Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:17Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-03-30 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O cancer de prostata e o segundo tipo de cancer mais frequente. Calicreinas teciduais e integrinas estao diretamente relacionadas com essa doenca, interferindo na adesao celular, diferenciacao e proliferacao. Neste trabalho utilizamos as linhagens estabelecidas DU145 e PC3 de cancer de prostata para o estudo do efeito do inibidor de calicreina recombinante, rBbKIm, o qual contem em sua sequencia primaria o motivo RGD, proveniente do inibidor BrTI isolado de Bauhnina rufa. O meio condicionado da cultura de DU145 e PC3 tratadas com rBbKIm por 48 horas inibiu cerca de 95% a atividade hidrolitica de HD-Pro-Phe-Arg- ƒÏNa por serino proteases da familia das calicreinas. rBbKIm inibiu a viabilidade celular da DU145 (56%, 100 ƒÊM, 48 horas) e da PC3 (28%, 100 ƒÊM, 48 horas) e interferiu somente em 5% da viabilidade da linhagem de fibroblastos de liquido amniotico (100 ƒÊM, 48 horas). rBbKIm nao inibiu a adesao das linhagens DU145 e PC3 sobre a fibronectina, laminina, colageno I e IV. Embora rBbKIm nao tenha interferido na migracao de DU145 o inibidor reduziu em 38% o processo migratorio da linhagem PC3 (100 ƒÊM) apos 23 horas de tratamento. Em relacao ao efeito do inibidor sobre a morte celular DU145 e PC3 tratadas com de rBbKIm (50 e 100 ƒÊM, 24 e 48 h) induziu a morte celular por apoptose. Alteracoes no ciclo celular foram observadas na linhagem PC3 com parada do ciclo nas fases G0/G1 e G2/M. Nao houve alteracao no ciclo celular na linhagem DU145. Ambas as celulas externalizaram o citocromo c para o citoplasma quando tratadas com rBbKIm (50 e 100 ƒÊM) por 24 horas. No caso da PC3 observou-se a ativacao de caspase-9 com 50 ƒÊM de rBbKIm apos 48 horas, nao havendo ativacao de caspase-3 enquanto que com a DU145 ocorreu ativacao da caspase-3 e nao houve ativacao da caspase-9. Os peptideos contendo a sequencia RGD e RGE nao inibiram a viabilidade celular de DU145 e PC3. Analises sobre o efeito de rBbKIm na viabilidade e migracao da linhagem endotelial humana (HUVEC), mostrou que rBbKIm (50 ƒÊM) inibiu 28% da viabilidade celular e 30% da motilidade celular da HUVEC. rBbKIm tambem apresentou atividade inibitoria na formacao de estruturas angiogenicas sobre Matrigel in vitro. Em resumo, o presente trabalho demonstrou a ação diferencial do inibidor de protease rBbKIm em linhagens de câncer de próstata independentes de andrógenos, PC3 e DU145, e em células normais de fibroblastos de líquido amniótico e em células endoteliais humanas, HUVEC. / Prostate cancer is the second more frequent type of cancer. In this work, using DU145 and PC3 prostate cancer cellular lines, we studied the effect of recombinant kallikrein inhibitor modified form (rBbKm), in which the sequence containing the signal motif sequence RGD of the inhibitor BrTI from Bauhnina rufa was inserted. When DU145 and PC3 were incubated with rBbKIm for 48h, and the conditioned medium the culture was incubated with the HD-Pro-Phe-Arg-ñNa, an kallikrein substrate, inhibited 95% of the degradation of this in both cells. rBbKIm inhibited cell viabillity of DU145 (56%, 100 ìM, 48 h) and PC3 (28%, 100 ìM, 48 h), but affect only 5% of the viabillity of fibroblast normal cell line (100 ìM, 48h). In cell adhesion, rBbKIm did not inhibit DU145 and PC3 cell line adhesion on fibronectin, laminin, collagen I and IV coat. In cell migration, rBbKIm did not inhibit DU145, but inhibited 38% of the PC3 (100 ìM) after 23 h. To evaluate the cytotoxicity, DU145 and PC3 were incubated with rBbKIm (50 and 100 ìM, 24 and 48h) inducing cell death by apoptosis. The presence of rBbKIm arrest PC3 cell cycle at the G0/G1 and G2/M phase, but did not affect DU145. Both cells released cytocrome c to the cytosol when treated with rBbKIm (50 and 100 ìM) for 24h. Moreover, DU145 when was treated with rBbKIm for 48h activated the caspase-3. However PC3 did not activated caspase-3, but activated caspase-9. The peptides containing the RGD and RGE sequence did not inhbit the cell viabillity of DU145 and PC3. Analyzing the effect of rBbKIm on HUVEC viabillity and migration, rBbKIm (50ìM) inhibited 28% and 30%, respectively. This protein inhibited 49% of the HUVEC angiogenesis in vitro on Matrigel. In summary, we have demonstrated the differential action of the protease inhibitor rBbKIm on androgen-independent prostate cancer PC3 and DU145, normal fibroblast and endothelial HUVEC cells. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Orientador: Prof. Dr. Luciano Puzer / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2015.

