Au cours de ce projet, nous avons émis l'hypothèse que les cellules cancéreuses en circulation ursupent les mécanismes utilisés par les cellules du système immunitaire pour lier l'endothélium, le traverser et former des métastases. En ce sens, nous avons observé en conditions dynamiques que la E-sélectine est nécessaire à l'adhérence puis au roulement des cellules cancéreuses de côlon HT-29 à la surface des cellules endothéliales. L'utilisation de divers variants de la Esélectine nous a permis de confirmer l'importance de sa portion cytoplasmique pour l'adhérence et le roulement des cellules cancéreuses. En utilisant une chambre à flux laminaire et un substitut vasculaire tridimensionnel construit par génie tissulaire, nous avons identifié trois mécanismes de diapédèse. Ainsi, 1) la majorité des cellules cancéreuses ne complètent pas le processus de diapédèse et restent au niveau des cellules endothéliales (diapédèse de type mosaïque), 2) certaines passent aux jonctions interendothéliales (diapédèse paracellulaire), 3) tandis que d'autres passent au travers de la cellule endothéliale (diapédèse transcellulaire). Nous avons aussi déterminé que l'activation de la E-sélectine conduit à celle des MAP kinases ERK et p38. Au moyen d'approches génétiques et d'inhibiteurs chimiques, nous avons par la suite démontré que l'activation de ces voies par la E-sélectine est requise pour la diapédèse des cellules cancéreuses, via le mécanisme paracellulaire. L'activation de p38 régule la diapédèse des cellules HT-29 en modulant la phosphorylation de la myosin light chain (MLC) et la formation de fibres de tension. D'autre part, l'activation de ERK par la E-sélectine régule l'ouverture des jonctions interendothéliales en initiant l'activation de c-Src et la dissociation du complexe VEcadhérine/p-caténine. Nous concluons que la E-sélectine est essentielle à l'adhérence des cellules cancéreuses de côlon HT-29 et que sa stimulation régule l'extravasation des cellules cancéreuses en initiant l'activation des voies MAP kinases ERK et p38 qui toutes deux contribuent à moduler l'intégrité de la barrière endothéliale et la diapédèse de type paracellulaire. / In the present work, we have investigated the mechanisms by which adhesion of colon cancer cells to E-selectin expressed by endothelial cells regulates the endothelial barrier function and modulates cancer cell transmigration. Several Ones of evidence indicate that cancer cells could use the inflammatory system to interact with the endothelium, to transmigrate and form metastases. Accordingly, we have observed in static and dynamic conditions that E-selectin was essential for the adhesion and rolling of HT-29 colon cancer cells on endothelial cells. By using various E-selectin constructs, we further found that both processes required the cytoplasmic portion of E-selectin. Moreover, the use of a laminar flux chamber and a vascular tridimensional substitute constructed by tissue engineering, permits to identify three diapedesis mechanisms. 1) The majority of cancer cells did not complete the diapedesis process and remained between endothelial cells (mosaic diapedesis), 2) some migrated at interendothelial junctions (paracellular diapedesis) and 2) some passed through an endothelial cell (transcellular diapedesis). We have also found that the activation of E-selectin by the adhesion of HT-29 cells, in a static or a dynamic conditions, resulted in an increased activity of ERK and p38 MAP kinases. In turn, activation of p38 and ERK enhanced transendothelial permeability and paracellular migration of HT-29 cells. We also obtained evidence suggesting that p38-mediated increase in transendothelial permeability and cancer cell migration depends on a myosin light chain (MLC) phosphorylation-mediated formation of stress fibers. On the other hand, the activation of ERK by E-selectin modulated the opening of interendothelial spaces by initiating the activation of c-Src kinase activities and the dissociation of the VE-cadherin/p-catenin complex. Thus, we conclude that E-selectin is essential for HT-29 cancer cells adhesion and that its activation regulates the extravasation of colon cancer cells by initiating p38- and ERK-dependent mechanisms that both contribute to the regulation of the integrity of the endothelial barrier and paracellular diapedesis.

