Orientador: Jose Camillo Novello / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-04T00:20:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Kassab_BaykiHussein_D.pdf: 1712667 bytes, checksum: 635db4ddccf22f18ef236c2bbd4e53b9 (MD5) Previous issue date: 2004 / Resumo: As lectinas presentes nos venenos ofídicos são classificadas como lectinas tipo-C e são formadas por cadeias polipeptídicas relativas ao CRD (carbohydrate recognition domain) livre, sem domínios adicionais. BJcuL é uma lectina presente no veneno da serpente Bothrops jararacussu, isolada e caracterizada em nosso laboratório. Trata-se de um homodímero, com grande afinidade à galactose e apresenta atividades tóxica sobre células tumorais e endoteliais. Este trabalho teve como proposta: (1) determinar a seqüência completa do cDNA da lectina do veneno da serpente Bothrops jararacussu; (2) desenvolver um sistema de expressão, solubilização e purificação para a produção de BJcuL recombinante; (3) comparar a atividade da BJcuL recombinante com a nativa. Concomitante ao trabalho acima, foi também de nosso interesse: (4) investigar o efeito de BJcuL nativa sobre células tumorais do cólon quanto a proliferação/viabilidade, e produção de espécies reativas de oxigênio (ROS). O cDNA-BJcuL foi isolado da biblioteca de cDNA a partir da glândula de veneno de B. jararacussu. A seqüência do cDNA-BJcuL (GenBank acesso No. AY388642); apresentou uma região codificadora de aminoácido correspondente a BJcuL nativa e com um elevado grau de identidade com outras lectinas do tipo-C. O cDNA-BJcuL foi amplificado por PCR e ligado ao vetor de pET15b e usado para transformar E. coli BL21 (DE3). Uma proteína ,insolúvel e inativa, de 18,5 kDa foi expressa após a adição de 1 mM de IPTG. A rBJcuL foi desnaturada com 6 M de uréia, purificada e renaturada em coluna de afinidade, seguida de diálise e cromatografia em gel. A eficiência no processo de renaturação foi confirmada através de ensaios biológicos, dicroísmo circular e análise dos peptídios de rBJcuL. As células tumorais do cólon HT-29 D4 e Caco-2, após a adesão, foram incubadas com BJcuL (0 - 10 mM com 5% de FBS) por diferentes períodos (24, 48 e 72h). Ensaios de proliferação foram feitos usando o Kit BrdU-Elisa e uma interessante diminuição na incorporação de BrdU foi observada em ambas as células. BJcuL (2,5 µM) foi capaz de inibir aproximadamente 50% da proliferação em Caco-2 e 30% em HT-29 D4 em 24h. Este efeito, aparentemente não foi relacionado ao tênue desequilíbrio celular de ROS, cerca de 20% na presença de 2,5 µM de BJcuL, medido em fluorímetro (excitação em 490 nm e emissão a 538 nm) após a adição da sonda DCFH-DA. Ensaios com o reagente MTT confirmaram que BJcuL apresenta fraca citotoxicidade e não é capaz de diminuir a viabilidade dessas células. Com base nos resultados obtidos, buscamos desenvolver um estudo mais detalhado da estrutura molecular de BJcuL e suas funções, por meio da clonagem, seqüenciamento e expressão de rBJcuL, na intenção de fornecer dados para o esclarecimento das particularidades estruturais dessas proteínas / Abstract: Snake venom lectins are classified as C-type lectins and their molecular structure consist in at least one carbohydrate recognition domain - CRD per subunit. BJcuL is a lectin from Bothrops jararacussu snake venom, which have been isolated and characterized in our laboratory. The lactose-binding BJcuL is a homodimer, and show toxic activity on cancer cells and endothelial cell lines. The aim of this work was: (1) to determine the complete cDNA sequence that encode the lectin from B. jararacussu snake venom; (2) to develop a methodology for the expression, solubilization, and purification of recombinant BJcuL; (3) to compare recombinant and native BJcuL activity. In addition to the work described we have investigated (4) native BJcuL effect on colon tumor cells concerning the proliferation and reactive oxygen species production (ROS). The cDNA-encoding BJcuL has been isolated of the cDNA phage library, constructed from B. jararacussu venom glands. The mature protein-coding region was amplified by PCR with specific oligonucleotides, and subcloned into the pET-15b vector to express the recombinant BJcuL in Escherichia coli BL21 (DE3). The deduced amino acid sequence exhibits a high degree of sequence identity with c-type lectins (CTLs) and c-type lectin-like domains (CTLDs). An insoluble and inactive 18.5-kDa protein was overexpressed after 1.0 mM IPTG induction. The recombinant BJcuL was recovered and denatured in a buffer with 6 M urea and purified on a nickel-affinity column. Protein refolding was carried out on this column, during procedure purification, followed by dialysis against CTBS and then by gel filtration for separation of the active dimmer. The refolding process of rBJcuL and the analysis of its structure were confirmed by biological