Orientador: Luciano Puzer / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC. Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia/Química, 2013

Orientador: Prof. Dr. Luciano Puzer / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biotecnociência, 2017. / As calicreinas 5 (KLK5) e 7 (KLK7) sao serino proteases que pertencem a um grupo de 15 calicrei.nas teciduais humanas (KLKs) encontradas em diversos tecidos do corpo. A KLK5 e encontrada principalmente no tecido mamario, sistema nervoso central, testiculos, prostata e traqueia, enquanto a KLK7 e encontrada no esofago, figado, rins e glandulas salivares. Alem disso, ambas as enzimas sao mais abundantemente expressas na pele humana, onde acredita-se que exercam importante papel no processo de descamacao epidermal, a partir da hidrolise de proteinas que compoem as estruturas de adesao intercelular dos corneodesmossomos. Estudos tambem demonstram, que a atividade dessas duas enzimas aparece aumentada em patologias relacionadas ao processo de descamacao da pele, como psoriase e dermatite atopica. Desta forma, o desenvolvimento de inibidores para KLK5 e KLK7 podera contribuir nao apenas para elucidar seus mecanismos fisiologicos e patologicos, mas como um arquetipo de novas drogas, visando ao desenvolvimento de novos procedimentos terapeuticos para patologias relacionadas ao processo de descamacao epidermal. Neste projeto, foram testados 17 pseudopeptideos e 10 compostos derivados do acido tetramico frente as calicrei.nas teciduais humanas 5 e 7, tripsina e quimotripsina. Dos 17 pseudopeptideos, oito compostos nao foram soluveis na fase de teste em meio aquoso e nove compostos foram soluveis em meio aquoso e puderam ser testados como inibidores das KLK 5 e KLK 7, sendo que quatro destes apresentaram inibicao utilizando concentracoes da ordem micromolar perante a KLK5. No entanto, apenas um composto obteve acao inibitoria frente a KLK7, porem com potencial inibitorio menor, comparado com resultados anteriores, relatados pelo nosso grupo de pesquisa. Os dez compostos aciltetramicos foram soluveis em tampao aquoso e apenas tres nao apresentaram atividade inibitoria contra as enzimas. Os resultados referentes as KLKs e tripsina foram significativos com uma acao inibitoria da ordem de micromolar. Os compostos derivados do acido tetramico nao inibiram a quimotripsina. Esses resultados abrem uma discussao sobre a especificidade da KLK7, que e classificada como uma enzima do tipo quimotripsina-like, no entanto, neste trabalho, apresentou um padrao de inibicao semelhante a tripsina. / The kallikreins 5 and 7 are serine proteases which belong to a group of fifteen human tissue kallikreins (KLKs) found in a diverse of body tissues. The KLK5 is mainly found on mammary tissue, central nervous system, testicles, prostate and trachea, while the KLK7 is found in the esophagus, liver, kidneys and salivary glands. Moreover, both enzymes are abundantly expressed on the human skin, and its believed that they have an important role on the epidermal desquamation process, from the hydrolysis of proteins that make up the corneodesmosomes intercellular adhesion structures. Recently it was shown that both kallikreins activity appears to be increased in diseases relates to the desquamation process, such as psoriasis and atopic dermatitis. Thus, the development of inhibitors for KLK5 and KLK7 would not only contribute to the elucidation of their physiological and pathological mechanisms, but also serve as an archetype for new drugs, aiming the development of new therapeutic procedures for diseases related to epidermal desquamation. In this project, 17 pseudo-peptides and 10 tetramic acid derived compounds were tested against the human tissue kallikreins 5 and 7, trypsin and chymotrypsin. From the 17 pseudo-peptides, nine were soluble in aqueous medium and could be tested; four of them showed inhibition in the micro molar range against the KLK5. Just one compound was effective against the KLK7, but with low inhibitory action. The 10 aciltetramic compounds were soluble in aqueous buffer, and only three of them did not show any inhibitory activity against the kallikreins. The results referring to the kallikreins and trypsin were significant, with an inhibitory action in the micro molar range. The compounds did not inhibit the chymotrypsin. These results open a discussion about the KLK7 specificity, which despite of being classified as a chymotrypsin-like enzyme, showed, in this work, an inhibition pattern similar to trypsin.