Le cancer du côlon (CC) est le 3ème cancer le plus fréquent en France avec plus de 40 000 nouveaux cas diagnostiqués par an. Vingt-cinq à 40% des CC sont diagnostiqués à un stade II. La majorité des CC de stade II ne nécessite pas de traitement adjuvant par chimiothérapie, cependant, environ 20% de ces patients vont évoluer avec l'apparition de métastases viscérales. Or, seuls les facteurs histopathologiques ou la détermination du statut avec instabilité des microsatellites (type MSI) permettent d’orienter ou non vers une chimiothérapie complémentaire à la chirurgie. La majorité des CC de stade II ont un profil avec stabilité des microsatellites (type MSS) et les facteurs pronostiques actuels sont mal définis. La découverte de marqueurs pronostiques pour ces patients est donc un enjeu majeur de la prise en charge du CC. De cette façon, notre équipe a mis en évidence l’existence d’une signature moléculaire sur 166 tumeurs, portant sur l’expression différentielle de 7 gènes, entre les tumeurs de CC de stade II et les tumeurs de CC de stade III. Ensuite, le statut mutationnel des gènes KRAS et BRAF, effectué sur 803 CC métastatiques, a mis en évidence que la mutation BRAF V600E est principalement associée au CC de type MSS suggérant un impact pronostique négatif. Enfin, l’étude du statut du gène APC (mutations, LOH, hyperméthylation du promoteur) sur 183 CC de stade II montre que ce gène n’est vraisemblablement pas impliqué dans le développement de métastases du CC. En perspective de ce travail, l’arrivée de techniques de séquençage de nouvelle génération permet d’envisager un traitement adapté à la tumeur, orientant vers une médecine personnalisée. / Colon cancer (CC) is the third most common cancer in France with 40000 new cases diagnosed every year. For thirty years, death-rate has decreased through better therapeutic and screening management, and 40% of CC are diagnosed of stage II. Most of stage II CC do not require chemiotherapy adjuva,t to surgical resection. About 20% of patients with stage II CC relapse within 5 years following the diagnosis. Except microsatelitte instability (MSI) incombination with few hispathologic parameters, the molecular prognosis factors are not well defined and remain a major biological challenge in stage II CC. Our study analyzed the molecular signature of 166 tumors and determined the different expression of seven genes between stage II and stage III CC. KRAS and BRAF mutations were determined on 803 metastatic CC showing an association between V600E BRAF mutation and tumors with microsatellite stability (MSS). This result suggests a negative prognostic impact of BRAF mutation in MSS CC. Finally, the APC gene statut (mutations, LOH, promoter hypermethylation) of 183 stage II CC shows that this gene is probably not involved in the metastatic process. Further developments will consist in applying the next generation sequencing to allow the simultaneous analysis of hundreds target genes. In this way, the treatment will be adapted to each tumor, moving towards personalized medicine.

La thrombine, une protéase à sérine connue pour être l'acteur clé de la cascade de coagulation, a été décrite pour réguler les processus apoptotiques au niveau du côlon via l'activation de récepteurs activés par des protéases ou PARs (Protease-Activated Receptors). Cependant, les effets de la thrombine sur la cellule épithéliale colique n'ont été étudiés qu'en utilisant des lignées cellulaires. Les conséquences d'une exposition à différentes doses de thrombine sur un épithélium complexe, composés de différents types cellulaires plus ou moins différenciés sont inconnues à ce jour. Un nouveau modèle cellulaire, nommé organoïde, permet de reconstituer un épithélium colique fonctionnel en 3-dimensions (3D) à partir de résections ou de biopsies humaines, et ce, grâce aux capacités d'auto-renouvellement et de différenciation des cellules souches issues des cryptes coliques. Le 1er objectif de ma thèse a été d'évaluer les effets de la thrombine sur la survie, la prolifération, l'apoptose et la différenciation de l'épithélium colique humain, en utilisant le modèle organoïde. Puis, de déterminer l'implication des récepteurs PAR1 et PAR4 activés par la thrombine dans ces effets. Ainsi, l'ajout de thrombine (à faible dose : 10mU/mL et à forte dose : 50mU/mL) sur une culture d'organoïdes établis à partir de tissus colorectaux normaux entraîne une diminution de moitié de l'activité métabolique et de la prolifération cellulaire. Ces effets sont bloqués en présence d'un antagoniste de PAR1. Le processus apoptotique est, cependant, augmenté d'un facteur 8 en réponse à la thrombine (aux deux doses). Ce processus est inhibé en présence d'antagoniste de PAR1 ou de PAR4. Concernant la différenciation épithéliale, la thrombine diminue le nombre de colonosphères (structures immatures), au profit d'une augmentation du nombre de structures apoptotiques et de colonoïdes (structures plus matures présentant des néo-cryptes). Cet effet est dû à l'activation à la fois de de PAR1 et de PAR4 dans les cellules épithéliales coliques. Mes résultats