assay, circular dichroism and Maldi-Tof. HT-29 D4 and Caco-2 cells, after adhesion, were treated with BJcuL (0 - 10 mM with 5%FBS) in 24, 48 and 72h. Proliferation assays were performed using BrdU-Elisa kit. An interesting decrease in BrdU incorporation was observed for both cells. At 2.5 µM BJcuL inhibited cell proliferation by approximately 50% for Caco-2 and 30% for HT-29 D4 in 24 h. This effect apparently was unrelated to subtle (20%) cellular redox imbalance induced by 2.5 µM BJcuL. In addiction, BJcuL showed a weak cytotoxic effect on these cell lines, since MTT assay did not show any decrease in cell viability. Together with the results presented, we are interested in a more detailed study of the molecular structure of BJcuL and its functions, through cloning and expression of rBJcuL, intending to clarify the structural particularities of these proteins / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Wanderley Dias da Silveira / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-24T22:45:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mendonca_Sergiode_D.pdf: 5307853 bytes, checksum: de9b6f00c4099ec1ab0d2f50163feb4e (MD5) Previous issue date: 1999 / Doutorado / Genetica / Doutor em Ciências Biológicas

Orientadores : Yoko Bomura Rosato , Spartaco Astolfi Filho / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-14T22:27:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Stripecke_Renata_M.pdf: 3003802 bytes, checksum: 8c424cedc5aad86a1d83c9a594fd7733 (MD5) Previous issue date: 1988 / Resumo: A bactéria Xanthomonas campestris é um fitopatógeno que produz a goma xantana, de grande importância econômica, devido ao seu variado potencial de utilização na Indústria e na agricultura. Com o objetivo de se verificar a expressão de um gene de amilase exógeno em X.campestris, estabeleceu-se um sistema de clonagem para esta bactéria. Este sistema constituiu-se no plasmídio promíscuo pMFY40 ao qual se inseriu o gene da alfa-emllese de Bacillus subtilis, resultando no plesmídio pAP1. Este plesmídio possui aproximadamente 14.0 Kb, á mobilizável por plasmídios ¿helper¿ e razoavelmente estável, em condições de fermentação, em X. campestris. O pAP1 foi introduzido por transformação e por conjugação em duas linhagens de campestris, uma delas originalmente amilolítica (REF) e outra não-amilolítica (280), mas que é uma boa produtora de goma. Após se verificar a secreção da enzima em meio sólido pelos recombinantes, analisou-se o consumo de amido e a produção de açúcar redutor em meto líquido. Verificou-se que a linhagem 280/pAPl foi capaz de degradar o amido do meio e que a linhagem REF/pAPl teve seu caráter amiolítico amplificado. A produção de xantana em meios contendo diferentes com posições de substratos foi verificada através da viscosidade da goma, para se analisar as potencialidades da substituição do substrato tradicional, que é a sacarose, pelo amido. Foi observado um acréscimo de produção nas linhagens contendo o pAPl em meio com 2X de amido e em meto com 1X de amido e IX de sacarose. Apesar da substituição total da sacarose pelo amido ser Inviável para a fermentação pela linhagem 280/pAP1, verificou-se que a composição de IX de sacarose e de 1X de amido Já fornece bons resultados / Abstract: Xanthomonas campestris Is a phytopathogenlc bacteria. Which produces the xanthan-gum a biopolimer of economical Importance due to lts great poss1b111tles of ut111zat1on ln the Industry and In the agriculture. A cloning system for the analysis of expression of the extracellular amylase was established. The alfa-amylase gene from Bacillus subtilis was introduced in the promiscuous plasmid pMFY40, giving rise to the hybrid plasmid pAP1. This plasmid contains approximately 14.0 Kb, is mobilizable by helper plasmid and is reasonably stable, in fermenting conditions, in X.campetris. The plasmid pAP1 has been introduced by transformation and by conjugation into two strains of X. campestris one of them originally amylolytlc (REF), and the other not amylolytic (280) but a very good gum producer. Besides the observation of the enzyme production by the recombinants in solid media, the starch consumption and the reducing-sugar production in liquid media were also analysed. It was verified that the strain 280/pAP1 was able to degradate the starch of the media and that the strain REF/pAP1 had its amylolytic character amplified. The xanthan production in media containing different substrates compositions was analysed to evaluate the potentialities of the substitution of the traditional substrate, sucrose, by starch. The strains bearing the plasmid pAP1 showed viscosity enhancement of the media containing 2% starch and also 1% starch plus 1% sucrose. Although the total substitution of sucrose by starch was not successful for the fermentation of 280/pAP1, good results were observed in the media containing 1% starch plus 1% sucrose / Mestrado / Genetica / Mestre em Ciências

