BEZERRA, Emanuel Alves. Respostas bioquímicas comparativas de genótipos suscetíveis e resistentes de feijão-de-corda [Vigna unguiculata (l.) Walp.] desafiados com o vírus do mosaico severo do caupi (CPSMV). 2016. 91 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2016. / Submitted by Aline Mendes (alinemendes.ufc@gmail.com) on 2016-08-22T21:04:59Z No. of bitstreams: 1 2016_dis_eabezerra.pdf: 2394876 bytes, checksum: 297dbffff92104435a54d9ac67bc99b5 (MD5) / Approved for entry into archive by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2016-08-23T18:27:22Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_dis_eabezerra.pdf: 2394876 bytes, checksum: 297dbffff92104435a54d9ac67bc99b5 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-23T18:27:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_dis_eabezerra.pdf: 2394876 bytes, checksum: 297dbffff92104435a54d9ac67bc99b5 (MD5) Previous issue date: 2016 / Cowpea [Vigna unguiculata (L.) WalP.] has great socioeconomic importance in the North and Northeast Brazil, other countries of South and Latin America, Africa, and Asia. Although its rusticity and high natural resistance to most diseases, cowpea severe mosaic virus (CPSMV), which belongs to the family Comoviridae, has great importance because its severity and extensive damage and loss it causes in cowpea. Although there are resistant genotypes to CPSMV, it is not well understood the mechanisms involved in defense. This comparative study was conducted with two resistant and two susceptible cowpea genotypes to shed light on the mechanisms of susceptibility and resistance to CPSMV. Thus, differences in the enzyme activities related to the oxidative stress involving superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), peroxidase ascorbate (APX), in addition to enzymes of the phenol metabolism as phenylalanine ammonia-lyase (PAL), guaiacol peroxidase (POX), and polyphenol oxidase (PPO) were analyzed. Quantitative differences in phenolic compounds, superoxide ion (O2-) and hydrogen peroxide (H2O2) were also evaluated. After inoculation with CPSMV, or only with the abrasive carborundum (controls), the secondary leaves of each genotype were collected at 0, 6, 24, 48, and 72 hours after inoculation (HAI) and the biochemical analyzes performed. In addition, the transcript levels of SOD, CAT, and APX were evaluated at 6 HAI, by quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR). In CPSMV infected resistant cowpea plants compared to the respective controls higher POX, PPO, PAL, SOD, but low CAT and APX activities were observed. Moreover, O2-, H2O2 and phenolic compounds showed higher contents than those of the respective controls at some time points after inoculation of the resistant cowpea genotypes with CPSMV. Opposite responses regarding to these above biochemical parameters were observed for the susceptible genotypes. Expression of the CAT transcript was in agreement with the CAT activity at 6 HAI. However, for only some cowpea genotypes the APX transcript synthesis at 6 HAI was in agreement with the enzyme activity. Nevertheless, the results suggest participation of SOD, CAT, APX, PAL, POX, PPO, associated with phenolic compound, O2-, and H2O2 levels in the mechanisms of resistance/susceptibility of the cowpea to CPSMV infection. / O feijão-de-corda [Vigna unguiculata (L.) Walp.] tem grande importância socioeconômica no Norte e Nordeste brasileiro e em vários outros países da America do Sul e Latina, África e Ásia. Apesar de sua rusticidade e elevada resistência natural a muitas doenças, o Vírus do Mosaico Severo do Caupi (CPSMV), pertencente à família Comoviridae, apresenta grande destaque por ser a virose que mais acomete essa cultura no país. Embora existam genótipos resistentes ao vírus, não se sabe quais os mecanismos de defesa envolvidos. Nesse projeto, um estudo comparativo entre genótipos de feijão-de-corda, resistentes e suscetíveis ao CPSMV, foi conduzido, tendo como abordagem experimental a avaliação de atividades de enzimas relacionadas aos mecanismos de defesa de plantas, com a finalidade de fornecer informações bioquímicas que ajudem a explicar por que há genótipos de feijão-de-corda resistentes e suscetíveis ao CPSMV. Assim, diferenças nas atividades de enzimas relacionadas ao estresse oxidativo, como dismutase do superóxido (SOD), catalase (CAT), peroxidase do ascorbato (APX), e as enzimas fenilalanina amônia liase (PAL), peroxidase de fenóis (POX) e polifenol oxidase (PPO), envolvidas com o metabolismo de fenóis, foram analisadas. Diferenças quantitativas de compostos fenólicos, íon superóxido (O2-) e peróxido de hidrogênio (H2O2) foram, também, avaliados. Após as folhas secundárias terem sido inoculadas com o CPSMV, ou apenas injuriadas com o abrasivo carborundum (controles), elas foram coletadas nos tempos 0, 6, 24, 48 e 72 horas após a inoculação (HAI) e as análises bioquímicas realizadas nos extratos proteicos obtidos. Além disso, a síntese de transcritos relativos à SOD, CAT e APX foi avaliada 6 HAI por meio da reação quantitativa em cadeia da polimerase (RT-qPCR), comparando-as com as atividades registradas dessas enzimas. Nas plantas infectadas com o CPSMV em relação as não infectadas (controles), os genótipos resistentes demonstraram maiores atividades da POX, PPO, PAL, SOD e baixas atividades da CAT e APX. O conteúdo de O2-, H2O2 e compostos fenólicos apresentaram-se elevados em alguns tempos durante a infecção nos genótipos resistentes, sendo observado o contrário nas atividades enzimáticas e conteúdo de O2-, H2O2 e compostos fenólicos dos genótipos suscetíveis. A expressão dos transcritos da CAT acompanhou a atividade da catalase. No entanto, apenas em alguns genótipos os transcritos da SOD e APX acompanharam a atividade de suas enzimas. Os resultados sugerem a participação da SOD, CAT, APX, PAL, POX, PPO, associados com os teores de superóxido, peróxido de hidrogênio e compostos fenólicos nos mecanismos de resistência/susceptibilidade do feijão-de-corda à infecção pelo CPSMV.