démontrent que la thrombine exogène agit sur les processus d'apoptose, de prolifération et de différenciation sur un épithélium complexe, issu de la culture de tissus humains. L'utilisation de ce modèle ex vivo permet de comparer les organoïdes pathologiques et normaux, voire de tester les effets d'approches pharmacologiques et de nouveaux médicaments sur ces cultures. Ainsi, la 2nde partie de ce travail de thèse a été d'aborder la mise en place des conditions de culture et d'imagerie nécessaires pour réaliser un screening à haut débit robuste et reproductible, HCS (High-Content Screening), appliquée aux organoïdes. Les conditions de culture d'organoïdes en plaques 96-puits ont été mises au point de même que les conditions permettant d'acquérir des images répondant aux critères nécessaires pour une analyse via un système HCS. Le système Operetta HCS couplé au logiciel d'analyse Harmony (PerkinElmer) a été utilisé pour mettre en place une procédure d'analyse permettant de reconnaître les organoïdes, de les dénombrer, de les classer selon leur état de différenciation et de suivre leur croissance tout au long de la culture. Pour conclure, ces travaux de thèse ont permis de mettre en évidence les effets de la thrombine sur l'état métabolique, l'apoptose et la différenciation de l'épithélium colique humain, grâce au modèle 3D ex vivo d'organoïdes colorectaux. L'utilisation de ce modèle complète les approches jusque-là effectuées dans des modèles de lignées de cellules épithéliales, proposant une vision intégrée du comportement d'un épithélium complexe humain. L'approche HCS initiée lors de ces travaux de thèse pourrait permettre d'analyser de façon robuste et automatisée dans ce modèle, les effets d'autres composés et avoir ainsi un impact majeur sur notre compréhension des pathologies épithéliales et sur les tests de nouvelles approches thérapeutiques. / Thrombin, a serine protease known for its role in the coagulation cascade, was described for its effects on the induction of apoptosis in colonic epithelial cell lines, through the activation of Protease Activated Receptors (PARs). However, the effects of thrombin on complex epithelial structures such as the human intestinal epithelium composed of different cell types and cells at different stages of differentiation, has never been investigated. A new cellular model, named organoid, enables to reconstitute a functional epithelium in 3-dimensions (3D), from human resections or biopsies, thanks to the self-renewal and differentiation properties of stem cells isolated from colonic crypts. The first objective of this thesis was to evaluate thrombin's effects on survival, proliferation, apoptosis and differentiation in human colonic epithelium, using the organoid model. Then, we aimed to determining the implication of PAR1 and PAR4 in the thrombin's effects. Thus, thrombin added (at low dose: 10mU/mL and higher dose: 50mU/mL) to organoid cultures from control patients, led to a decrease by half of metabolic activity and cell proliferation. These effects were blocked by the addition of a PAR1 antagonist. Apoptotic process was 8-fold higher in organoid cultures exposed to thrombin (both doses) and this effect was inhibited by the addition of a PAR1 or a PAR4 antagonist. As per epithelial differentiation, thrombin decreased the number of colonospheres (immature structures) favoring the increase of apoptotic structures and colonoids (budding structures considered as more mature). This effect was due to PAR1 and PAR4 activation as again, it was blocked both by PAR1 and PAR4 antagonist. Taken together, these results reveal that exogenous thrombin acts on apoptosis, proliferation and differentiation processes in complex human colonic epithelium. The use of this ex vivo model will allow to compare pathological versus normal organoid cultures, but also to test the effects of pharmacological approaches and new treatment options directly in cultured human tissues. Thus, the 2nd part of this thesis was to setup the best culture conditions and the best imaging conditions to perform a robust and reproducible screening approach, HCS (High-Content Screening), using organoid cultures. Culture conditions in 96-well plates were set up and allowed to acquire images with the HCS system. Operetta HCS coupled to an analysis software (Harmony, PerkinElmer) was used to develop a specific program enabling the recognition of organoids, their counting, their classification according to their differentiation status and enabling to follow organoid growth in cultures. To sum up, the work performed allowed to highlight the effects of thrombin on metabolic status, apoptosis and differentiation of human colon epithelium, using an ex vivo 3D organoid model. The use this model nicely completed epithelial cell line approaches, offering an integrated view of the complex behavior of human epithelium. The HCS approach initiated within this thesis should allow the automated analysis of a number of drugs and treatments. It should help our understanding of epithelial pathologies and the testing of new therapeutic approaches.

