Dissertação (mestrado)-Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2009. / Submitted by Jadiana Paiva Dantas (jadi@bce.unb.br) on 2011-06-29T23:42:04Z No. of bitstreams: 1 2009_KellyCristinaRodriguesSimi.pdf: 4029652 bytes, checksum: b826daae737141b32d0d9e55a96db197 (MD5) / Approved for entry into archive by Elna Araújo(elna@bce.unb.br) on 2011-07-04T18:29:05Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_KellyCristinaRodriguesSimi.pdf: 4029652 bytes, checksum: b826daae737141b32d0d9e55a96db197 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-07-04T18:29:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_KellyCristinaRodriguesSimi.pdf: 4029652 bytes, checksum: b826daae737141b32d0d9e55a96db197 (MD5) / A Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS) é uma doença pandêmica que atinge diversos países no mundo todo. Atualmente, não existe uma vacina eficiente contra o vírus da imunodeficiência (HIV) devido a habilidade do vírus de escapar do sistema imune. Contudo, estudos recentes têm utilizado glicoproteínas do envelope do HIV como potencial alvo para o desenvolvimento de uma vacina capaz de inibir a entrada do vírus na célula hospedeira. Recentemente, nosso grupo selecionou fragmentos de anticorpos (Fabs) de uma biblioteca combinatória de anticorpos de pacientes com osteosarcoma direcionados para um peptídeo sintético de um epítopo neutralizante da gp41. No presente trabalho, foram clonados os Fabs anti-gp41-HIV em vetor de expressão de Pichia pastoris. Após a obtenção das clonagens dos Fabs nesse vetor as respectivas sequências foram confirmadas. A levedura Pichia pastoris tem sido largamente utilizada para a produção de proteínas recombinantes com sucesso. O nível de expressão obtido para os Fabs na levedura Pichia pastoris foi muito baixo. Esses Fabs demonstraram possuir um bom índice de adaptação de códon para a expressão em Pichia pastoris. Dessa forma, ajustes no protocolo de expressão deverão ser realizados. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The Acquired Immunodeficiency Syndrome (AIDS) is a pandemic deficiency through out the continent. At the moment there is not an efficient vaccine against immunodeficiency virus (HIV) due the virus efficient escape of from the immune system. However, recent studies have used glycoprotein of HIV as a potential target to development a vaccine to inhibit the virus entry into host cells. Recently, our group selected antibody fragments (Fabs) from an antibody combinatorial library of osteosarcoma patients directed to a synthetic biotinilated peptide gp41 neutralizing epitope (576 to 619 amino acids residues). In this work, the Fabs anti-gp41-HIV into a Pichia pastoris were cloned into expression vector. Three Fabs were cloned into this vector with correct sequence. Pichia pastoris has been used extensively and successfully to express recombinant proteins. Unfortunately, the recombinant proteins were expressed in low levels. However, this Fabs showed to have a good codon adaptation index to be expressed in Pichia pastoris, thus adjustment in the protocol must be performed.

