La maladie d’Alzheimer (MA) représente la cause la plus importante de la démence, pourtant la cause de la MA reste toujours inconnue. Des données récentes suggèrent que la protéine BMI1 joue un rôle protecteur contre la MA et un rôle essentiel dans l’intégrité de l’hétérochromatine constitutive (hét-c) – les régions génomiques inactives au niveau de la transcription. Les niveaux de BMI1 et d’hét-c sont diminués dans les cerveaux de patients atteints de la MA, et des modèles de déficience de BMI1 in vivo et in vitro reproduisent des phénotypes canoniques de la MA. Nous avançons l’hypothèse que la perturbation de l’hét-c, effectuée par l’inactivation de gènes impliqués dans son intégrité, induira trois phénotypes canoniques de la MA : l’amyloïdopathie, la tauopathie et l’apoptose. Les knock-out (KO) de ces gènes se réalisent individuellement via le système CRISPR-Cas9 dans des neurones humains in vitro. Huit des 38 conditions de KO manifestent une perturbation d’hét-c, analysée par Western Blot; six manifestent une amyloïdopathie, deux manifestent une tauopathie et quatre manifestent des niveaux élevés d’apoptose, analysés par microscopie confocale et immunofluorescence. Les conditions de KO de gènes impliqués dans les domaines associés à la lamine manifestent plusieurs ou tous ces phénotypes de la MA. Ces résultats peuvent suggérer une nouvelle théorie qui expliquerait la cause de la MA : la dérépression de ces domaines induit l’activation des long interspersed elements (LINEs) dont leur dérépression cause des dommages à l’ADN et une réponse immunitaire innée aboutissant à un état sénescent et pro-inflammatoire qui entraîne la neurodégénérescence. / Alzheimer’s Disease (AD) represents the number one cause of dementia, however the cause of AD remains unknown. Recent data suggest that the protein BMI1 plays a protective role against AD and an essential role in the integrity of constitutive heterochromatin (c-het) – transcriptionally inactive, genomic regions. The levels of BMI1 and c-het are diminished in brains of AD patients, and models of BMI1 deficiency in vivo and in vitro reproduce canonical phenotypes of AD. We hypothesize that the disruption of c-het, brought about by inactivating genes implicated in its integrity, will induce three canonical phenotypes of AD: amyloidopathy, tauopathy and apoptosis. These gene knock-outs (KO) are carried out individually via the CRISPR-Cas9 system in human neurons in vitro. Eight of the 38 KO conditions present a disruption of c-het, analysed by Western Blot; six present amyloidopathy, two present tauopathy and four present elevated levels of apoptosis, analysed by confocal microscopy and immunofluorescence. The KO conditions of genes implicated in lamina-associated domains present some or all these AD phenotypes. These results may suggest a novel theory that would explain the cause of Alzheimer’s Disease: the derepression of these domains induces the activity of long interspersed elements (LINEs) which causes DNA damage and an innate immune response, culminating in a pro-inflammatory state of cellular senescence which leads to neurodegeneration.

Le cancer du pancréas est la quatrième cause de décès par cancer au Canada. Avec des mutations activatrices de KRas présentes dans près de 90% des lésions bénignes et tumeurs, ce cancer arbore une activation de la voie MAPK très tôt dans son développement. Or, peu de littérature existe sur les étapes clés de la progression et sur le rôle précis de cette signalisation dans le passage des lésions bénignes (PanIN) au stade avancé (PDAC). Depuis plusieurs années, notre laboratoire s’intéresse aux kinases ERK1/2, actives en aval de Ras, des acteurs centraux du programme de sénescence cellulaire, soit un programme antitumoral intrinsèque aux cellules. L’hypothèse centrale des présents travaux est donc que les mutations de KRas acquises dès le stade PanIN induisent une sénescence qui agit comme barrière à la progression tumorale, et que l’atténuation du signal de ERK est impliquée dans le contournement de ce mécanisme. La première partie de cette thèse montrera donc les avancées que nous avons faites sur la caractérisation de la progression entre le stade bénin et le stade avancé, de laquelle l’acquisition d’un caractère souche, la transition épithélio-mésenchymateuse et le développement d’une dépendance mitochondriale semblent être des déterminants. Ensuite, nous présenterons nos découvertes sur le rôle des kinases ERK1/2, de la sénescence cellulaire et du stress nucléolaire dans une nouvelle approche visant à restaurer un mécanisme de suppression tumorale inspiré des lésions bénignes et impliquant une altération de la biogenèse ribosomique. Finalement, pour bonifier cette nouvelle stratégie, nous présenterons les résultats d’un criblage CRISPR-Cas9 génome-entier nous ayant permis d’identifier les composantes d’une stratégie « one-two punch » basée sur l’induction de sénescence dans les cellules PDAC combinée à l’inhibition de la Glutathion peroxydase 4 (GPX4), de façon à promouvoir une sénolyse efficace dans