Os defeitos da calota craniana causados por traumas severos, neoplasias, cirurgias ou deformidades congênitas representam um grande desafio para os cirurgiões. O uso de enxertia óssea autóloga continua sendo o método de tratamento padrão ouro, embora apresente morbidade na área doadora e seja considerado insuficiente para reconstrução de grandes defeitos. Recentemente, com o advento da bioengenharia tecidual, novas expectativas surgiram na regeneração óssea. O objetivo deste estudo foi desenvolver um modelo experimental em ratos para o estudo de deformidades craniofaciais e verificar se as células-tronco humanas provenientes de dentes decíduos seriam capazes de regenerar defeitos críticos em calota craniana de ratos não imunossuprimidos. Foram realizados dois defeitos ósseos de espessura total com diâmetro de 5 x 8 mm na região biparietal. O lado esquerdo foi preenchido com membrana de colágeno, enquanto o lado direito com membrana de colágeno associada a células-tronco humanas provenientes de dentes decíduos. Essas células foram caracterizadas previamente in vitro como células mesenquimais. A eutanásia dos animais foi realizada no 7º, 21º, 30º e 60º dia de pós-operatório e amostras de tecido ósseo foram extraídas para realização da análise histológica. A análise da presença de células humanas no novo osso formado foi confirmada através do estudo molecular. A linhagem de células-tronco humanas provenientes de dentes decíduos foi positiva para células-tronco mesenquimais e sua diferenciação em tecido ósseo também foi evidenciada in vitro. Foi observada a formação óssea após 21 dias de cirurgia nos dois lados, sendo o lado direito um osso mais maduro. A reação da cadeia de polimerase para DNA humano foi amplificada apenas no lado direito demonstrando que existiam células humanas nesse novo osso formado. O uso de células-tronco de dentes decíduos humanas em ratos não imunossuprimidos não evidenciou rejeição durante o período estudado. Os achados sugerem que o modelo experimental descrito poderá ser utilizado para o estudo dos defeitos ósseos cranianos em cirurgia craniofacial e que o uso de células-tronco humanas provenientes de dentes decíduos associado à membrana de colágeno parece representar uma importante estratégia para a reconstrução de tecidos ósseos e seu uso pode ser considerado uma opção para o reparo de grandes defeitos ósseos cranianos. / Repair of bone defects caused by severe trauma, resection of tumors, and congenital deformity remains a big challenge to surgeons. As a gold standard for the treatment of bone defects in clinic, autologous bone grafts are usually limited by considerable donor site mobility and available supply of tissue that can be harvested. Recently, tissue engineering has become a promising approach for bone regeneration. The main aim of this study is to create an experimental surgical protocol and evaluate the capacity of human dental pulp stem cells isolated from deciduous teeth, to reconstruct critical size cranial bone defects in nonimmunosuppressed rats. Bilateral 5 x 8 mm cranial full-thickness defects of parietal bone were created. The left side was supplied with collagen membrane only and the right side with collagen membrane and human dental pulp stem cells. Cells were used after in vitro characterization as mesenchymal cells. Animals were euthanized at 7, 21, 30 and 60 days postoperatively and cranial tissue samples were taken from the defects for histologic analysis. Analysis of the presence of human cells in the new bone was confirmed by molecular analysis. The human dental pulp stem cells lineage was positive for the four mesenchymal cell markers tested and showed osteogenic in vitro differentiation. The bone formation was observed 21 days after surgery on both sides, but a more mature bone was present in the right side. Human DNA was polymerase chain reaction-amplified only at the right side, indicating that this new bone had human cells. The use of human dental pulp stem cells in nonimmunosuppressed rats did not cause any graft rejection during this period. Our findings suggest that surgical protocol created may ultimately be used in experimental studies of cranial bone defects in craniofacial surgery and the use of human dental pulp stem cells together with collagen membrane seems to be a promising strategy for in vivo bone tissue reconstruction and their use might provide an option to repair human large cranial bone defects.