O aumento da incidência de cepas de Mycobacterium tuberculosis resistente a múltiplas drogas tornou urgente a necessidade de novos agentes terapêuticos para o tratamento da tuberculose. A via do ácido chiquímico é essencial para a sobrevivência deste organismo, o que torna suas enzimas interessantes alvos para o desenvolvimento de novos medicamentos. A enzima corismato sintase (MtCS) foi identificada no genoma de M. tuberculosis por homologia de seqüência. Esta enzima catalisa a síntese NADH- e FMN-dependente de ácido corísmico, precursor de aminoácidos aromáticos, naftoquinonas, menaquinonas e micobactinas. Este trabalho descreve a clonagem, super-expressão e purificação até a homogeneidade da MtCS recombinante. As medidas das atividades das reações de corismato sintase e de NADH:FMN oxidoredutase comprovaram a bifuncionalidade da MtCS. A atividade de flavina redutase foi caracterizada, mostrando a existência de um complexo estável entre FMNOX e MtCS. Efeitos isotópicos primários de deutério e de solvente foram realizados, e sugerem etapas distintas para a transferência do próton e para a transferência do hidreto, com o último contribuindo mais fortemente para a etapa limitante da reação. Os resultados descritos aqui auxiliarão no desenho racional de novos agentes contra tuberculose. / The emergence of multi-drug resistance Mycobacterium tuberculosis has created an urgent need for new agents to treat tuberculosis. The enzymes of shikimate pathway are attractive targets to the development of these agents, since experimental evidence that this pathway is essential for M. tuberculosis has been reported. Chorismate synthase (MtCS) has been identified by sequence homology in the genome of M. tuberculosis. This enzyme catalyzes the NADH- and FMN-dependent synthesis of chorismate, a precursor of aromatic amino acids, naphthoquinones, menaquinones, and mycobactins. In the present work, we describe MtCS cloning, overexpression and purification of recombinant protein to homogeneity. The bifunctionality of MtCS was determined by measurements both chorismate synthase and NADH:FMN oxidoreductase activities. The flavin reductase activity was characterized, showing the existence of a stable complex between FMNox and MtCS. Primary deuterium and solvent kinetic isotope effects are described and suggest distinct steps for hydride and proton transfers, with the former being more rate-limiting. These results should pave the way for the rational design of antitubercular agents.

A técnica de transferência nuclear é uma ferramenta que possibilita a produção de embriões clones que podem ser utilizados tanto na clonagem reprodutiva, proporcionando o nascimento de produtos, como modelo para o estudo de diversos mecanismos fisiológicos durante o desenvolvimento embrionário. Este trabalho teve como objetivos a otimização da técnica de clonagem no Laboratório de Embriologia e Biotécnicas de Reprodução (FAVET, UFRGS), avaliar a taxa de sucesso da clonagem interespécie, e testar e eficiência da utilização de oócitos vitrificados como citoplasmas receptores para a reconstrução dos embriões clones, sendo realizado em três etapas. A primeira teve por objetivo o estabelecimento da técnica de clonagem, bem como sua otimização nas nossas condições, dando condições para que os experimentos subseqüentes pudessem ser realizados. Para isto foram realizados experimentos in vitro comparando diferentes meios de manipulação, sistemas de ativação química, meios de cultivo e fontes protéicas no cultivo dos embriões, e células oriundas de diferentes origens e animais como doadores de núcleo. Os resultados obtidos in vitro alcançaram taxas de 64,7% de clivagem e de 19,5% de blastocistos. Um grupo de embriões foi transferido para receptoras (n=24), e foram observadas 54,2% de prenhezes aos 35 dias, 8,3% de prenhezes aos 260 dias e 4,2% de nascimentos. Os resultados obtidos in vitro alcançaram taxas de 64,7% de clivagem e de 19,5% de blastocistos. Um grupo de embriões foi transferido para receptoras (n=24), e foram observadas 54,2% de prenhezes aos 35 dias, 8,3% de prenhezes aos 260 dias e 4,2% de nascimentos.A segunda parte dos experimentos teve por objetivo a produção de clones interespécies utilizando o citoplasma bovino como receptor para células ovinas, caprinas e suínas. As taxas de clivagem nos grupos NTSCi ovino (60,3%), caprino (68,4%) e suína (57,1%) não diferiram dos grupos controles NTSC bovino. A taxa de blastocisto observada