, accumulation of neutrophils and macrophages, hemorrhage, endothelial and alveolar epithelial injury and alveolar collapse. It is believed that prolactin, a hormone produced by pituitary lactotroph cells, interferes on the inflammatory process, sometimes stimulating it and sometimes inhibiting it. In addition to the direct relationship on lactation, this hormone has been observed to play important role on the modulation of the immune system, stimulating the cell proliferation and cell survival. In the present study, we sought to determine the morphofunctional aspects of compromised lung during sepsis induced by cecal ligation and perforation (CLP) in rats with hyperprolactinemia induced by sulpiride, a dopamine antagonist. The present study showed that pretreated rats with saline and subjected to CLP developed the morphogical pattern of sepsis such as increase in inflammatory cells with predominance of polymorphonuclear cells, interstitial edema and alveolar collapse. In addition, this study showed that sepsis induced by CLP produced a decrease in mean arterial pressure and decrease in ventilatory parameters such as tidal and pulmonary volume in unanesthetized rats. An interesting observation was that pretreated rats with sulpiride and subjected to CLP had a greater impairment in the morphological findings as well as an increase in the fall of the tidal volume during the ventilation analysis. The present study suggests that the hyperprolactinemia should be closely observed by a close relationship with the worsening of the inflammatory process caused by a pre-existing infection, which would result in increasing the number of deaths in septic patients.

Objetivo: o objetivo deste estudo foi avaliar a prevalência de autoanticorpos e a dosagem da concentração de células Natural Killer (NK) no sangue periférico em pacientes com endometriose. Métodos: Entre dezembro de 2004 e dezembro de 2007 foram avaliadas 155 pacientes submetidas a videolaparoscopia, divididas em um grupo sem endometriose(n=55) e outro com endometriose (n=100). Foi coletada amostra de sangue periférico de todas as pacientes no momento da laparoscopia e nessa amostra foi realizada a quantificação do percentual de células NK em relação aos linfócitos periféricos (por citometria de fluxo), e a determinação dos seguintes auto-anticorpos: anticorpos antinucleares (ANA, por imunofluorescência indireta), anticorpos antitireoglobulina e antiperoxidase (anti-TG e anti-TPO, por eletroquimioluminescência), anticorpos anticardilipina e antifosfatidilserina (aCL e aPS IgG, IgM e IgA, todos por ensaio imunoenzimático). Além da presença de endometriose, essas pacientes também foram avaliadas quanto ao estadiamento, os locais de doença, relações com a fase do ciclo, e a classificação histológica dessa doença. Resultados: as pacientes com endometriose apresentaram percentual de células NK (média DP de 15,3 9,8%) superiores àquelas sem a doença (média DP de 10,6 5,8%), p<0,001. Quanto aos autoanticorpos, as portadoras de endometriose também apresentaram positividade para ANA mais frequentemente (33%) que as pacientes do grupo controle (12,7%), p=0,006. Quanto aos anti-TG, anti-TPO, anti-CL (IgG, IgM e IgA) e aPS ( IgG, IgM e IgA), não houve diferenças estatísticas quanto à sua positividade. As células NK também mostraram-se mais elevadas nas protadoras de endometriose em estádios avançados e naquelas com comprometimento de retossigmóide, grupo no qual encontramos o maior percentual de células NK com concentração média de 19,8 10,3%. Concentrações de células NK 12,5% podem ser usadas como marcadores de endometriose em retossigmóide, com sensibilidade de 73% e especificidade de 65%. Utilizando-se de um modelo estatístico de probabilidades, demonstramos que associação desse marcador (NK 12,5%) com a presença de sintomas como dor e/ou sangramento intestinal durante a menstruação nos possibilitou estimar uma probabilidade de comprometimento de retossigmóide de 60,4%. Conclusões: pacientes com endometriose apresentam maior concentração de células NK periféricas, além de maior prevalência de ANA positivo em relação àquelas sem endometriose. As células NK aumentam nas pacientes com endometriose predominantemente nos estádios avançados, com comprometimento de retossigmóide. Nesse sentido poderiam ser utilizadas como marcadores diagnósticos desse tipo de comprometimento da doença, principalmente se forem avaliadas em conjunto com os sintomas das pacientes / Objectives: The objective of this study was to evaluate the prevalence of autoantibodies and the percentage of natural killer (NK) cells in the peripheral blood of patients with endometriosis. Methods: Between December 2004 and December 2007, 155 patients submitted to videolaparoscopy were evaluated. Patients