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:13:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TESE Julia de Miranda Moraes.pdf: 2895250 bytes, checksum: e061f736f6922f781b2c671bf4f90f32 (MD5) Previous issue date: 2012-08-17 / The aim of this work was to evaluate the regeneration of equine ulnar nerves submitted to neurotomy, silicone tubing and cell therapy with bone marrow mononuclear cells fraction (MCF) or adipose derived mesenchymal stem cells (ADSC). Fifteen adult horses were divided into three groups with five animals each: control group (CG) with the use of saline solution, group with FCM deposition and group with ADSC deposition. The same surgical procedure was performed in all groups, using both nerves of each animal (right and left), establishing two moments of biopsy: on the 13th week on the right limb (CG1, MCF1 and ADSC1) and on the 26th week on the left limb (CG2, MCF2 and ADSC2). The MCF and ADSC were obtained respectively, from bone marrow and adipose tissue from each animal, both used as an authologous implant. After 13 and 26 weeks, biopsies were performed in all groups and immediately it was made some fragments slide imprints for viewing the nanocrystal fluorescent label. The fragments were fixed in 10% buffered formalin for histological analysis, with HE, luxol fast blue, Masson's trichrome, immunohistochemistry against the antibodies neurofilament (NF), S-100, FGF-2 and GDNF. Microscopically it was observed the presence of axonal growth, connective tissue, inflammatory infiltrate, Schwann cells, neural growth factors, myelin sheath and wallerian degeneration. For histologic analysis, it was established qualitative scores and for immunohistochemistry it was performed quantitative analysis with Image J program. It was observed wallerian degeneration reduction, better fascicular reorganization, new collagen increased, myelin sheath early formation, and NF antibody stronger staining in the experimental groups compared to CG. The ADSC group presented the best results than the other groups, showing ADSCs efficiency compared to MCF and CG for peripheral nerve regeneration. However, it was proved a longer time necessity to occur complete regeneration of peripheral nerve after injury. / Este trabalho teve por objetivo avaliar a regeneração do nervo ulnar de equinos, submetidos à neurotomia, tubulização com tubo de silicone e terapia celular com fração de células mononucleares da medula óssea (FCM) ou células-tronco mesenquimais do tecido adiposo (ADSC). Foram utilizados 15 equinos adultos alocados em três grupos, com cinco animais em cada: grupo controle (GC) com utilização de soro fisiológico; grupo com deposição de FCM; e grupo com deposição de ADSC. Foi realizado o mesmo procedimento cirúrgico em todos os grupos, utilizando-se os dois nervos de cada animal (direito e esquerdo), e estabelecido dois momentos de biopsia: na 13ª semana com biopsia no membro direiro (GC1, FCM1 e ADSC1) e na 26ª semana com biopsia no membro esquerdo (GC2, FCM2 e ADSC2). A FCM e a ADSC foram obtidas respectivamente, da medula óssea e tecido adiposo de cada aninal, ambos utilizados como implantes autólogos. Após 13 e 26 semanas, realizaram-se as biopsias de todos os grupos e imediatamente, faziam-se imprints dos fragmentos para visualização do marcador fluorescente nanocristal. Os fragmentos foram fixados em formol tamponado a 10%, para análise histológica, com as coloraçãoes de HE, luxol fast blue, tricrômio de Masson e imuno-histoquímica com os anticorpos neurofilamento (NF), S-100, FGF-2 e GDNF. Microscopicamente avaliou-se a presença de proliferação axonal, tecido conjuntivo, infiltrado inflamatório, células de Schwann, fatores de crescimento neurais, bainha de mielina, e degeneração walleriana. Para a análise histológica estabeleceram-se escores qualitativos e para a imuno-histoquímica realizou-se análise quantitativa com o programa Image J. Foi observada diminuição da degeneração walleriana, melhor reorganização fascicular, aumento do colágeno novo, início de formação de bainha de mielina, além de maior marcação do anticorpo NF nos grupos experimentais em relação ao GC. O grupo ADSC apresentou melhores resultados em relação aos demais, enfatizando a eficiência das ADSCs em relação à FCM e ao GC para a regeneração nervosa periférica. Porém, há a necessidade de um tempo maior para ocorrer completa regeneração do tecido nervoso periférico após lesão.