VALENTE, Anna Lídia Nunes. Parâmetros bioquímicos, fisiológicos e proteômica do feijão-de-corda [Vigna Unguiculata (l) walp.] Infectado pelo vírus do mosaico severo do caupi (cpsmv) e a influência do estresse salino nesta interação incompatível. 2016. 408 f. Tese (Doutorado em Bioquímica)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2016. / Submitted by Anderson Silva Pereira (anderson.pereiraaa@gmail.com) on 2017-01-03T23:44:38Z No. of bitstreams: 1 2016_tese_alnvarela.pdf: 8717281 bytes, checksum: bc8a1100792cb952716f329e1468da38 (MD5) / Approved for entry into archive by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2017-01-04T22:34:59Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_tese_alnvarela.pdf: 8717281 bytes, checksum: bc8a1100792cb952716f329e1468da38 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-04T22:34:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_tese_alnvarela.pdf: 8717281 bytes, checksum: bc8a1100792cb952716f329e1468da38 (MD5) Previous issue date: 2016 / Cowpea (Vigna unguiculata) is a great commercialy importance food, however its productivety is strongly decreased by environmental stresses, biotic or abiotic. In semiarid regions, salinity and viruses, such as severe mosaic of cowpea (CPSMV), are the most important stresses that limit cowpea yield. Under field conditions, these stresses may occur individually or simultaneously increasing the negative effects on plants growth and development. Therefore, this study was conducted in order to improve the understanding of the mechanisms involved in the incompatible interaction of cowpea (BRS-Marataoã genotype) with CPSMV, salt stress and the combination of stresses. Under these conditions, were evaluated gas exchange measurements (PN, gS, C and E), chlorophyll content (Chla, chlb, total chl and carotenoids), enzyme kinetics of antioxidant protein (superoxide dismutase, catalase and ascorbate peroxidase), PR-proteins (peroxidase-glucanase and chitinase), the hydrogen peroxide dosage and quantification of TBARS. In addition, the differentially accumulated proteins from cowpea leaves subjected to combined stress were quantified and identified by nano LC-MS / MS and available databases. The analyzes were performed at 2 and 6 days after the stresses imposition. Visually, the resistant cultivar BRS-Marataoã did not have symptoms of disease caused by CPSMV, as expected, additionaly, plants did not show accumulation of virus particles in the infected leaves. Besides that, the infected plants (V) showed high levels of photosynthesis and chlorophyll compared to control plants (I). Furthermore, it was observed reductions in CAT and APX and increases in SOD and PAL activities, leading to increase of H2O2 and phenolic compounds in infected plants compared to controls. Interestingly, the βGLU activity decreased only in plants inoculated with V, which may have been associated with increase of callose, which prevents the virus spreading in the plant. All these results shown support evidences that this cultivar is resistant to CPSMV. When the combination of salt stress and viruses are applied simultaneously [SV], a remarkable decrease was observed in photosynthetic parameters and chlorophyll content. These results are even lower when the salt stress is induced and, 24 hours later, inoculated CPSMV is [S(24h)V]. The CPSMV resistant cultivar became sensible to this virus after 24 h in presence of salt stress. In this group of plants, we noted the presence of RNA of viral particles, and a large accumulation of peroxide and membrane damage, showing that the salt stress, when applied 24 hours before the viral stress, weakens the plant and favors the pathogen attack. However, these plants did not show apparent symptoms of CPSMV. This may be related to the increased activity of antioxidant enzymes and PR-proteins such as CAT, SOD, thioredoxin, peroxiredoxins CHI and POX when compared to the controls. It is known that those enzymes trigger defense mechanisms and prevent the establishment of diseases in plants. Differentially expressed proteins related to photosynthesis, carbohydrate energy and metabolism, defense and stress, structure and signaling, nucleotide ligands, related to redox homeostasis, among others, were identified with nano LC-MS/MS. These results are important for the understanding of the cellular mechanisms that act in string bean, genotype BRS-Marataoã, when subjected to viral infection, to saline stress, and to both stresses in a combined manner. / O feijão-de-corda (Vigna unguiculata) é um alimento de grande importância comercial, infelizmente, está sujeito a vários estresses ambientais, acarretando perdas consideráveis em sua produtividade. A salinidade representa um dos fatores abióticos mais importantes, além disso os vírus, como o mosaico severo do caupi (CPSMV), destacam-se, pois, representam o principal grupo de patógenos que acometem essa cultura. Em condições de campo, os estresses mencionados acima podem ocorrer tanto individualmente quanto simultaneamente, promovendo impacto negativo no crescimento e desenvolvimento das plantas. Portanto, esse trabalho foi realizado a fim de melhorar a nossa compreensão sobre os mecanismos complexos envolvidos na interação incompatível do feijão-de-corda (genótipo BRS-Marataoã) com o CPSMV, sua resposta frente ao estresse salino e a combinação desses dois estresses. Sob essas condições, medidas de trocas gasosas (PN, gS, Ci e E), conteúdo de clorofilas (Chla, chlb, chl totais e carotenoides), cinética enzimática de proteínas antioxidantes (superóxido dismutase, catalase e ascorbato peroxidase) e PR-proteínas (peroxidase, glucanase e quitinase), bem como a dosagem de peróxido de hidrogênio, TBARS e a quantificação do CPSMV em folhas de feijão-de-corda foram realizadas. Além disso, proteínas diferencialmente acumuladas em folhas de feijão-de-corda submetidas a esses estresses foram quantificadas e identificadas por nano LC-MS/MS e bancos de dados disponíveis. Todas as análises foram realizadas com 2 e 6 dias após os estresses. Visualmente, por ser um cultivar resistente, BRS-Marataoã não apresenta sintomas da doença causada pelo CPSMV, como esperado, também não apresentou acúmulo de partículas virais nas folhas que foram infectadas pelo vírus, via RT-PCR. Além disso, plantas infectadas (V) mantiveram elevados níveis de fotossíntese e clorofilas em relação as plantas controles (MI), observou-se também uma redução em atividades CAT e APX e aumento nas atividades de SOD e PAL, o que levou ao aumento do H2O2 e acúmulo de compostos