were divided into two groups: one group of women without endometriosis (n = 55) and another in which all the women had endometriosis (n = 100). Samples of peripheral blood were collected from all the patients at the time of laparoscopy and flow cytometry was used to determine the percentage of NK cells in relation to peripheral blood lymphocytes in these samples. In addition, the following autoantibodies were measured: antinuclear antibodies (ANA) by indirect immunofluorescence, anti-thyroglobulin and anti-thyroid peroxidase antibodies (anti-TG and anti-TPO) by electrochemiluminescence, and anticardiolipin and anti-phosphatidylserine antibodies (aCL and aPS IgG, IgM and IgA), all performed using immunoenzymatic assay. In addition to the presence of endometriosis, these patients were also evaluated with respect to staging, to the sites of the disease, any association with the phase of the menstrual cycle and the histological classification of the disease. Results: The patients with endometriosis had a higher percentage of NK cells (15.3 ± 9.8%; mean ± SD) compared to those without the disease (10.6 ± 5.8%; mean ± SD), (p<0.001). Evaluation of the autoantibodies showed that positivity for ANA was more common in the group of patients with endometriosis (33%) compared to the patients in the control group (12.7%), (p = 0.006). With respect to anti-TG, anti-TPO, aCL (IgG, IgM and IgA) and aPS (IgG, IgM and IgA), no statistically significant differences were found between the groups of patients with or without endometriosis. NK cell concentrations were also found to be higher in patients with advanced stages of endometriosis and in those in whom the rectosigmoid was affected by the disease, this being the group in which the highest percentage of NK cells was found, with mean concentrations of 19.8 ± 10.3%. NK cell concentrations 12.5% may be used as markers of endometriosis of the rectosigmoid, with sensitivity of 73% and specificity of 65%. Using a statistical model of probability, these findings showed that the association of this marker (NK 12.5%) with the presence of symptoms such as pain and/or intestinal bleeding during menstruation permitted an estimation to be made of a likelihood of 60.4% of rectosigmoid endometriosis. Conclusions: Patients with endometriosis have higher percentages of peripheral NK cells, as well as a greater prevalence of positive ANA compared to those without endometriosis. The concentration of peripheral NK cells increases in patients with endometriosis, predominantly in patients with advanced stages of the disease and those in whom the rectosigmoid is affected. Therefore, the concentration of NK cells in peripheral blood could be used as a diagnostic marker of this type of endometriosis, particularly when evaluated together with patients symptoms

Objetivo: o objetivo deste estudo foi avaliar a prevalência de autoanticorpos e a dosagem da concentração de células Natural Killer (NK) no sangue periférico em pacientes com endometriose. Métodos: Entre dezembro de 2004 e dezembro de 2007 foram avaliadas 155 pacientes submetidas a videolaparoscopia, divididas em um grupo sem endometriose(n=55) e outro com endometriose (n=100). Foi coletada amostra de sangue periférico de todas as pacientes no momento da laparoscopia e nessa amostra foi realizada a quantificação do percentual de células NK em relação aos linfócitos periféricos (por citometria de fluxo), e a determinação dos seguintes auto-anticorpos: anticorpos antinucleares (ANA, por imunofluorescência indireta), anticorpos antitireoglobulina e antiperoxidase (anti-TG e anti-TPO, por eletroquimioluminescência), anticorpos anticardilipina e antifosfatidilserina (aCL e aPS IgG, IgM e IgA, todos por ensaio imunoenzimático). Além da presença de endometriose, essas pacientes também foram avaliadas quanto ao estadiamento, os locais de doença, relações com a fase do ciclo, e a classificação histológica dessa doença. Resultados: as pacientes com endometriose apresentaram percentual de células NK (média DP de 15,3 9,8%) superiores àquelas sem a doença (média DP de 10,6 5,8%), p<0,001. Quanto aos autoanticorpos, as portadoras de endometriose também apresentaram positividade para ANA mais frequentemente (33%) que as pacientes do grupo controle (12,7%), p=0,006. Quanto aos anti-TG, anti-TPO, anti-CL (IgG, IgM e IgA) e aPS ( IgG, IgM e IgA), não houve diferenças estatísticas quanto à sua positividade. As células NK também mostraram-se mais elevadas nas protadoras de endometriose em estádios avançados e naquelas com comprometimento de retossigmóide, grupo no qual encontramos o maior percentual de células NK com concentração média de 19,8 10,3%. Concentrações de células NK 12,5% podem ser usadas como marcadores de endometriose em