Resumo não disponível.

A associação de matrizes produzidas por electrospinning (ES) e células-tronco tem sido apontada como uma alternativa promissora na reconstituição de tecidos. A associação de moléculas bioativas, tais como o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) em nanofibras, permite a libertação controlada do fator incorporado. Isso pode contribuir para a migração e diferenciação celular, tornando-se uma opção interessante para a regeneração de tecidos. Neste trabalho foi analisado a influência da incorporação do VEGF em matrizes de poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) produzidas por ES. As análises de adesão, viabilidade celular e citotoxicidade dos biomateriais foram realizadas em três grupos de matrizes: (1) PLGA/BSA/VEGF, (2) PLGA/BSA, (3) PLGA 13%. As análises físico-químicas das matrizes como morfologia, diâmetro da fibra, degradabilidade, solvente residual, ângulo de contato, propriedades mecânicas, eficiência de incorporação e liberação controlada do VEGF foram realizadas. As nanofibras apresentaram superfície lisa sem beads com poros interconectados, semelhantes às da MEC. Observou-se melhora na adesão celular nas matrizes PLGA/BSA/VEGF quando comparadas aos demais grupos. As matrizes foram atóxicas para as células. Portanto, a associação entre matrizes de nanofibras com fatores de crescimento incorporados e células-tronco pode ser uma estratégia útil para a engenharia de tecidos (ET). / The association of matrices produced by electrospinning (ES) and stem cells has been considered as a promising alternative for the recovery of tissue. The association of bioactive molecules, such as vascular endothelial growth factor (VEGF) in nanofibres, allows the controlled release of the incorporated factor. It can contribute to cellular migration and differentiation, becoming an interesting option for tissue regeneration. In this work, the influence of VEGF incorporation on a poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) scaffold produced by ES was analyzed. The analysis of cell adhesion, cell viability and biomaterials cytotoxicity was carried out in three matrice groups: (1) PLGA/BSA/VEGF; (2) PLGA/BSA, (3) PLGA 13%. The physical-chemical analysis assessment of morphology, fiber diameter, residual solvent, degradability, contact angle, mechanical properties, loading efficiency and controlled release of VEGF were performed. Nanofibres showed smooth surfaces without beads with interconnected pores, similar to those of ECM. An improvement in cell adhesion was observed for the matrices of PLGA/BSA/VEGF when compared to the other groups. The matrices were non toxic for the cells. Therefore, the association between nanofibre matrices loaded with growth factors and stem cells may be a useful strategy for tissue engineering.

Os scaffolds produzidos por electrospinning (ES) são ferramentas bastante atrativas para a engenharia de tecidos (ET). Mimetizando fisicamente a matriz extracelular natural, esses scaffolds atuam como suportes para o desenvolvimento celular. Contudo, uma ocupação celular uniforme nesses scaffolds permanece sendo um problema a ser resolvido. Neste trabalho, células-tronco foram integradas a scaffolds de PLGA ainda durante a sua produção com o objetivo de se obter uma melhor distribuição celular por toda a estrutura do biomaterial. Para a obtenção desses scaffolds contendo células-tronco (SCCT), as técnicas de ES e bio-electrospraying (BES) foram associadas. Os SCCT foram caracterizados quanto a suas propriedades físico-químicas e biológicas. As fibras produzidas apresentaram-se lisas, bem distribuídas e com características mecânicas e de degradação adequadas a diferentes aplicações na ET. As células integradas aos SCCT mantiveram-se viáveis e foram capazes de se proliferar dentro dessa estrutura ao longo do período de cultivo. Cortes histológicos dos SCCT demonstraram que as células estavam bem distribuídas em toda a arquitetura do biomaterial. Esses resultados sugerem que a associação do ES e BES é uma técnica interessante para a produção de scaffolds tridimensionais integrados a células, tornando-se uma alternativa viável para uso na engenharia de tecidos. / Scaffolds produced by electrospinning (ES) are very attractive tools for tissue engineering (TE). These scaffolds act by mimicking physically the native extracellular matrix as carriers for cell growth. However, a uniform cell occupation of scaffolds remains a problem to be solved. In this study, stem cells were integrated into the PLGA scaffolds during their production in order to obtain better cell distribution throughout the biomaterial structure. The ES and bio-electrospraying (BES) techniques were associated to obtain these scaffolds containing stem cells (SCCT). The SCCT were characterized by their physicochemical and biological properties. Smooth and well distributed fibers, with suitable mechanical and degradation characteristics were obtained which allows different applications in TE. The cells incorporated onto SCCT remained viable and are capable of proliferating in this structure during cell culture. The cells were well distributed throughout the biomaterial architecture as observed in histological sections of SCCT. These results suggest that association between ES and BES is an interesting technique to produce 3D cell integrated scaffolds, making it a viable alternative for tissue engineering.