ce contexte. Dans leur ensemble, les travaux présentés dans cette thèse montrent un avancement significatif dans la compréhension de la biologie des cancers pancréatiques en identifiant à la fois des vulnérabilités intrinsèques et inductibles afin de générer de nouvelles idées thérapeutiques pour ce cancer hautement fatal. / Pancreatic cancer is the fourth leading cause of death by cancer in Canada. With frequent activating mutations in KRas in up to 90% of benign lesions and tumors, this cancer possesses an early activation of the MAPK pathway. However, key events of its progression from the PanIN stage to the PDAC stage and the precise role of MAPK signaling in it are still poorly understood. For many years, our laboratory has taken interest in the ERK1/2 signaling pathway, activated downstream of oncogenic Ras and a key mediator of cellular senescence. Cellular senescence is considered an intrinsic antitumor mechanism due to its ability to stably halt the cell cycle. The central hypothesis of this work is then that KRas mutations that are acquired at the PanIN stage induce cellular senescence which acts as a barrier against tumor development. Still, this powerful mechanism can be circumvented as cells tend to attenuate the ERK1/2 signaling to promote progression and acquisition of more aggressive features. Thus, the first part of this thesis will present our most recent advances in characterizing the progression events between PanIN and PDAC stages, during which stem cell features acquisition, epithelial-mesenchymal transition and mitochondrial dependency seem to occur. Next, we will present our discoveries regarding the implication of ERK1/2 kinases, cellular senescence and nucleolar stress in a new approach to restore a tumor suppression mechanism inspired by the PanIN stage and based on ribosome biogenesis alteration. Finally, to potentiate this strategy, we will show the results of a genome-wide CRISPR-Cas9 screen that identified the components of a “one-two punch” approach to induce cellular senescence in PDAC cells and to efficiently eliminate them by GPX4 inhibitors-mediated senolysis. Globally, the work presented in this thesis show significant progress in the field of pancreatic cancer, identifying previously unknown vulnerabilities of those cancer cells and paving the way for the development of new therapeutic combinations.

Human Immunodeficiency Virus (HIV) infection initiates major metabolic and cell- survival complications. Anti-retroviral therapy (ART) is the current approach to suppress active HIV replication to a level of undetected viral load, but it is not a curative approach. Newer and sophisticated gene editing technologies could indeed be a potent antiviral therapy to achieve a clinical sterilization/cure of HIV infection. Chronic HIV patients, even under a successful ART regimen, exhibit a low-grade inflammation, immune senescence, premature aging, telomeric DNA attrition, T cell apoptosis, and cellular homeostasis. In this dissertation, we investigated CD4 T cell homeostasis, degree of T cell apoptosis, an associated telomeric DNA damage, DNA damage repair signaling, and the apoptotic pathways in CD4 T cells during HIV infection with or without ART treatment. Our data support a DNA damage accumulation, and impaired DNA damage repair in chromosome ends via recruitment of 53BP1 protein to the damaged foci. We found that a key player of DNA damage and repair enzyme, ATM, and its associated checkpoint proteins (CHK1, CKH2) are affected by HIV infection. HIV infection also altered another multifunctional master regulator protein AKT that is crucial in maintaining cellular homeostasis. Curing HIV is the ultimate redemption against HIV-associated complications. To explore the possibility of a functional cure, we investigated the use of a transient and a non-viral CRISPR/Cas9-based gene editing technology targeting the latently incorporated HIV provirus. After performing a nucleofection/electroporation using an in vitro formulated ribonucleoprotein (RNP) constituting a synthetic guide RNA (gRNA) and Cas9 nuclease protein, we demonstrated a significant (maximum 97%) reduction of HIV-mRNA and p24-capsid protein expression, upon stimulation (using PMA) and latency reactivation of latently HIV-infected CD4 T cells and latent-monocytes. Notably, the RNP treatment did not induce any cytotoxic effects, without affecting the abilility of cell proliferation. A sequence specific cleavage of HIV-provirus in two crucial gene locations (targeting vpr/tat genes) showed the most significant suppression of HIV reactivation or latency reversal. We have used DNA sequencing, and T7EI assay to confirm the target-site-specific cleavage of the HIV-proviral genome. Our data confirm the activation of non- homologous end joining (NHEJ) pathway to repair the double-stranded DNA break created by the CRISPR/Cas9 treatment. Taken together, this study provides a new gene therapeutic approach using synthetic gRNA/Cas9 targeting HIV genome, which warrant further in vivo animal and human studies.