fenólicos, favorecendo a resposta antioxidante da planta. Curiosamente, a atividade βGLU diminuiu em plantas apenas inoculadas com o V, o que pode estar relacionado com o aumento de calose impedindo que o vírus se espalhe pela planta. Todos esses resultados nos mostram indícios de alguns fatores envolvidos na resistência desse cultivar ao CPSMV. Quando os estresses, sal e vírus, são aplicados simultaneamente [SV] notamos acentuada diminuição em parâmetros fotossintéticos e conteúdo de clorofilas. Esses resultados são ainda menores quando o estresse salino é induzido e, 24 horas após, o CPSMV é inoculado [S(24h)V]. Nesse grupo de plantas, por RT-PCR, notamos a presença do RNA das partículas virais, além de um grande acúmulo de peróxido e danos de membrana, mostrando que o estresse salino, quando aplicado 24 horas antes do estresse viral, debilita a planta favorecendo o ataque do patógeno. Contudo, essas plantas não apresentaram sintomas característicos do CPSMV. Isso pode estar relacionado com o aumento da atividade de enzimas antioxidantes como CAT, SOD, tiorredoxinas, peroxirredoxinas. Além de PR-proteínas como CHI e POX, que acionam os mecanismos de defesa e impedem o estabelecimento da doença nessas plantas. Foram identificadas, com nano LC-MS/MS, proteínas diferencialmente expressas relacionadas com fotossíntese, energia e metabolismo de carboidratos, defesa e estresse, estrutura e sinalização, ligantes a nucleotídeos, relacionadas com homeostase redox, entre outras. Estes resultados são importantes para a compreensão dos mecanismos celulares que atuam no feijão-de-corda, genótipo BRS-Marataoã, quando submetido à infecção viral, ao estresse salino, e a ambos os estresses de forma combinada.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / O feijÃo-de-corda (Vigna unguiculata) à uma das principais leguminosas cultivadas no Brasil. Entretanto, devido à presenÃa de fatores biÃticos e abiÃticos sÃo geradas perdas significativas na produtividade desta cultura. O VÃrus do Mosaico Severo do Caupi (CPSMV) tem atacado com grande frequÃncia os cultivos brasileiros. AlÃm disso, devido o feijÃo-de-corda ser cultivado em regiÃes onde os Ãndices pluviomÃtricos sÃo baixos, a deficiÃncia hÃdrica à bastante comum. Esse estresse promove impacto negativo substancial no crescimento e desenvolvimento das plantas, resultando em diminuiÃÃo na produÃÃo de biomassa. Em condiÃÃes de campo, os estresses mencionados acima podem ocorrer tanto individualmente quanto simultaneamente. Portanto, o presente estudo teve como objetivo estudar as respostas do feijÃo-de-corda (genÃtipo CE-31, sin. PitiÃba) submetido ao estresse hÃdrico, infectado com o CPSMV e sob pressÃo dos dois estresses combinados. Sob essas condiÃÃes, a cinÃtica enzimÃtica de proteÃnas antioxidantes (superÃxido dismutase, catalase e ascorbato peroxidase) e PR-proteÃnas (glucanase, quitinase e guaiacol peroxidase), bem como a dosagem de perÃxido de hidrogÃnio e quantificaÃÃo do CPSMV em folhas de feijÃo-de-corda foram realizadas. AlÃm disso, proteÃnas diferencialmente acumuladas em folhas de feijÃo-de-corda submetidas à esses estresses foram quantificadas e identificadas por LC-MS/MS e bancos de dados disponÃveis. A infecÃÃo viral nÃo alterou a maioria dos parÃmetros fisiolÃgicos. Jà a deficiÃncia hÃdrica contribuiu para a diminuiÃÃo da fotossÃntese lÃquida, transpiraÃÃo e condutÃncia estomÃtica. Atà 6 dias apÃs inoculaÃÃo do CPSMV, o vÃrus nÃo agravou os efeitos negativos da seca. Os resultados da cinÃtica enzimÃtica revelaram que as respostas sÃo alteradas de formas diferentes frente aos estresses quando impostos individualmente ou simultaneamente e que a presenÃa do estresse hÃdrico favoreceu a infecÃÃo viral apÃs 2 dias de inoculaÃÃo. A anÃlise proteÃmica revelou 117 proteÃnas diferencialmente acumuladas pertencentes a diferentes categorias de acordo com as funÃÃes fisiolÃgicas: energia e metabolismo, fotossÃntese, metabolismo de proteÃnas, homeostase redox, fatores de regulaÃÃo e processamento de RNA, resposta ao estresse, defesa de plantas e outras. Estes resultados sÃo importantes para a compreensÃo dos mecanismos celulares que atuam no feijÃo-de-corda, genÃtipo CE-31, quando submetido ao estresse hÃdrico, à infecÃÃo pelo CPSMV e a ambos os estresses de forma combinada. / Cowpea (Vigna unguiculata) is a legume (Fabaceae) with high nutritional value grown in Brazil. However, biotic and abiotic factors are responsible for causing significant losses to the growth and yield of leguminous plants. Cowpea mosaic severe virus (CPSMV) is one of the more severe problems affecting cowpea production in Brazil. Also, cowpea are mainly grown in regions where rainfall is low, thus water deficit is quite common. This stress promotes substantial negative impact on growth and development of plants, resulting in decreased of biomass production. Under field conditions, the stresses mentioned above can occur both individually and simultaneously. Therefore, this work aimed to study the responses of cowpea (CE-31 genotype, syn. Pitiuba) subjected to water deficit, infected with CPSMV and under pressure of the two combined stresses. Under these conditions, enzyme kinetics of antioxidant protein (superoxide dismutase, catalase and ascorbate peroxidase) and PR-proteins (glucanase, chitinase and guaiacol peroxidase) as well as hydrogen peroxide dosage and quantification of CPSMV in cowpea leaves were performed. In addition, differentially accumulated proteins from cowpea leaves subjected to these stresses were identified and quantified by LC-MS/MS. Viral infection did not affect the majority of physiological parameters. Already water deficit contributed to the decrease in net photosynthesis, transpiration and stomatal conductance. At 6 days after CPSMV inoculation, the virus did not worsen the negative effects of drought. The results revealed that the enzyme kinetics of the responses was changed across different ways when the stress imposed individually or simultaneously and the presence of water deficit favored viral infection after 2 days of CPSMV inoculation. The proteomic analysis revealed 117 differentially accumulated proteins belonging to different categories according to the physiological functions: energy and metabolism, photosynthesis, protein metabolism, redox homeostasis, regulation factors and RNA processing, response to stress, plant defense and others. These results are important for understanding the cellular mechanisms that operate in cowpea (CE-31 genotype), when subjected to water deficit, CPSMV infection and both combined stresses.