Durante as duas últimas décadas ocorreram progressos substanciais a respeito do entendimento da patofisiologia da cicatrização de feridas, e novas terapias têm sido desenvolvidas. Contudo, acelerar o processo de reparo continua sendo um desafio no campo da cirurgia plástica reconstrutiva. Tratamentos inovadores para melhorar a cicatrização e a regeneração cutânea são necessários e é nesse âmbito que as pesquisas com as células-troncos mesenquimais (MSCs) vêm ganhando espaço na última década. As MSCs foram estudadas em diversas áreas no que diz respeito ao seu efeito sobre a cicatrização de lesões e suas aplicações clínicas. O uso de MSCs, em feridas agudas ou crônicas, resultam em uma aceleração no processo cicatricial, em decorrência do impacto benéfico que elas trazem para todas as fases da cicatrização (inflamatória, proliferativa e remodelamento). O momento da aplicação das MSCs nas feridas e o número ideal de aplicações ainda não são bem conhecidos; alguns autores citam em sua metodologia o seu uso, mas dificilmente eles justificam ou concluem sobre as aplicações. Nessas condições, o presente trabalho visa apresentar os resultados da aplicação de células-tronco mesenquimais derivadas do tecido adiposo (ADSCs), em duas fases consecutivas da cicatrização – uma delas na fase inflamatória e outra na proliferativa. Além disso, irá indicar em qual dessas duas fases a aplicação de ADSCs é mais eficaz. Paralelamente a isso, definir se duas doses são mais eficientes do que apenas uma para promover a cicatrização durante sete dias de observação. Para tanto, os resultados foram divididos em dois artigos. O primeiro compara o momento da aplicação das células, ao passo que o segundo compara a eficiência de duas doses em relação a uma, ambos em um período de avaliação de sete dias. Portanto, no primeiro artigo o objetivo foi avaliar a ação das ADSCs no tratamento de feridas cutâneas agudas a fim de entender se o momento da aplicação das células resulta em diferença na cicatrização nos primeiros sete dias de lesão. As células-tronco foram isoladas de tecido adiposos de camundongos C57Bl/6 GFP+. Para tanto, foram utilizados 49 camundongos C57Bl/6 divididos em quatro grupos: Grupo I (GI/controle; n= 14); Grupo II (GII; n= 14): ADSCs injetadas ao no d0; Grupo III (GIII; n= 14): ADSCs injetadas no 3° dia após a indução da lesão (d3) e Grupo IV (GIV; n= 7): ADSCs injetadas no 5° dia após a indução da lesão (d5). As avaliações clínicas ocorreram nos dias 0, 3, 5 e 7 e as histopatológicas nos dias 5 e 7. Na metodologia proposta podemos observar que, em apenas sete dias de avaliação, o uso de ADSCs aumenta a vascularização, a formação de tecido de granulação, a colagenização e incrementa o número de folículos pilosos. Além disso, o momento da aplicação das células não repercutiu diferenças significativas na fase inflamatória e proliferativa do processo de cicatrização de feridas cutâneas. Contudo, os diferentes momentos de aplicação das ADSCs resultaram em efeitos benéficos para aspectos importantes dos mecanismos da cicatrização como a presença de tecido de granulação, a proliferação vascular, a colagenização e a presença de folículos pilosos, porém distintos. Assim, a escolha do momento de aplicação dependerá da necessidade de cada paciente e da intenção do médico quando estudos clínicos forem realizados. No segundo artigo o objetivo foi avaliar a ação das ADSCs no tratamento de feridas cutâneas agudas a fim de entender se duas aplicações consecutivas de células promovem a cicatrização nos primeiros sete dias de lesão. Para o experimento foram utilizados 49 camundongos C57Bl/6 divididos em quatro grupos: (G0/controle; n = 14); (G1D; n = 14): ADSCs injetadas no d0; Grupo 3D (G3D; n = 14): ADSCs injetadas no d0 e no d3; Grupo 5D (G5D; n = 7): ADSCs injetadas no d0 e no d5. As avaliações clínicas ocorreram nos dias 0, 3, 5 e 7 e as histopatológicas nos dias 5 e 7. Nesse estudo pode-se observar que o uso de duas doses de ADSCs aumenta a proliferação celular e vascular e uma aplicação incrementa o número de folículos pilosos em apenas sete dias de avaliação. Assim, é possível concluir que utilizar duas doses é mais eficiente do que uma quando avaliamos os sete primeiros dias de cicatrização. Além disso, não há diferença no momento de aplicação da segunda dose de ADSCs quando em um período de observação de 7d. / During the last two decades, there has been substantial progress regarding the understanding of the pathophysiology of wound healing, and new therapies were developed. However, in the field of reconstructive plastic surgery acceleration the repair process remains a challenge. It is necessary innovative treatments to improve healing and skin regeneration. In this context that research on mesenchymal stem cell (MSCs) have been gaining ground in the last decade in the field of reconstructive plastic surgery. MSCs studies in different areas with respect to their effect on the healing of injuries and their clinical applications. The use of MSCs in acute or chronic wounds, result in an acceleration of the healing process, due to the beneficial impact they bring to all stages of healing (inflammatory, proliferative and remodeling). The time of application of MSCs in the wounds and the ideal number of doses is still not very clear, and