nos embriões NTSCi ovinos (10,3%) foram semelhantes às taxas observadas no grupo NTSC bovino (12,7%). No grupo NTSCi caprino, 5,3% dos embriões chegaram ao estádio de blastocisto, enquanto que no grupo NTSCi suíno não houve desenvolvimento até o estádio de blastocisto. Na terceira parte do trabalho, experimentos visando a utilização de oócitos vitrificados imaturos com citoplasma receptor foram realizados. Foram submetidos a maturação 764 complexos cumuli-oócitos vitrificados, e 73,0% destes foram recuperados após o desnudamento e 46,8% apresentavam corpúsculo polar, taxas significativamente inferiores às observadas nos oócitos não vitrificados (91,4% e 65,8%, respectivamente). As taxas de sobrevivência após a micromanipulação (77,8%), taxa de fusão (82,1%) e de sobrevivência após a ativação (79,9%) do grupo vitrificado não apresentaram diferença significativa com o grupo controle não vitrificado. As taxas de blastocistos também não apresentaram diferença entre os grupos vitrificado e não vitrificado (16,7% e 23,4%) respectivamente. Em resumo, os resultados deste trabalho demonstraram que oócitos bovinos frescos ou vitrificados, nas nossas condições estabelecidas, foram capazes de suportar o desenvolvimento de embriões clones bovinos até o estádio de blastocisto ou a termo, e proporcionam citoplasmas compatíveis para o desenvolvimento de embriões clones interespécie até o estádio de blastócito. / Somatic cell nuclear transfer (NTCS) procedures is a valuable tool for the production of clone embryos for use in reproductive cloning, by providing the birth of live animals, and for use as a research model, allowing the study of physiologic mechanisms during the embryonic development. This work aimed to optimize cloning procedures at the Embryology and Reproductive Technology Laboratory (FAVET, UFRGS), to evaluate the success rate of interspecies cloning, and to test the effectiveness of vitrified oocytes as recipient cytoplasm for embryo reconstruction, being carried out in three stages. The first stage was focused on the establishment of the cloning technique and the optimization of procedures and conditions in the lab so that the subsequent experiments could be accomplished. Thus, in vitro experiments were performed to compare different manipulation media, chemical activation systems, manipulating media, source of protein supplementation to the embryo culture media, and distinct cell types and genotypes. The mean cleavage and blastocyst rates obtained after conditions were optimized were 64.7% and 9.5%, respectively. Pregnancy rates on Days 35 and 260 of gestation and calving rate at term following the transfer of a group of embryos to synchronous recipient cows (n=24) were 54.2%, 8.3% and 4.2%, respectively. The second stage of the study evaluated the success rate of the production of interspecies clones (NTSCi) using the bovine oocyte as recipient cytoplasm for transferred nuclei from ovine, caprine or porcine cells. Cleavage rates using ovine (60.3%), caprine (68.4%) and porcine (57.1%) nuclei did not differ from controls (bovine nuclei). Blastocyst rates observed for NTSCi embryos using ovine nuclei (10.3%) were similar to those observed in the bovine NTSC group (12.7%). The NTSCi-caprine group reached a 5.3% blastocyst rate, whereas no development to the blastocyst stage was observed when using porcine cells as nucleus donor. In the third stage of this work, experiments evaluated the efficiency of vitrified bovine oocytes as recipient cytoplasms for cloning by TNCS. Following vitrification and warming, 764 cumulus-oocyte complexes were in vitro-matured. A total of 73.0% was recovered after cumulus removal, with 46.8% presenting visible polar bodies, which were significantly lower than rates observed in non-vitrified oocytes (91.4% and 65.8%, respectively). However, survival rates following micromanipulation (77.8%), fusion rates (82.1%) and survival after activation (79.9%) of oocytes were not different from the control group (non-vitrified oocytes). In addition, blastocyst rates did not differ between vitrified and non-vitrified groups (16.7% and 23.4%, respectively). In summary, results from this study demonstrated that fresh or vitrified bovine oocytes, under our optimized conditions, were able to support development of bovine clone embryos to the blastocyst stage or to term, and provided a compatible cytoplasm for the development of interspecies clone embryos to the blastocyst stage.