SILVA, Rodolpho Glauber Guedes. Respostas fisiológicas e bioquímicas do feijão-de-corda [Vigna unguiculata (L.) Walp.] submetido ao estresse hídrico, infectado com o vírus do mosaico severo do caupi, e sob pressão dos dois estresses combinados. 2016. 137 f. Tese (Doutorado em bioquímica)- Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2016. / Submitted by Elineudson Ribeiro (elineudsonr@gmail.com) on 2016-07-28T15:41:58Z No. of bitstreams: 1 2016_tese_rggsilva.pdf: 2259649 bytes, checksum: 18f9f4ca9a43a3bfd289cedfbacbd968 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-08-02T14:43:34Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_tese_rggsilva.pdf: 2259649 bytes, checksum: 18f9f4ca9a43a3bfd289cedfbacbd968 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-02T14:43:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_tese_rggsilva.pdf: 2259649 bytes, checksum: 18f9f4ca9a43a3bfd289cedfbacbd968 (MD5) Previous issue date: 2016 / Cowpea (Vigna unguiculata) is a legume (Fabaceae) with high nutritional value grown in Brazil. However, biotic and abiotic factors are responsible for causing significant losses to the growth and yield of leguminous plants. Cowpea mosaic severe virus (CPSMV) is one of the more severe problems affecting cowpea production in Brazil. Also, cowpea are mainly grown in regions where rainfall is low, thus water deficit is quite common. This stress promotes substantial negative impact on growth and development of plants, resulting in decreased of biomass production. Under field conditions, the stresses mentioned above can occur both individually and simultaneously. Therefore, this work aimed to study the responses of cowpea (CE-31 genotype, syn. Pitiuba) subjected to water deficit, infected with CPSMV and under pressure of the two combined stresses. Under these conditions, enzyme kinetics of antioxidant protein (superoxide dismutase, catalase and ascorbate peroxidase) and PR-proteins (glucanase, chitinase and guaiacol peroxidase) as well as hydrogen peroxide dosage and quantification of CPSMV in cowpea leaves were performed. In addition, differentially accumulated proteins from cowpea leaves subjected to these stresses were identified and quantified by LC-MS/MS. Viral infection did not affect the majority of physiological parameters. Already water deficit contributed to the decrease in net photosynthesis, transpiration and stomatal conductance. At 6 days after CPSMV inoculation, the virus did not worsen the negative effects of drought. The results revealed that the enzyme kinetics of the responses was changed across different ways when the stress imposed individually or simultaneously and the presence of water deficit favored viral infection after 2 days of CPSMV inoculation. The proteomic analysis revealed 117 differentially accumulated proteins belonging to different categories according to the physiological functions: energy and metabolism, photosynthesis, protein metabolism, redox homeostasis, regulation factors and RNA processing, response to stress, plant defense and others. These results are important for understanding the cellular mechanisms that operate in cowpea (CE-31 genotype), when subjected to water deficit, CPSMV infection and both combined stresses. / O feijão-de-corda (Vigna unguiculata) é uma das principais leguminosas cultivadas no Brasil. Entretanto, devido à presença de fatores bióticos e abióticos são geradas perdas significativas na produtividade desta cultura. O Vírus do Mosaico Severo do Caupi (CPSMV) tem atacado com grande frequência os cultivos brasileiros. Além disso, devido o feijão-de-corda ser cultivado em regiões onde os índices pluviométricos são baixos, a deficiência hídrica é bastante comum. Esse estresse promove impacto negativo substancial no crescimento e desenvolvimento das plantas, resultando em diminuição na produção de biomassa. Em condições de campo, os estresses mencionados acima podem ocorrer tanto individualmente quanto simultaneamente. Portanto, o presente estudo teve como objetivo estudar as respostas do feijão-de-corda (genótipo CE-31, sin. Pitiúba) submetido ao estresse hídrico, infectado com o CPSMV e sob pressão dos dois estresses combinados. Sob essas condições, a cinética enzimática de proteínas antioxidantes (superóxido dismutase, catalase e ascorbato peroxidase) e PR-proteínas (glucanase, quitinase e guaiacol peroxidase), bem como a dosagem de peróxido de hidrogênio e quantificação do CPSMV em folhas de feijão-de-corda foram realizadas. Além disso, proteínas diferencialmente acumuladas em folhas de feijão-de-corda submetidas à esses estresses foram quantificadas e identificadas por LC-MS/MS e bancos de dados disponíveis. A infecção viral não alterou a maioria dos parâmetros fisiológicos. Já a deficiência hídrica contribuiu para a diminuição da fotossíntese líquida, transpiração e condutância estomática. Até 6 dias após inoculação do CPSMV, o vírus não agravou os efeitos negativos da seca. Os resultados da cinética enzimática revelaram que as respostas são alteradas de formas diferentes frente aos estresses quando impostos individualmente ou simultaneamente e que a presença do estresse hídrico favoreceu a infecção viral após 2 dias de inoculação. A análise proteômica revelou 117 proteínas diferencialmente acumuladas pertencentes a diferentes categorias de acordo com as funções fisiológicas: energia e metabolismo, fotossíntese, metabolismo de proteínas, homeostase redox, fatores de regulação e processamento de RNA, resposta ao estresse, defesa de plantas e outras. Estes resultados são importantes para a compreensão dos mecanismos celulares que atuam no feijão-de-corda, genótipo CE-31, quando submetido ao estresse hídrico, à infecção pelo CPSMV e a ambos os estresses de forma combinada.