although some authors cite in their methodology use, they hardly justify or conclude about the applications. Under these conditions, the results of mesenchymal stem cells derived from adipose tissue (ADSCs) applied in two consecutive stages of healing - one in the inflammatory phase and another in proliferative. Also, indicate which of these two phases ADSCs of the application is more efficient. Parallel to this, determine whether two doses are more effective in promoting healing of a seven-day observation period. Therefore, the results were divided into two articles. The first compares the time of application of the cells, and the second article compares the efficiency of two doses instead one, both in seven days evaluation period. Therefore, the results were divided into two articles. The first compares the time of application of the cells, and the second article compares the efficiency of two doses instead one, both in seven days evaluation period. Therefore, in the first article we evaluated the action of ADSCs in the treatment of acute wounds in order to understand if the time of application of the cells results in difference in healing the first seven days of injury. The stem cells were isolated from adipose tissue of C57BL / 6 mice GFP +. Thus, we used 49 mice C57BL / 6 divided into four groups: Group I (GI / control, n = 14); Group II (GII; n = 14): ADSCs injected to the d0; Group III (GIII; n = 14): ADSCs injected on the 3rd day after the induction of injury (d3) and Group IV (GIV; n = 7): ADSCs injected on day 5 after induction of skin defect (d5). Clinical evaluations were performed on days 0, 3, 5 and 7 and the histopathology on days 5 and 7. In the proposed methodology, can be seen that the use of ADSCs increased vascularization, formation of granulation tissue, collagen deposition and increases the number of hair follicles in just seven days of evaluation. In addition, the time of application of the cells did not affect significant differences in the inflammatory and the proliferative phase of wound healing skin. However, the use of different periods ADSCs resulting in beneficial effects on important aspects of wound healing mechanisms. Such as the presence of granulation tissue, vascular proliferation, collagen deposition and the presence of hair follicles; but distinct. So, choose the time of application will depend on the needs of each patient and the doctor's intention. In the second article, we evaluated the action of ADSCs in the treatment of acute wounds in order to understand if two consecutive applications of cells promote healing in the first seven days of injury. For the experiment were used 49 C57BL / 6 mice divided into four groups: (G0 / control; n = 14); (G1D, n = 14): injected into the ADSCs d0; 3D Group (G3D; n = 14): ADSCs injected into the d0 and d3; 5D group (G5d; n = 7): ADSCs injected on d0 and d5. Clinical evaluations were performed on days 0, 3, 5 and 7 and the histopathology on days 5 and 7. In this study, it can be seen that the use of two doses of ADSCs enhances cell proliferation and vascular application and increases the number of follicles hair in just seven days of evaluation. Thus, we conclude that use two doses is more efficient than when evaluating the first seven days of healing. In addition, there is no difference in the time of the second treatment of ADSCs when an observation period of 7d.

Submitted by Leonardo Freitas (leonardo.hfreitas@ufpe.br) on 2015-04-13T13:31:16Z No. of bitstreams: 2 DISSERTAÇÃO ANA PATRICIA DE OLIVEIRA SOUZA.pdf: 737773 bytes, checksum: e610ffdcf3c473a5761efb9f7f680d1d (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-13T13:31:16Z (GMT). No. of bitstreams: 2 DISSERTAÇÃO ANA PATRICIA DE OLIVEIRA SOUZA.pdf: 737773 bytes, checksum: e610ffdcf3c473a5761efb9f7f680d1d (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2013-08-29 / Técnicas e biomateriais vêm sendo testados e utilizados, todos com suas vantagens e desvantagens, assim como limitações principalmente com relação ao tamanho da reconstrução e à necessidade de um leito receptor adequado, que proporcione a vascularização, nutrição e fornecimento de células em boa quantidade para o processo de neoformação óssea. Foi realizado um estudo in vitro associando células-tronco mesenquimais (CTMs) de cordão umbilical humano com uma biocerâmica fosfacálcica bifásica nano-micro-macro porosa de hidroxiapatita - beta tricálcio fosfato (HA-βTCP) densa. A proporção de hidroxiapatita (HA) foi de 60% e βTCP 40% com micro poros de 10 micra de diâmetro e diâmetro dos poros intercomunicantes de até 500 micra. O experimento foi mantido em estufa a 37º por 21 dias e as trocas do meio de cultura realizadas a cada 03 dias. As amostras foram analisadas semanalmente até 21 dias por microscópio invertido de contraste de fase e após os 21 dias foi realizada a análise citoquímica das amostras com o método do vermelho de alizarina. Os resultados demonstraram que a morfologia das CTMs em estudo condiz com o achado de que a estimulação das mesmas pela presença do biomaterial foi capaz de produzir células possivelmente secretoras demostrando que a associação da biocerâmica Osteosynt® com células-tronco mesenquimais de cordão umbilical humano é um campo bastante promissor na bioengenharia de tecido ósseo.