Orientador: Prof. Dr. Luciano Puzer / Tese (doutorado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2017. / As calicreinas teciduais humanas (KLKs) compreendem uma familia de quinze serino proteases encontradas em uma diversidade de fluidos e tecidos biologicos. Estas enzimas sao identificadas como possuindo papel em diferentes doencas como Alzheimer, cancer, dermatite atopica, esclerose multipla, Parkinson, psoriase e outras. Existe, portanto, uma crescente demanda por inibidores especificos para cada uma das calicreinas e este e o objetivo do nosso grupo de pesquisa na UFABC. Neste trabalho pretendemos gerar inibidores para as calicreinas teciduais humanas 3, 5 e 7, utilizando bibliotecas baseadas em duas serpinas diferentes: uma expressando a forma Pittsburgh do inibidor de proteinase-¿¿1 (IP-¿¿1 M358R), randomizada nos residuos 352-356 (P7-P3); e outra expressando a serpina bacteriana vioserpina, randomizada nos residuos 343-347 (P3-P2f). A abordagem do phage display foi eficaz para gerar as bibliotecas e o protocolo de bioselecao utilizado adequado para enriquecer diversas variantes reativas. Na selecao da biblioteca do IP-¿¿1 M358R, consensos PSEAL e PSRIL foram observados, para KLK5 e KLK7, respectivamente, e varias das sequencias selecionadas exibiram maiores taxas de inibicao para ambas as calicreinas, quando comparadas a molecula molde (IP-¿¿1 M358R). A variante HDVIL e o consenso PSRIL foram identificados como sendo altamente seletivos para a KLK7, com constantes de segunda ordem 14 e 33 vezes maiores que as para KLK5. Pudemos realizar uma selecao efetiva da biblioteca de vioserpina contra a KLK7, cujas variantes enriquecidos demonstraram uma preferencia geral pelo aminoacido Serina ocupando as posicoes P3, P1f, P2f e P1, seguido por uma Tirosina, tambem preferida em P2. A tecnica de phage display foi, portanto, eficiente como base para um estudo de especificidade, e para o desenvolvimento de melhores e mais especificos inibidores para as Calicreinas Teciduais Humanas, e pode ser utilizada para o desenvolvimento de novas bibliotecas, com outras regioes da RCL randomizadas, ou mesmo baseadas em outras serpinas. / The human tissue kallikreins (KLKs) comprise a family of fifteen serine proteases found in a diversity of biological fluids and tissues. These enzymes are identified as having a role in different diseases such as Alzheimer's, cancer, atopic dermatitis, multiple sclerosis, Parkinson's, psoriasis, and others. Thus there is a growing demand for specific inhibitors for each of these kallikreins, and this is the aim of our group at UFABC. In this work we intended to generate inhibitors for the human tissue kallikreins 3, 5 and 7, using libraries based on two different serpins: one expressing the Pittsburgh form of the human serpin á1-proteinase inhibitor (á1-PI M358R), randomized at residues 352-356 (P7-P3); and another one expressing the bacterial vioserpin, randomized at residues 343-347 (P3-P2¿). The phage display approach was effective to generate the libraries and the biopanning protocol used suitable to enrich numerous reactive variants. On the á1-PI M358R selection, loose consensus of PSEAL and PSRIL were observed, for KLK5 and KLK7, respectively, and several of the selected sequences exhibited higher inhibition rates when compared to the template molecule for both kallikreins. The variant HDVIL and consensus PSRIL were found to be highly selective for the KLK7, with second order constants 14- and 33-fold higher than the ones for KLK5. We could only perform an effective selection with the vioserpin library for the KLK7, whose enriched variants demonstrated a general preference for the amino acid Serine occupying the positions P3, P1¿, P2¿ and P1, followed by a Tyrosine, also preferred on the P2. The phage display approach was therefore effective as basis for a specificity study, and for the development of improved, more specific inhibitors for the Human Tissue Kallikreins, and can be used to develop new libraries, with other randomized RCL regions, or even based on other serpins.

A Doença de Parkinson (DP) é um distúrbio neurodegenerativo, caracterizada em parte pela perda de neurônios dopaminérgicos da via nigroestriatal, originada na substância negra com projeções para o estriado, causando vários déficits motores. Atualmente, o tratamento mais utilizado é a administração de L-DOPA, um análogo da dopamina. Porém, essa droga apresenta eficácia limitada e induz diversos efeitos colaterais. A exploração dos efeitos neuroprotetores, proliferativos e neuroregenerativos da bradicinina (BK) em modelo animal de DP pode conduzir à substituição celular do tecido lesionado pela 6-hidroxidopamina (6-OHDA). De fato, a BK e seus receptores possuem um grande espectro de ações fisiológicas, estando classicamente envolvida no controle da homeostase cardiovascular e inflamação, além de exercer efeitos