L'alpha-1 antitrypsine (A1AT) est un inhibiteur de sérine protéase sécrété principalement par le foie et libéré dans la circulation où sa concentration physiologique est de 1,5 à 3,5 g/L. La principale fonction de l'A1AT est d'inhiber l'activité de l'élastase des neutrophiles (NE) afin de maintenir l'équilibre protéase/anti-protéase dans les poumons. Son déficit (A1ATD) touche plus de 3,4 millions d'individus dans le monde chez qui l'élastase des neutrophiles décompose l'élastine, provoquant ainsi une diminution de l'élasticité du poumon ainsi qu'une dégradation de son tissu conjonctif. En conséquence, l'A1ATD entraîne des troubles respiratoires tels que l'emphysème ou la maladie pulmonaire obstructive chronique et ceux qui en sont atteints nécessitent des injections fréquentes d'A1AT purifiée à partir du sang d'un donneur. Cependant, l'A1AT plasmatique est hétérogène dans son état de glycosylation et sa qualité varie d'un lot à l'autre. De plus, il y a un risque, même très faible, de transmission d'agents pathogènes avec l'administration d'A1AT purifiée par plasma. Par conséquent, il existe un besoin pour une version recombinante. La glycoprotéine mature possède trois sites de N-glycosylation comprenant principalement des structures de type complexe bi-antennaires afucosylées et α-2,6-di-sialylées, A2G2S2 (6,6). Bien que la glycosylation ne soit pas essentielle à l'activité inhibitrice de l'A1AT, il a été démontré qu'elle a un impact significatif sur sa demi-vie in vivo. Notamment, l'acide sialique, un monosaccharide terminal chargé négativement présent sur les N-glycanes, aide à prolonger la demi-vie de l'A1AT dans le sérum en empêchant l'interaction entre l'avant-dernier galactose (Gal) du N-glycane et les récepteurs hépatiques des asialoglycoprotéines (ASGPRs), composés de deux sous-unités appelées lectines hépatiques (HL) 1 et 2, qui se lient aux glycoprotéines asialylées contenant un Gal terminal et conduisent à leur dégradation. Par conséquent, il est important de produire A1AT dans un système d'expression qui peut effectuer les modifications post-traductionnelles (PTM) appropriées à des fins thérapeutiques. Jusqu'à présent, la production d'A1AT recombinante (rA1AT) a été tentée dans différents systèmes d'expression cellulaire avec un succès limité. Malgré la disponibilité de diverses lignées cellulaires, les cellules ovariennes de hamster chinois (CHO) ont été largement utilisées pour la production de glycoprotéines thérapeutiques car ces cellules sont compatibles avec des stratégies de glyco-ingénierie pour produire des glycoprotéines recombinantes composées de glycanes de type humain. Cependant, ces cellules synthétisent des N-glycanes de type complexe comprenant de la fucosylation centrale et de l'acide sialique lié en α-2,3. Par conséquent, dans ce projet, l'objectif était de développer une version recombinante d'A1AT avec un profil de glycosylation humaine exprimée en cellules CHO modifiées et qui se prête à des utilisations thérapeutiques. À cette fin, dans notre étude, nous avons d'abord empêché l'α-2,3 sialylation ainsi que la fucosylation centrale en éliminant les gènes responsables via la technologie CRISPR/Cas9, suivie de la surexpression de l'α-2,6‐sialyltransférase humaine à l'aide d'un système d'expression inductible au cumate. Nous avons ensuite montré la supériorité du promoteur inductible CR5 pour l’expression de A1AT par rapport à cinq promoteurs constitutifs forts couramment utilisés dans l'industrie. En utilisant le promoteur CR5, nous avons généré des populations de CHO stables modifiées par glyco-ingénierie produisant plus de 2,1 g/L pour la forme native et 2,8 g/L pour la version mutée d'A1AT avec des N-glycanes analogues au produit clinique dérivé du plasma, la Prolastin-C. L'effet bénéfique de la supplémentation en N‐acétylmannosamine du milieu de culture cellulaire sur la glycosylation de