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-07-11T18:06:56Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 518257 bytes, checksum: a284ae16f3d43e9016579dfb01f9d2c4 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-11T18:06:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 518257 bytes, checksum: a284ae16f3d43e9016579dfb01f9d2c4 (MD5) Previous issue date: 2001-04-13 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A base da silvicultura clonal para o gênero Eucalyptus está na utilização de clones de alta produtividade, normalmente identificados nas avaliações dos testes clonais. Em geral, quanto maior o número de clones avaliados por unidade de tempo, maior a possibilidade de sucesso com a seleção. Entretanto, as etapas de avaliação e seleção são as mais caras e demoradas do programa de melhoramento, dificultando a elaboração e a execução de extensos programas de seleção de clones. Assim, o presente trabalho teve como objetivos: a avaliação da influência da idade, do espaçamento e do local sobre o tamanho da parcela experimental em testes clonais, considerando-se os coeficientes de variação experimentais, coeficientes de variação fenotípicos e produtividade em volume; e a determinação do tamanho da parcela experimental, por meio do Método de Máxima Curvatura Modificado, do Coeficiente de Correlação Intraclasse e da Análise Visual. A partir de quatro testes clonais, estabelecidos em área da International Paper do Brasil Ltda., analisaram -se as características altura, dap e volume dos quatro testes clonais, dispostos em delineamento em blocos ao acaso, com quatro repetições e parcela experimental quadrada de 25 plantas (5 x 5). Após a simulação de diferentes tamanhos de parcela: 2, 3, 4, 5, 9, 10, 15, 20 e 25 plantas/parcela, procedeu-se às análises do efeito do tamanho da parcela na produtividade, na precisão experimental e na variação do coeficiente fenotípico. Determinou-se, também, o tamanho da parcela pelos Métodos de Máxima Curvatura Modificado, do Coeficiente de Correlação Intraclasse e da Análise Visual. De forma geral, o tamanho da parcela não alterou a estimativa de produção volumétrica dos clones nas diferentes idades analisadas. No entanto, o coeficiente de variação experimental (CV exp ) e o coeficiente de variação fenotípico (CV f ) apresentaram maiores valores nas idades mais avançadas e com tendência de queda com o aumento do número de plantas na parcela, independentemente da idade. O espaçamento de plantio pode alterar o tamanho da parcela, pois, quanto maior o espaçamento, menores o CV exp e o CV f . O comportamento da parcela foi pouco influenciado pelas avaliações realizadas nos diferentes locais. O tamanho mínimo da parcela experimental indicado pelos Métodos de Máxima Curvatura Modificado e pelo Coeficiente de Correlação Intraclasse variou de 1 a 8,6 plantas/parcela; já na análise visual, variou de 5 a 15 plantas por parcela, nos diferentes testes clonais e nas características analisadas. Com base no presente estudo, pôde-se concluir que, em programas iniciais para seleção de clones, parcela de 5 a 10 plantas indica boa precisão experimental, sendo recomendada, principalmente, em situação com limitações de mudas, teste de grande número de clones e avaliações de cunho preliminar e em idade precoce. No entanto, vale ressaltar que, para um melhor conhecimento do clone para uso comercial, parcelas quadradas maiores e, ou, plantios-piloto são os mais indicados. / The base of clonal forestry for the Eucalyptus gender is the use of high production clones, normally identified in clonal test evaluations. In general, the higher the number of evaluated clones per time unit, the greater the possibility of a successful selection. However, the evaluation and selection stages are the most expensive and time-consuming of the enhancement program, creating difficulties for working out and carrying out extensive clone selection programs. Therefore, the present study had the objectives: evaluation of age influence, spacing and site on the experimental parcel size in clonal tests, considering the coefficient of variation experimental, the coefficient of variation phenotype and the volume productivity, as well as the determination of the experimental parcel size, by means of the Maximum Modified Curvation, the Interclass Correlation coefficient and Visual Analysis methods. Based on four clonal tests, established in the area of International Paper of Brazil Ltda., the characteristics height, diameter at breast height and volume were tested in the four clonal tests, set up in design of random blocks in four repetitions, in experimental square parcels of 25 plants (5x5). After the simulation of different parcel sizes: 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20 and 25 plants/parcel, the influence