Mycoplasma hyopneumoniae (MH) é uma das menores bactérias encontradas na natureza, apresentando genoma altamente reduzido e ausência de parede celular. Este organismo é o agente causador da pneumonia enzoótica suína, a qual apresenta distribuição mundial causando importantes perdas econômicas. Recentemente, várias espécies de Mycoplasma tiveram seus genomas completamente seqüenciados, incluindo três cepas de MH. Apesar da grande quantidade de dados gerados, pouco se sabe sobre as seqüências nucleotídicas que controlam o início da transcrição nestes microrganismos. Assim como em outras espécies deste gênero, M. hyopneumoniae não possui vários mecanismos que regulam a expressão gênica, incluindo o sistema de dois componentes e diversos fatores σ. Portanto, aparentemente, os sinais que promovem e regulam a transcrição, nestes organismos, devem diferir significativamente de outras bactérias. Além disso, o baixo conteúdo de GC e a falta de promotores experimentalmente caracterizados, também são fatores que dificultam o reconhecimento de seqüências controladoras. Para possibilitar a identificação das seqüências promotoras de MH in vitro, através da utilização da RNA polimerase holoenzima reconstituída, este trabalho tem como objetivo purificar o fator σ através da expressão heteróloga do gene rpoD de M. hyopneumoniae cepa 7448. Como esta CDS possui três códons de parada UGA – os quais codificam triptofano nos micoplasmas –, foi utilizado uma técnica baseada em PCR para introduzir as mutações (TGA→TGG) necessárias. A metodologia de mutagênese sítio-dirigida, empregada neste trabalho, apresentou eficiência relativamente boa na substituição dos nucleotídeos alvo. O gene íntegro e mutado foi subclonado no vetor pET23a-d(+) e expresso em Escherichia coli. De acordo com o fato de que os fatores σ exibem menor mobilidade em SDS-PAGE, a proteína expressa apresentou uma massa molecular aparente de 64 kDa, diferente dos 58 kDa deduzidos a partir da seqüência nucleotídica. Ainda, nas condições utilizadas, maior quantidade da proteína foi produzida de forma insolúvel. Para obtenção de um fator σ recombinante funcional, diferentes protocolos de expressão, solubilização e purificação serão testados. / Mycoplasma hyopneumoniae (MH) is one of the smallest bacteria found in nature, presenting a small genome and no cell wall. It is present in the majority of swine herds throughout the world, and is considered an important pathogen in the swine industry. Recently, many species of this genus had their genome completely sequenced, including three strains of MH. Nevertheless, very little is understood of the nucleotide sequences that control transcription initiation in these microorganisms. Like its relatives, M. hyopneumoniae lacks several major regulators of gene expression, including two component regulatory systems and multiple σ factors, thus it appears that the signals for promotion and regulation of transcription may differ significantly from other bacteria. In addition, the low GC content and the dearth of experimentally characterized promoters in this genus severely limit the recognition of the controlling sequences. To enable in vitro identification of the MH promoter sequences, the aim of this study is to purify the σ factor through the heterologous expression of the rpoD gene from the M. hyopneumoniae strain 7448, that will allow reconstituting RNA polymerase holoenzyme. As this CDS has three UGA stop codons – which encode tryptophan in mycoplasma –, a PCR-based method to introduce the necessary mutations (TGA→TGG) was used. The site-direct mutagenesis methodology, employed in this work, showed a relative good efficiency to substitute the targets nucleotides. The full length mutated gene was subcloned into pET23a-d(+) vector and expressed in fusion with a C-terminal polihistidine tag. In agreement with the fact that σ factors show slower mobility on SDS-PAGE, the expressed protein exhibited an apparent molecular mass of 64 kDa in despite of the 58 kDa that was deduced from the nucleotide sequence. However, most of the protein was insoluble under the conditions used. Therefore, to obtain a functional recombinante σ factor, different protocols related to the expression, solubilization, and purification will be tested.