D'importantes recherches en biologie moléculaire ont permis de mettre en évidence l'existence de régulateurs du cycle cellulaire. Ces régulateurs peuvent jouer un rôle dans le déroulement du cycle cellulaire en effectuant une sorte de " contrôle qualité " à chaque étape du cycle. Ils peuvent bloquer sa progression lorsqu'une anomalie est détectée, par exemple lorsque l'ADN est endommagé, et permettre sa réparation. On note ainsi deux points de contrôle du cycle cellulaire, en G1/S et G2/M. Récemment, deux composés, la granulatimide et l'isogranulatimide, ont été isolés d'une ascidie, Didemnum granulatum. Ces composés ont montré une activité inhibitrice intéressante sur le point de contrôle en G2. Cet intérêt provient du fait que la plupart des cellules cancéreuses ont un point de contrôle en G1 déficient suite à une mutation du gène p53 et que seul le point de contrôle en G2, bien que partiellement défectueux, permet l'arrêt du cycle cellulaire nécessaire à la réparation de l'ADN endommagé. Ainsi, les inhibiteurs du point de contrôle en G2, couplés à l'action d'agents endommageant l'ADN, vont entraîner les cellules cancéreuses vers une mitose précoce et létale. Dans ce travail une première partie bibliographique est consacrée à la présentation du point de contrôle en G2 du cycle cellulaire, et plus particulièrement de la checkpoint 1 kinase Chk1 et de ses inhibiteurs. Dans une seconde partie la synthèse d'analogues de la granulatimide et de l'isogranulatimide pour lesquels l'hétérocycle imidazole est remplacé par un maléimide est décrite. Nous avons exploré plusieurs voies d'accès à de nouveaux analogues substitués par divers groupements sur les différentes parties de la molécule de référence. Nous avons également effectué la synthèse de dérivés pour lesquels l'indole a été remplacé par un 7- azaindole. Une troisième partie présente les résultats des tests d'activités biologiques effectués. Tous les analogues synthétisés ont été testés sur plusieurs lignées cellulaires cancéreuses par les Laboratoires SERVIER pour évaluer leur cytotoxicité. Les effets sur le cycle cellulaire ont également été étudiés sur quelques analogues.