retossigmóide, com sensibilidade de 73% e especificidade de 65%. Utilizando-se de um modelo estatístico de probabilidades, demonstramos que associação desse marcador (NK 12,5%) com a presença de sintomas como dor e/ou sangramento intestinal durante a menstruação nos possibilitou estimar uma probabilidade de comprometimento de retossigmóide de 60,4%. Conclusões: pacientes com endometriose apresentam maior concentração de células NK periféricas, além de maior prevalência de ANA positivo em relação àquelas sem endometriose. As células NK aumentam nas pacientes com endometriose predominantemente nos estádios avançados, com comprometimento de retossigmóide. Nesse sentido poderiam ser utilizadas como marcadores diagnósticos desse tipo de comprometimento da doença, principalmente se forem avaliadas em conjunto com os sintomas das pacientes / Objectives: The objective of this study was to evaluate the prevalence of autoantibodies and the percentage of natural killer (NK) cells in the peripheral blood of patients with endometriosis. Methods: Between December 2004 and December 2007, 155 patients submitted to videolaparoscopy were evaluated. Patients were divided into two groups: one group of women without endometriosis (n = 55) and another in which all the women had endometriosis (n = 100). Samples of peripheral blood were collected from all the patients at the time of laparoscopy and flow cytometry was used to determine the percentage of NK cells in relation to peripheral blood lymphocytes in these samples. In addition, the following autoantibodies were measured: antinuclear antibodies (ANA) by indirect immunofluorescence, anti-thyroglobulin and anti-thyroid peroxidase antibodies (anti-TG and anti-TPO) by electrochemiluminescence, and anticardiolipin and anti-phosphatidylserine antibodies (aCL and aPS IgG, IgM and IgA), all performed using immunoenzymatic assay. In addition to the presence of endometriosis, these patients were also evaluated with respect to staging, to the sites of the disease, any association with the phase of the menstrual cycle and the histological classification of the disease. Results: The patients with endometriosis had a higher percentage of NK cells (15.3 ± 9.8%; mean ± SD) compared to those without the disease (10.6 ± 5.8%; mean ± SD), (p<0.001). Evaluation of the autoantibodies showed that positivity for ANA was more common in the group of patients with endometriosis (33%) compared to the patients in the control group (12.7%), (p = 0.006). With respect to anti-TG, anti-TPO, aCL (IgG, IgM and IgA) and aPS (IgG, IgM and IgA), no statistically significant differences were found between the groups of patients with or without endometriosis. NK cell concentrations were also found to be higher in patients with advanced stages of endometriosis and in those in whom the rectosigmoid was affected by the disease, this being the group in which the highest percentage of NK cells was found, with mean concentrations of 19.8 ± 10.3%. NK cell concentrations 12.5% may be used as markers of endometriosis of the rectosigmoid, with sensitivity of 73% and specificity of 65%. Using a statistical model of probability, these findings showed that the association of this marker (NK 12.5%) with the presence of symptoms such as pain and/or intestinal bleeding during menstruation permitted an estimation to be made of a likelihood of 60.4% of rectosigmoid endometriosis. Conclusions: Patients with endometriosis have higher percentages of peripheral NK cells, as well as a greater prevalence of positive ANA compared to those without endometriosis. The concentration of peripheral NK cells increases in patients with endometriosis, predominantly in patients with advanced stages of the disease and those in whom the rectosigmoid is affected. Therefore, the concentration of NK cells in peripheral blood could be used as a diagnostic marker of this type of endometriosis, particularly when evaluated together with patients symptoms

As células Natural Killer (NK), quando estimuladas por meio de seus receptores, rapidamente produzem citocinas e quimiocinas, incluindo IFN?, TNF?, TGF?, GMCSF, MIP1?, MIP1?, IL-10 e outras, as quais podem afetar a função de outras células hematopoéticas. Considerando as evidências recentes de que as célulastronco hematopoéticas (CTH) respondem diretamente à sinalização de várias citocinas, acreditamos que a produção de citocinas mediada pelas células NK possa regular a função da CTH e que a sua desregulação possa favorecer a transformação maligna. As neoplasias mieloproliferativas (NMP) negativas para o rearranjo t(9;22)/BCR-ABL1, incluindo as entidades Policitemia Vera (PV), Trombocitemia Essencial (TE) e Mielofibrose Primária (MFP), são doenças hematopoéticas originadas de alteração clonal da