INTRODUÇÃO: As células-tronco hematopoiéticas (CTH) do sangue do cordão umbilical (SCU) têm sido utilizadas com sucesso para o tratamento de doenças malignas e não malignas. No entanto, algumas unidades de SCU podem apresentar baixa quantidade de células nucleadas totais (CNT). Algumas abordagens têm sido sugeridas para evitar problemas em relação à baixa concentração de CTH no transplante, como a administração de duas unidades de SCU para o paciente e a expansão ex vivo de CTH. OBJETIVO: Avaliar as taxas de proliferação celular na expansão ex vivo do SCU em sistema de cocultura com células-tronco mesenquimais (CTM) obtidos a partir de diferentes fontes com alta e baixa confluência e adicionando-se ou não coquetel de citocinas no meio de cultura. MÉTODOS: Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética de Pesquisa (CAPPesq) do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da USP. A coleta do SCU (n =10) foi realizada após o nascimento do bebê e expulsão da placenta. O processamento foi realizado utilizando o método de redução de volume, o qual consiste em depleção de eritrócitos. As amostras de CTM provenientes do endotélio vascular do cordão umbilical foram obtidas de doadores diferentes (n=3) e o tecido adiposo (n=3) do inventário do LIM-31. A expansão das CNT e das células com expressão de marcadores CD133+/CD34+ foram observados depois de sete dias de cultura. Além disso, o ensaio para análise de unidades de formadoras de colônias (UFC) foi realizado em todas as amostras antes e depois da expansão do SCU. Para a expansão em sistema de cocultura foi separado dois grupos para ambas as fontes de CTM (Grupo I - cocultura com adição de coquetel de citocinas vs. Grupo II - cocultura sem citocinas). RESULTADOS: Após sete dias, no grupo I com cocultura confluente, a taxa de proliferação de CNT foi duas vezes maior ao comparar com cocultura subconfluente (35 vs. 16 vezes). No mesmo grupo também foi possível evidenciar elevada taxa de proliferação de células CD133+/CD34+. O índice de proliferação das UFC no grupo I aumentou até oito vezes. A cocultura subconfluente tanto do endotélio vascular do cordão umbilical como do tecido adiposo apresentou menor rendimento em comparação as CTM confluentes. A expansão das células na presença de citocinas apresentou maior proliferação celular ao comparar às coculturas sem adição de citocinas. CONCLUSÃO: Este estudo mostrou que para alto rendimento de células do SCU, o sistema de cocultura requer adição de coquetel de citocinas e CTM confluente independentemente da fonte utilizada / INTRODUCTION: Umbilical cord blood (UCB) hematopoietic stem cells have been successfully used for the treatment of both malignant and non-malignant diseases. Nevertheless, some UCB units could have low total nucleated cells (TNC) dose. Several approaches have been suggested to avoid inadequacy problems of hematopoietic stem cells (HSC) number for transplantation, such as administration of two UCB units to the patient and HSC ex vivo expansion. OBJECTIVE: Evaluate UCB ex vivo expansion proliferative rates in a high and low mesenchymal stem cells (MSC) confluence feeder layer obtained from different MSC sources and by adding or not cytokines cocktail into the medium. METHODS: This study was approved by the Research Ethic Committee (CAPPESQ) of Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da USP. The collection of UCB (n=10) was made after delivery of the infant and the expulsion of placenta. Processing was performed using volume reduction method which consists in red blood depletion. MSC samples from umbilical cord endothelium were obtained from three different donors and adipose tissue (n=3) obtained from LIM31\'s pattern inventory. The total nucleated cell (TNC), expression of hematopoietic surface markers such as CD133+/CD34+ were observed after seven days of culture. Beyond that, colony forming unit assay (CFU) was performed before and after UCB expansion. The expansion by coculture method was observed in two groups (Group I - coculture with cytokines cocktail added vs. Group II- coculture without cytokines cocktail) for both MSCs sources. RESULTS: After seven days, analysis of confluent coculture showed that TNC proliferation rate ware almost 2 times higher than in subconfluent coculture (35 vs. 16-fold) in Group I and also revealed higher proliferative rate in CD133+/CD34+ cells considering. CFU showed similar increase after seven days of culture in comparison of day 0 (up to 8-fold). Subconfluent coculture for both umbilical cord endothelium and adipose tissue showed lower yield compared with those with high MSC confluence. The expansion in the presence of cytokines showed higher cell proliferation compared to the cocultures without addition of cytokines. CONCLUSION: This study showed that coculture system may require the addition of cytokines cocktail in the media and confluent MSC regardless of source for high yield of UCB cells