Résumé: Suivant un stress inflammatoire, les cellules épithéliales intestinales (CE1s) relâchent des nucléotides extracellulaires, des molécules pro-inflammatoires qui activent les récepteurs purinergiques P2Y qui sont impliqués dans l'inflammation intestinale. Hormis les récepteurs P2Y, la famille des transporteurs MRP joue aussi un rôle dans l'inflammation intestinale et les maladies en découlant. Plus spécifiquement, MRP2 joue un rôle important dans l'expert de molécules inflammatoires et de drogues cytotoxiques hors des CEIs. Dans cette perspective, nous avons caractérisé en quoi la coopération du transporteur MRP2 avec les récepteurs P2Y pouvait influencer les fonctions des CEIs dans le cancer colorectal. La lignée cellulaire Caco-2 a été stimulée à l'aide de 100 p.M d'ATP ou d'UTP pendant 3 à 18 heures et l'expression de MRP2 et de P2Y2 a été mesurée par qPCR et par immunobuvardage. Nous avons par la suite vérifié s'il existe une relation entre l'expression de MRP2 et celle de P2Y2 dans les échantillons de tumeurs colorectales obtenus à partir de biopsies. D'un point de vue physiologique, nous nous sommes demandés si la modulation de l'expression de MRP2 par l'ATP pouvait conférer aux CEIs une résistance accrue face à divers agents chimiothérapeutiques. Nous avons également entamé une étude dans le but d'établir par quelle voie de signalisation l'activation du récepteur P2Y2 pouvait stimuler l'expression de MRP2. Nous avons démontré que la stimulation des CEIs par les nucléotides extracellulaires augmente l'expression de MRP2. La modulation de l'expression de MRP2 passe par l'activation du récepteur P2Y2 et semble impliquer la voie de signalisation MEK/ERK. De façon surprenante, nous avons observé que l'expression de l'ARNm de MRP2 est augmentée dans les tumeurs de cancer colorectal comparé au tissu sain, tandis que celle de P2Y2 est diminuée. Nous avons également démontré que la stimulation des CEIs par l'ATP augmente la résistance des cellules à l'étoposide et que l'invalidation du transporteur MRP2 diminue la survie des CEIs face à l'étoposide, le cisplatin et la doxorubicine. Finalement, notre analyse de l'expression de l'ARNm de P2Y2 nous a démontré que celle-ci est augmentée dans les CEls où MRP2 est invalidé. Ces résultats montrent clairement l'implication et la coopération du récepteur P2Y2 et du transporteur MRP2 dans le développement et la progression du cancer colorectal. Ils sont concordants avec les rôles de ce récepteur dans la prolifération cellulaire et l'inflammation intestinale, ainsi que ceux de MRP2 dans l'export de drogues cytotoxiques. // Abstract: Following an inflammatory stress, intestinal epithelial cells (IECs) release extracellular nucleotides, notably ATP and UTP, pro-inflammatory molecules that activate P2Y purinergic receptors that are involved in intestinal inflammation as well as a variety of cancers. Apart from P2Y receptors, the family of MRP transporters also plays a role in intestinal inflammation and in pathologies deriving from it. More specifically, MRP2 plays an important role in the export of inflammatory molecules and cytotoxic drugs from IECs. In this perspective, we studied the involvement and cooperation of MRP2 with P2Y 2 receptor in colorectal cancer. The Caco-2 cell line was stimulated with 100 µM ATP and UTP for a period of 3, 6 and 18 hours, whereafter the expression of MRP2 and P2Y2 was measured by real-time quantitative PCR and western blot. We then verified if there was a correlation between the mRNA expression of MRP2 and P2Y2 in biopsies obtained from patients with colorectal cancer. From a physiological standpoint, we wondered if the modulation of MRP2 expression by ATP could confer an increased resistance to IECs against chemotherapeutic agents. In this context, we began a study with the aim to establish by which signalization cascade the activation of P2Y 2 receptor could stimulate the expression of MRP2. We have demonstrated in this study that the stimulation of IECs with ATP and UTP increases the expression of MRP2, both at the transcriptional and protein level. The modulation of MRP2 expression occurs via the activation of the P2Y 2 receptor upon its stimulation with its agonists ATP and UTP, and the signaling