CTH, e podem servir de modelo para o estudo dessa regulação NK-CTH. Além de mutações que ativam vias de proliferação e sobrevivência celular, como a mutação JAK2V617F, presente em mais da metade das NMP, outros mecanismos contribuem para a patogênese e manutenção da doença, tais como mutações adicionais e regulação da hematopoese neoplásica pelo microambiente da medula óssea. Este último inclui não apenas células do estroma, mas também células do sistema imune. Dessa forma, com objetivo de investigar a potencial contribuição das células NK para a patogênese das NMP, caracterizamos células do sangue periférico de pacientes com NMP do Ambulatório de Hematologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, bem como células esplênicas obtidas de animais de um modelo murino condicional knockin de expressão heterozigótica da Jak2V617F (Jak2VF) quanto à frequência, expressão de receptores e função das células NK. Observamos menor porcentagem de células NK e maior expressão do receptor inibitório NKG2A nos animais Jak2 wt/VF. Pacientes portadores de NMP apresentaram número absoluto de células NK-CD16+ reduzido em relação aos controles saudáveis. O número de células NK-CD16+ foi menor na MFP em relação aos controles e à TE, particularmente naqueles portadores da mutação JAK2V617F. Encontramos menor expressão do receptor de ativação NKG2D nos portadores de PV positivos para a mutação JAK2V617F. Houve menor expressão do receptor de ativação NKp46 nos portadores de NMP, particularmente nos portadores da mutação JAK2V617F, e nos pacientes com MFP. Observamos também menor expressão do receptor NKG2A nos portadores de TE negativos para a mutação JAK2V617F. Em concordância com a redução de células NK, a porcentagem de linfócitos totais mostrou-se reduzida nos pacientes com NMP, particularmente nos portadores de MFP, independentemente da mutação JAK2V617F. Encontramos redução percentual e absoluta do subtipo de células NK CD56brightCD16- (cuja principal função é secretória) nos pacientes com NMP, especialmente na presença da mutação JAK2V617F, nos pacientes com PV e MFP, e menor frequência absoluta do subtipo CD56-CD16bright (com função primariamente citotóxica) nos portadores de MFP. Em contraste, não verificamos deficiência citotóxica das células NK dos animais Jak2 wt/VF em relação aos controles Jak2 wt/wt. Adicionalmente, as células NK dos animais Jak2-mutados demonstraram menor capacidade de secreção da citocina MIP-1?, reconhecida por regular a função de CTH, em relação aos animais controle. Finalmente, houve expressão significativamente aumentada do gene MyD88 nos animais mutados em relação aos controles, sugerindo que a via de sinalização dos receptores do tipo Toll (TLR) pode estar envolvida na regulação NKCTH nas NMP. Em resumo, detectamos deficiência numérica e funcional de células NK em células primárias murinas e humanas de NMP. Nossos achados sugerem potencial regulação da hematopoese maligna pelas células NK nestas neoplasias e podem contribuir para a identificação de novas estratégias terapêuticas que possam interferir nesta complexa interação. / Natural Killer (NK) cells, when stimulated by their receptors, rapidly produce cytokines and chemokines, including IFN?, TNF?, TGF?, GM-CSF, MIP1?, MIP1?, IL-10 and others, which may affect the function of other hematopoietic cells. Considering the recent evidence that hematopoietic stem cells (HSC) directly respond to cytokine signaling, we hypothesized that NK cells mediated cytokine production can regulate HSC function and that their dysregulation may favor malignant transformation. BCR-ABL1-negative myeloproliferative neoplasms (MPN), including Polycythemia Vera (PV), Essential Thrombocythemia (ET) and Primary Myelofibrosis (PMF), are hematopoietic diseases originated from HSC clonal transformation, and thus can serve as a model for studying this NK-HSC regulation. In addition to mutations that activate cell proliferation and survival pathways, such as the JAK2V617F mutation, present in more than half of MPN cases, other mechanisms contribute to the pathogenesis and maintenance of the disease, such as additional mutations and regulation of neoplastic hematopoiesis by the bone marrow microenvironment. This latter includes not only stromal cells but also cells of the immune system. Therefore, in order to investigate the potential contribution of NK cells to the pathogenesis of MPN, we characterized the frequency, receptor expression and function of NK cells from patients with MPN from the Clinical Hospital of the Medical School of Ribeirão Preto, University of São Paulo, as well as from splenic cells obtained from animals of a conditional knockin murine model of Jak2V617F heterozigous expression. Lower percentage of NK cells and higher NKG2A