Made available in DSpace on 2014-06-12T17:16:59Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo2464_1.pdf: 901352 bytes, checksum: 02348441657144d23a24c49a05223c82 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2011 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O trabalho tem por objeto a análise da diferença no tratamento ético e jurídico da questão das células-tronco embrionárias quando obtidas, de um lado, dos embriões excedentes da técnica de reprodução humana assistida e, de outro lado, de embriões produzidos pelo processo de clonagem terapêutica. A problemática é analisada numa perspectiva dos direitos fundamentais, na interface da Bioética e do Biodireito com o Direito Constitucional. A nova Lei da Biossegurança regulamentou a questão, permitindo a utilização, para fins de pesquisa e terapia, de embriões resultantes da reprodução assistida e não utilizados no procedimento; todavia, vetou a possibilidade de obtenção de células-tronco pela clonagem terapêutica. Busca-se averiguar, assim, as semelhanças e diferenças dessas situações jurídicas, abordando a possibilidade de nova legislação vir a igualar tais procedimentos ora tratados de maneira distinta. A decisão do STF, em sede da ADI 3510, é também analisada, sob a ótica de que as considerações ali lançadas têm direta repercussão no tratamento da clonagem terapêutica. O exame da problemática perpassa a questão do tratamento do embrião in vitro, cuja destruição constitui traço comum entre os dois processos de obtenção de células-tronco embrionárias em confronto, levantando o debate acerca do início da proteção jurídica da vida. O trabalho propõe que também a clonagem terapêutica utilizada de forma ponderada e com finalidade estritamente terapêutica , assim como a utilização das sobras embrionárias, não representa uma violação ao direito à vida e à dignidade da pessoa humana

Made available in DSpace on 2014-06-12T17:20:49Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo5470_1.pdf: 348219 bytes, checksum: 18fc081a9013212a16de24888d1a1496 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2003 / Este trabalho estuda a clonagem de seres humanos e suas implicações éticas e jurídicas. Ao mesmo tempo, procura pontuar de que maneira a manipulação genética afeta a humanidade, suscitando um amplo debate acerca de juízos de valores e da reformulação de conceitos tradicionais. O grande desafio do século XXI será desenvolver uma bioética e um biodireito que resgatem a valorizem a dignidade da pessoa humana, ao considerá-la como paradigma biomédico humanista. O texto enfoca, ainda, as experiências biogenéticas em seres humanos e seus limites, tomando-se por base o aparato normativo referente ao tema. Considerando- se que o genoma humano é patrimônio de toda a humanidade, destaca-se a necessidade de criação de referenciais bioéticos universais que garantam a dignidade, a biossegurança e a vida humana. Discute-se a clonagem humana sob o prisma do ordenamento jurídico brasileiro vigente a à luz dos princípios fundamentais da bioética e do biodireito. Finalmente, analisa-se os aspectos da Constituição brasileira como compromisso maior nos dilemas bioéticos

Made available in DSpace on 2014-06-12T17:22:03Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo6009_1.pdf: 491047 bytes, checksum: 37b91f59a41436de79512fd89ee482ed (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2002 / Este trabalho estuda a clonagem de seres humanos e suas implicações éticas e jurídicas. Ao mesmo tempo, procura pontuar de que maneira a manipulação genética afeta a humanidade, suscitando um amplo debate acerca de juízos de valores e da reformulação de conceitos tradicionais. O grande desafio do século XXI será desenvolver uma bioética e um biodireito que resgatem a valorizem a dignidade da pessoa humana, ao considerá-la como paradigma biomédico humanista. O texto enfoca, ainda, as experiências biogenéticas em seres humanos e seus limites, tomando-se por base o aparato normativo referente ao tema. Considerando-se que o genoma humano é patrimônio de toda a humanidade, destaca-se a necessidade de criação de referenciais bioéticos universais que garantam a dignidade, a biossegurança e a vida humana. Discutese a clonagem humana sob o prisma do ordenamento jurídico brasileiro vigente a à luz dos princípios fundamentais da bioética e do biodireito. Finalmente, analisase os aspectos da Constituição brasileira como compromisso maior nos dilemas bioéticos