of the parcel size on the productivity, the experimental accuracy and the variation of the phenotype coefficient were tested. The parcel size was also determined by the Maximum Modified Curvation, the Interclass Correlation Coefficient and the Visual Analysis methods. In the main, the parcel size did not influence the volume production estimative of the clones at the different analyzed ages. However, the coefficient of variation experimental (CV exp ) and the coefficient of variation phenotype (CV ph ) presented higher values at more advanced ages, with a sinking tendency when the number of plants in the parcel was reduced, independent of the age. The plant spacing can change the parcel size, since the greater the spacing, the lower the CV exp and CV ph . The parcel behavior was little influenced by the evaluations performed in the different sites. The minimum size of the experimental parcel indicated by the Maximum Modified Curvation and the Interclass Correlation Coefficient methods ranged from 1 to 8.6 plants per parcel, while for the Visual Analysis it varied from 5 to 15 plants per parcel in the different clone tests and the analyzed characteristics. Based on the present study, the conclusion can be drawn that in initial clone selection programs, parcels of 5 to 10 plants provide good experimental accuracy, especially recommended when there is only a limited number of seedlings available, a high number of test clones and evaluations of preliminary type and at an early age. However, it must be emphasized that in order to obtain more knowledge about a clone for commercial use, larger square parcels and/or, pilot plantings are the most indicated. / Dissertação importada do Alexandria

Orientador : Oswaldo Garcia Junior / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-18T15:20:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Novo_MariaTeresaMarques_M.pdf: 3770876 bytes, checksum: e759cfa99a47f8a9dc0e976ada11184e (MD5) Previous issue date: 1993 / Mestrado / Genetica de Microorganismos / Mestre em Ciências Biológicas

Submitted by Ana Damasceno (ana.damasceno@unipampa.edu.br) on 2017-05-12T16:58:20Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Clonagem e expressão Datransposase mos1 de Drosophila simulans e o desenho in silico de um vetor para expressão heteróloga de proteínas.pdf: 1982928 bytes, checksum: 704cbac648c3f7621a8bb8d5cf3116c7 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-12T16:58:21Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Clonagem e expressão Datransposase mos1 de Drosophila simulans e o desenho in silico de um vetor para expressão heteróloga de proteínas.pdf: 1982928 bytes, checksum: 704cbac648c3f7621a8bb8d5cf3116c7 (MD5) Previous issue date: 2016-03-10 / A importância da expressão de proteínas de forma heteróloga tem crescido surpreendentemente, tendo em vista a progressiva necessidade de sua produção para aplicações na indústria farmacêutica, para uso terapêutico, ou uso comerciais, e estudo de estrutura e função. No entanto, a expressão das proteínas pode ser limitada por diversos fatores, podendo apresentar diversas dificuldades como a formação de corpos de inclusão ou proteínas com conformação incorreta, por exemplo. Estudos em hospedeiro para expressão de proteínas heterólogas tem sido desenvolvido, a fim de otimizar fatores como temperatura e concentração de indutor, com o intuito de melhorar a qualidade das proteínas obtidas. Neste estudo, inicialmente objetivou-se otimizar a expressão da transposase do elemento mariner mos1, em diferentes cepas de Escherichia coli BL21(DE3), E. coli BL21 (DE3) pLysS, E. coli BL21-CodonPlus (DE3) -RP; E. coli BL21-CodonPlus (DE3) -RIL; E. coli BL21(DE3) pT-GROE, usando para subclonagem o vetor plasmidial de expressão pGEX-4T1. Analisando o melhor sistema de expressão para este elemento em particular, comparando as temperaturas de 30°C e 37°C para expressão e utilizando concentrações de 0,1mM; 0,5mM e 1,0mM de IPTG. Mesmo obtendo sucesso na expressão, com todas as condições de IPTG e em ambas as temperaturas testadas, o sistema de expressão não foi eficaz para obter proteínas de forma solúvel. Frente a este problema procuramos desenvolver um vetor de expressão de proteínas heterólogas que afim de tornar este processo mais rápido e mais eficiente, utilizando apenas um evento de clonagem e de transformação da bactéria de expressão. O vetor para expressão foi desenhado in silico a partir de um promotor Lac responsivo a IPTG, seguido por um sinal de exportação celular (peptídeo-sinal), um fragmento Strep-tagII para purificação e um sítio para trombina, permitindo a clivagem da proteína de interesse dos tags fusionados. Foram inseridos dois sítios para endonucleases de restrição (BamHI e XbaI) que permitem a clivagem do gene clonado no constructo. Desta forma demonstramos que todas as cepas foram eficazes na