inhibitory receptor expression was observed in Jak2 wt/VF animals as compared to Jak2 wt/wt controls. In agreement, patients with MPN presented reduced absolute numbers of NK-CD16+ cells when compared to healthy controls. The number of NKCD16+ cells was lower in the PMF than in controls or ET patients, particularly in those bearing the JAK2V617F mutation. We found lower expression of the NKG2D activatory receptor in PV patients with the JAK2V617F mutation. There was lower expression of the NKp46 activatory receptor in MPN patients, particularly in those with the JAK2V617F mutation, and in PMF patients. We also observed reduced expression of the NKG2A receptor in non-JAK2 mutated ET patients. In agreement with the NK cell reduction, the percentage of total lymphocytes was reduced in patients with MPN, particularly in PMF, regardless of the JAK2V617F mutation. We found an absolute decrease of the CD56brightCD16- NK subtype (whose main function is secretory) in patients with MPN, especially when the JAK2V617F mutation was present, in patients with PV and PMF. Also, lower absolute frequency of CD56-CD16bright NK subtype (primarily cytotoxic) was found in PMF patients. In contrast, we did not find cytotoxic deficiency in the Jak2 wt/VF NK cells as compared to the Jak2 wt/wt controls. In addition, Jak2-mutated NK cells presented reduced ability of secreting the cytokine MIP-1?, known to regulate HSC function. Finally, there was significantly increased expression of the MyD88 gene in the Jak2-mutated animals as compared to controls, suggesting that the Toll-like receptors (TLR) signaling pathway may be involved in NK-HSC regulation in MPN. In summary, we detected numerical and functional deficiency of NK cells in murine and human primary cells of MPN. Our findings suggest a potential regulation of malignant hematopoiesis by NK cells in these neoplasms and may contribute to the identification of new therapeutic strategies that may target this complex interaction.

As células Natural Killer (NK), quando estimuladas por meio de seus receptores, rapidamente produzem citocinas e quimiocinas, incluindo IFN?, TNF?, TGF?, GMCSF, MIP1?, MIP1?, IL-10 e outras, as quais podem afetar a função de outras células hematopoéticas. Considerando as evidências recentes de que as célulastronco hematopoéticas (CTH) respondem diretamente à sinalização de várias citocinas, acreditamos que a produção de citocinas mediada pelas células NK possa regular a função da CTH e que a sua desregulação possa favorecer a transformação maligna. As neoplasias mieloproliferativas (NMP) negativas para o rearranjo t(9;22)/BCR-ABL1, incluindo as entidades Policitemia Vera (PV), Trombocitemia Essencial (TE) e Mielofibrose Primária (MFP), são doenças hematopoéticas originadas de alteração clonal da CTH, e podem servir de modelo para o estudo dessa regulação NK-CTH. Além de mutações que ativam vias de proliferação e sobrevivência celular, como a mutação JAK2V617F, presente em mais da metade das NMP, outros mecanismos contribuem para a patogênese e manutenção da doença, tais como mutações adicionais e regulação da hematopoese neoplásica pelo microambiente da medula óssea. Este último inclui não apenas células do estroma, mas também células do sistema imune. Dessa forma, com objetivo de investigar a potencial contribuição das células NK para a patogênese das NMP, caracterizamos células do sangue periférico de pacientes com NMP do Ambulatório de Hematologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, bem como células esplênicas obtidas de animais de um modelo murino condicional knockin de expressão heterozigótica da Jak2V617F (Jak2VF) quanto à frequência, expressão de receptores e função das células NK. Observamos menor porcentagem de células NK e maior expressão do receptor inibitório NKG2A nos animais Jak2 wt/VF. Pacientes portadores de NMP apresentaram número absoluto de células NK-CD16+ reduzido em relação aos controles saudáveis. O número de células NK-CD16+ foi menor na MFP em relação aos controles e à TE, particularmente naqueles portadores da mutação JAK2V617F. Encontramos menor expressão do receptor de ativação NKG2D nos portadores de PV positivos para a mutação JAK2V617F. Houve menor expressão do receptor de ativação NKp46 nos portadores de NMP, particularmente nos portadores da mutação JAK2V617F, e nos pacientes com MFP. Observamos também menor expressão do receptor NKG2A nos portadores de TE negativos para a mutação JAK2V617F. Em concordância com a redução de células NK, a porcentagem de linfócitos totais mostrou-se reduzida nos pacientes com NMP, particularmente nos portadores de MFP, independentemente da mutação JAK2V617F. Encontramos redução percentual e absoluta do subtipo de células NK CD56brightCD16- (cuja principal função é