protetores em fisiopatologias do sistema nervoso, como em modelos de acidente vascular cerebral. Vários tipos celulares têm suas vias de sinalização associadas à ativação do receptor B2 de cininas (B2BKR). Trabalhos anteriores de nosso grupo mostraram que a BK está envolvida na diferenciação neural de células progenitoras neurais por um loop autócrino que resulta em ativação do B2BKR. Os resultados apresentados neste trabalho mostram a eficácia do tratamento com BK, um agonista de B2BKR, em animais submetidos à lesão da via nigro-estriatal induzida por 6-OHDA. Além disso, há uma recuperação comportamental e histológica desses animais quando tratados com Captopril®, um potencializador dos efeitos farmacológicos da BK, e com [Phe8Ψ(CH-NH)Arg9]-Bradicinina, agonista estável do receptor B2BKR. Assim, concluímos que a ativação de B2BKR pela BK desencadeiaum processo de neuroregeneração dopaminérgica de animais submetidos à lesão por 6-OHDA. Trabalhos recentes mostram que o receptor B2BKR desempenha um importante papel neuroprotetor em modelo animal da Doença de Alzheimer, o que corrobora nossos achados. Juntos, esses resultados contribuem para o estabelecimento da ação neuroprotetora e neurorregenerativa da BK no modelo de animal de neurodegeneração dopaminérgica, tornando-a uma excelente candidata para aplicação em terapias de reparo neuronal. / Parkinson\'s disease (PD) is a neurodegenerative disorder partially characterized by the loss of dopaminergic neurons from the nigrostriatal pathway, originated in the substantia nigra with projections to the striatum, which causes several motor deficits. Currently, the most commonly used drug for PD treatment is levodopa. However, it has limited efficacy and induces several side effects. Elucidation of the neuroprotective, proliferative and neuroregenerative effects of bradykinin (BK) in animal models of PD can culminate in cellular replacement of the tissue damaged by 6-hydroxydopamine (6-OHDA). In fact, BK and its receptor have several physiological effects, being classically involved in the control of cardiovascular homeostasis and inflammation. Besides, BK exerts protective effects on nervous system pathophysiology, as observed in stroke models. Several cell types have their signaling pathways associated with the B2 kinin receptor (B2BKR) activation. Previous work from our group showed that BK is involved in differentiation of neural progenitor cells by an autocrine loop that results in activation of B2BKR. The results presented in this thesis show the efficacy of treatment with BK, through B2BKR activation, in animals submitted to nigrostriatal pathway injury induced by 6-OH dopamine. Furthermore, behavioral and histological recoveries of these animals were observed when treated with Captopril®, a potentiator of BK pharmacological effects, and with [Phe8Ψ (CH-NH) Arg9] -BK, a stable agonist of the B2BKR receptor. Thus, we conclude that BK activation of B2BKR triggers neuroregenerative processes in animals submitted to 6- OHDA injury. Recent studies showed that the B2BKR receptor plays an important neuroprotective role in an animal model of Alzheimer\'s disease, which corroboratesour findings. Together, these results contribute to the establishment of the neuroprotective and neuroregenerative actions of BK - an excellent candidate for neural repair therapies.

Introdução: A toxicidade da cisplatina é bem compreendida nos sistemas renal, gastrointestinal, auditivo e nervoso, assim como na medula óssea. No entanto, os mecanismos causadores de infertilidade induzidos pela cisplatina são pouco compreendidos. Objetivo: Nosso objetivo foi verificar a participação do sistema calicreína-cininas e do estresse oxidativo na infertilidade induzida pela cisplatina, auxiliando no desenvolvimento de novas alternativas terapêuticas. Métodos: Os camundongos fêmeas C57BL/6 adultos (n=9) receberam dois ciclos de 2,5 mg/kg de cisplatina por via intraperitoneal durante cinco dias, com um período de recuperação de sete dias entre os ciclos. O grupo controle (n=9) recebeu solução de NaCl 0,9%. Foi feita a avaliação do ciclo estral e a contagem de folículos ovarianos. O marcador Ki67 foi avaliado por imunohistoquímica. Testes bioquímicos para calicreína plasmática, intersticial e glandular, tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPa), óxido nítrico (NO), superóxido dismutase (SOD), glutationa reduzida (GSH), mieloperoxidase (MPO) e N-acetil glucosaminidase (NAG); e Western-blot para os receptores de bradicinina B1R e B2R também foram realizados Resultados: Após o protocolo de cisplatina, 100% das fêmeas do grupo controle mantiveram a ciclicidade estral versus 44,4% das fêmeas do grupo cisplatina. O grupo controle apresentou maior número de folículos antrais (p=0,011) e folículos viáveis totais (p=0,006). O grupo cisplatina apresentou maior número de folículos atrésicos (p=0,014). O marcador Ki67 demonstrou semelhantes taxas de proliferação celular entre os grupos. Os marcadores inflamatórios foram aumentados no grupo cisplatina, incluindo a geração de calicreína plasmática (p=0,003), a diminuição do TTPa (p=0,02), o aumento da atividade da calicreína intersticial (p=0,002) e glandular (p=0,008) e na expressão dos receptores B1R (p=0,001) e B2R (p=0,001), MPO (p=0,03) e NAG (p=0,04). Os marcadores de estresse oxidativo também foram aumentados no grupo cisplatina, com maior produção de NO (p=0,01) e diminuição na SOD (p=0,003) e na GSH (p=0,01). Conclusão: Todas as reações inflamatórias parecem ser ativadas pelo tratamento com cisplatina, exemplificadas pelo aumento da atividade da calicreína plasmática, intersticial e glandular, bem como a diminuição no TTPa e o aumento na expressão de B1R e B2R. A toxicidade mediada pela reação inflamatória da cisplatina é bem conhecida em seus efeitos colaterais, como ototoxicidade e nefrotoxicidade. Houve aumento da produção de NO nos ovários dos animais tratados, associado à indicação de menores concentrações de SOD e de GSH. Os desequilíbrios nos antioxidantes parecem contribuir para o estresse oxidativo ovariano. Quanto à MPO (neutrófilos) à NAG (macrófagos), a maior atividade de ambas no grupo cisplatina se explica pelo fato de que as células fagocíticas ativadas produzem grandes quantidades de espécies reativas de oxigênio, aumentando ainda mais o estresse oxidativo e a inflamação. O aumento da atividade do sistema calicreína-cininas e dos marcadores de estresse oxidativo no tecido ovariano propiciaram uma melhor compreensão da infertilidade induzida por cisplatina e indicam possíveis alternativas para proteção ovariana durante a quimioterapia, como inibidores do sistema calicreína-cinina e antioxidantes. / Background: Cisplatin toxicity is well understood in the renal, gastrointestinal, auditory and nervous systems, as well as in the bone marrow. However, the mechanisms causing infertility induced by cisplatin are poorly understood. Purpose: Our objective was to verify the participation of the kallikreinkinin system and oxidative stress in cisplatin-induced infertility, aiding in the development of new therapeutic alternatives. Methods: C57BL/6 adult (n=9) female mice received two 2.5 mg/kg intra-peritoneal cycles of cisplatin for five days, with a seven-day recovery period between cycles. The control group (n=9) received 0.9% NaCl solution. The ovarian follicles were counted with hematoxylin and eosin staining. Ki67 marker was evaluated by immunohistochemistry. Biochemical tests for plasma, interstitial and glandular kallikrein, activated partial thromboplastin time (aPTT), nitric oxide (NO), superoxide dismutase (SOD), reduced glutathione (GSH), myeloperoxidase (MPO) and N-acetyl glucosaminidase (NAG); and Western blotting for the bradykinin B1R and B2R receptors were also performed. Results: After cisplatin protocol, 100% of the females in the control group maintained estral cyclicity versus 44.4% of females in cisplatin group. The control group had a higher number of antral follicles (p=0.011) and total viable follicles (p=0.006). Cisplatin group had a higher number of atretic follicles (p=0.014). Ki67 marker demonstrated similar rates of cell proliferation between groups. Inflammatory markers were increased in cisplatin group, including plasma kallikrein generation (p=0.003), a decrease of aPTT (p=0.02), increased interstitial (p=0.002) and glandular (p=0.008) kallikrein, B1R (p=0.001) and B2R (p=0.001) expression, MPO (p=0.03) and NAG (p=0.04) Oxidative stress markers were also increased in cisplatin group, with higher NO production (p=0.01) and a decrease in SOD (p=0.003) and GSH (p=0.01). Conclusion: All inflammatory reactions appear to be activated by cisplatin treatment, exemplified by increased plasma, interstitial and glandular kallikrein activity, as well as the decrease in aPTT and increased expression of B1R and B2R. The toxicity mediated by cisplatin inflammatory reaction is well known in its side effects, such as ototoxicity and nephrotoxicity. There was an increase in NO production in the ovaries of treated animals, associated with the indication of lower concentrations of SOD and GSH. Imbalances in antioxidants appear to contribute to ovarian oxidative stress. Regarding MPO (neutrophils) and NAG (macrophages), the greater activity of both in cisplatin group is explained by the fact that activated phagocytic cells produce large amounts of reactive oxygen species, further increasing oxidative stress and inflammation. Increased activity of the kallikrein-kinin system and markers of oxidative stress in ovarian tissue provided a better understanding of cisplatin-induced infertility and indicate possible alternatives for ovarian protection during chemotherapy, such as inhibitors of the kallikrein-kinin system and antioxidants.

