Thesis (Ph.D. in Molecular Biology) -- University of Colorado Denver, 2007. / Typescript. Includes bibliographical references (leaves 198-221). Free to UCD affiliates. Online version available via ProQuest Digital Dissertations;

L’arthrose est la pathologie articulaire la plus fréquente, caractérisée par une destruction progressive du cartilage articulaire et impliquant une communication anormale entre l'os sous-chondral et le cartilage. Notre équipe a identifié la protéine 14-3-3ε comme un médiateur soluble secrété par l’os et capable d’altérer l'homéostasie du cartilage en stimulant l’expression de MMP-3 et MMP-13, deux métalloprotéases impliquées dans la dégradation du cartilage au cours de l’arthrose. CD13/APN, récepteur potentiel pour cette protéine, a été mis en évidence à la surface des chondrocytes murins et humains. Le but de cette étude était d’étudier son implication dans la réponse des chondrocytes à 14-3-3ε. L’invalidation de CD13/APN par des siRNA ou des anticorps bloquants, réduit significativement l’effet catabolique chondrocytaire induit par 14-3-3ε. Les chondrocytes articulaires possèdent une activité APN mais elle n’est pas modifiée en présence de 14-3-3ε. Nous avons mis en évidence la présence d’une interaction directe entre 14-3-3ε et CD13/APN grâce à la technologie SPR (Surface Plasmon Resonance) et le système Biacore. En utilisant 14-3-3ε marquée à la biotine, nous avons montré que 14-3-3ε est capable de se lier à la surface des chondrocytes via CD13/APN. Nous avons donc eu recours ensuite aux études de modélisation in silico qui ont permis d’identifier le résidu Y582 phosphorylé appartenant à la séquence E579FNYVW584 de CD13/APN, comme résidu indispensable pour sa liaison à 14-3-3ε. Ce travail de thèse permet de mieux comprendre le mécanisme d’action de 14-3-3ε et propose l’interaction entre 14-3-3ε et CD13 comme une nouvelle cible thérapeutique dans l’arthrose. / Osteoarthritis (OA) is a whole-joint disease characterized by progressive destruction of articular cartilage involving abnormal communication between subchondral bone and cartilage. Our team identified 14-3-3ε protein as a subchondral bone soluble mediator altering cartilage homeostasis. This protein acts as a potent stimulatory factor of MMP-3 and MMP-13 involved in the degradation of cartilage matrix in OA. CD13/APN, potential receptor of this protein, was identified on the surface of chondrocytes. The aim of this study was to investigate its involvement in chondrocytes response to 14-3-3ε. CD13/APN invalidation, using the siRNA strategy and blocking antibodies, reduces significantly the catabolic effect induced by 14-3-3ε in chondrocytes. APN activity was identified in chondrocytes but found unchanged following stimulation with 14-3-3ε. Then, we have revealed the presence of a direct interaction between 14-3-3ε and CD13/APN through the SPR (Surface Plasmon Resonance) and the Biacore system. Using biotin-labeled 14-3-3ε, we have shown that 14-3-3ε is able to bind to the surface of chondrocytes in a manner that is dependent on CD13/APN. It was then necessary to identify the putative motifs involved in this interaction. We therefore used in silico modelling studies which have identified the phosphorylated residue Y582, belonging to the E579FNYVW584 sequence of CD13/APN, as a critical residue for its binding to 14-3-3ε. This thesis work suggest that CD13 plays its receptor role to bind 14-3-3ε and transmit its signal in chondrocytes to induce a catabolic phenotype similar to that observed in OA. Thus, 14-3-3ε-CD13 interaction could be a novel therapeutic target in OA.