expressão da transposase mos1, sendo a temperatura mais adequada de 37°C em todas as concentrações de IPTG, já que não houve nenhuma diferença quanto a mudança deste fator. Apresentamos um novo vetor de expressão de proteínas heterólogas, com a finalidade de facilitar a obtenção de proteínas heterólogas purificadas, tais problemas encontrados durante a tentativa de expressão da transposase. / The importance of heterologous protein expression has surprisingly grown in view of the progressive need for its production for applications in the pharmaceutical industry, for therapeutic use, or commercial use, and study of structure and function. However, the expression of the proteins may be limited by several factors, and may present several difficulties such as the formation of inclusion bodies or proteins with incorrect conformation, for example. Host studies for expression of heterologous proteins have been developed in order to optimize factors such as temperature and concentration of inducer in order to improve the quality of proteins obtained. In this study, we initially aimed to optimize transposase expression of the mariner element mos1 in different strains of Escherichia coli BL21 (DE3), E. coli BL21 (DE3) pLysS, E. coli BL21CodonPlus (DE3) -RP; E. coli BL21-CodonPlus (DE3) -RIL; E. coli BL21 (DE3) pTGROE, using for subcloning the pGEX-4T1 expression plasmid vector. Analyzing the best expression system for this particular element, comparing the temperatures of 30°C and 37°C for expression and using concentrations of 0.1 mM; 0.5mM and 1.0mM IPTG. Even with expression success, with all IPTG conditions and at both temperatures tested, the expression system was not effective in obtaining proteins in a soluble form. In view of this problem we have tried to develop an expression vector of heterologous proteins in order to make this process faster and more efficient, using only one event of cloning and transformation of the expression bacterium. The vector for expression was drawn in silico from an IPTG responsive Lac promoter, followed by a cell export signal (peptide-signal), a Strep-tagII fragment for purification and a site for thrombin, allowing cleavage of the protein from Interest of merged tags. Two sites for restriction endonucleases (BamHI and XbaI) were inserted which allow the cleavage of the cloned gene in the construct. In this way, we demonstrated that all strains were effective in the expression of the transposase mos1, with the most suitable temperature being 37 ° C in all concentrations of IPTG, since there was no difference in the change of this factor. We present a new expression vector of heterologous proteins, in order to facilitate the obtaining of purified heterologous proteins, such problems encountered during the attempt to express the transposase.

Epigenética é o ramo da biologia que estuda as características herdáveis não associadas a alterações na seqüência de nucleotídeos do DNA. Um dos principais processos epigenético estudados é a metilação do DNA, a qual está associada a diversos mecanismos de regulação gênica, entre eles o imprinting (marcação) genômico. Esse tipo de regulação caracteriza-se pela expressão parental específica dos loci associados e à metilação diferencial em regiões regulatórias conhecidas como centros de imprinting (ICs). Alterações desse mecanismo estão relacionadas com síndromes de hipo e hipercrescimento em humanos e animais domésticos, desenvolvimento de tumores, doenças associadas com alterações de comportamento e já foram detectadas em indivíduos concebidos por técnicas de reprodução assistida e em células-tronco embrionárias derivadas de diferentes espécies. Essas duas últimas evidenciam que genes marcados são particularmente lábeis ao estresse induzido por manipulação celular in vitro. As possíveis causas dessas epimutações não estão completamente esclarecidas. Os bovinos parecem ser um melhor modelo comparativo no estudo dessas alterações, evitando a utilização de embriões humanos. No entanto, existem poucas seqüências descritas de genes marcados nessa espécie. No presente estudo, duas regiões diferencialmente metiladas (H19DMR e KvDMR1) foram caracterizadas em bovinos em termos de elementos conservados (EC), enriquecimento de elementos repetitivos (ERs) e padrões de metilação. A análise de ECs e ERs foi realizada utilizandose os programas VISTA e RepeatMasker, respectivamente. Os padrões de metilação para ambas as DMRs foram analisados utilizando-se o ensaio de COBRA (do inglês COmbined Bisulfite Restriction Analysis) em DNA de sangue periférico e espermatozóides em amostras de animais concebidos in vivo. Também foi pesquisada a possível ocorrência de perda de imprinting em uma amostra de quatro animais clonados. A análise dos resultados indicou que os padrões de imprinting observados nas DMRs bovinas estudadas são semelhantes aos descritos