Introdução: A toxicidade da cisplatina é bem compreendida nos sistemas renal, gastrointestinal, auditivo e nervoso, assim como na medula óssea. No entanto, os mecanismos causadores de infertilidade induzidos pela cisplatina são pouco compreendidos. Objetivo: Nosso objetivo foi verificar a participação do sistema calicreína-cininas e do estresse oxidativo na infertilidade induzida pela cisplatina, auxiliando no desenvolvimento de novas alternativas terapêuticas. Métodos: Os camundongos fêmeas C57BL/6 adultos (n=9) receberam dois ciclos de 2,5 mg/kg de cisplatina por via intraperitoneal durante cinco dias, com um período de recuperação de sete dias entre os ciclos. O grupo controle (n=9) recebeu solução de NaCl 0,9%. Foi feita a avaliação do ciclo estral e a contagem de folículos ovarianos. O marcador Ki67 foi avaliado por imunohistoquímica. Testes bioquímicos para calicreína plasmática, intersticial e glandular, tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPa), óxido nítrico (NO), superóxido dismutase (SOD), glutationa reduzida (GSH), mieloperoxidase (MPO) e N-acetil glucosaminidase (NAG); e Western-blot para os receptores de bradicinina B1R e B2R também foram realizados Resultados: Após o protocolo de cisplatina, 100% das fêmeas do grupo controle mantiveram a ciclicidade estral versus 44,4% das fêmeas do grupo cisplatina. O grupo controle apresentou maior número de folículos antrais (p=0,011) e folículos viáveis totais (p=0,006). O grupo cisplatina apresentou maior número de folículos atrésicos (p=0,014). O marcador Ki67 demonstrou semelhantes taxas de proliferação celular entre os grupos. Os marcadores inflamatórios foram aumentados no grupo cisplatina, incluindo a geração de calicreína plasmática (p=0,003), a diminuição do TTPa (p=0,02), o aumento da atividade da calicreína intersticial (p=0,002) e glandular (p=0,008) e na expressão dos receptores B1R (p=0,001) e B2R (p=0,001), MPO (p=0,03) e NAG (p=0,04). Os marcadores de estresse oxidativo também foram aumentados no grupo cisplatina, com maior produção de NO (p=0,01) e diminuição na SOD (p=0,003) e na GSH (p=0,01). Conclusão: Todas as reações inflamatórias parecem ser ativadas pelo tratamento com cisplatina, exemplificadas pelo aumento da atividade da calicreína plasmática, intersticial e glandular, bem como a diminuição no TTPa e o aumento na expressão de B1R e B2R. A toxicidade mediada pela reação inflamatória da cisplatina é bem conhecida em seus efeitos colaterais, como ototoxicidade e nefrotoxicidade. Houve aumento da produção de NO nos ovários dos animais tratados, associado à indicação de menores concentrações de SOD e de GSH. Os desequilíbrios nos antioxidantes parecem contribuir para o estresse oxidativo ovariano. Quanto à MPO (neutrófilos) à NAG (macrófagos), a maior atividade de ambas no grupo cisplatina se explica pelo fato de que as células fagocíticas ativadas produzem grandes quantidades de espécies reativas de oxigênio, aumentando ainda mais o estresse oxidativo e a inflamação. O aumento da atividade do sistema calicreína-cininas e dos marcadores de estresse oxidativo no tecido ovariano propiciaram uma melhor compreensão da infertilidade induzida por cisplatina e indicam possíveis alternativas para proteção ovariana durante a quimioterapia, como inibidores do sistema calicreína-cinina e antioxidantes. / Background: Cisplatin toxicity is well understood in the renal, gastrointestinal, auditory and nervous systems, as well as in the bone marrow. However, the mechanisms causing infertility induced by cisplatin are poorly understood. Purpose: Our objective was to verify the participation of the kallikreinkinin system and oxidative stress in cisplatin-induced infertility, aiding in the development of new therapeutic alternatives. Methods: C57BL/6 adult (n=9) female mice received two 2.5 mg/kg intra-peritoneal cycles of cisplatin for five days, with a seven-day recovery period between cycles. The control group (n=9) received 0.9% NaCl solution. The ovarian follicles were counted with hematoxylin and eosin staining. Ki67 marker was evaluated by immunohistochemistry. Biochemical tests for plasma, interstitial and glandular kallikrein, activated partial thromboplastin time (aPTT), nitric oxide (NO), superoxide dismutase (SOD), reduced glutathione (GSH), myeloperoxidase (MPO) and N-acetyl glucosaminidase (NAG); and Western blotting for the bradykinin B1R and B2R receptors were also performed. Results: After cisplatin protocol, 100% of the females in the control group maintained estral cyclicity versus 44.4% of females in cisplatin group. The control group had a higher number of antral follicles (p=0.011) and total viable follicles (p=0.006). Cisplatin group had a higher number of atretic follicles (p=0.014). Ki67 marker demonstrated similar rates of cell proliferation between groups. Inflammatory markers were increased in cisplatin group, including plasma kallikrein generation (p=0.003), a decrease of aPTT (p=0.02), increased interstitial (p=0.002) and glandular (p=0.008) kallikrein, B1R (p=0.001) and B2R (p=0.001) expression, MPO (p=0.03) and NAG (p=0.04) Oxidative stress markers were also increased in cisplatin group, with higher NO production (p=0.01) and a decrease in SOD (p=0.003) and GSH (p=0.01). Conclusion: All inflammatory reactions appear to be activated by cisplatin treatment, exemplified by increased plasma, interstitial and glandular kallikrein activity, as well as the decrease in aPTT and increased expression of B1R and B2R. The toxicity mediated by cisplatin inflammatory reaction