Orientadores: Reginaldo Bruno Gonçalves, Daniel Saito / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-16T03:29:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cruz_SergioEduardoBragada_D.pdf: 4484196 bytes, checksum: 41cbfe2b81d194ae03d4070bbe8108b8 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Há um consenso que outros micro-organismos além de Aggregatibacter actinomycetemcomitans (Aa), Porphyromonas gingivalis (Pg), Tannerella forsythia (Tf) e Treponema denticola (Td) estariam correlacionados às periodontites, inclusive algumas espécies ainda não identificadas. Nosso objetivo foi estudar as microbiotas subgengivais de indivíduos com periodontite crônica generalizada (PCG) e periodontite agressiva generalizada (PAG) para avaliar diferenças entre suas microbiotas. MATERIAL E MÉTODOS-Foram selecionados 15 indivíduos com PCG e 14 com PAG. Coletou-se amostra do biofilme subgengival de uma bolsa periodontal profunda (BP-PS ? 7mm) e uma moderada (BM - PS entre 5 e 6 mm) de cada indivíduo. Foi preparado e analisado, por meio de DGGE, o perfil bacteriano entre os grupos. A similaridade e a análise de cluster do padrão de UTO's foram verificadas utilizando-se coeficiente de Jaccard e a construção do dendrograma realizada por UPGMA. Realizou-se também análise clonal direta de 10 amostras de BP de cada grupo e as sequências foram agrupadas em táxons com similaridade >97%. RESULTADOS-DGGE - No perfil de DGGE foi observada uma tendência para a formação de grupos em BP, mas não em BM, com a presença de dois grupos maiores e distintos de oito indivíduos tanto para PCG como PAG, com variação de similaridade intra-grupo entre 53,6-68,4% e 50,2-64,7%, respectivamente. Análise clonal - Foram identificados 109 táxons conhecidos a partir de 987 clones. Ao todo 44 gêneros bacterianos, 28 gêneros comuns aos dois grupos, nove que se apresentaram apenas para PCG e sete para PAG. Entre os dois grupos foram observados 34 táxons comuns, sendo 42 específicos para PAG e 37 para PCG. A espécie Tf foi detectada em 90% dos indivíduos com PCG e 80% com PAG, Pg foi detectada em 70% com PCG e 50% com PAG e Td foi detectada em 40% com PCG e 30% PAG. A espécie Aa foi encontrada em somente 20% de PCG e 30% de PAG. A espécie Filifactor alocis foi observada em altas taxas e prevalência em PCG (58 clones, 90%) e PAG (91 clones, 90%). As espécies encontradas exclusivamente por grupo com prevalência acima de dois pacientes foram: PCG: Treponema lecithinolyticum, Selenomonas dianae, Prevotella pleuritidis, Dialister pneumosintes; e para PAG: Fusobacterium nucleatum ss vincentii, Veillonella parvula, Peptococcus sp. Cepa GEA8, Streptococcus gordonii, Lautropia mirabilis, Gemella sanguinis, Afipia broomeae. Para os filotipos, PCG: Peptostreptococcaceae sp. Clone-MCE10_174, Fusobacterium sp. C-I035, Veillonellaceae sp. C-JS031; PAG: Peptostreptococcaceae sp. C-PUS9170, Treponema sp. CG093. Apesar de não haver exclusividade entre grupos, é de nota os filotipos Synergistes sp. clone W028 (80% e 60%) e o clone D084 (70% e 10%) em PCG e PAG, respectivamente. O filotipo Bacteroidetes sp. AU126 foi encontrado tanto em PCG (60%) como PAG (30%). CONCLUSÃO - O presente trabalho demonstrou por meio de DGGE uma tendência a um perfil microbiano comum entre a maioria das amostras estudadas, entretanto, sem seu completo delineamento como dois grupos