para regiões homólogas em outras espécies de mamíferos. As características genômicas mostraram uma maior similaridade nas regiões analisadas entre bovinos e humanos do que entre humanos e camundongos. Não foram encontradas diferenças entre o padrão de imprinting de animais gerados naturalmente ou por transferência nuclear. Os resultados desse trabalho poderão auxiliar em futuras pesquisas de genes marcados em bovinos, além de contribuir para o melhoramento na utilização dessa espécie como modelo de comparação para desenvolvimento humano. / Epigenetics is the branch of biology which studies heritable changes in genome function that occur without a change in nucleotide sequence within the DNA. One of the most studied epigenetic process is the DNA methylation, which is associated with several gene regulation mechanisms such as genomic imprinting. This type of regulation is characterized by parental specific gene expression and differential methylation of the associated loci in regulatory sequences named imprinting centers (ICs). Alterations of this mechanism has been related to hypo and hypergrowth syndromes in humans and domestic animals, tumor development, behavior disorders, and it has also been associated with epimutations in individuals conceived by assisted reproduction (AR) techniques and stem cells derived from different species. These last two evidences are indicatives of the imprinted genes lability to in vitro cell manipulation. The possible causes of these epimutations are not completely clear. Cattle seem to be a better comparative model in the study of this epigenetic alterations, and it can avoid the use of human embryos. However, there is few description of imprinted gene sequences this species. In the present work, two differently methylated regions (H19DMR and KvDMR1) were characterized in terms of conserved elements (CEs), enrichment of repetitive elements (RE) and methylation patterns. The CEs and REs analysis was carried out using the VISTA and RepeatMasker softwares, respectively. The methylation patterns for both DMRs were analyzed by COBRA (COmbined Bisulfite Restriction Analysis) assay in DNA from peripherical blood and sperm samples of in vivo conceived animals. It also was investigated the loss of imprinting in samples of four cloned animals. The results indicated that the imprinting patterns of the studied bovine DMRs are similar to the other homologue regions in mammals. The genomic features demonstrated a bigger similarity of the analyzed regions between cattle and humans than between humans and mice. Differences between the imprinting patterns of in vivo conceived versus cloned animals were not found. The results of this work can help future studies of imprinted genes in cattle, and, in addition, can contribute for the improvements of this animal model as a comparative to the human development.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-05-02T18:36:32Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 465320 bytes, checksum: aef535b7b9e18085d72080d249710846 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-02T18:36:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 465320 bytes, checksum: aef535b7b9e18085d72080d249710846 (MD5) Previous issue date: 2005-02-21 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A família Geminiviridae é caracterizada pelo aspecto geminado da partícula viral e genoma composto por DNA circular de fita simples, com aproximadamente 2.600 nucleotídeos. É dividida em quatro gêneros, de acordo com o tipo de inseto vetor, gama de hospedeiros, organização do genoma e relacionamento filogenético. Os begomovírus possuem dois componentes genômicos, são transmitidos por mosca-branca e infectam espécies dicotiledôneas. No Brasil há diversos relatos de begomovírus causando sérias perdas nas culturas do feijoeiro e tomateiro. Embora a importância econômica dos begomovírus em soja seja secundária, a ocorrência desses patógenos nesta cultura é preocupante. Duas possíveis novas espécies de begomovírus, denominadas “vírus A” e “vírus B” foram isoladas e clonadas a partir de plantas de soja. Obteve-se a seqüência completa de nucleotídeos do DNA-B do “vírus A”, e uma seqüência parcial do DNA-A do “vírus B”. A comparação de seqüências e análise filogenética indica que o DNA-B do “vírus A” possui a máxima correspondência nucleotídica com o isolado B3 do Sida micrantha mosaic virus (SimMV), e o DNA-A do “vírus B” com o isolado A2 do SimMV. Entretanto os níveis de identidade são baixos, indicando que ambos os vírus realmente devem constituir novas espécies de begomovírus. Vírus de plantas, incluindo os begomovírus, têm sido utilizados com sucesso na construção de vetores para a indução de silenciamento gênico. Entretanto, existem poucos vetores eficientes para a inoculação em plantas de tomate e não há relatos para plantas de soja. Os