cascade MEK/ERK seems to be implicated. In a surprising manner, we observed that the mRNA expression of MRP2 is increased in tumors of colorectal cancer compared to the healthy tissue while that of P2Y 2 is decreased. We have also demonstrated that the stimulation of IECs with ATP increases the resistance of cancer cells to the drug etoposide. On the contrary, the invalidation of MRP2 by shRNA decreases the survival of IECs against the chemotherapeutic agents etoposide, cisplatin and doxorubicin. Finally, our analysis of the mRNA expression of P2Y 2 has demonstrated that it is increased in IECs that are invalidated for the expression of MRP2. These results demonstrate an evident involvement and cooperation between extracellular nucleotides, P2Y2 receptor and MRP2 transporter in the development and progression of colorectal cancer. They are concordant with the role of this receptor in intestinal inflammation as well as that of MRP2 in the export of a variety of drugs. [symboles non conformes]

L’autophagie est un processus d’autodigestion qui se produit dans toutes les cellules eucaryotes et conduit à la dégradation d’éléments du cytoplasme (organites, macromolécules) par le lysosome. Elle peut se produire au hasard dans le cytoplasme où elle peut être sélective, par exemple d’un organite intracellulaire. Lorsque les mitochondries sont sélectivement dégradées par autophagie, on parle de mitophagie. L’autophagie et la mitophagie sont impliquées dans diverses pathologies comme les maladies neurodégénératives et le cancer car leur dérégulation peut grandement perturber l’homéostasie cellulaire.Mon projet de thèse porte sur le rôle de la protéine co-chaperonne BAG6 dans la régulation de la mitophagie.BAG6 est une protéine de 150 kDa, également appelée BAT3 ou Scythe, dont la fonction majeure réside dans le contrôle qualité du cytoplasme mais BAG6 est également impliquée dans l’immunité, l’apoptose ou l’autophagie. Nous montrons que son mécanisme d’action passe, tout d’abord, par la régulation de la morphologie mitochondriale en induisant la fission des mitochondries. Ensuite, la protéine BAG6 induit la mitophagie : les protéines impliquées dans la mitophagie (PINK1 et PARKIN) s’accumulent à la mitochondrie alors que les protéines de la mitochondrie (TOM20, TFAM et TIM23) voient leur expression diminuée. BAG6 diminue également la masse mitochondriale par un mécanisme dépendant de l’autophagie. L’analyse de la séquence de BAG6 montre qu’elle est composée de nombreux domaines protéiques incluant les domaines UBL et deux domaines LIR (LC3-Interacting Region) et nous avons montré que BAG6 interagit avec LC3 grâce à son domaine LIR2. Ces caractéristiques identifient la protéine BAG6 comme un nouveau récepteur potentiel de la mitophagie. / Autophagy, literally meaning self-eating, is a highly evolutionary conserved process in eukaryotes where elements of the cytoplasm (organelles, macromolecules) are degraded by lysosomes. Autophagy can occur randomly in the cytoplasm or can be selective of a specific organelle. Among other, the specific degradation of mitochondria is called mitophagy. Autophagy and mitophagy have been implicated in several physiopathologies such as neurodegenerative diseases or cancer. Deregulations of autophagy/mitophagy may profoundly affect homeostasis.The aim of my thesis is to characterize the role of the co-chaperonne protein BAG6 in the regulation of mitophagy.BAG6 is a 150kDa protein, also known as BAT3 or Scythe, which functions in the quality control of the cytoplasm. Moreover BAG6 is also involved in immunity, apoptosis or autophagy. Our work showed that it is implicated in the regulation of mitochondrial morphology by inducing mitochondrial fission. Also, BAG6 induces mitophagy: in presence of BAG6, mitophagy markers such as PINK1 and PARKIN are more localized at the mitochondria whereas the expression of mitochondrial specific protein’s (TOM20, TFAM and TIM23) decreases. After its sequence analysis, we discovered that BAG6 is composed of many domains such as the UBL domains and two LIR domains (LC3- Interacting Region) and that BAG6 interacts with LC3 through its LIR2 domain. These features lead to identify BAG6 as a new potential receptor of mitophagy.