l'A1AT a également été démontré. Enfin, nous avons montré que l'activité anti‐élastase des rA1ATs est comparable à celle de la Prolastin-C, et que la substitution des résidus méthionines critiques par des valines rendait A1AT significativement plus résistante à l'oxydation. Nous avons ensuite étudié l'impact de la glycosylation d'A1AT sur son interaction avec les orthologues d'ASGPR. Pour cela, nous avons initialement utilisé un test d'internalisation cellulaire basé sur la lignée cellulaire hépatique humaine HepG2 connue pour exprimer les ASGPRs à sa surface et avons examiné leur interaction avec les rA1ATs possédant divers profils de glycosylation. Comme le test d'internalisation basé sur les cellules HepG2 a démontré un faible rapport signal sur bruit (SNR) ainsi qu'un niveau élevé de signal de fond d'internalisation, nous avons cherché à développer un nouveau test basé sur des cellules CHO surexprimant des orthologues ASGPR recombinants. Alors que la sous-unité HL-1 humaine seule était suffisante pour lier et internaliser l'A1AT asialylée, les sous-unités HL-1 et HL-2 étaient nécessaires pour former des récepteurs fonctionnels et ayant une forte affinité pour les ASGPR de rat et de souris. Afin d'améliorer le SNR de notre test cellulaire d'internalisation, le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) a été utilisé pour enrichir les populations de cellules CHO pour celles exprimant des niveaux élevés d'orthologues ASGPR. Enfin, en utilisant des structures de glycanes remodelés par voie enzymatique de Prolastin-C, nous n'avons observé aucune internalisation lorsque les glycanes sont terminés avec α-2,6-Neu5Ac ni α-2,8-Neu5Ac-α-2,6-Neu5Ac par l’ASGPR de l'humain, du rat et de la souris. D'autre part, l'absorption de Prolastin-C portant des glycanes bi-antennaires avec une branche terminée par de l'acide sialique α-2,3 et l'autre par du galactose terminal, par l'ASGPR de souris a été statistiquement plus élevée que celle de l'humain et du rat. En somme, l'A1AT recombinante résistante à l'oxydation décrite dans ce projet pourrait représenter un meilleur médicament biothérapeutique tout en offrant une alternative sûre et plus stable pour la thérapie d'augmentation. Nous avons également contribué à une meilleure compréhension de l'impact de la sialylation de l'A1AT sur son internalisation cellulaire par les orthologues ASGPR. / Alpha-1 antitrypsin (A1AT) is a serine protease inhibitor secreted primarily by the liver, and released in the circulation where its physiological concentration is 1.5-3.5 g/L. The main physiological function of A1AT is to inhibit the activity of neutrophil elastase (NE) to maintain the protease/anti-protease balance in the lung. The A1AT deficiency (A1ATD) is affecting more than 3.4 million individuals worldwide where neutrophil elastase breaks down elastin, thereby causing a decrease in the elasticity of the lung as well as a degradation of its connective tissue. As a result, A1ATD leads to respiratory disorders such as emphysema or chronic obstructive pulmonary disease. Treatment of this health condition requires frequent injections of A1AT purified from donor blood. However, plasma A1AT is heterogeneous in its glycosylation state and its quality varies from batch to batch. Moreover, there is a risk, however very low, of pathogen transmittance with plasma-purified A1AT administration. Therefore, there is a need for recombinant version. The mature glycoprotein has three N-glycosylation sites possessing mostly afucosylated, α-2,6-di-sialylated bi-antennary complex-type structures, A2G2S2 (6,6). Though glycosylation is not essential for A1AT's inhibitory activity, it has been shown to have a significant impact on its in vivo half-life. Notably, sialic acid, a terminal negatively charged monosaccharide present on N-glycans, helps to prolong the half-life of A1AT in serum by preventing the