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Le resvératrol (RV/RSV) est un composé chimique organique connu pour ses effets anticancéreux mais aussi pour son effet rajeunissant sur les cellules et les organismes. Afin d’étudier le ou les multiples mécanismes à l’origine de ces effets, Y. Benslimane du laboratoire Harrington a étudié l’effet du resvératrol in vitro, à des concentrations de l’ordre de 12,5 μM à 25 μM, sur plusieurs lignées de cellules cancéreuses humaines, notamment NALM6 et JURKAT. Ses recherches ont démontré que le traitement par resvératrol conduit à l’activation de la voie de signalisation ATR/CHK1, qui maintient les cellules mitotiques en phase S afin d'induire la réparation de l'ADN. Dans ces cellules, le resvératrol présente spécifiquement une signature similaire à celle de l’hydroxyurée, un composé anticancéreux connu pour l’induction de stress réplicatif. Cette induction de stress réplicatif semble complémentaire aux mécanismes de la littérature existante, qui présente le resvératrol comme un activateur de sirtuines, une famille d’histones désacétylases hautement conservées entre les espèces et impliquées dans la réparation de l'ADN et la réponse métabolique. Cependant, alors que plusieurs articles démontrent une activation de la sirtuine 1 (SIRT1) comme conséquence notable du traitement par le resvératrol, les études de Benslimane et al. ont démontré quant à elles que le knock-out de la sirtuine 1 dans les cellules NALM6 et Jurkat n’affectait pas le phénotype de stress réplicatif observé. Or les concentrations de resvératrol employées dans l’ensemble de la littérature scientifique varient de 0,5 μM à 100 μM in vitro, laissant supposer une variance dans les conditions expérimentales qui pourrait expliquer la variance de résultats observés. Dans ce contexte, nous avons émis l’hypothèse que l’effet du resvératrol était dépendant de la concentration utilisée, autrement dit, que son effet était biphasé. Plus spécifiquement, dans les cellules NALM6 cancéreuses, nous avons supposé que les stress réplicatif causé par des concentrations élevées (>12,5 μM) de resvératrol pouvait masquer l’activation des sirtuines et spécifiquement celle de la sirtuine 1, tandis que des concentrations plus faibles (<5 μM) 4 permettraient l’observation potentielle de mécanismes parallèles à l’activation de la voie ATR/CHK1. Nous avons également émis l’hypothèse que l’échelle temporelle d’observation jouait un rôle dans la mesure des résultats et leur observabilité. Afin d’examiner nos hypothèses, nous avons dans un premier temps fixé le temps d’observation à 72h après traitement, et évalué l'effet du resvératrol et de l'inhibiteur de l'ATR VE-821 sur la viabilité cellulaire relative dans les cellules NALM6 WT, p53 KO et SIRT1 KO. La lignée p53 KO fut choisie, car p53 est en aval des voies de signalisation ATR/CHK1 et SIRT1. Cette expérience a montré une augmentation légère et non significative de la viabilité relative dans les trois lignées à des concentrations de resvératrol d'environ 2,5 μM, et une réduction significative de la viabilité à des concentrations supérieures à 10 μM. En outre, le score de synergie Bliss a révélé un effet additif entre le resvératrol et VE-821. Dans un second temps, nous avons quantifié l’effet de différentes concentrations de resvératrol sur le cycle cellulaire. Dans les trois lignées cellulaires, on trouve un pourcentage significatif de cellules arrêtées en phase S après un traitement de 24 heures avec 12,5 μM de resvératrol, mais aucune différence significative entre les conditions DMSO et 2,5 μM de resvératrol. On n’observe pas de différence significative entre les lignées. Enfin, une expérience temporelle révèle que les effets du resvératrol pourraient s'estomper après 16h, et montre une légère augmentation des cellules arrêtées en phase S après un traitement à 2,5 μM de resvératrol à 16h, par rapport au contrôle DMSO, suggérant un temps d’observation intéressant en deçà de 16h et un potentiel effet du resvératrol à faible dose. Ces résultats semblent confirmer l'action du resvératrol sur la voie ATR/CHK1, avec un arrêt du cycle cellulaire en phase S après traitement par 12,5 μM de resvératrol, dans les trois lignées WT, SIRT1 KO et p53 KO. Ils suggèrent également un effet potentiellement bénéfique du resvératrol à faibles doses par le biais d'un stress réplicatif de faible intensité, sans démontrer de dépendance à SIRT1 ou p53. Enfin, ils soulignent la nécessité d’une observation à différentes échelles temporelles. / Resveratrol (RV/RSV) is an organic chemical compound known for its anti-cancer and rejuvenating effects on cells and organisms. To investigate the multiple mechanisms behind these effects, Y. Benslimane of the Harrington laboratory studied the effect of resveratrol in vitro, at concentrations ranging from 12.5 μM to 25 μM, on several human cancer cell lines, including NALM6 and JURKAT. His research has shown that treatment with resveratrol leads to activation of the ATR/CHK1 signaling pathway, which keeps mitotic cells in S phase to induce DNA repair. Resveratrol specifically displays a signature similar to that of hydroxyurea, an anti-cancer compound known to induce replicative stress. This induction of replicative stress seems complementary to the