Les intégrines sont les principaux récepteurs d'adhésion des cellules à la matrice extracellulaire. La perturbation de cette adhésion induit l’anoïkose (mort par détachement). Les intégrines suppriment donc l’anoïkose en adhérant à la matrice extracellulaire. Dans l'intestin, l'intégrine α2β1 est exprimée dans les cryptes (cellules indifférenciées). Nous avons démontré précédemment que le fait de bloquer l’intégrine α2β1 à l’aide d’anticorps bloquants dirigés contre celle-ci induisait la mort cellulaire chez les entérocytes indifférenciés et différenciés. Cependant, il n’avait pas été déterminé par quelles voies de signalisation cette intégrine transmettait ses signaux de survie ou quelle était son implication dans la survie des cellules carcinomateuses de côlon. L’hypothèse de la présente étude est donc que l’intégrine α2β1 contribue à la suppression de l’anoïkose entérocytaire humaine. Le premier objectif pour y répondre était de confirmer le rôle de l’intégrine α2β1 dans la suppression de l’anoïkose chez les cellules absorbantes indifférenciées. Ainsi, nous avons vérifié l’impact de l’invalidation d’α2 sur la survie cellulaire, puis nous avons analysé la signalisation affectée dans ces conditions, soient les voies majeures de la survie cellulaire, les voies PI3K/Akt et MAPK/ERK. Le second objectif était d’analyser le rôle de l’intégrine α2β1 dans la résistance à l’anoïkose exhibée par les cellules carcinomateuses de côlon humain, puisque cette caractéristique contribue à leur capacité à former des métastases. Dans ce cas-ci, nous avons vérifié l’impact de son atténuation sur la résistance à l’anoïkose et évalué son rôle dans la survie de deux modèles cellulaires exhibant une résistance à cette mort cellulaire par leur activation des mêmes voies que chez les entérocytes indifférenciés. Nos résultats indiquent que chez les cellules entérocytaires indifférenciées, la contribution d’α2β1 à la suppression de l’anoïkose pourrait dépendre de son niveau d’expression et de la compensation par d’autres intégrines telle qu’α5β1. De plus, elle communiquerait ces signaux de survie en stimulant l’activation de la voie MAPK/ERK. Par contre, chez les cellules carcinomateuses de côlon, α2β1 ne semble pas jouer de rôle majeur dans la suppression de l’anoïkose entérocytaire humaine et son rôle dans la signalisation de survie demeure incertain.

La perte de l’intégrité et de la perméabilité sélective de la barrière endothéliale est un évènement précoce dans la séquence des lésions oxydatives responsables de l’athérosclérose, de l’hypertension et de l’épanchement de cellules cancéreuses durant la dissémination métastatique. Nous avons déjà démontré que la phosphorylation de la Ser283 de la tropomyosine-1 (Tm1) par la DAPK1, en aval de la voie ERK1/2, est nécessaire à la formation de fibres de stress dans les cellules endothéliales exposées aux stress oxydant. La perméabilité endothéliale et la migration transendothéliale de carcinomes du côlon ont été mesurées par des essais de perméabilité et de migration en chambre de Boyden. L’usage d’ARNi et des formes sauvages et mutantes de la Tm1 ont permis de démontrer que la phosphorylation de la Tm1 est un évènement clé nécessaire dans les mécanismes de protection contre la dysfonction endothéliale lorsque l’endothélium est soumis à un stress oxydant. / Loss of endothelial cell integrity and selective permeability barrier is an early event in the sequence of oxidant-mediated injury and may result in atherosclerosis, hypertension, and facilitation of transendothelial migration of cancer cells during metastasis. We already showed that phosphorylation of tropomyosin-1 (Tm1) at Ser283 by DAPK1, downstream of the ERK1/2 pathway, is necessary to stress fibers formation in endothelial cells in response to oxidative stress. Endothelial permeability and transendothelial migration of colon cancer cells were evaluated by Boyden chamber assays. Use of siRNA and wild-type and mutated forms of Tm1 provide evidence indicating that phosphorylation of Tm1 is a key event required inside protection mechanism against endothelial barrier dysfunction associated with oxidative stress injury.