A associação das células-tronco (CT) com os biomateriais prometem ser os protagonistas para o futuro da medicina regenerativa no tratamento de lesões de tecidos e órgãos. No presente trabalho, as células-tronco foram cultivadas em matrizes construídas pela técnica de electrospinning, usando o polímero poli-D,L-ácido láctico (PDLLA) associado ou não à biomassa da microalga Spirulina (PDLLA/Sp), que possui componentes bioativos de interesse para a engenharia de tecidos (ET). As análises físico-químicas realizadas foram a avaliação da morfologia, do diâmetro das fibras, da degradabilidade, da rugosidade, do teor de solvente residual, do ângulo de contato com água, entre outros. A adesão e a proliferação celular, bem como a citotoxicidade do biomaterial também foram avaliados. As nanofibras obtidas apresentaram-se sem beads e com características semelhantes às da matriz extracelular natural (MEC) em termos de propriedades mecânicas e topográficas. Nos testes biológicos, verificou-se que as CTs aderiram mais e tiveram maior viabilidade nos scaffolds de PDLLA/Sp, quando comparado com as matrizes de nanofibras de PDLLA. Ambos os biomateriais mostraram-se atóxicos para as CTs. Pode-se concluir que as matrizes desenvolvidas neste trabalho apresentam as características necessárias de um novo biomaterial adequado para uso na ET. / The association of stem cells (SCs) with biomaterials promises to be the protagonist for future regenerative medicine in the treatment of tissue and organ lesions. Stem cells were cultivated in scaffolds constructed by the electrospinning technique, using poly-D,L-lactic acid (PDLLA) associated or not with Spirulina biomass (PDLLA/Sp), which has bioactive components of interest for tissue engineering (TE). Physicochemical analyses were performed, such as morphology, fiber diameter, degradability, residual solvent, roughness, contact angle with water, among others. SC adhesion and proliferation and scaffold cytotoxicity were also evaluated. Nanofibers without beads and with characteristics similar to the natural extracellular matrix (ECM) in terms of mechanical and topographical properties were obtained. In biological tests it was found that SCs adhered more and had greater viability in the PDLLA/Sp molds, when compared to the PDLLA scaffolds. The scaffolds were shown to be atoxic for the SCs. It can be concluded that the scaffolds developed in this work have the characteristics to be a new biomaterial suitable for use in TE.

As células-tronco mesenquimais (CTMs) tem sido o foco de diversos estudos nos últimos anos, devido ao seu alto potencial terapêutico. Muitos estudos in vitro tem demonstrado que essas células podem ser hipoimunogênicas, indicando a possibilidade de uso dessas células em transplantes alogênicos sem nenhum efeito colateral. No entanto, estudos in vivo demonstram que as CTMs podem gerar uma resposta imune quando transplantadas em hospedeiros imunocompetentes, inclusive com a formação de células T de memória. Isto indica que possívelmente as CTMs não sejam imunoprivilegiadas. O objetivo deste estudo foi avaliar o comportamento de CTMs pré-ativadas e não ativadas, quando transplantadas sob a cápsula renal de camundongos imunocompetentes. Células mesenquimais derivadas do tecido adiposo foram coletadas de camundongos transgênicos C57Bl/6-GFP. As células foram então caracterizadas por ensaios de diferenciação adipogênica e osteogênica, assim como por imunofenotipagem, realizada por citometria de fluxo. Os animais foram divididos em três grupos para o transplante. No grupo singênico, machos C57Bl/6 receberam células C57Bl/6-GFP. Nos grupos alogênicos, camundongos BALB/c foram transplantados com células C57Bl/6-GFP ou células C57Bl/6-GFP pré-ativadas através da incubação com 20 ng/mL IFN-γ e 30 ng/mL TNF-α antes do transplante. A análise histológica e a imunofluorescência demonstraram que nenhum dos animais que receberam o transplante alogênico apresentou células GFP+ 28 dias após o transplante. Aos dias 7 e 14 os animais apresentaram grandes infiltrados de células inflamatórias no local. Aos 28 dias este infiltrado esteve reduzido ou inexistente, indicando completa rejeição das células transplantadas. Os animais que receberam o transplante singênico apresentaram células GFP+ 100 dias após o transplante. A análise histológica e a imunofluorescência demonstraram que nenhum dos animais que receberam o transplante alogênico apresentou células GFP+ 28 dias após o transplante. Aos dias 7 e 14 os animais apresentaram grandes infiltrados de células inflamatórias no local. Aos 28 dias este infiltrado esteve reduzido ou inexistente, indicando completa rejeição das células transplantadas. Os animais que receberam o transplante singênico apresentaram células GFP+ 100 dias após o transplante. A quantificação de citocinas no plasma dos animais não demonstrou diferenças entre os grupos. Foi feito também um teste de proliferação de esplenócitos in vitro, co-cultivado com CTMs. O presente estudo demonstrou que as células alogênicas possuem a capacidade de provocar a proliferação dos esplenócitos, o que poderia explicar a rejeição