mechanisms exposed in the literature, which presents resveratrol as an activator of sirtuins, a family of histone deacetylases highly conserved across species and involved in DNA repair and metabolic response. However, while several articles demonstrate activation of sirtuin 1 (SIRT1) as a notable consequence of resveratrol treatment, studies by Benslimane et al. showed that sirtuin 1 knockout in NALM6 and Jurkat cells did not affect the observed phenotype of replicative stress. Because concentrations of resveratrol used in the literature vary from 0.5 μM to 100 μM in vitro, we hypothesized that this variance in experimental conditions might explain the variety of results observed. More specifically, in NALM6 cancer cells, we hypothesized that replicative stress caused by high concentrations (>12.5 μM) of resveratrol could mask activation of sirtuins and specifically sirtuin 1, while lower concentrations (<5 μM) would allow the potential observation of mechanisms parallel to activation of the ATR/CHK1 pathway. We also hypothesized that the time scale of observation played a role in the measurement of results and their observability. To examine our hypotheses, we first set the observation time at 72h post-treatment, and assessed the effect of resveratrol and the ATR inhibitor VE-821 on relative cell viability in NALM6 WT, p53 KO and SIRT1 KO cells. The p53 KO line was chosen, as p53 is downstream of the 6 ATR/CHK1 and SIRT1 signaling pathways. This experiment showed a slight, non-significant increase in relative viability in all three lines at resveratrol concentrations of around 2.5 μM, and a significant reduction in viability at concentrations above 10 μM. In addition, the Bliss synergy score revealed an additive effect between resveratrol and VE-821. In a second step, we quantified the effect of different resveratrol concentrations on the cell cycle. In all three cell lines, we found a significant percentage of cells arrested in S phase after 24h treatment with 12.5 μM resveratrol, but no significant difference between DMSO and 2.5 μM resveratrol conditions. No significant difference was observed between lines. Finally, a time-course experiment revealed that the effects of resveratrol might fade after 16h, and showed a slight increase in S-phase arrested cells after treatment with 2.5 μM RSV at 16h, compared with the DMSO control, suggesting an interesting observation time below 16h and a potential effect of resveratrol at low doses. These results seem to confirm the action of resveratrol on the ATR/CHK1 pathway, with cell cycle arrest in S phase after treatment with 12.5 μM resveratrol, in the three lines WT, SIRT1 KO and p53 KO. They also suggest a potentially beneficial effect of low-dose resveratrol via low-intensity replicative stress, without demonstrating dependence on SIRT1 or p53. Finally, they emphasize the need for observation on different time scales.

El sistema TK/GCV es, problamente, la estrategia suicida mejor caracterizada hasta el momento. No obstante, se desconocen muchos aspectos relacionados con su mecanismo de acción. Con el objetivo de indentificar condicionantes de la respuesta TK/GCV, realizamos un estudio comparativo de la expresión de genes y de las vías de señalización que se activan en células sensibles y en células resistentes al tratamiento. Así, pudimos asociar la actividad de la quinasa Chk1, y la expresión de genes involucrados en el control del ciclo celular, con una mayor respuesta al sistema suicida. Así mismo, determinamos que la combinación de TK/GCV con el inhibidor de Chk1 UCN-01 produce un efecto antagónico en las células sensibles a TK/GCV. Por otro lado, la terapia combinada capaz de lisar las células e inducir muerte celular por fosforilación de GCV, en un único agente (ICOVIR11), resultó en una potenciación de sus efectos citotóxicos, permitiendo la compensación de la pérdida de potencia secundaria al uso de un promotor selectivo de tumor. Más aún, la expresión de TK como gen tardío de ICOVIR11,permitió la monitorización in vivo y de manera no invasiva, de la actividad TK y la replicación viral. / Although extensively characterized, the paradigmatic suicide system TK/GCV conceals the details of its ultimate mechanism of action. In order to shed some light on this issue, we conducted a series of experiments with resistant and sensitive cell lines, allowing us to identify cell cyclerelated genes that are deregulated in cells with induced resistance to TK/GCV. In addition, the association of Chk1 activation with a greater sensitivity to TK/GCV, pointed out the relevance of the cell cycle status at the moment of receiving the treatment, and its control in response to genotoxic insults. Treatment with a Chk1 inhibitor induced, in sensitive cells, an antagonistic effect on TK/GCV cytotoxicity. On the other hand, single-agent combination therapy of TK/GCV with adenoviral lysis resulted in enhanced cytotoxicity. In this setting the expression of TK as a late gene in an oncolytic adenovirus minimized the loss of potency associated to the conditioning of viral replication. On top of that, TK expression allowed for in vivo, real time, non-invasive monitoring of viral replication in mice, and was used to analyze the effects of treatment schedule on treatment outcome.