is well known in its side effects, such as ototoxicity and nephrotoxicity. There was an increase in NO production in the ovaries of treated animals, associated with the indication of lower concentrations of SOD and GSH. Imbalances in antioxidants appear to contribute to ovarian oxidative stress. Regarding MPO (neutrophils) and NAG (macrophages), the greater activity of both in cisplatin group is explained by the fact that activated phagocytic cells produce large amounts of reactive oxygen species, further increasing oxidative stress and inflammation. Increased activity of the kallikrein-kinin system and markers of oxidative stress in ovarian tissue provided a better understanding of cisplatin-induced infertility and indicate possible alternatives for ovarian protection during chemotherapy, such as inhibitors of the kallikrein-kinin system and antioxidants.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The kallikrein-kinin system (KKS) has been described as an important mediator of physiologic processes. Kallikreins use kininogen (KNG) as substrate to generate bradykinin, the principal active peptide of the KKS which acts through two types of receptors, the B1R and B2R. The objective of this study was to characterize some components of KKS in different compartments of ovary during the ovulation process in bovine. mRNA expression pattern of KNG, B1R and B2R was assessed in theca and granulosa cells and bradykinin concentration and kallikrein-like activity in follicular fluid of bovine peri-ovulatory follicles. In order to obtain a peri-ovulatory follicle (≥ 12mm), twenty-seven cows were submitted to estrus synchronization protocol and ovariectomized by colpotomy at 0, 3, 6, 12 or 24 hours after a GnRH-analog injection (gonadorelin; 100 μg, IM). Follicular fluid was aspirated for enzymatic assays and granulosa and theca cells were harvested for mRNA analysis. The mRNA expressions in follicular cells were evaluated by real-time RT-PCR and data represented as relative to housekeeping gene cyclophilin. Bradykinin concentration and Kallikrein-like activity was measured in follicular fluid by enzymatic immunoassay and selective substrate cleavage, respectively, and the absorbance measured using a plate reader. KNG mRNA expression was similar for both follicular cell types (P>0.05), while B2R expression in theca cells and B1R expression in theca and granulosa cells showed different profiles during peri-ovulatory period (P<0.05). Bradykinin concentration and kallikrein-like activity in follicular fluid were different (P<0.05) according the time during ovulation process. The results provide an important characterization of the presence and possible regulation of KKS during ovulation in bovine. / O sistema calicreína-cinina (KKS) tem sido descrito como um importante mediador de processos fisiológicos. Calicreínas utilizam o cininogênio (KNG) como substrato para formar a bradicinina, que é o principal peptídeo ativo do KKS o qual atua através de dois tipos de receptores, o B1R e B2R. O objetivo deste estudo foi caracterizar os principais componentes do KKS em diferentes compartimentos ovarianos durante o processo ovulatório de bovinos. A expressão de RNAm de KNG, B1R e B2R foi mensurada em células da teca e granulosa, e concentração de bradicinina e atividade de calicreína no fluido folicular de folículos peri-ovulatórios bovinos. Para obter um folículo peri-ovulatório (≥ 12mm), vinte e sete vacas foram submetidas a um protocolo de sincronização de cios e ovariectomizadas por colpotomia 0, 3, 6, 12 ou 24 horas após uma injeção de um análogo ao GnRH (gonadorelina; 100 μg, IM). O fluido folicular foi aspirado para os ensaios enzimáticos e as células da teca e granulosa dissecadas para análise do RNAm. A expressão do RNAm em células foliculares foi avaliada por PCR em tempo real e os dados representados em relação ao gene constitutivo ciclofilina. A concentração de bradicinina e atividade de calicreína foram mensuradas no fluido follicular por imunoensaio enzimático e clivagem de substrato seletivo, respectivamente, e sua absorbância mensurada por leitor de placas. A expressão de RNAm para o KNG não variou em ambos os tipos celulares nos diferentes tempos (P>0,05), enquanto que para B2R a expressão em células da teca e expressão para B1R nas células da teca e granulosa apresentaram diferentes padrões durante o período peri-ovulatório (P<0,05). A concentração de bradicinina e a atividade de calicreína no fluido follicular foram diferentes (P<0,05) de acordo com o tempo durante o processo ovulatório. Estes resultados demonstram que o KKS está presente e há indicativos de sua regulação durante a ovulação em bovinos

Introdução: A toxicidade da cisplatina é bem compreendida nos sistemas renal, gastrointestinal, auditivo e nervoso, assim como na medula óssea. No entanto, os mecanismos causadores de infertilidade induzidos pela cisplatina são pouco compreendidos. Objetivo: Nosso objetivo foi verificar a participação do sistema calicreína-cininas e do estresse oxidativo na infertilidade induzida pela cisplatina, auxiliando no desenvolvimento de novas alternativas terapêuticas. Métodos: Os camundongos fêmeas C57BL/6 adultos (n=9) receberam dois ciclos de 2,5 mg/kg de cisplatina por via intraperitoneal durante cinco dias, com um período de recuperação de sete dias entre os ciclos. O grupo controle (n=9) recebeu solução de NaCl 0,9%. Foi feita a avaliação do ciclo estral e a contagem de folículos ovarianos. O marcador Ki67 foi avaliado por imunohistoquímica. Testes bioquímicos