ocorrida in vivo. / The immunomodulatory properties of mesenchymal stem cells (MSCs) have been the focus of several studies over the past few years due to their therapeutic potential. Many in vitro studies have shown that these cells can be hypoimmunogenic, indicating the possibility of using them in allogenic transplants without any harmful effects. However, recent in vivo studies show that these cells can generate an immune response when transplanted into an immunocompetent host, with the formation of memory T cells. This indicates that MSCs may not actually be immune privileged. The main goal of this study has been to evaluate the role of activated and non-activated MSCs when transplanted to the renal subcapsular space of allogenic mice. Adipose-derived mesenchymal stem cells were isolated from C57Bl/6-GFP transgenic mice. The cells were characterized by adipogenic and osteogenic differentiation assays and immunophenotyping was performed by flow cytometry. The animals were divided in three different groups for the transplant. Male C57Bl/6 mice were transplanted with C57Bl/6-GFP cells. In the allogenic groups, male BALB/c mice were transplanted with C57Bl/6-GFP cells or C57Bl/6-GFP cells pre-activated by incubation with 20 ng/mL IFN-γ and 30 ng/mL TNF-α for 20h before transplantation. Histological and immunofluorescence analysis of graft-bearing kidneys showed that no GFP+ cells were found in any allogenic transplant after 28 days. At 7 and 14 days, the transplant sites showed a massive proliferation of inflammatory cells, which vanished after 28 days, indicating complete rejection of the transplanted cells. The syngeneic transplant was not rejected, showing GFP+ cells through the whole period of study. Cytokine quantification in the blood plasma showed no difference between any of the groups. An in vitro splenocyte proliferation assay was performed, which indicates that MSCs alone can induce the activation of allogenic splenocytes. This could explain their rejection in vivo.

O transplante de Células Tronco Hematopoéticas alogênico é o tratamento curativo para diversas doenças hematológicas malignas, benignas e imunodeficiências, porém é acompanhado de grande morbidade e mortalidade. Uma das principais complicações é a doença do enxerto contra hospedeiro aguda que, se não controlada rapidamente, pode ser fatal. A Doença do Enxerto contra Hospedeiro aguda tem como tratamento o uso de esteróides, no entanto, em cerca de 30 a 50% dos casos se revela resistente à esta terapia, sendo considerados com Doença do Enxerto contra Hospedeiro aguda refratária ou resistente. O tratamento para Doença do Enxerto contra Hospedeiro aguda refratária ou resistente à esteróides não está ainda estabelecido sendo alta a mortalidade desses pacientes. Nesse contexto, começou-se a pesquisar o papel das células-tronco mesenquimais em pacientes com Doença do Enxerto contra Hospedeiro aguda resistente a esteróides, devido a capacidade de imunomodulação que aquelas possuem. As células-tronco mesenquimais são células-tronco adultas, com capacidade de autorrenovação, proliferação e diferenciação em diferentes linhagens celulares. As propriedades imunomoduladoras das células-tronco mesenquimais ainda não são totalmente conhecidas, mas sabe-se por estudos in vitro que elas interagem com diversos tipos celulares e citocinas, sendo sua aplicabilidade terapêutica muito pesquisada em diversas doenças inflamatórias; ainda assim, poucos se conhece sobre o efeito modulador das células-tronco mesenquimais in vivo. Inúmeros estudos piloto ou séries de casos sobre a aplicabilidade de célula-tronco mesenquimal para o tratamento da Doença do Enxerto contra Hospedeiro aguda foram publicados com resultados animadores, no entanto, não há até o momento na literatura estudo prospectivo randomizado em pacientes com Doença do Enxerto contra Hospedeiro aguda refratária comparando célula-tronco mesenquimal com o tratamento padrão. Finalmente, dentre os problemas decorrentes da intensa imunossupressão necessária para controlar a Doença do Enxerto contra Hospedeiro aguda resistente a esteroides, se destacam o aumento da incidência de infecções graves e a possibilidade da diminuição do Efeito Enxerto Versus Leucemia, ao qual se atribui o poder curativo do transplante de células-tronco hematopoético alogênico. As células Natural Killer com sua capacidade anti-tumoral inata, parecem ser os principais linfócitos envolvidos no Enxerto Versus Leucemia. Esse estudo teve como objetivo determinar o papel das células-tronco mesenquimais no tratamento da Doença do Enxerto contra Hospedeiro aguda resistente a esteroides comparando, de forma randomizada, com a terapia com anticorpos monoclonais padrão; e estudar aspectos relacionados à imunomodulação decorrente da terapia com célulatronco mesenquimal, in vivo, com particular atenção à citocinas a ao comportamento das células Natural Killer neste contexto. Nossos resultados confirmam que a infusão de célula-tronco mesenquimal levam a um aumento significativo da Interleucina 10 de efeito anti-inflamatório, e indicam pela primeira vez, que as células Natural Killer