distintos microbiologicamente. A análise clonal, apesar de algumas espécies específicas entre grupos, demonstrou pequenas diferenças, sem, entretanto, delinear grupos microbiologicamente específicos. / Abstract: There is an agreement that not only the already known periodontopathogens, Aggregatibacter actinomycetemcomitans (Aa), Porphyromonas gingivalis (Pg), Tannerella forsythia (Tf) and Treponema denticola (Td) would be involved in periodontitis, but also some others micro-organisms not-yet-identified. The scope of this study is to compare the subgingival microbiota in generalized chronic periodontitis (GCP) or generalized aggressive periodontitis (GAP) subjects. MATERIAL AND METHODS - 15 subjects with GCP and 14 with GAP were enrolled. One subgingival biofilm sample from a periodontal deep pocket (DP) with PD ? 7mm and one from a moderate pocket (MP) with PD from 5 to 6 mm were harvested from each subject. The microbial profiles (OTU's) were compared between groups by DGGE and the similarity OTU profile was analyzed by Jaccard coefficient and the dendrogram and cluster analyses were made by UPGMA. The direct clonal analysis of the 16SrDNA from 10 samples of each group from DP was made. The sequences were grouped in clusters of taxa with > 97% similarity. RESULTS - DGGE - It was observed in the profile a tendency for eight subjects from each group to assemble as clusters in the DP, but not for the MP samples, with similarities between 53.6-68.4% (GCP) and 50.2-64.7% (GAP). Clonal analyses - One-hundred-and-nine already recognized taxa were obtained from 987 clones. From a total of 44 bacterial genera, 28 were common for both groups; nine were exclusive to PCG and seven to PAG subjects. It was found 34 common taxa between GCP and GAP, 37 were specific for GCP and 42 for GAP. The Tf species was found in 90% from GCP subjects and 80% from GAP subjects, Pg was found in 70% from GCP and in 50% from GAP and Td was detected in 40% from GCP and 30% from GAP. The Aa species were found in only 20% GCP subjects and in 30% from GAP. Filifactor alocis species were detected in high prevalence in both GCP (58 clones, 90%) and PAG (91 clones, 90%). The species which were detected exclusively in each group, with 20% prevalence or more were, for GCP: Treponema lecithinolyticum, Selenomonas dianae, Prevotella pleuritidis, Dialister pneumosintes; and GAP: Fusobacterium nucleatum ss vincentii, Veillonella parvula, Peptococcus sp. Cepa GEA8, Streptococcus gordonii, Lautropia mirabilis, Gemella sanguinis, Afipia broomeae. In relation to phylotypes, PCG: Peptostreptococcaceae sp. Clone-MCE10_174, Fusobacterium sp. C-I035, Veillonellaceae sp. C-JS031; PAG: Peptostreptococcaceae sp. C-PUS9170, Treponema sp. C-G093. Despite not been found exclusively for neither GCP nor GAP, the phylotypes Synergistes sp. clone W028 (80% e 60%) and clone D084 (70% e 10%) had a notable presence in GCP and GAP, respectively. The phylotype Bacteroidetes sp. AU126 was found in GCP (60%) and GAP (30%) groups. CONCLUSION - The present study demonstrated by DGGE a slight tendency to the clustering of the microbial profile of some GCP and GAP subjects, although these were not well delineated. The clonal analyses showed some differences, but also could not show GCP and GAP as microbiologic distinct profiles. / Doutorado / Microbiologia e Imunologia / Doutor em Biologia Buco-Dental