L’Aminopeptidase-N (APN ou CD13) [EC.3.4.11.2] est une ectoenzyme homodimérique de nature glycoprotéique appartenant à la famille M1 des zinc-aminopeptidases. Elle est surexprimée à la surface des cellules endothéliales angiogéniques, ainsi que sur un certain nombre de cellules tumorales. Et il existe une corrélation étroite entre l’élévation de l’expression de l’APN, une activité enzymatique accrue et le pouvoir invasif de nombreux types de cellules tumorales. Des inhibiteurs puissants et sélectifs de l’APN, appartenant à la famille des composés de type amino-benzosubérone, ont été synthétisés au laboratoire. Ces composés ont été testés in vitro et in vivo, et il est apparu qu’ils présentaient une affinité variant du nano au picomolaire. En parallèle à ces essais, un nouveau projet a débuté il y a quelques années au laboratoire, visant à déterminer la structure tridimensionnelle de l’APN humaine. La connaissance de cette structure constitue un enjeu majeur car des co-cristallisations avec ces inhibiteurs permettraient de résoudre le mode de liaison de cette nouvelle famille de composés à l’APN. La difficulté de cette étude réside dans le fait que l’APN est une glycoprotéine membranaire particulièrement difficile à purifier à partir de tissus ; de plus, cette protéine étant ancrée dans la membrane de la cellule, sa cristallisation en est d’autant plus complexe. Plusieurs stratégies de clonage et de surexpression de l’APN humaine ont été envisagées, avec pour objectif final, l’obtention d’une protéine cristallisable, glycosylée ou non. / Aminopeptidase-N (APN or CD13) [EC.3.4.11.2] is a highly glycosylated type II membrane-bound ectoenzyme that belongs to the M1 family of zinc-dependent aminopeptidases. The members of this family have a thermolysin-like catalytic domain with the consensus HEXXH-X18-E zinc-binding sequence and an exopeptidase motif, GXMEN, in the active site. APN/CD13 is a widespread enzyme, located in many tissues, organs and cells, whose multiple functions dependent on its location. It is overexpressed on the endothelial cells of angiogenic, but not normal, vasculature, as well as on numerous tumor cells. As it was demonstrated that APN plays a critical role in tumor cell angiogenesis and metastasis, this protein was identified as a potential target for cancer therapy. In this context, highly potent and selective non-peptidic APN inhibitors, with Ki values ranging from micro to nanomolar, were previously designed and synthesized in the laboratory. In vitro and in vivo efficacy of these novel amino-benzosuberone derivatives was tested. In parallel to these works, a new project was started a few years ago which consists to solve the 3D structure of mammalian APN. Co-crystallizations with amino-benzosuberone derivatives would determine the binding mode of these novel inhibitors. Nevertheless solving the structure of a membrane protein like mammalian APN still remains a challenge. Therefore several cloning and expression strategies for human APN production were developed.

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L'Aminopeptidase-N (APN ou CD13) [EC.3.4.11.2] est une ectoenzyme homodimérique de nature glycoprotéique appartenant à la famille M1 des zinc-aminopeptidases. Elle est surexprimée à la surface des cellules endothéliales angiogéniques, ainsi que sur un certain nombre de cellules tumorales. Et il existe une corrélation étroite entre l'élévation de l'expression de l'APN, une activité enzymatique accrue et le pouvoir invasif de nombreux types de cellules tumorales. Des inhibiteurs puissants et sélectifs de l'APN, appartenant à la famille des composés de type amino-benzosubérone, ont été synthétisés au laboratoire. Ces composés ont été testés in vitro et in vivo, et il est apparu qu'ils présentaient une affinité variant du nano au picomolaire. En parallèle à ces essais, un nouveau projet a débuté il y a quelques années au laboratoire, visant à déterminer la structure tridimensionnelle de l'APN humaine. La connaissance de cette structure constitue un enjeu majeur car des co-cristallisations avec ces inhibiteurs permettraient de résoudre le mode de liaison de cette nouvelle famille de composés à l'APN. La difficulté de cette étude réside dans le fait que l'APN est une glycoprotéine membranaire particulièrement difficile à purifier à partir de tissus ; de plus, cette protéine étant ancrée dans la membrane de la cellule, sa cristallisation en est d'autant plus complexe. Plusieurs stratégies de clonage et de surexpression de l'APN humaine ont été envisagées, avec pour objectif final, l'obtention d'une protéine cristallisable, glycosylée ou non.