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DNA is wrapped around proteins called histones, whose modification regulates numerous cellular processes. Therefore it is not surprising that mutations in the genes that modify the histones are frequently associated with human cancer. For example, mutations in SETD2, encoding the sole enzyme that catalyses histone H3 lysine 36 trimethylation (H3K36me3), occur frequently in multiple cancer types. This identifies H3K36me3 loss as an important event in cancer development, and also as a potential therapeutic target. This thesis investigates the following questions: (1) how does the loss of H3K36me3 contribute to cancer development; and (2) what therapy can be used to kill cancers that have already lost H3K36me3. To answer the first question, this thesis shows that H3K36me3 facilitates the accurate repair of DNA double-stranded breaks (DSBs) by homologous recombination (HR). H3K36me3 promotes HR by recruiting CtIP to the site of DSBs to carry out resection, allowing the binding of HR proteins (such as RPA and RAD51) to the damage sites. Thus it is proposed that error-free HR repair within H3K36me3-decorated transcriptionally active genomic regions suppresses genetic mutations which could promote tumourigenesis. To answer the second question, this thesis reveals a clinically relevant synthetic lethal interaction between H3K36me3 loss and WEE1 inhibition. WEE1 inhibition selectively kills H3K36me3-deficient cells by inhibiting DNA replication, and subsequent fork stalling results in MUS81 endonuclease-dependent DNA damage and cell death. The mechanism is found to be synergistic depletion of RRM2 (ribonucleotide reductase small subunit), the enzyme that generates deoxyribonucleotides (dNTPs). This work reveals two pathways that regulate RRM2: one involves transcriptional activation of RRM2 by H3K36me3, and the other involves RRM2 degradation regulated by Cyclin-Dependent Kinase, CDK1 (which is controlled by WEE1, CHK1 and ATR). Based on this mechanism, the synthetic lethal interaction is expanded, from between two genes, to between two pathways. Supported by in vivo experiments, the study suggests that patients with cancers that have lost H3K36me3 could benefit from treatment with the inhibitors of WEE1, CHK1 or ATR.

La protéine E4F1 découverte comme cible cellulaire de l'oncoprotéine adénovirale E1A est une protéine ubiquitaire agissant comme facteur de transcription et comme E3-ligase atypique. La protéine E4F1 interagit également directement avec plusieurs gènes suppresseurs de tumeurs et des oncoprotéines, suggérant son implication dans la tumorigénèse. Des travaux antérieurs du laboratoire, sur les fonctions cellulaires d’E4F1 dans les cellules cancéreuses ont montré que sa déplétion entraîne une mort cellulaire massive dans les Mefs transformés déficients en p53. De plus, E4F1 contrôle directement l'expression de 38 gènes, notamment impliqués dans le métabolisme cellulaire et les checkpoints du cycle cellulaire/Réponse aux dommages de l'ADN (DDR), tel que Chek1 qui code un composant majeur du checkpoint ATR/ATM. Conformément à ce rôle d’E4F1 dans la survie des cellules cancéreuses chez la souris, des patientes atteintes d'un cancer du sein triple négatif (TNBC) exprimant fortement E4F1 présentent une survie sans rechute (RFS) plus faible.Nous avons donc décidé d’étudier pour la première fois le programme transcriptionnel d’E4F1 dans les cellules humaines et d’explorer son rôle dans la survie des cellules de TNBC, avec une attention particulière pour son rôle dans la réponse aux agents de chimiothérapie.Les transcriptomes (RNAseq) de cellules SUM159 de TNBC montrent, lors de la déplétion d’E4F1, une diminution de l’expression de 147 des 276 gènes associés à la DDR. La combinaison de RNAseq et de ChIPseq révèle qu’E4F1 régule directement 57 gènes dans les cellules de TNBC humaines. Parmi ces gènes, E4F1 lui-même, CHEK1, mais aussi TTI2 et PPP5C codant pour des régulateurs post-transcriptionnels de l'axe ATM/ATR-CHK1, et définissant ainsi un "régulon" ATM/ATR-CHK1, encore inconnu et dépendant d’E4F1. TTI2 forme avec TELO2 et TTI1, le complexe TTT nécessaire au repliement correct et à la stabilité des protéines de la famille PIKK, telles qu’ATR et ATM. La phosphatase PPP5C est impliquée dans l'activation de la signalisation ATR-CHK1. Fait important, nous montrons qu’E4F1 se fixe sur et régule probablement ces