MAGALHÃES, Vladimir Gonçalves. Prospecção bioquímica e molecular de fatores possivelmente envolvidos na defesa de feijão-de-corda [Vigna unguiculata (L.) Walp] ao vírus do mosaico severo do caupi (CPSMV). 2011. 109 f. : Dissertação (Mestrado em Bioquímica)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2011. / Submitted by Eric Santiago (erichhcl@gmail.com) on 2016-07-15T14:36:03Z No. of bitstreams: 1 2011_dis_vgmagalhaes.pdf: 4392892 bytes, checksum: 571bbf928e7a06498a9e935694d2ab1d (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-08-02T20:26:15Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_dis_vgmagalhaes.pdf: 4392892 bytes, checksum: 571bbf928e7a06498a9e935694d2ab1d (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-02T20:26:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_dis_vgmagalhaes.pdf: 4392892 bytes, checksum: 571bbf928e7a06498a9e935694d2ab1d (MD5) Previous issue date: 2011 / Cowpea [(Vigna unguiculata (L.) Walp.)] has a major socioeconomic importance in Northeastern Brazil. However, its production is low due abiotic and biotic factors. Amongst the biotic factors the cowpea severe mosaic virus (CPSMV, Secoviridae family) has a great importance because it causes the most prevalent and serious virus disease that affects this crop in the country. Although there are resistant cultivars to CPSMV, the defense mechanisms involved is not understood. For this reason, a comparative study was conducted between resistant and susceptible cultivars, using two experimental approaches. In the first one, the biochemical approach, possible differences of enzyme activities related to oxidative stress (superoxide dismutase, ascorbate peroxidase, guaiacol peroxidase) and pathogenesis (β-1,3-glucanase and chitinase), in addition of phenyl amonium lyase, and H2O2 generation in the leaves of the cultivars Pitíuba (susceptible) and Macaibo (resistant) were analyzed. The secondary leaves were harvested at 6, 12, 24, 48, 72 h after treatment with CPSMV or carborundum (controls) and these above parameters were measures in the protein extracts obtained. It was shown that, in general, the response amongst the cultivars did not differ significantly, suggesting that the defense mechanisms of cowpea are different from the classic response of defense observed for several plant species. In the second approach, molecular, the nucleotide sequences of the genes that code for the translation initiation factors (eIF4E, eIF(iso)4E, eIF4G, eIF(iso)4G and nCBP) and the primary strucuture of the correspondent putative proteins were analyzed in order to search patterns of polymorphis between the studied cowpea cultivars that could be related to a constitutive defense conferred by recessive genes. After sequence analysis, it was found that eIF4E showed polymorphisms between cultivars, and, in at least two positions (68 and 108), there were differences between susceptible and resistant cultivars (Arg68/Pro68; Val108 or Pro108/Ala108). The molecular modeling revealed that differences in amino acid are located in two external loops close to the cap (m7G) binding domain, well reported in cases of recessive resistance within the Potyviridae family. Through immunodetection studies with the leaf extracts and the protein fractions obtained after the affinity chromatography on a Sepharose-7-metil-guanosina column, it was found that the amino acid mutations found did not impair the ability of eIF4E to bind to M7G in vitro. However, as it was observed two variants for eIF4E comparing the resistant and susceptible cultivars to CPSMV, at spatially neighboring regions, it could not be ruled out the hypothesis that this constitutive/recessive resistant trait is correlated with these mutations detected, which could impair, consequently, the in vivo interaction of eIF4E with the viral VPg. / O feijão-de-corda [Vigna unguiculata (L.) Walp.] tem grande importância socioeconômica no Nordeste brasileiro. Entretanto, sua produção é baixa devida a diversos fatores abióticos e bióticos. Dentre os fatôres bióticos, o vírus do mosaico severo do caupi (CPSMV, família Secoviridae) apresenta grande destaque, por causar a virose que mais acomete essa cultura no país. Embora existam cultivares resistentes ao vírus, não se sabe quais os mecanismos de defesa envolvidos. Por essa razão, foi elaborado um estudo comparativo entre cultivares resistentes e susceptíveis, utilizando duas abordagens experimentais. Na abordagem bioquímica, possíveis diferenças de atividades de enzimas relacionadas ao estresse oxidativo (dismutase do superóxido, peroxidase do ascorbato, peroxidase) e à patogênese (β-1,3-glucanase e quitinase), além da fenilamônia liase, e teores de H2O2 foram estudadas nos cultivares Pitiúba (susceptível) e Macaibo (resistente). Após tratamento com o CPSMV ou com apenas carborundum (plantas controles), foram realizadas coletas nos tempos de 6, 12, 24, 48 e 72 h, tendo sido realizadas as análises bioquímicas nos extratos protéicos obtidos das folhas secundárias. Foi verificado que, de maneira geral, a resposta entre os cultivares não diferiram significamente, sugerindo que os mecanismos de defesa de feijão-de-corda sejam diferentes da resposta clássica de defesa. Na segunda abordagem, molecular, as sequências nucleotídicas dos genes codificantes para os fatores de iniciação de tradução (eIF4E, eIF(iso)4E, eIF4G, eIF(iso)4G e nCBP) e as sequências primárias putativas das proteínas correspondentes foram analisados, no intuito de se averiguar a existência de padrões de polimorfismos entre cultivares resistentes e susceptíveis, que pudessem estar relacionados à defesa constitutiva conferida por genes recessivos. Após análise das sequências, foi observado que eIF4E apresentava