para calicreína plasmática, intersticial e glandular, tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPa), óxido nítrico (NO), superóxido dismutase (SOD), glutationa reduzida (GSH), mieloperoxidase (MPO) e N-acetil glucosaminidase (NAG); e Western-blot para os receptores de bradicinina B1R e B2R também foram realizados Resultados: Após o protocolo de cisplatina, 100% das fêmeas do grupo controle mantiveram a ciclicidade estral versus 44,4% das fêmeas do grupo cisplatina. O grupo controle apresentou maior número de folículos antrais (p=0,011) e folículos viáveis totais (p=0,006). O grupo cisplatina apresentou maior número de folículos atrésicos (p=0,014). O marcador Ki67 demonstrou semelhantes taxas de proliferação celular entre os grupos. Os marcadores inflamatórios foram aumentados no grupo cisplatina, incluindo a geração de calicreína plasmática (p=0,003), a diminuição do TTPa (p=0,02), o aumento da atividade da calicreína intersticial (p=0,002) e glandular (p=0,008) e na expressão dos receptores B1R (p=0,001) e B2R (p=0,001), MPO (p=0,03) e NAG (p=0,04). Os marcadores de estresse oxidativo também foram aumentados no grupo cisplatina, com maior produção de NO (p=0,01) e diminuição na SOD (p=0,003) e na GSH (p=0,01). Conclusão: Todas as reações inflamatórias parecem ser ativadas pelo tratamento com cisplatina, exemplificadas pelo aumento da atividade da calicreína plasmática, intersticial e glandular, bem como a diminuição no TTPa e o aumento na expressão de B1R e B2R. A toxicidade mediada pela reação inflamatória da cisplatina é bem conhecida em seus efeitos colaterais, como ototoxicidade e nefrotoxicidade. Houve aumento da produção de NO nos ovários dos animais tratados, associado à indicação de menores concentrações de SOD e de GSH. Os desequilíbrios nos antioxidantes parecem contribuir para o estresse oxidativo ovariano. Quanto à MPO (neutrófilos) à NAG (macrófagos), a maior atividade de ambas no grupo cisplatina se explica pelo fato de que as células fagocíticas ativadas produzem grandes quantidades de espécies reativas de oxigênio, aumentando ainda mais o estresse oxidativo e a inflamação. O aumento da atividade do sistema calicreína-cininas e dos marcadores de estresse oxidativo no tecido ovariano propiciaram uma melhor compreensão da infertilidade induzida por cisplatina e indicam possíveis alternativas para proteção ovariana durante a quimioterapia, como inibidores do sistema calicreína-cinina e antioxidantes. / Background: Cisplatin toxicity is well understood in the renal, gastrointestinal, auditory and nervous systems, as well as in the bone marrow. However, the mechanisms causing infertility induced by cisplatin are poorly understood. Purpose: Our objective was to verify the participation of the kallikreinkinin system and oxidative stress in cisplatin-induced infertility, aiding in the development of new therapeutic alternatives. Methods: C57BL/6 adult (n=9) female mice received two 2.5 mg/kg intra-peritoneal cycles of cisplatin for five days, with a seven-day recovery period between cycles. The control group (n=9) received 0.9% NaCl solution. The ovarian follicles were counted with hematoxylin and eosin staining. Ki67 marker was evaluated by immunohistochemistry. Biochemical tests for plasma, interstitial and glandular kallikrein, activated partial thromboplastin time (aPTT), nitric oxide (NO), superoxide dismutase (SOD), reduced glutathione (GSH), myeloperoxidase (MPO) and N-acetyl glucosaminidase (NAG); and Western blotting for the bradykinin B1R and B2R receptors were also performed. Results: After cisplatin protocol, 100% of the females in the control group maintained estral cyclicity versus 44.4% of females in cisplatin group. The control group had a higher number of antral follicles (p=0.011) and total viable follicles (p=0.006). Cisplatin group had a higher number of atretic follicles (p=0.014). Ki67 marker demonstrated similar rates of cell proliferation between groups. Inflammatory markers were increased in cisplatin group, including plasma kallikrein generation (p=0.003), a decrease of aPTT (p=0.02), increased interstitial (p=0.002) and glandular (p=0.008) kallikrein, B1R (p=0.001) and B2R (p=0.001) expression, MPO (p=0.03) and NAG (p=0.04) Oxidative stress markers were also increased in cisplatin group, with higher NO production (p=0.01) and a decrease in SOD (p=0.003) and GSH (p=0.01). Conclusion: All inflammatory reactions appear to be activated by cisplatin treatment, exemplified by increased plasma, interstitial and glandular kallikrein activity, as well as the decrease in aPTT and increased expression of B1R and B2R. The toxicity mediated by cisplatin inflammatory reaction is well known in its side effects, such as ototoxicity and nephrotoxicity. There was an increase in NO production in the ovaries of treated animals, associated with the indication of lower concentrations of SOD and GSH. Imbalances in antioxidants appear to contribute to ovarian oxidative stress. Regarding MPO (neutrophils) and NAG (macrophages), the greater activity of both in cisplatin group is explained by the fact that activated phagocytic cells produce large amounts of reactive oxygen species, further increasing oxidative stress and inflammation. Increased activity of the kallikrein-kinin system and markers of oxidative stress in ovarian tissue provided a better understanding of cisplatin-induced infertility and indicate possible alternatives for ovarian protection during chemotherapy, such as inhibitors of the kallikrein-kinin system and antioxidants.