trois gènes in vivo dans des tumeurs TNBC dérivées de patientes (PDTX). Dans la lignée SUM159 et les PDTX, le recrutement d’E4F1 sur ces gènes est augmenté lors du traitement avec la Gemcitabine, un agent de chimiothérapie bloquant la réplication de l’ADN. Étonnamment, nous avons révélé qu’E4F1 contrôle aussi indirectement l'expression de TELO2, un second membre du complexe TTT. Par conséquent, dans les cellules TNBC déplétées en E4F1, les taux de protéines des CHK1, TTI2, TELO2 mais aussi des kinases ATM/ATR, sont fortement diminués, entraînant une déficience de la DDR. Ainsi, les cellules SUM159 déplétées en E4F1 ne parviennent pas à s'arrêter en phase S lors du traitement à la Gemcitabine et sont hautement sensibilisées à cet agent de chimiothérapie, ainsi qu'à d'autres agents endommageant l'ADN comme le Cisplatine. Dans leur ensemble, mes travaux de thèse révèlent que la voie de signalisation ATM/ATR-CHK1, et la réponse au stress / dommages de l'ADN sont étroitement contrôlées aux niveaux transcriptionnel et post-transcriptionnel par E4F1. E4F1 apparait donc comme un acteur central dans la survie cellulaire des cellules TNBC, en particulier lorsqu'elles sont exposées à des agents endommageant l'ADN ou à des agents de chimiothérapie. Ainsi E4F1 pourrait représenter un marqueur pronostique de réponse à la chimiothérapie et une cible thérapeutique potentielle. / The E4F1 protein discovered as the cellular target of the adenoviral oncoprotein E1A is a ubiquitous protein acting both as a transcription factor and as an atypical E3-ligase. E4F1 protein also interacts directly with several cellular tumor suppressors and oncoproteins, suggesting its involvement in tumorigenesis. Previous laboratory work on the cellular functions of E4F1 in cancer cells has shown that its depletion leads to massive cell death in transformed Mefs deficient in p53. In addition, E4F1 directly controls the expression of 38 genes, including genes involved in cell metabolism and cell cycle checkpoints/DNA Damage Response (DDR), such as Chek1 that encodes a major component of the ATR/ATM checkpoint. Consistent with this role of E4F1 in cancer cell survival in mice, patients with triple-negative breast cancer (TNBC) with high E4F1 expression exhibit a poorer relapse free survival (RFS).We therefore aimed to study for the first time the transcriptional program of E4F1 in human cells and explore its role in the survival of TNBC cells, with particular focus on its role in the response to chemotherapy agents.Transcriptomes (RNAseq) of SUM159 TNBC cells show, when E4F1 is depleted, a decrease in expression of 147 out of 276 DDR-associated genes. The combination of RNAseq and ChIPseq shows that E4F1 directly regulates 57 genes in human TNBC cells. Among these genes, E4F1 itself, CHEK1, but also TTI2 and PPP5C coding for post-transcriptional regulators of the ATM/ATR-CHK1 axis, and thus defining an ATM/ATR-CHK1 "regulon", undescribed and E4F1-dependent. TTI2 composes with TELO2 and TTI1, the TTT complex required for the correct folding and stability of PIKK family proteins, such as ATR and ATM. PPP5C phosphatase is involved in the activation of ATR-CHK1 signaling. Importantly, we show that E4F1 binds to and probably regulates these three genes in vivo in Patient Derived TNBC Xenografts (PDTX). In both SUM159 cells and PDTX, the recruitment of E4F1 on these genes is increased upon Gemcitabine treatment, a chemotherapy agent that impairs DNA replication. Surprisingly, we found that E4F1 also indirectly controls the expression of TELO2, a second member of the TTT complex. Consequently, in TNBC cells depleted of E4F1, the protein levels of CHK1, TTI2, TELO2 but also ATM/ATR kinases, are significantly decreased, leading to DDR deficiency. Thus, SUM159 cells depleted of E4F1 fail to stop in phase S during Gemcitabine treatment and are highly sensitized to this chemotherapy agent, as well as other DNA damaging agents such as Cisplatin. Altogether, my thesis results demonstrate that the ATM/ATR-CHK1 signaling pathway, and the response to stress / DNA damage are tightly controlled at the transcription and post-transcription levels by E4F1. E4F1 therefore appears to be a central actor in the cellular survival of TNBC cells, particularly when exposed to DNA-damaging agents or chemotherapy agents. Thus, E4F1 could represent a prognostic marker for chemotherapy response and a potential therapeutic target.