polimorfismos entre os cultivares, sendo que, em pelo menos duas posições nas sequências primárias putativas do fator (68 e 108), existiram diferenças entre cultivares susceptíveis e resistentes (Arg68/Pro68; Val108 ou Pro108/Ala108). A modelagem molecular revelou que as diferenças em aminoácidos situam-se em dois loops externos, próximos ao domínio de ligação ao capacete (m7G), bastante relatados em casos de resistência recessiva para a família Potyviridae. Através de estudos de imunodectecção posterior ao passo cromatográfico em coluna de afinidade, foi observado que as mudanças de aminoácidos não comprometiam, a capacidade de eIF4E em se ligar ao m7G in vitro. Entretanto, como foram observadas duas variantes para eIF4E, entre cultivares resistentes e susceptíveis ao CPSMV, em regiões próximas espacialmente, não se pode descartar a hipótese de que a resistência recessiva constitutiva esteja associada com essas mutações detectadas nessas sequências, que iriam modificar, consequentemente, a interação da VPg viral com eIF4E in vivo.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / O feijÃo-de-corda [Vigna unguiculata (L.) Walp.] tem grande importÃncia socioeconÃmica no Nordeste brasileiro. Entretanto, sua produÃÃo à baixa devida a diversos fatores abiÃticos e biÃticos. Dentre os fatÃres biÃticos, o vÃrus do mosaico severo do caupi (CPSMV, famÃlia Secoviridae) apresenta grande destaque, por causar a virose que mais acomete essa cultura no paÃs. Embora existam cultivares resistentes ao vÃrus, nÃo se sabe quais os mecanismos de defesa envolvidos. Por essa razÃo, foi elaborado um estudo comparativo entre cultivares resistentes e susceptÃveis, utilizando duas abordagens experimentais. Na abordagem bioquÃmica, possÃveis diferenÃas de atividades de enzimas relacionadas ao estresse oxidativo (dismutase do superÃxido, peroxidase do ascorbato, peroxidase) e à patogÃnese (β-1,3-glucanase e quitinase), alÃm da fenilamÃnia liase, e teores de H2O2 foram estudadas nos cultivares PitiÃba (susceptÃvel) e Macaibo (resistente). ApÃs tratamento com o CPSMV ou com apenas carborundum (plantas controles), foram realizadas coletas nos tempos de 6, 12, 24, 48 e 72 h, tendo sido realizadas as anÃlises bioquÃmicas nos extratos protÃicos obtidos das folhas secundÃrias. Foi verificado que, de maneira geral, a resposta entre os cultivares nÃo diferiram significamente, sugerindo que os mecanismos de defesa de feijÃo-de-corda sejam diferentes da resposta clÃssica de defesa. Na segunda abordagem, molecular, as sequÃncias nucleotÃdicas dos genes codificantes para os fatores de iniciaÃÃo de traduÃÃo (eIF4E, eIF(iso)4E, eIF4G, eIF(iso)4G e nCBP) e as sequÃncias primÃrias putativas das proteÃnas correspondentes foram analisados, no intuito de se averiguar a existÃncia de padrÃes de polimorfismos entre cultivares resistentes e susceptÃveis, que pudessem estar relacionados à defesa constitutiva conferida por genes recessivos. ApÃs anÃlise das sequÃncias, foi observado que eIF4E apresentava polimorfismos entre os cultivares, sendo que, em pelo menos duas posiÃÃes nas sequÃncias primÃrias putativas do fator (68 e 108), existiram diferenÃas entre cultivares susceptÃveis e resistentes (Arg68/Pro68; Val108 ou Pro108/Ala108). A modelagem molecular revelou que as diferenÃas em aminoÃcidos situam-se em dois loops externos, prÃximos ao domÃnio de ligaÃÃo ao capacete (m7G), bastante relatados em casos de resistÃncia recessiva para a famÃlia Potyviridae. AtravÃs de estudos de imunodectecÃÃo posterior ao passo cromatogrÃfico em coluna de afinidade, foi observado que as mudanÃas de aminoÃcidos nÃo comprometiam, a capacidade de eIF4E em se ligar ao m7G in vitro. Entretanto, como foram observadas duas variantes para eIF4E, entre cultivares resistentes e susceptÃveis ao CPSMV, em regiÃes prÃximas espacialmente, nÃo se pode descartar a hipÃtese de que a resistÃncia recessiva constitutiva esteja associada com essas mutaÃÃes detectadas nessas sequÃncias, que iriam modificar, consequentemente, a interaÃÃo da VPg viral com eIF4E in vivo. / Cowpea [(Vigna unguiculata (L.) Walp.)] has a major socioeconomic importance in Northeastern Brazil. However, its production is low due abiotic and biotic factors. Amongst the biotic factors the cowpea severe mosaic virus (CPSMV, Secoviridae family) has a great importance because it causes the most prevalent and serious virus disease that affects this crop in the country. Although there are resistant cultivars to CPSMV, the defense mechanisms involved is not understood. For this reason, a comparative study was conducted between resistant and susceptible cultivars, using two experimental approaches. In the first one, the biochemical approach, possible differences of enzyme activities related to oxidative stress (superoxide dismutase, ascorbate peroxidase, guaiacol peroxidase) and pathogenesis (β-1,3-glucanase and chitinase), in addition of phenyl amonium lyase, and H2O2 generation in the leaves of the cultivars PitÃuba (susceptible) and Macaibo (resistant) were analyzed. The secondary leaves were harvested at 6, 12, 24, 48, 72 h after treatment with CPSMV or carborundum (controls) and these above parameters were measures in the protein extracts obtained. It was shown that, in general, the response amongst the cultivars did not differ significantly, suggesting that the defense mechanisms of cowpea are different from the classic response of defense observed for several plant species. In the second approach, molecular, the nucleotide sequences of the genes that code for the translation initiation factors (eIF4E, eIF(iso)4E, eIF4G, eIF(iso)4G and nCBP) and the primary strucuture of the correspondent putative proteins were analyzed in order to search patterns