interaction between the penultimate galactose (Gal) of the N-glycan and the hepatic asialoglycoprotein receptors (ASGPRs), composed of two subunits termed hepatic lectin (HL) 1 and 2, which bind to asialylated glycoproteins containing terminal Gal and lead to their degradation. To this extend, it is important to produce A1AT in an expression system that can carry out the appropriate post-translational modifications (PTMs) for therapeutic purposes. Thus far, the production of recombinant A1AT (rA1AT) has been attempted in different cell expression systems with limited success. Despite the availability of various cell lines, Chinese hamster ovary (CHO) cells have been widely used to produce therapeutic glycoproteins as these cells can tolerate glycoengineering strategies to produce recombinant glycoproteins with human-like glycans. However, these cells synthesize complex-type N-glycans with core-fucosylation along with α-2,3-linked sialic acid. Therefore, in this research project, the aim was to develop a recombinant version of A1AT with human glycosylation pattern expressed in genetically engineered CHO cells that would be amenable to therapeutic uses. To this end, in our study, we first prevented α-2,3 sialylation as well as core-fucosylation by eliminating the corresponding genes via CRISPR/Cas9 technology, followed by overexpressed human α-2,6‐sialyltransferase using a cumate‐inducible CHO expression system. We then showed superiority of the CR5 inducible promoter compared to five strong constitutive promoters commonly used in the industry. Using the CR5 promoter, we generated glycoengineered stable CHO pools producing over 2.1 g/L of the wild-type and 2.8 g/L of the mutein forms of A1AT, with N‐glycans analogous to the plasma‐derived clinical product, Prolastin-C. The effect of N‐acetylmannosamine supplementation to the cell culture media on the A1AT glycosylation was also demonstrated. Finally, we showed that the anti‐elastase activity of rA1ATs is comparable to that of Prolastin-C, and that substitution of critical methionine residues with valines rendered A1AT significantly more resistant to oxidation. We then studied the impact of A1AT glycosylation on its interaction with ASGPR orthologs. For this, we initially used a cell-based internalization assay based on the human HepG2 hepatic cell line known to express ASGPRs at its surface and examined their interaction with rA1ATs possessing various glycosylation profiles. As HepG2 cell-based internalization assay demonstrated poor signal-to-noise ratio (SNR) as well as high level of background internalization signal, we then aimed at developing a new assay based on CHO cells overexpressing recombinant ASGPRs orthologs. While human HL-1 subunit alone was sufficient to bind and internalize asialylated A1AT, both HL-1 and HL-2 subunits were required to form functional and high affinity receptors for the rat and mouse ASGPRs. To enhance SNR of our cell-based uptake assay, fluorescence-activated cell sorting (FACS) was used to enrich the CHO pools for cells expressing high levels of ASGPR orthologs. Finally, using enzymatically remodelled glycan structures of Prolastin-C, we observed no uptake when glycans are terminated with α-2,6-Neu5Ac nor α-2,8-Neu5Ac-α-2,6-Neu5Ac by human, rat, and mouse ASGPR orthologs. On the other hand, the uptake of Prolastin-C bearing bi-antennary glycans with one branch terminated with α-2,3 sialic acid and the other with terminal galactose, by mouse ASGPR was observed to be statistically higher than that by human and rat ASGPR orthologs. Collectively, the oxidation-resistant recombinant A1AT described in this project could represent a viable biobetter drug while offering a safe and more stable alternative for augmentation therapy. We also contributed a better understanding of the impact of A1AT sialylation on its cellular uptake by ASGPR orthologs.