L’extravasation des cellules cancéreuses circulantes est importante pour la dissémination métastatique qui est initiée par l’adhérence de cellules cancéreuses aux cellules endothéliales vasculaires. Elle nécessite l’interaction entre les récepteurs d’adhérence comme E-sélectine sur les cellules endothéliales et leurs ligands sur les cellules cancéreuse. Notamment, E-sélectine influence le potentiel métastatique des cancers du sein, de la vessie, de l’estomac, du pancréas et du côlon, des leucémies et lymphomes. Ici on montre que l’expression de E-sélectine est ciblée par deux groupes distinctifs de microRNAs (miRNAs); i.e. miR-31, qui cible directement le mRNA de E-sélectine, et miR-146a et -181a/b, qui répriment l’expression de E-sélectine, indirectement en ciblant la voie de NF-κB en amont. La voie des MAP kinases joue un rôle pivot dans la transcription de deux de ces miRNAs en réponse à l’IL-1β, étant donné que p38 et JNK contrôlent la transcription de miR-31, et que p38, ERK et JNK médient la transcription de miR- 146a. Les facteurs de transcription en aval des MAP kinases, GATA2, c-Fos et c-Jun, modulent la transcription de ces deux miRNAs. L’inhibition de p38 augmente l’activité de NF-κB au moins partiellement par miR-146a. L’inhibition de p38 augmente aussi l’expression de Esélectine au niveau post-transcriptionnel en diminuant miR-31. En réponse à l’IL-1β, p38 MAP kinase réprime donc l’expression de E-sélectine aux niveaux transcriptionnel et posttranscriptionnel via miR-146a et miR-31, respectivement. Ces résultats révèlent un nouveau mécanisme par lequel p38 inhibe l’expression de E-sélectine par les miRNAs suivant une stimulation pro-inflammatoire. L’inhibition de E-sélectine médiée par miR-31/-146a diminue le potentiel métastatique de cellules de cancer du côlon en réduisant leur adhérence à l’endothélium, et leur migration transendothéliale. Ces résultats soulignent pour la première fois que les miRNAs médient l’extravasation des cellules du cancer du côlon dépendante de E-sélectine. / Extravasation of circulating cancer cells is a key event of metastatic dissemination that is initiated by the adhesion of cancer cells to vascular endothelial cells. It requires the interaction between adhesion receptors such as E-selectin present on endothelial cells and their ligands on cancer cells. Notably, E-selectin influences the metastatic potential of breast, bladder, gastric, pancreatic, and colorectal carcinoma as well as of leukemia and lymphoma. Here, we show that E-selectin expression is targeted by two distinct sets of microRNAs (miRNAs); i.e. miR-31, which targets E-selectin mRNA directly, and miR-146a and -181a/b, which repress E-selectin expression indirectly by targeting the upstream pro-inflammatory NF-κB pathway. MAP kinases play pivotal roles in the transcription of some of these miRNAs in response to IL-1β, in that p38 and JNK control the transcription of miR-31, and that p38, ERK and JNK mediate the transcription of miR-146a. The downstream transcription factors of MAK kinases, namely GATA2, c-Fos and c-Jun modulate the transcription of both miRNAs. Inhibiting p38 MAP kinase increases NF-κB activity, at least partially via miR-146a. Inhibiting p38 also increases the expression of E-selectin at the post-transcriptional level via decreasing miR-31. In response to IL-1β, p38 MAP kinase hence represses the expression of E-selectin at the transcriptional and the post-transcriptional levels, via miR-146a and miR-31, respectively. These results highlight a novel mechanism by which p38 downregulates the expression of E-selectin through microRNAs following inflammatory stimuli. The miR-31/-146a-mediated repression of E-selectin impairs the metastatic potential of colon cancer cells by decreasing their adhesion to, and migration through, the endothelium. These results highlight for the first time that miRNAs mediate E-selectindependent extravasation of colon cancer cells.

La E-sélectine, un récepteur d'adhérence spécifique des cellules endothéliales interagit avec le Death Receptor 3 (DR3), exprimé par les cellules du cancer du côlon. Dans cette étude, nous nous sommes intéressés plus particulièrement aux mécanismes par lesquels les voies activées en aval de DR3 confèrent des avantages de survie aux cellules cancéreuses du côlon. Dans un premier temps, nous avons montré que DR3 est exprimé par les cellules HT29 sous une version potentiellement sécrétée et sous une forme membranaire toutes deux tronquées. Ces versions dépourvues de Death Domain n’induisent pas l'apoptose. Secondairement, nous avons constaté que la E-sélectine déclenche la phosphorylation sur tyrosine du récepteur via un membre de la famille des Src kinases. Nous avons finalement obtenu des preuves indiquant que la E-sélectine comme le TL1A activent l’axe de survie PI3K/Akt/ NFB. / E-selectin, a specific endothelial adhesion receptor, interacts with Death Receptor 3 (DR3) expressed by colon cancer cells. In this study, we investigated further the mechanisms by which the E-selectin-activated pathways downstream of DR3 confer a survival advantage to colon cancer cells. We found that DR3 exists under both transmembrane and secreted versions in HT29 cells. These Death Domain deleted isoforms hamper apoptosis. Additionally, we found that E-selectin could trigger the tyrosine phosphorylation Tyr285 of DR3 in a Src family member-dependent manner. We also obtained evidence indicating that E-selectin and TL1A induce the PI3K/Akt/NFκB p65 survival axis.