of polymorphis between the studied cowpea cultivars that could be related to a constitutive defense conferred by recessive genes. After sequence analysis, it was found that eIF4E showed polymorphisms between cultivars, and, in at least two positions (68 and 108), there were differences between susceptible and resistant cultivars (Arg68/Pro68; Val108 or Pro108/Ala108). The molecular modeling revealed that differences in amino acid are located in two external loops close to the cap (m7G) binding domain, well reported in cases of recessive resistance within the Potyviridae family. Through immunodetection studies with the leaf extracts and the protein fractions obtained after the affinity chromatography on a Sepharose-7-metil-guanosina column, it was found that the amino acid mutations found did not impair the ability of eIF4E to bind to M7G in vitro. However, as it was observed two variants for eIF4E comparing the resistant and susceptible cultivars to CPSMV, at spatially neighboring regions, it could not be ruled out the hypothesis that this constitutive/recessive resistant trait is correlated with these mutations detected, which could impair, consequently, the in vivo interaction of eIF4E with the viral VPg.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / O feijÃo-de-corda tem grande importÃncia socioeconÃmica no Nordeste brasileiro. Entretanto, sua produÃÃo à baixa devido a diversos fatores biÃticos, como, por exemplo, o vÃrus do mosaico severo do caupà (CPSMV, gÃnero Comovirus), que apresenta grande destaque, por causar a virose que mais acomete essa cultura no paÃs. No estudo da interaÃÃo planta-vÃrus, diversos trabalhos mostram que o tratamento de sementes com o etil metanosulfonato (EMS, mutagÃnico quÃmico) resulta no fenÃtipo de resistÃncia em plantas que, anteriormente, apresentavam susceptibilidade à infecÃÃo por vÃrus do gÃnero Potyvirus. Por essa razÃo, o presente estudo teve como objetivo investigar as respostas de defesa bioquÃmicas e fisiolÃgicas das plantas de feijÃo-de-corda do genÃtipo (CE-31) susceptÃvel ao CPSMV (CPI) a partir de sementes tratadas com EMS (0,04% v/v), e avaliar se as plantas mutagenizadas (MCPI), produzidas a partir dessas sementes se tornaram resistentes ao CPSMV. Duas diferentes abordagens foram utilizadas neste trabalho: 1) anÃlises bioquÃmicas (enzimas antioxidantes e conteÃdo de H2O2, PR-proteÃnas e compostos secundÃrios) e fisiolÃgicas (parÃmetros fotossintÃticos e teor de clorofila); 2) abordagem proteÃmica quantitativa (LC-ESI-MS/MS), livre de marcaÃÃo, para identificar proteÃnas responsivas à infecÃÃo viral. Os resultados obtidos demonstram que as plantas MCPI sÃo capazes de induzir respostas bioquÃmicas (aumento de H2O2, induÃÃo de PR-proteÃnas e aumento no conteÃdo de compostos secundÃrios) e alteraÃÃes nos parÃmetros fisiolÃgicos (alta taxa fotossintÃtica e teor de clorofila) que, aparentemente, tÃm relaÃÃo com o fenÃtipo de resistÃncia das plantas mutagenizadas ao CPSMV. Na anÃlise proteÃmica, 99 proteÃnas foram identificadas como sendo diferenciais, das quais 68 aumentaram e 31 diminuÃram em abundÃncia nas plantas MCPI em relaÃÃo as plantas CPI. A anÃlise proteÃmica, mostrou diversas vias metabÃlicas (Metabolismo Redox, Energia e Metabolismo, FotossÃntese, Metabolismo de RNA e Defesa) envolvidas nas respostas de defesa das plantas MCPI frente a infecÃÃo viral. O tratamento das sementes com o EMS, resultou em plantas de feijÃo-de-corda com fenÃtipo de resistÃncia capazes de acionar mecanismos de defesa para impedir a infeÃÃo viral / Cowpea is an important crop that makes major nutritional contributions as a source of proteins and carbohydrates in the diet of many people worldwide. However, its production is impaired due to various stresses including those of biotic origins. Cowpea Severe Mosaic Virus (CPSMV) infects cowpeas leading to severe symptoms and low productivity. Several studies of plant-virus interaction show that seed treatment with Ethyl methanesulfonate (EMS, chemical mutagen), results in a resistant phenotype in plants, which was previously susceptibility, to virus infection of the Potyvirus genus. The aim of this study was to investigate some physiological and biochemical parameters of a susceptible cowpea cultivar (CPI) (CE-31, sin. Pitiuba) in comparison with its derived resistant mutagenized (MCPI), both infected with CPSMV. MCPI plantlets were obtained after treatment of CE-31 seeds with 0.04% EMS. Two different approaches were used in this study: 1) biochemical (antioxidant enzymes and H2O2 content, PR-proteins and secondary metabolites) and physiological analysis (photosynthetic parameters and chlorophyll content); and 2) Label free quantitative proteomic approach (LC-ESI-MS / MS) to identify proteins responsive to viral infection. Our results showed that MCPI had no symptoms of CPSMV infection and biochemical (high H2O2, PR-proteins and secondary compounds [phenolic and lignin]) and physiological responses (High photosynthesis index and chlorophyll content) is activated in MCPI plantlets after CPSMV inoculation. With regard to proteomic analysis, 99 proteins were differentially represented, where these 68 are up- and 31 down represented in MCPI compared to CPI. Regardless whether to CPI (susceptible) or MCPI (mutagenized resistant) plantlets, CPSMV induce changes in proteome profile that involve several biological process (energy and metabolism, photosynthesis, response to stress, oxidative burst, and scavenging). Moreover, these results suggest that the CPSMV responsive proteins in the MCPI represent a complex network involving in resistant mechanisms to CPSMV. Treatment of the susceptible CE-31 genotype seeds with the mutagenic agent EMS induced genomic alterations generating a cowpea mutagenized resistant to CPSMV by apparently inducing classical biochemical and physiological responses against infection