dois componentes genômicos do Tomato rugose mosaic virus (ToRMV) encontram-se completamente seqüenciados e, o DNA-A foi utilizado para a construção do vetor viral pToR- A1.4 CP. A estratégia utilizada foi a construção de um clone infeccioso sem o gene da proteína capsidial, substituído por um sítio múltiplo de clonagem para 9 enzimas de restrição derivado do vetor pKS+. Este vetor viral baseado no ToRMV será um complemento e uma alternativa em estudos de genômica funcional de tomateiro e de soja, na análise de genes envolvidos em vários processos biológicos. / The Geminiviridae is a family of plant viruses characterized by twinned icosahedral viral particles and a circular single-stranded DNA genome, with approximately 2.600 nucleotides. It is divided into four genera according to the type of insect vector, host range, genomic organization and phylogenetic relationships. Begomoviruses have two genomic components, are transmitted by whitefly and infect dicotyledoneous species. In Brazil, begomoviruses cause serious losses in tomato and bean crops. Although the economic importance of the begomoviruses in soybean is secondary, the presence of these pathogens in this crop is cause of concern. Two possible new begomovirus species, named “virus A” and “virus B”, were isolated and cloned from soybean plants. The complete nucleotide sequence of the DNA-B from “virus A” and a partial sequence of the DNA-A from “virus B” were obtained. Sequence comparisons and phylogenetic analysis indicated that the DNA-B from “virus A” has a maximum nucleotide identity with the isolate B3 from Sida micrantha mosaic virus (SimMV), and that the DNA-A from “virus B” with the isolate A2 from SimMV. However, identity levels are low, indicating that both viruses could actually comprise novel begomovirus species. Plant viruses, including begomoviruses, have been used with success for the construction of vectors for the induction of gene silencing. However, there are few effective vectors for inoculation into tomato plants and none for soybean plants. Both genomic components of Tomato rugose mosaic virus (ToRMV) have been completely sequenced and, the DNA-A was used for the construction of the viral vector pToR-A1.4 CP. The strategy used was the construction of an infectious clone without the capsid protein gene, replaced by a multiple cloning site for 9 restriction enzymes, derived from the pKS+ plasmid vector. This viral vector will be a complement and an alternative in functional genomics of tomato and soybean plants, in the analysis of genes involved in various biological processes. / Dissertação importada do Alexandria

Epigenética é o ramo da biologia que estuda as características herdáveis não associadas a alterações na seqüência de nucleotídeos do DNA. Um dos principais processos epigenético estudados é a metilação do DNA, a qual está associada a diversos mecanismos de regulação gênica, entre eles o imprinting (marcação) genômico. Esse tipo de regulação caracteriza-se pela expressão parental específica dos loci associados e à metilação diferencial em regiões regulatórias conhecidas como centros de imprinting (ICs). Alterações desse mecanismo estão relacionadas com síndromes de hipo e hipercrescimento em humanos e animais domésticos, desenvolvimento de tumores, doenças associadas com alterações de comportamento e já foram detectadas em indivíduos concebidos por técnicas de reprodução assistida e em células-tronco embrionárias derivadas de diferentes espécies. Essas duas últimas evidenciam que genes marcados são particularmente lábeis ao estresse induzido por manipulação celular in vitro. As possíveis causas dessas epimutações não estão completamente esclarecidas. Os bovinos parecem ser um melhor modelo comparativo no estudo dessas alterações, evitando a utilização de embriões humanos. No entanto, existem poucas seqüências descritas de genes marcados nessa espécie. No presente estudo, duas regiões diferencialmente metiladas (H19DMR e KvDMR1) foram caracterizadas em bovinos em termos de elementos conservados (EC), enriquecimento de elementos repetitivos (ERs) e padrões de metilação. A análise de ECs e ERs foi realizada utilizandose os programas VISTA e RepeatMasker, respectivamente. Os padrões de metilação para ambas as DMRs foram analisados utilizando-se o ensaio de COBRA (do inglês COmbined Bisulfite Restriction Analysis) em DNA de sangue periférico e espermatozóides em amostras de animais concebidos in vivo. Também foi pesquisada a possível ocorrência de perda de imprinting em uma amostra de quatro animais clonados. A análise dos resultados indicou que os padrões de imprinting observados nas DMRs bovinas estudadas são semelhantes aos descritos para regiões homólogas em outras espécies de mamíferos. As características genômicas mostraram uma maior similaridade nas regiões analisadas entre bovinos e humanos do que entre