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[ES] Las leguminosas son un grupo de plantas consideradas de gran importancia por su valor nutricional para la alimentación humana y ganadera. Además, las familias de leguminosas se caracterizan por rasgos distintivos de desarrollo como su inflorescencia compuesta y su compleja ontogenia floral. Para comprender mejor estas características distintivas, es importante estudiar los genes reguladores clave involucrados en el desarrollo de la inflorescencia y la flor. El gen SUPERMAN (SUP) es un factor transcripcional de dedos de zinc (Cys2-Hys2) considerado como un represor activo que controla el número de estambres y carpelos en A. thaliana. Además, SUP está involucrado en la terminación del meristemo floral y el desarrollo de los tejidos derivados del carpelo. El objetivo principal de este trabajo fue la caracterización funcional del ortólogo de SUP en la leguminosa modelo Medicago truncatula (MtSUP). Logramos este objetivo en base a un enfoque de genética reversa, análisis de expresión génica y ensayos de complementación y sobreexpresión. Nuestros resultados muestran que MtSUP es el gen ortólogo de SUP en M. truncatula. MtSUP comparte algunos de los roles ya descritos para SUP con algunas variaciones. Curiosamente, MtSUP controla la determinación del meristemo inflorescente secundario (I2) y de los primordios comunes (CP) a pétalos y estambres. Por tanto, MtSUP controla el número de flores y de pétalos-estambres que producen el meristemo I2 y los primordios comunes, respectivamente. MtSUP muestra funciones novedosas para un gen de tipo SUP, desempeñando papeles clave en los meristemos que confieren complejidad de desarrollo a esta familia de angiospermas. Este trabajo permitió identificar a MtSUP, un gen clave que forma parte de la red reguladora genética que subyace al desarrollo de la inflorescencia compuesta y de las flores en la leguminosa modelo M. truncatula. / [CA] Les lleguminoses són un gran grup de plantes considerades de gran importància pel seu valor nutricional per a l'alimentació humana i ramadera. A més, les famílies de lleguminoses es caracteritzen per trets distintius de desenrotllament com la seua inflorescència composta i la seua complexa ontogènia floral. Per a comprendre millor estes característiques distintives, és important estudiar els gens reguladors clau involucrats en la inflorescència i el desenrotllament floral. El gen SUPERMAN (SUP) és un factor transcripcional de dits de zinc (Cys2-Hys2) considerat com un repressor actiu que controla el nombre d'estams i carpels en A. thaliana. A més, SUP està involucrat en la terminació del meristemo floral i el desenrotllament dels teixits derivats del carpel. "L'objectiu principal d'este treball va ser la caracterització funcional de l'ortòleg de SUP en la lleguminosa model Medicago truncatula (MtSUP) . Aconseguim l'objectiu amb base en un enfocament genètic invers, anàlisi d'expressió gènica i assajos de complementació i sobreexpressió. Els nostres resultats mostren que MtSUP és el gen ortòleg de SUP en M. truncatula. MtSUP compartix alguns dels rols ja descrits per a SUP amb variacions. Curiosament, MtSUP està involucrat en la determinació del meristemo de la inflorescència secundària (I2) i els primordios comuns (CP). Per tant, MtSUP controla el nombre de flors i pètals-estams que produïxen el meristemo I2 i els primordios comuns, respectivament. MtSUP mostra funcions noves per a un gen tipus SUP, exercint papers clau en els meristemos que conferixen complexitat de desenrotllament a esta família d'angiospermes. "Este treball va permetre identificar a MtSUP, un gen clau que forma part de la xarxa reguladora genètica darrere de la inflorescència composta i el desenrotllament de flors en la lleguminosa model M. truncatula. / [EN] Legumes are a large group of plants considered of great importance for their nutritional value in human and livestock nutrition. Besides, legume families are characterized by distinctive developmental traits as their compound inflorescence and complex floral ontogeny. For a better understanding of these distinctive features is important to study key regulatory genes involved in the inflorescence and floral development. The SUPERMAN (SUP) gene is a zinc-finger (Cys2-Hys2) transcriptional factor considered to be an active repressor that controls the number of stamens and carpels in A. thaliana. Moreover, SUP is involved in the floral meristem termination and the development of the carpel marginal derived tissues. The main objective of this work was the functional characterization of the SUP orthologue in the model legume Medicago truncatula (MtSUP). We achieved this objective based on a reverse genetic approach, gene expression analysis, and complementation and overexpression assays. Our results show that MtSUP is the orthologous gene of SUP in M. truncatula. MtSUP shares some of the roles already described for SUP with variations. Interestingly, MtSUP controls the determinacy of the secondary inflorescence (I2) meristem and the common primordia (CP). Thus, MtSUP controls the number of flowers and petal-stamens produced by the I2 meristem and the common primordia respectively. MtSUP displays novel functions for a SUP-like gene, playing key roles in the meristems that confer developmental complexity to this angiosperm family. This work allowed to identify MtSUP, a key gene that participates in the genetic regulatory network underlying compound inflorescence and flower development in the model legume M. truncatula. / I would like to thanks the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness for the grant (MINECO; BIO2016-75485-R) that supported this work. Special thanks to the Generalitat Valenciana for funding my doctorate with the Santiago Grisolía predoctoral scholarships / Rodas Méndez, AL. (2021). MtSUPERMAN controls the number of flowers per inflorescence and floral organs in the inner three whorls of Medicago truncatula [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/171474