SOUZA, Pedro Filho Noronha de. Análise comparativa de parâmetros bioquímicos e fisiológicos de um genótipo de feijão-de-corda (Vigna unguiculata L. Walp.) suscetível e seu mutante derivado, resistente, infectados com o vírus do mosaico severo do caupi (CPSMV). 2016. 180 f. Tese (Doutorado em bioquímica)- Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2016. / Submitted by Elineudson Ribeiro (elineudsonr@gmail.com) on 2016-07-28T15:30:39Z No. of bitstreams: 1 2016_tese_pfnsouza.pdf: 6363124 bytes, checksum: a74bcc0c69df39e0286b864e93babb1a (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-08-02T14:43:45Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_tese_pfnsouza.pdf: 6363124 bytes, checksum: a74bcc0c69df39e0286b864e93babb1a (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-02T14:43:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_tese_pfnsouza.pdf: 6363124 bytes, checksum: a74bcc0c69df39e0286b864e93babb1a (MD5) Previous issue date: 2016 / Cowpea is an important crop that makes major nutritional contributions as a source of proteins and carbohydrates in the diet of many people worldwide. However, its production is impaired due to various stresses including those of biotic origins. Cowpea Severe Mosaic Virus (CPSMV) infects cowpeas leading to severe symptoms and low productivity. Several studies of plant-virus interaction show that seed treatment with Ethyl methanesulfonate (EMS, chemical mutagen), results in a resistant phenotype in plants, which was previously susceptibility, to virus infection of the Potyvirus genus. The aim of this study was to investigate some physiological and biochemical parameters of a susceptible cowpea cultivar (CPI) (CE-31, sin. Pitiuba) in comparison with its derived resistant mutagenized (MCPI), both infected with CPSMV. MCPI plantlets were obtained after treatment of CE-31 seeds with 0.04% EMS. Two different approaches were used in this study: 1) biochemical (antioxidant enzymes and H2O2 content, PR-proteins and secondary metabolites) and physiological analysis (photosynthetic parameters and chlorophyll content); and 2) Label free quantitative proteomic approach (LC-ESI-MS / MS) to identify proteins responsive to viral infection. Our results showed that MCPI had no symptoms of CPSMV infection and biochemical (high H2O2, PR-proteins and secondary compounds [phenolic and lignin]) and physiological responses (High photosynthesis index and chlorophyll content) is activated in MCPI plantlets after CPSMV inoculation. With regard to proteomic analysis, 99 proteins were differentially represented, where these 68 are up- and 31 down represented in MCPI compared to CPI. Regardless whether to CPI (susceptible) or MCPI (mutagenized resistant) plantlets, CPSMV induce changes in proteome profile that involve several biological process (energy and metabolism, photosynthesis, response to stress, oxidative burst, and scavenging). Moreover, these results suggest that the CPSMV responsive proteins in the MCPI represent a complex network involving in resistant mechanisms to CPSMV. Treatment of the susceptible CE-31 genotype seeds with the mutagenic agent EMS induced genomic alterations generating a cowpea mutagenized resistant to CPSMV by apparently inducing classical biochemical and physiological responses against infection. / O feijão-de-corda tem grande importância socioeconômica no Nordeste brasileiro. Entretanto, sua produção é baixa devido a diversos fatores bióticos, como, por exemplo, o vírus do mosaico severo do caupí (CPSMV, gênero Comovirus), que apresenta grande destaque, por causar a virose que mais acomete essa cultura no país. No estudo da interação planta-vírus, diversos trabalhos mostram que o tratamento de sementes com o etil metanosulfonato (EMS, mutagênico químico) resulta no fenótipo de resistência em plantas que, anteriormente, apresentavam susceptibilidade à infecção por vírus do gênero Potyvirus. Por essa razão, o presente estudo teve como objetivo investigar as respostas de defesa bioquímicas e fisiológicas das plantas de feijão-de-corda do genótipo (CE-31) susceptível ao CPSMV (CPI) a partir de sementes tratadas com EMS (0,04% v/v), e avaliar se as plantas mutagenizadas (MCPI), produzidas a partir dessas sementes se tornaram resistentes ao CPSMV. Duas diferentes abordagens foram utilizadas neste trabalho: 1) análises bioquímicas (enzimas antioxidantes e conteúdo de H2O2, PR-proteínas e compostos secundários) e fisiológicas (parâmetros fotossintéticos e teor de clorofila); 2) abordagem proteômica quantitativa (LC-ESI-MS/MS), livre de marcação, para identificar proteínas responsivas à infecção viral. Os resultados obtidos demonstram que as plantas MCPI são capazes de induzir respostas bioquímicas (aumento de H2O2, indução de PR-proteínas e aumento no conteúdo de compostos secundários) e alterações nos parâmetros fisiológicos (alta taxa fotossintética e teor de clorofila) que, aparentemente, têm relação com o fenótipo de resistência das plantas mutagenizadas ao CPSMV. Na análise proteômica, 99 proteínas foram identificadas como sendo diferenciais, das quais 68 aumentaram e 31 diminuíram em abundância nas plantas MCPI em relação as plantas CPI. A análise proteômica, mostrou diversas vias metabólicas (Metabolismo Redox, Energia e Metabolismo, Fotossíntese, Metabolismo de RNA e Defesa) envolvidas nas respostas de defesa das plantas MCPI frente a infecção viral. O tratamento das sementes com o EMS, resultou em plantas de feijão-de-corda com fenótipo de resistência capazes de acionar mecanismos de defesa para impedir a infeção viral.