aumentam gradativamente durante e após as infusões de células-tronco mesenquimais tanto em proporção dentre os linfócitos, como no seu grau de ativação, resultando em uma atividade citotóxica significativamente elevada no 280 dia após o início das infusões. Postulamos, inclusive, que a ativação das células Natural Killer seria o mecanismo pelo qual não se observa aumento de recidiva ou das infecções com o emprego de infusões de células-tronco mesenquimais para o tratamento da Doença do Enxerto contra Hospedeiro aguda resistente a esteróides. / Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation is the curative therapy for several malignant and non-malignant hematological diseases as well as for immunodeficiences. Although curative, morbidity and mortality are high, been acute Graft versus Host Disease and infections amongst the most frequent life threatening complications. Treatment for acute Graft versus Host Disease is high dose steroids, however, 30 to 50% of the cases are resistant or refractory to it. Steroid resistant or refractory Graft versus Host Disease is a very difficult condition to treat and effective treatment strategies are still to be defined. In this scenario, the intravenous infusion of Mesenchymal Stem Cells has emerged as a tool to rescue patients from that condition because of its immunomodulatory potential. Mesenchymal Stem Cells are adult stem cells with capacity for self-renewal, proliferation and differentiation in mesodermal tissues, particularly chondrocytes, osteoblasts and fibroblasts. Its immunomodulatory proprieties and effectiveness in several inflammatory diseases are still a matter of intense debate and mostly studied in in vitro conditions. There are several published or ongoing studies on the role of Mesenchymal Stem Cells for steroid resistant acute Graft versus Host Disease, but none randomizing it with monoclonal antibody therapy frequently utilized as treatment with variable results, and complicated by an intense cellular immunodeficiency and severe infections. Since hematologic malignancies are the number one indication for allogeneic hematopoietic stem cell transplantation and the secondary Graft versus Leukemia effect mediated by immune effector cells recognized as responsible for its curative potential, an intense cellular immunodeficiency is not desirable in this scenario. In the last few years, Natural Killer cells have emerged as an effector involved in Graft versus Leukemia sparing the patient of Graft versus Host Disease, however, in vivo Mesenchymal Stem Cells and Natural Killer crosstalk have not been studied although severe infections and relapse are not increased after Mesenchymal Stem Cells cellular therapy. Here we show that, in spite of the results of most of the in vitro studies suggesting that Mesenchymal Stem Cells inhibits Natural Killer cell activity, in vivo evidences points to an increment of Natural Killer cells number and activity during the several Mesenchymal Stem Cells infusions, particularly at the 28th day after the beginning of infusions, thereby explaining the apparent infection and relapse protection promoted by Mesenchymal Stem Cells.

A medicina regenerativa é um campo fascinante e tem chamado a atenção, nos últimos anos, pelo crescente esforço multidisciplinar em busca de metodologias adequadas para a reposição de tecidos danificados no corpo humano. Entre as técnicas utilizadas para desenvolver matrizes para o uso em engenharia tecidual está o electrospinning. Essa técnica que permite a produção de nanofibras através do uso de forças electrostáticas e tem sido empregado para a produção de matrizes fibrosas. As células-tronco mesenquimais (CTM) são células-tronco adultas com alta plasticidade e por isto alvo de muitos estudos terapêuticos. O presente trabalho foi dividido em dois capítulos sendo que cada um tratou de um objetivo, como segue: (1) cultivar e diferenciar células-tronco mesenquimais em matrizes de nanofibras de poli(ácido lático-co-glicólico) (PLGA) produzidas através da técnica de electrospinning e investigar o envolvimento de receptores integrina- 1 no processo de adesão em matrizes de PLGA; (2) avaliar a viabilidade celular de células-tronco mesenquimais ou células mononucleares (CMNs) misturadas a uma solução de poli(álcool vinílico) (PVA) e submetidas a produção de fibras por electrospinning. No capítulo I, as CTM foram isoladas de camundongos da linhagem C57BL/6, cultivadas e submetidas a diferenciação condrogênica em matrizes de nanofibras de PLGA produzidas por electrospinning. Análises realizadas 24 horas após a semeadura demonstraram que as CTM eram responsívas e apresentavam morfologia semelhante a de fibroblastos com a presença de fibras de estresse de actina. O bloqueio dos receptores integrina- 1 reduziu (em cerca de 20%) a adesão celular e as observações demonstraram a perda das fibras de estresse de actina. Estes resultados demonstraram a habilidade das nanofibras de PLGA em ativar respostas celulares mediadas por adesão via integrina. No capítulo II foi avaliada a viabilidade de CTM e CMNs após terem sido processadas pelo