Uma das principais complicações inerentes ao transplante de células-tronco hematopoiéticas é a doença do enxerto contra hospedeiro (DECH), que se trata da resposta imunológica contra os tecidos do receptor pelas células T do doador contidas no transplante. Este quadro é responsável por 15-30% das mortes que ocorrem após o transplante de células-tronco hematopoiéticas alogênicas. Apesar dos recentes avanços para reduzir a incidência de DECH através de alternância de regimes profiláticos reduzindo a intensidade do condicionamento, são poucos os tratamentos efetivos. Recentemente, o potencial imunomodulador das células-tronco mesenquimais tornou-se o foco de vários estudos. Alguns autores descreveram a atuação destas células na redução da resposta imunológica através da inibição da proliferação de células T, representando um novo potencial terapêutico para DECH. Mediante esse conhecimento, investigamos o papel das células-tronco mesenquimais na proliferação, apoptose e na produção de citocinas por linfócitos T. Nossos resultados mostraram que a presença de células-tronco mesenquimais nas culturas regulam negativamente a proliferação de linfócitos T estimulados de forma independente de contato e a apoptose de forma parcialmente dependente de contato. Observamos também que linfócitos T virgens em diferenciação para Th17 na presença de células-tronco mesenquimais apresentam redução na capacidade de produzir duas importantes citocinas efetoras implicadas na DECH, o interferon gama (IFN-y) e a interleucina 17A (IL-17A). Investigamos se a prostaglandina E2 (PGE2), por depletar triptofano, estava envolvida com a diminuição de proliferação de linfócitos T quando em cultivo com células-tronco mesenquimais. Utilizamos nas culturas a indometacina (IDT), um anti-inflamatório bloqueador de cicloxigenase (COX 1 e 2) e portanto da via da PGE2. Entretanto, observamos que o bloqueio da via da PGE2 inibia ainda mais a proliferação de linfócitos T e isto ocorria de acordo com a dose de IDT. Com o resultado deste experimento concluímos que, se a proliferação de linfócitos é inibida pela depleção de triptofano do meio, ela não ocorre via PGE2. Entretanto ainda não conseguimos esclarecer se esta via é ativada por outras moléculas, ou se é esta a via realmente responsável pela inibição da proliferação de linfócitos. No que concerne a via de inibição de apoptose, mostramos que a cadeia alpha do receptor de IL-7 (CD127) está aumentada na superfície de linfócitos T quando em presença de células-tronco mesenquimais. Verificamos que o bloqueio de IL-7 nas culturas aumenta a apoptose em linfócitos, bem como sua adição causa diminuição de apoptose. Identificamos a produção intracelular de IL-7 nas células-tronco mesenquimais, relacionando estas células e IL-7 com a inibição de apoptose em linfócitos T nestas condições. Este trabalho gerou dados que permitiram a compreensão de alguns possíveis mecanismos pelos quais as MSCs podem atuar sobre linfócitos T ativados e/ou alorreativos; mecanismos estes que podem ser utilizados como base para futuras investigações na elucidação e prevenção da DECH / A major complication after hematopoietic stem cell transplantation is the graft versus host disease (GVHD), which is an immunological response of transplanted donor T cells against the recipient tissues; this outline is responsible for 15-30% of deaths that can occur after allogeneic hematopoietic stem cells transplant. Despite recent advances in reducing GVHD incidence by alternating prophylactic regimens, thus reducing the intensity of conditioning, there are few effective treatments. Recently, the immune modulatory potential of mesenchymal stem cells has become the focus of several studies. Some authors described the role of these cells in reducing immune response by inhibiting T cell proliferation, representing a potential new therapy for GVHD. Through this knowledge, we investigated the mesenchymal stem cells role into T lymphocytes proliferation, apoptosis and cytokine production. Our results showed that the presence of mesenchymal stem cells into the cultures downregulates the proliferation of stimulated lymphocytes independent of contact and apoptosis of stimulated lymphocytes in partially contact-dependent manner. We also observed during naive T lymphocytes differentiation into Th17 cells, that the mesenchymal stem cell presence reduces the lymphocyte ability in producing the GVHD major effectors cytokines, interferon gamma (IFN-y) and interleukin-17A (IL-17A). We investigated whether prostaglandin E2 (PGE2) was involved in the reduction of T lymphocytes proliferation, when cultured with mesenchymal stem cells, by tryptophan depletion. Indomethacin (IDT), an anti-inflammatory drug blocker of cyclooxygenase (COX 1 and 2) and therefore PGE2 pathway, was used. However, we observed that, according to IDT dose, blocking this pathway further inhibited lymphocyte proliferation. With this result we conclude that if lymphocyte proliferation is inhibited by tryptophan depletion, it does not occur via PGE2. However, we still cannot say whether this pathway is activated by other molecules, or if this pathway is actually responsible for T lymphocytes proliferation inhibition. Regarding the apoptosis inhibition in T lymphocytes, we show that the IL-7 receptor alpha chain (CD127) is increased on the surface of T lymphocytes when in the presence of mesenchymal stem cells. We found that IL-7 blockage in the cultures increases apoptosis in T lymphocytes, as well as their addition causes apoptosis decrease. We also identified the intracellular production of IL-7 on mesenchymal stem cells, linking these cells and IL-7 directly with apoptosis inhibition in T lymphocytes under these conditions This work has generated data that allowed the understanding of some possible mechanisms by which MSCs can act on activated and/or alloreactive T lymphocytes; mechanisms that can be used as a basis for future research in the elucidation and prevention of GVHD