Most of microorganisms are ubiquitously able to live in both planktonic and biofilm states, which can be applied to dissolve the energy and environmental issues (e.g., producing biofuels and purifying waste water), but can also lead to serious public health problems. To better harness microorganisms, plenty of studies have been implemented to investigate the metabolism of planktonic and/or biofilm cells via multi-omics approaches (e.g., transcriptomics and proteomics analysis). However, these approaches are limited to provide the direct description of intracellular metabolism (e.g., metabolic fluxes) of microorganisms. Therefore, in this study, I have applied computational modeling approaches (i.e., 13C assisted pathway and flux analysis, flux balance analysis, and machine learning) to both planktonic and biofilm cells for better understanding intracellular metabolisms and providing valuable biological insights. First, I have summarized recent advances in synergizing 13C assisted pathway and flux analysis and metabolic engineering. Second, I have applied 13C assisted pathway and flux analysis to investigate the intracellular metabolisms of planktonic and biofilm cells. Various biological insights have been elucidated, including the metabolic responses under mixed stresses in the planktonic states, the metabolic rewiring in homogenous and heterologous chemical biosynthesis, key pathways of biofilm cells for electricity generation, and mechanisms behind the electricity generation. Third, I have developed a novel platform (i.e., omFBA) to integrate multi-omics data with flux balance analysis for accurate prediction of biological insights (e.g., key flux ratios) of both planktonic and biofilm cells. Fourth, I have designed a computational tool (i.e., CRISTINES) for the advanced genome editing tool (i.e., CRISPR-dCas9 system) to facilitate the sequence designs of guide RNA for programmable control of metabolic fluxes. Lastly, I have also accomplished several outreaches in metabolic engineering. In summary, during my Ph.D. training, I have systematically applied computational modeling approaches to investigate the microbial metabolisms in both planktonic and biofilm states. The biological findings and computational tools can be utilized to guide the scientists and engineers to derive more productive microorganisms via metabolic engineering and synthetic biology. In the future, I will apply 13C assisted pathway analysis to investigate the metabolism of pathogenic biofilm cells for reducing their antibiotic resistance. / Ph. D. / Most of microorganisms are ubiquitously able to live in both planktonic and biofilm states (i.e., floating in a flow and anchoring on a surface, respectively), which can be applied to dissolve the energy and environmental issues (e.g., producing biofuels and purifying waste water), but can also lead to serious public health problems (e.g., chronic infections). Therefore, deciphering the metabolism of both planktonic and biofilm cells are of great importance to better harness microorganism. Plenty of studies have been implemented to investigate the metabolism of planktonic and/or biofilm cells by measuring the abundances of single type of biological components (e.g., gene expression and proteins). However, these approaches are limited to provide the direct description of intracellular metabolism (e.g., enzyme activities) of microorganisms. Therefore, in this study, I have applied computational modeling approaches to both planktonic and biofilm cells for providing valuable biological insights (e.g., enzyme activities). The biological insights include 1) how planktonic cells response to mixed stresses (e.g., acids and organics) 2) how planktonic cells produce various chemicals, and 3) how biofilm cells generate electricity by rewiring the intracellular metabolic pathways. I also developed a novel platform to utilize multiple types of biological data for improving the prediction accuracy of biological insights of both planktonic and biofilm cells. In addition, I designed a computational tool to facilitate the sequence designs of an advanced genome editing tool for precisely controlling the corresponding enzyme activities. Lastly, I have also accomplished several outreaches in metabolic engineering. In summary, during my Ph.D. training, I have systematically applied computational modeling approaches to investigate the microbial metabolisms in both planktonic and biofilm states. The biological findings and computational tools can be utilized to guide the metabolic engineered to derive more productive microorganisms via metabolic engineering and synthetic biology. In the future, I plan to investigate how the pathogenic biofilm cells improve their antibiotic resistance and attempt to reduce such strong resistance.

Factor VIII is a clotting factor found on the intrinsic side of the coagulation cascade. A mutation in the factor VIII gene causes the disease Hemophilia A, for which there is no cure. The most common treatment is administration of recombinant factor VIII. However, this can cause an immune response that renders the treatment ineffective in certain hemophilia patients. For this reason a new treatment, or cure, needs to be developed. Gene editing is one solution to correcting the factor VIII mutation. CRISPR/Cas9 mediated gene editing introduces a double stranded break in the genomic DNA. Where this break occurs repair mechanisms cause insertions and deletions, or if a template oligonucleotide can be provided point mutations could be introduced or corrected. However, to accomplish this goal for editing factor VIII mutations, a way to deliver the components of CRISPR/Cas9 into somatic cells is needed. In this study, I confirmed that the CRISPR/Cas9 system was able to create a mutation in the factor VIII gene in zebrafish. I also showed that the components of CRISPR/Cas9 could be piggybacked by vivo morpholino into a variety of blood cells. This study also confirmed that the vivo morpholino did not interfere with the gRNA binding to the DNA, or Cas9 protein inducing the double stranded break.