Com o objetivo de compreender os mecanismos que regulam a formação da simbiose entre fungos micorrízicos arbusculares e raízes de plantas, procurou-se identificar e clonar genes com expressão diferencial na interação através da técnica do"display"diferencial de cDNAs. Raízes de fumo (Nicotiana tabacum) não colonizadas e colonizadas pelo fungo Glomus intraradices foram coletadas, após um período experimental de oito semanas, para a extração de RNA. Em seguida, iniciadores com base na seqüência poliadenílica do RNA mensageiro de eucariotos (oligo-dTs) foram utilizados para a síntese de cDNA. Iniciadores aleatórios ou combinações de iniciadores aleatórios e oligo-dTs foram utilizadas para amplificar, por PCR, a primeira fita de cDNA. Três produtos de amplificação presentes somente em amostras de raízes colonizadas foram identificados e clonados. Os clones foram seqüenciados e suas seqüências comparadas às seqüências de genes conhecidos. O clone NtGil apresentou 55 a 70% e 33 a 66% de identidade em nível de nucleotídeos e aminoácidos, respectivamente, com genes que codificam proteínas acessórias da urease (UreG), de várias bactérias e Arabidopsis. O clone NtGi2 também apresentou alta homologia (55 a 66% em nível de nucleotídeos e 41 a 65% em nível de aminoácidos) com proteínas UreG de várias bactérias. Esse clone é praticamente idêntico à NtGil, diferindo apenas por uma inserção de 74 nucleotídeos, entre as posições 534 e 607. A seqüência de nucleotídeos do clone NtGi3 é idêntica à sequência de NtGil, exceto pelo fato do clone NtGil abranger uma porção maior da região 3’ do gene. A análise da seqüência de aminoácidos deduzida revelou a presença de sítios putativos de N-glicosilação (NYSR e NKTD), de ligação ATP/GTP (GPVGSGKT,"P-loop") e de fosforilação por quinase-tirosina (RELADYIIY). Os sítios de glicosilação e de ligação ATP/GTP são conservados entre as proteínas UreG armazenadas nos bancos de dados. No entanto, o sítio de fosforilação é específico para os cDNAs isolados. Com base nos resultados obtidos, é possível que as proteínas UreG estejam envolvidas no metabolismo do nitrogênio durante a simbiose ou ainda com a infectividade do fungo. / not available

O híbrido de Saccharomyces cerevisiae M606 é uma levedura de aplicação industrial que alia alta capacidade de produção de etanol a resistência ao antibiótico poliênico nistatina. Com o objetivo de isolar o gene que confere a esse organismo a capacidade de se multiplicar na presença dessa substância, tóxica a leveduras e à maioria dos fungos, foi construída uma biblioteca genômica com o DNA de uma linhagem segregante de M606, M606.1c. Um plasmídio epissomal de levedura contendo um fragmento genômico da biblioteca de 5900 pares de bases foi capaz de conferir resistência a linhagens sensíveis quando introduzido por transformação. A determinação da sequência de nucleotídeos desse fragmento de DNA, designado NYS1, permitiu a sua localização no braço longo do cromossomo XIV de Saccharomyces cerevisiae. A subclonagem do fragmento NYS1 revelou que o gene responsável pela resistência é o quadro de leitura aberta (ORF) conhecido como YNL231C, que passa a ser denominado NYS, gene de resistência a nistatina de Saccharomyces cerevisiae. O gene NYS foi subclonado em um fragmento de 1337 pares de bases, que foi nomeado NYS3. Esse plamídio foi utilizado para transformar linhagens sensíveis, conferindo-lhes resistência. Sua sequência de nucleotídeos foi integralmente determinada e comparada com o Banco de Dados de Genoma de Saccharomyces cerevisiae para a identificação das diferenças ao nível do DNA entre os mutantes NYS e o tipo selvagem sensível a nistatina. Não foram identificadas diferenças de sequência entre o tipo selvagem e o gene clonado. Esse dado sugere que o gene clonado não é o mesmo que é responsável pela resistência de M606.1c. M606.1c apresentou o derivado de ergosterol cholesta-5,7,22,24-tetraenol, que parece estar ligado à resistência. As leveduras transformadas com o gene NYS não apresentaram a formação desse composto, sendo este mais um dado que sugere a clonagem de um segundo gene de resistência. A provável explicação para a resistência conferida por um gene selvagem seria o alto número de cópias em que ele se apresenta nos transformantes. O desequilíbrio na dosagem do produto gênico de NYS, possivelmente teria tido como efeito alguma alteração na membrana plasmática que levou à resistência a nistatina / not available