secretória) nos pacientes com NMP, especialmente na presença da mutação JAK2V617F, nos pacientes com PV e MFP, e menor frequência absoluta do subtipo CD56-CD16bright (com função primariamente citotóxica) nos portadores de MFP. Em contraste, não verificamos deficiência citotóxica das células NK dos animais Jak2 wt/VF em relação aos controles Jak2 wt/wt. Adicionalmente, as células NK dos animais Jak2-mutados demonstraram menor capacidade de secreção da citocina MIP-1?, reconhecida por regular a função de CTH, em relação aos animais controle. Finalmente, houve expressão significativamente aumentada do gene MyD88 nos animais mutados em relação aos controles, sugerindo que a via de sinalização dos receptores do tipo Toll (TLR) pode estar envolvida na regulação NKCTH nas NMP. Em resumo, detectamos deficiência numérica e funcional de células NK em células primárias murinas e humanas de NMP. Nossos achados sugerem potencial regulação da hematopoese maligna pelas células NK nestas neoplasias e podem contribuir para a identificação de novas estratégias terapêuticas que possam interferir nesta complexa interação. / Natural Killer (NK) cells, when stimulated by their receptors, rapidly produce cytokines and chemokines, including IFN?, TNF?, TGF?, GM-CSF, MIP1?, MIP1?, IL-10 and others, which may affect the function of other hematopoietic cells. Considering the recent evidence that hematopoietic stem cells (HSC) directly respond to cytokine signaling, we hypothesized that NK cells mediated cytokine production can regulate HSC function and that their dysregulation may favor malignant transformation. BCR-ABL1-negative myeloproliferative neoplasms (MPN), including Polycythemia Vera (PV), Essential Thrombocythemia (ET) and Primary Myelofibrosis (PMF), are hematopoietic diseases originated from HSC clonal transformation, and thus can serve as a model for studying this NK-HSC regulation. In addition to mutations that activate cell proliferation and survival pathways, such as the JAK2V617F mutation, present in more than half of MPN cases, other mechanisms contribute to the pathogenesis and maintenance of the disease, such as additional mutations and regulation of neoplastic hematopoiesis by the bone marrow microenvironment. This latter includes not only stromal cells but also cells of the immune system. Therefore, in order to investigate the potential contribution of NK cells to the pathogenesis of MPN, we characterized the frequency, receptor expression and function of NK cells from patients with MPN from the Clinical Hospital of the Medical School of Ribeirão Preto, University of São Paulo, as well as from splenic cells obtained from animals of a conditional knockin murine model of Jak2V617F heterozigous expression. Lower percentage of NK cells and higher NKG2A inhibitory receptor expression was observed in Jak2 wt/VF animals as compared to Jak2 wt/wt controls. In agreement, patients with MPN presented reduced absolute numbers of NK-CD16+ cells when compared to healthy controls. The number of NKCD16+ cells was lower in the PMF than in controls or ET patients, particularly in those bearing the JAK2V617F mutation. We found lower expression of the NKG2D activatory receptor in PV patients with the JAK2V617F mutation. There was lower expression of the NKp46 activatory receptor in MPN patients, particularly in those with the JAK2V617F mutation, and in PMF patients. We also observed reduced expression of the NKG2A receptor in non-JAK2 mutated ET patients. In agreement with the NK cell reduction, the percentage of total lymphocytes was reduced in patients with MPN, particularly in PMF, regardless of the JAK2V617F mutation. We found an absolute decrease of the CD56brightCD16- NK subtype (whose main function is secretory) in patients with MPN, especially when the JAK2V617F mutation was present, in patients with PV and PMF. Also, lower absolute frequency of CD56-CD16bright NK subtype (primarily cytotoxic) was found in PMF patients. In contrast, we did not find cytotoxic deficiency in the Jak2 wt/VF NK cells as compared to the Jak2 wt/wt controls. In addition, Jak2-mutated NK cells presented reduced ability of secreting the cytokine MIP-1?, known to regulate HSC function. Finally, there was significantly increased expression of the MyD88 gene in the Jak2-mutated animals as compared to controls, suggesting that the Toll-like receptors (TLR) signaling pathway may be involved in NK-HSC regulation in MPN. In summary, we detected numerical and functional deficiency of NK cells in murine and human primary cells of MPN. Our findings suggest a potential regulation of malignant hematopoiesis by NK cells in these neoplasms and may contribute to the identification of new therapeutic strategies that may target this complex interaction.