La leucémie myéloïde aiguë (LMA) est l’une des formes de cancer le plus génétiquement hétérogène avec un faible taux de survie globale sur 5 ans de 21 % 1. En effet, les traitements standards sont peu efficaces pour les patients plus âgés, ceux présentant des comorbidités, ceux en rechutes ou pour les cas résistants. Bien que notre compréhension génétique de la LMA ait progressé ces dernières années, les traitements ont peu évolué et le taux de survie reste toujours faible chez les patients. À la suite d’un criblage de plus de 10 000 composés sur 56 échantillons primaires de LMA, nous avons regroupé des composés actifs contre la LMA à l’aide d’une nouvelle approche développée par notre groupe, nommée Compound Correlation Cluster (CCC) 2. L’hypothèse à l’origine de cette méthode de regroupement est que les composés d’un même CCC agissent sur les mêmes cibles moléculaires. Dans le présent mémoire, nous caractérisons une nouvelle petite molécule issue d’un de ces CCC, le BMS-249 du CCC88, un potentiel agent thérapeutique prometteur ciblant les sous-types de LMA à mauvais pronostic clinique. En effet, nous avons démontré que les spécimens de LMA TP53 mutés, à caryotype complexe, ou à risque défavorable, sont plus sensibles au BMS-249. Grâce à un criblage CRISPR/Cas9 sur l’ensemble du génome humain, nous avons déterminé que les gènes importants de la voie moléculaire du mévalonate et du cholestérol étaient impliqués dans son mécanisme d’action. Par des études de synergie et de quantification des lipides, nos résultats montrent que le BMS-249 impacte la voie métabolique du cholestérol dans des modèles de cellules leucémiques. De manière intéressante, des études récentes sur les statines ont montré que le métabolisme du cholestérol est une cible thérapeutique d’intérêt en LMA 3, et l’effet du BMS-249 sur cette voie démontre effectivement qu’elle est cruciale pour la survie des cellules cancéreuses. Dans l’avenir, de plus amples études sur la relation entre la structure et l’activité du BMS-249, à des fins d’optimisation et d’identification directe de la cible moléculaire, seront grandement pertinentes. Globalement, nos résultats ont démontré que l’approche par CCC permet de rapidement trouver des voies moléculaires importantes pouvant être ciblées pour le développement de nouveaux agents thérapeutiques contre la LMA. / Acute myeloid leukemia (AML) is one of the most genetically heterogeneous forms of cancer with a low 5-year overall survival rate of 21% (1). Indeed, standard treatments are not very effective for older patients, those with comorbidities, those in relapse or for drug resistant cases. Although our genetic understanding of AML has progressed in recent years, treatments have slowly evolved, and the survival rate remains low among patients. Following a screening of more than 10,000 compounds on 56 primary AML samples, we clustered compounds active against AML using a novel approach developed by our group, named Compound Correlation Cluster (CCC) (2). The assumption behind this clustering method is that compounds of the same CCC act on the same molecular targets. In this thesis, we characterize a new small molecule derived from one of these CCCs, the BMS-249 of CCC88, a potential promising therapeutic agent targeting AML subtypes with poor clinical outcomes. Indeed, we demonstrated that specimens of AML TP53 mutated, with a complex karyotype, or at unfavorable risk are more sensitive to BMS-249. Through a human genome-wide CRISPR/Cas9 screen, we determined that important genes of the mevalonate and cholesterol molecular pathway are involved in its mechanism of action. Through synergy and lipid quantification studies, our results show that BMS-249 impacts the cholesterol metabolic pathway in leukemic cell models. Interestingly, recent studies on statins have shown that cholesterol metabolism is a therapeutic target of interest in AML (3), and the effect of BMS- 249 on this pathway effectively demonstrates that it is crucial for cancer cell survival. In the future, further studies on the relationship between the structure and activity of BMS-249, for the purpose of optimization and direct identification of the molecular target, will be highly relevant. Overall, our results demonstrated that the CCC approach allows to quickly find molecular pathways that can be targeted for new therapeutic agents against AML.