electrospinning. As CTM foram extraídas da parede de cordão umbilical e as CMNs do sangue de cordão umbilical. Ambas as células foram misturadas a uma solução de PVA 10% e esta suspensão foi utilizada para produzir fibras pelo processo de electrospinning durante 30 minutos utilizando-se uma voltagem de 21 kV. Após o procedimento a viabilidade celular foi mensurada através de contagem celular com exclusão de células mortas por coloração com Trypan Blue. As CTM tiveram a viabilidade reduzida para 19.6%, e as CMNs para 8.38%. Os dados coletados sugerem a necessidade de mais estudos na busca de estratégias de proteção celular durante o electrospinning, uma vez que a elevada perda da viabilidade celular pode estar relacionada à alta viscosidade da solução polimérica, levando a redução do acesso ao meio nutritivo, associada aos efeitos do estresse mecânico e elétrico inerentes do procedimento. Os resultados gerais destes capítulos (1) demonstraram a habilidade das matrizes de nanofibras de PLGA em ativar respostas celulares via receptores integrinas- 1; (2) sugerem que a incorporação de células em matrizes fibrosas durante a produção de fibras através da técnica de electrospinning é um procedimento viável e pode ser utilizado como estratégia para a melhor distribuição celular na matriz formada. Juntamente, estes dados contribuem para o entendimento do comportamento das CTM em matrizes biodegradáveis e biocompatíveis produzidas por electrospinning, as quais podem ser utilizadas como material carreador em tratamentos clínicos envolvendo transplante celular. / Regenerative medicine is an amazing field that has called attention, in the last years, due to the multidisciplinary efforts to find suitable methodologies to regenerate damage tissues. Electrospinning is an important technique used to produce nanofibers and is employed to develop fibrous scaffolds. Mesenchymal stem cells (MSC) are adult stem cells with high plasticity and, for this reason, are widely studied in therapeutic approaches. The present study is composed by two chapters, with different aims, as follow: (1) culture MSC on poly(D, Llactide- co-glycolide) (PLGA) nanofiber scaffolds and induce them to condrogenic differentiation and, analyze the influence of the integrin- 1 receptor in the adhesion of MSC on PLGA scaffolds; (2) analyze the viability of MSC and mononuclear cells (MNCs) mixed to a PVA solution after electrospinning. In the Chapter I, MSCs were isolated from C57BL/6 mice, cultured on PLGA scaffold produced by electrospinning technique and differentiated into chondrogenic lineage. After seeding, MSCs were responsive and become flattened with fibroblast-like morphology demonstrated by the presence of actin stress fibers. Integrin- 1 receptor blockage reduced (about 20%) cell adhesion with loss of actin stress fibers, demonstrating the ability of PLGA nanofiber to trigger integrin receptor-mediated cell adhesion. In the Chapter II, the viability of MSC and MNC after electrospinning were analyzed. MSC were extracted from the wall of the umbilical cord, and MNC from the umbilical cord blood. Cells were resuspended in a solution of poly(vinil alcohol) (PVA) 10% and subjected to electrospinning during 30 minutes under a voltage of 21kV. Cell viability was assessed before and after the procedure by exclusion of dead cells by Trypan Blue staining. After electrospinning the MSC viability reduced to 19.6%, and the MNCs viability to 8.38%. These data suggest the need for more investigations looking for strategies to protect cell from the damages caused by electrospinning, as the loss of viability can be related to the high viscosity of the polymeric solution which reduced the access to nutrients associated to the electric and mechanical stress during electrospinning. The results of both chapters (1) demonstrated the ability of PLGA nanofiber to trigger integrin receptor-mediated cell adhesion; (2) suggested that the cellular incorporation into fibrous scaffolds produced by electrospinning is a viable process and can be used to improve the cellular distribution into scaffolds. The present data contribute to the understanding of MSCs´ behavior on these biodegradable and biocompatible scaffolds that can be used as carriers in treatments involving cell transplantation.

Submitted by SARAH MARIA BARNEZE COSTA null (sarahbarneze@hotmail.com) on 2017-04-27T05:04:44Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Final para o Repositório da Unesp - Aluna Sarah Barneze.pdf: 2655925 bytes, checksum: 922eb75a13d7d9ff08b061e4361675e1 (MD5) / Rejected by Luiz Galeffi (luizgaleffi@gmail.com), reason: Solicitamos que realize uma nova submissão seguindo a orientação abaixo: Incluir o número do processo de financiamento nos agradecimentos da dissertação/tese. Corrija esta informação e realize uma nova submissão com o arquivo correto. Agradecemos a compreensão. on 2017-05-03T14:13:29Z (GMT) / Submitted by SARAH MARIA BARNEZE COSTA null (sarahbarneze@hotmail.com) on 2017-05-03T16:11:16Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Final para o Repositório da Unesp - Aluna Sarah Barneze.pdf: 2656758 