Os C/EBP (CCAAT/enhancer-binding proteins) são uma família de fatores de transcrição implicados numa variedade de processos da hematopoese, regulando tanto a diferenciação terminal como a proliferação celular. Dentre estes, sabe-se que o C/EBP gamma (C/EBPG) está envolvido na maturação funcional de células Natural Killer (NK). Entretanto, os mediadores dessa regulação não são conhecidos. As células NK são linfócitos com funções efetoras de citotoxicidade e de produção de citocinas, dependentes de um equilíbrio dinâmico entre a expressão de receptores ativatórios e inibitórios bem como de receptores de citocinas. As duas funções (citotóxica e secretora), fazem das células NK importantes componentes da hematopoese, capazes de eliminar alvos susceptíveis bem como de recrutar outras células e amplificar a resposta inflamatória. Diante de incompatibilidade entre as células-alvo e células NK efetoras, os efeitos citotóxicos preponderam; enquanto na ausência de incompatibilidade, os efeitos mediados por citocinas sobre as demais células hematopoéticas se sobressaem. Por exemplo, citocinas como IFN?, TNF?, TGF?, GM-CSF e IL-10, produzidas por células NK, são potenciais reguladoras da função das células-tronco hematopoéticas (CTH). Com o objetivo de estudar a regulação das células NK pelo C/EBPG, utilizamos células NK isoladas de animais transgênicos knockout (KO) para o C/ebpg e seus controles para analisar sua expressão gênica e função diferencial, com especial foco nos genes-alvo com potencial para regulação da hematopoese. Visando identificar potenciais genes-alvo do C/EBPG, isolamos células NK deficientes para o C/ebpg e controles, por meio de sorting, e realizamos posterior isolamento do RNA seguido de análise de expressão gênica em larga escala. A validação da expressão diferencial dos genes-alvo do C/ebpg, de interesse para a função secretória das células NK, foi realizada por PCR em Tempo Real para oito genes diferencialmente expressos na análise de expressão gênica em larga escala, a saber: Il-10, Gmcsf, Ifng, Tnfa, Tgfb, Tlr4, Myd88 e Irak4. Os dados referentes à expressão basal e estimulada com IL-2, destes genes em células NK de animais KO para o C/ebpg e seus controles, revelaram uma tendência ao aumento da expressão de Myd88 nos animais KO quando comparados aos controles. Foram verificados os níveis das citocinas IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A, TNF? and IFN? por meio de citometria de fluxo, utilizando o sobrenadante da cultura de NK de ambos os animais, observando-se que, após a ativação com IL-2, a produção de IFN? mostrou-se diminuída em células NKdeficientes para o C/ebpg em comparação aos controles. Para caracterizar as células NK Cebpg-deficientes, analisamos a sua frequência (células linhagem-/CD3- /NK1.1+) e expressão dos receptores NKG2D, Ly49D e NKG2A, não sendo observadas diferenças numéricas ou de expressão de receptores entre células NK deficientes ou não para o C/ebpg. Os subtipos funcionais destas células foram caracterizados de acordo com a expressão de CD27 e CD11b, que permitem identificar as subpopulações de células NK imaturas secretórias, secretórias, citotóxicas e tolerantes. Os animais KO mostraram maior percentagem de células secretórias e redução percentual e numérica de células citotóxicas quando comparadas às células NK dos controles. Para demonstrar a deficiência funcional realizamos um ensaio de ativação de células. Em concordância, após a coincubação de esplenócitos totais com células YAC-1, o ensaio de detecção do CD107 revelou que as células dos animais KO para o C/ebpg são cinco vezes menos ativadas do que células NK controles. Ademais, foi realizado um ensaio de citotoxicidade por citometria de fluxo utilizando o CTO (Cell Tracker Orange) como sonda fluorescente, o qual se incorpora às células-alvo da linhagem YAC-1. Como resultado, para a razão 10:1 NK: células-alvo, as células NK C/ebpg KO foram menos citotóxicas do que as células NK dos controles. Concluímos que as células NK de animais transgênicos KO para o C/ebpg têm função deficiente, menor potencial citotóxico e expressão de genes e citocinas alteradas em relação aos seus controles. Os mediadores apontados, em especial, o IFN?, são alvos importantes para a regulação da função secretória das células NK. / C/EBP (CCAAT/enhance-binding proteins) are a family of transcription factors involved in a variety of hematopoietic processes, regulating both terminal differentiation and cellular proliferation. Among these, it is known that C/EBP gamma (C/EBPG) is involved in the functional maturation of Natural Killer (NK) cells. However, the mediators of this regulation are unknown. NK cells are lymphocytes with effector functions of cytotoxicity and production of cytokines, both dependent on a dynamic equilibrium between the expression of activating and inhibitory receptors as well as cytokine receptors. The two functions (cytotoxic and secretory) make NK cells important components of hematopoiesis, able