humanos e camundongos. Não foram encontradas diferenças entre o padrão de imprinting de animais gerados naturalmente ou por transferência nuclear. Os resultados desse trabalho poderão auxiliar em futuras pesquisas de genes marcados em bovinos, além de contribuir para o melhoramento na utilização dessa espécie como modelo de comparação para desenvolvimento humano. / Epigenetics is the branch of biology which studies heritable changes in genome function that occur without a change in nucleotide sequence within the DNA. One of the most studied epigenetic process is the DNA methylation, which is associated with several gene regulation mechanisms such as genomic imprinting. This type of regulation is characterized by parental specific gene expression and differential methylation of the associated loci in regulatory sequences named imprinting centers (ICs). Alterations of this mechanism has been related to hypo and hypergrowth syndromes in humans and domestic animals, tumor development, behavior disorders, and it has also been associated with epimutations in individuals conceived by assisted reproduction (AR) techniques and stem cells derived from different species. These last two evidences are indicatives of the imprinted genes lability to in vitro cell manipulation. The possible causes of these epimutations are not completely clear. Cattle seem to be a better comparative model in the study of this epigenetic alterations, and it can avoid the use of human embryos. However, there is few description of imprinted gene sequences this species. In the present work, two differently methylated regions (H19DMR and KvDMR1) were characterized in terms of conserved elements (CEs), enrichment of repetitive elements (RE) and methylation patterns. The CEs and REs analysis was carried out using the VISTA and RepeatMasker softwares, respectively. The methylation patterns for both DMRs were analyzed by COBRA (COmbined Bisulfite Restriction Analysis) assay in DNA from peripherical blood and sperm samples of in vivo conceived animals. It also was investigated the loss of imprinting in samples of four cloned animals. The results indicated that the imprinting patterns of the studied bovine DMRs are similar to the other homologue regions in mammals. The genomic features demonstrated a bigger similarity of the analyzed regions between cattle and humans than between humans and mice. Differences between the imprinting patterns of in vivo conceived versus cloned animals were not found. The results of this work can help future studies of imprinted genes in cattle, and, in addition, can contribute for the improvements of this animal model as a comparative to the human development.

Este trabalho descreve a clonagem do gene de resistência ao Metolachlor em um plasmídio epissomal bifuncional (YEp 351), o qual pode ser utilizado como marcador seletivo dominante na transformação de Saccharomyces cerevisiae. Clones tranformantes selecionados diretamente em meio YEPD acrescido de 720 mg/L de Metolachlor, tiveram seu DNA genômico extraído e utilizado para transformar Escherichia coli a fim de amplificar e recuperar os plasmídios recombinantes. Outras linhagens de Saccharomyces foram também transformadas e foi possível observar que existe diferença entre linhagens quanto às suas capacidades de receber, manter e expressar DNA heterólogo, pois houve variação considerável nas suas eficiências de transformação. Vários métodos foram aplicados para obtenção do "cariótipo eletroforético” (este termo refere-se ao genoma de um dado organismo expresso em bandas cromossômicas) de Saccharomyces cerevisiae, dentre eles, o tratamento com acetato de lítio ganhou mais destaque. Empregando-se a técnica de eletroforese em campo pulsado e hibridização, foi possível mapear o gene de resistência ao Metolachlor no cromossomo XV da levedura, confirmando-se os dados de análise genética. / This work describes the cloning of the metolachlor resistance gene into an episomal bifunction plasmid (YEp 351) which can used as a dominant selective marker for Saccharomyces cerevisiae transformation. DNA of the transformed clones, directly selected onto YEPD medium added of 720 mg/l metolachlor, was used to transform Escherichia coli in order to amplify and recover recombinant plasmids. Other Saccharomyces strains were also transformed and as far as differences in receiving, maintaining and expression of the heterologous DNA is concerned, considerable variation in transformation was found them. Electrophoretic caryotyping (refers to an organism genome expressed in chromosomal bands) was performed in Saccharomyces cerevisiae according to different methods, and among them lithium acetate was the standing one. Pulsed field and hybridization were performed to map the metolachlor resistance gene into the yeast chromosome XV and these data were confirmed by genetical analysis.