bytes, checksum: 41757de66dd6c78c3165310b774a5fcb (MD5) / Approved for entry into archive by Luiz Galeffi (luizgaleffi@gmail.com) on 2017-05-03T16:16:11Z (GMT) No. of bitstreams: 1 costa_smb_me_bot.pdf: 2656758 bytes, checksum: 41757de66dd6c78c3165310b774a5fcb (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-03T16:16:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 costa_smb_me_bot.pdf: 2656758 bytes, checksum: 41757de66dd6c78c3165310b774a5fcb (MD5) Previous issue date: 2017-02-16 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A regulação da remodelação óssea ocorre por meio de fatores locais e sistêmicos. Entre os fatores locais estão as citocinas: Receptor Activator of Nuclear Factor Kappa B Ligand (RANKL), presente nos osteoblastos, e Receptor Activator of Nuclear Factor Kappa B (RANK), presente nos osteoclastos, além de outras citocinas como o Tumor Necrosis Factor Alpha (TNF-α) que podem agir no processo de deposição e/ou reabsorção óssea in vivo. Entre os fatores sistêmicos que participam da remodelação óssea estão os hormônios estrógeno (E2) e triiodotironina (T3). O objetivo do trabalho foi verificar a ação do E2, infrafisiológico (simulando a menopausa) e T3, suprafisiológico (simulando hipertireoidismo) em osteoblastos humanos derivados de células troncos mesenquimais (CTMs) na síntese proteica de RANKL e TNF-α. Os osteoblastos foram incubados por 72 horas na presença de E2 em dose fisiológica (E2F/10-8M) e infrafisiológica (E2I/10-9M), e T3 em dose fisiológica (T3F/10-9M) e suprafisiológica (T3S/10-8M), e quantificada a matriz mineralizada óssea e a síntese proteica de RANKL e TNF-α por Western Blot. A análise estatística dos dados foi realizada pelo teste de variância ANOVA complementada pelo teste de Tukey, sendo o nível de significância considerado p<0,05. O tratamento de E2 em dose E2F (1,96± 0,48; p<0,05) e E2I (3,18±0,31; p<0,001) elevou a síntese proteica de RANKL comparado ao controle (C) (1,00±0,32), e de TNF-α em dose de E2F (3,61±0,45; p<0,05) e E2I (2,45±0,07; p<0,05) também aumentou em relação ao C (1,13±0,19). Assim como o E2, o T3 elevou os níveis proteicos de RANKL em T3F (1,18±0,10; p<0,05) e T3S (1,14±0,004; p<0,05) comparado ao controle (1,00±0,02), porém, TNF-α diminui em dose de T3S (0,82±0,09; p<0,05) relacionado ao T3F (1,00±0,09) e C (0,99±0,04). Com isso, E2I diminuiu a matriz mineralizada óssea e aumentou a síntese de ambas as proteínas estudadas, o que nos leva a especulação de que a reabsorção óssea observada na menopausa seja via RANKL e TNF-α. Por outro lado, na mimetização de hipertireoidismo com o T3S, observamos diminuição da matriz mineralizada óssea, supressão da síntese proteica de TNF-α e aumento de RANKL, o que nos leva a inferir que o mecanismo de reabsorção óssea no hipertireoidismo seja via RANKL. / The regulation of bone remodeling is intermediated by local and systemic factors. The cytokines are among the local factors: Receptor Activator of Nuclear Factor Kappa B Ligand (RANKL), present in osteoblasts, and Receptor Activator of Nuclear Factor Kappa B (RANK), present in osteoclasts, in addition to other cytokines such as Tumor Necrosis Factor Alpha (TNF-α) that can act in the process of bone deposition and/or resorption in vivo. Hormones are among the systemic factors involved in bone remodeling, estrogen (E2) and triiodothyronine (T3). The aim of the study was to verify the action of E2, infraphysiological (simulating menopause) and T3, supraphysiological (simulating hyperthyroidism) in human osteoblasts derived from mesenchymal stem cells (CTMs) in the protein synthesis of RANKL and TNF-α. Osteoblasts were incubated during 72 hours in the presence of E2 at physiological dose (E2F/10 -8 M) and infraphysiological (E2I/10 -9 M), and T3 at physiological (T3F/10 -9 M) and supraphysiological (T3S/10-8 M) and quantified the bone mineralized matrix and the protein synthesis of RANKL and TNF-α by Western Blot. Statistical analysis of the data was performed by the ANOVA variance test complemented by the Tukey test, and the significance level was considered p<0.05. The treatment of E2F in E2F dose (1.96 ± 0.48, p<0.05) and E2I (3.18 ± 0.31; p <0.001) increased RANKL protein synthesis compared to control (C) (1.00 ± 0.32), and TNF-α in the dose of E2F (3.61 ± 0.45; p<0.05) and E2I (2.45 ± 0.07; p <0.05) also increased in relation to C (1.13 ± 0.19). As with E2, T3 increased RANKL protein levels in T3F (1.18 ± 0.10, p <0.05) and T3S (1.14 ± 0.004; p <0.05) compared to control (1 , 00 ± 0.02), but TNF-α decreased in dose T3S (0.82 ± 0.09; p <0.05) related to T3F (1.00 ± 0.09) and C (0, 99 ± 0.04). Thus, E2I decreased the bone mineralized matrix and increased the synthesis of both proteins studied which leads to speculation that bone resorption observed at menopause by RANKL and TNF-α pathway. On the other hand, in the mimicry of hyperthyroidism with T3S, we observed a reduction of the bone mineralized matrix, suppression of TNF-α protein synthesis and increase of RANKL, which leads us to infer that the mechanism of action for bone resorption in hyperthyroidism is by RANKL. / FAPESP: 2014/15529-0