to eliminate susceptible targets as well as recruit other cells to amplify inflammatory responses. In face of incompatibility between target cells and NK effector cells, cytotoxic effects predominate; while in the absence of incompatibility, cytokine-mediated effects that influence other hematopoietic cells prevail. For example, cytokines such as IFN?, TNF?, TGF?, GMCSF and IL-10, produced by NK cells, are potential regulators of hematopoietic stem cells (HSC). With the aim of studying the regulation of NK cells by C/EBPG, we isolated NK cells from transgenic C/ebpg knockout (KO) animals and controls to analyze their differential gene expression and function, with a special focus on hematopoiesis regulation. In order to identify potential C/EBPG target genes, we isolated C/ebpg-deficient and control NK cells by the use of sorting by flow cytometry and isolated RNA for gene expression analysis. Differential expression of C/ebpg target genes was performed by Real-time PCR for eight genes differentially expressed in the microarray analysis: Il-10, Gmcsf, Ifng, Tnfa, Tgfb, Tlr4, Myd88 e Irak4. When compared to controls, non-activated and IL-2-stimulated C/ebpg KO NK cells presented a tendency to have higher expression of Myd88. Cytokine levels of IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17?, TNF? and IFN?, obtained from NK culture supernatants, were verified by flow cytometry, after IL-2 activation. Among these cytokines, the production of IFN? by C/ebpg-deficient NK cells was found to be reduced. To further characterize NK cells, we analyzed their frequency (Lineage- /CD3-/NK1.1+ cells) and the expression of the receptors NKG2D, Ly49D and NKG2A, and both analyses presented similar expression between control or C/epbg KO NK cells. The functional subtypes of these cells were characterized according to the expression of CD27 and CD11b, which allow the identification of NK subpopulationsas immature secretory, mature secretory, cytotoxic or tolerant. The KO animals showed higher percentage of secretory cells and percentual and numerical reduction of cytotoxic cells when compared to the NK control cells. In agreement, CD107a expression was 5-times lower in C/ebpg KO splenocytes than in control splenocytes after co-incubation with YAC-1 cells. In addition, a cytotoxicity assay by flow cytometry was performed. The fluorescent probe CTO (Cell Tracker Orange) was incorporated to YAC-1 cells, used as target cells. As a result, in the 10:1 NK:target cells ratio, C/ebp KO cells were less cytotoxic than NK control cells. We concluded that C/ebpg-deficient cells are dysfunctional, have a greater secretory potential and an altered expression of genes and cytokines as compared to their controls. The potential mediators revealed by our study, in particular, IFN?, may be important targets for the regulation of NK secretory function.

Linfócitos T CD8 e células NK atuam no combate à infecções por bactérias intracelulares, vírus e células tumorais, provocando a morte dessas células por meio da secreção de grânulos citotóxicos. Proteínas RAB GTPase têm se destacado em estudos de tráfego intracelular, porém, são escassos dados sobre o papel destas proteínas em células citóxicas. Um estudo prospectivo de proteômica realizado por nosso grupo identificou a RAB2A, RAB5A, RAB17 e RAB18 em grânulos citotóxicos. Análises mais aprofundadas revelaram que a RAB2A está associada a proteínas como LAMP-1 e LAMP-2, enquanto que RAB5A, RAB17 e RAB18 estavam presentes na mesma linhagem em um contexto não contemplado neste estudo. Desenvolvemos ainda uma abordagem de silenciamento gênico da RAB2A, e por fim, adaptamos uma série de protocolos de simples execução e baixo custo para avaliar funções efetoras de células NK. O conhecimento da maquinaria secretória é fundamental, uma vez que defeitos nas vias de tráfego intracelular constituem a base de um grande número de doenças que desencadeiam quadros fatais. / CD8 T lymphocytes and NK cells fight against infections by intracellular bacteria, viruses and tumor cells by killing those cells through the secretion of cytotoxic granules. RAB GTPase has been highlighted in studies of intracellular trafficking, however there are scarce reports regarding the role of these proteins in cytotoxic cells. A proteomic study performed by our group identified RAB2A, RAB5A, RAB17 and RAB18 in cytotoxic granules. Further analysis revealed that RAB2A is associated with LAMP-1 and LAMP-2, while RAB5A, RAB17 and RAB18 were present in the same cell line, but in a context not included in this study. We also have developed a gene silencing approach for RAB2A and adapted a number of protocols, simple and low-cost, that can be used to evaluate effector functions of natural killer cells The knowledge of secretory machinery involved in the movement cytotoxic granules of cytotoxic cells is critical, since defects in intracellular trafficking pathways constitute the basis for a large number of diseases which trigger death.