Moléculas de L-cisteína (CSH) e L-glutationa (GSH) foram ancoradas na superfície de eletrodos de ouro, previamente modificados com uma camada autoarranjada de ácido 3-mercaptopropiônico (MPA). Esta arquitetura molecular foi importante para preservar a atividade redox dos grupos tiólicos da CSH e GSH na interface eletrodo/solução. A identificação do par redox R-S-S-R/R-SH, bem como a determinação do pKa dos grupos -SH superficiais, foram efetuadas usando voltametria cíclica em soluções de eletrólito em diferentes pH contedo ferricianeto de potássio. A presença dos grupos -SH e -S-S- na superfície dos eletrodos modificados foi ainda confirmada por Espectroscopia Raman de Superfície. Determinaram-se as constantes de velocidade de transferência de carga do processo quase reversível R-S-S-R / R-SH. Estes eletrodos modificados apresentaram resposta eletrocatalítica para a redução de espécies reativas de oxigênio (ROS), como peróxido de hidrogênio e para a oxidação de compostos com atividade antioxidante como a quercetina. Demonstrou-se que a presença de íons Cu2+ na superfície destes eletrodos é capaz de deslocar o equilíbrio do par R-SS-R/R-SH, no sentido oxidativo. Métodos de quantificação para estes compostos foram desenvolvidos por amperometria hidrodinâmica e voltametria cíclica. / L-cysteine molecules (CSH) and L-glutathione (GSH) were anchored on the surface of gold electrodes, previously modified with a self assembled monolayer of 3-mercaptopropionic acid (MPA). This molecular architecture was important to preserve the redox properties of the thiol groups of CSH and GSH in the interface electrode / solution. The identification of the redox couple RSSR / R-SH and the determination of the pKa of -SH groups surface were made using cyclic voltammetry in electrolyte solutions at different pH contents potassium ferricyanide. The presence of the -SH and -SS- modified electrode surface was further confirmed by Raman spectroscopy of surface. It was determined the rate constants of direct electron transfer of quasi-reversible coupled R-SS-R/R-SH. The modified electrodes showed electrocatalytic response to the reduction of reactive oxygen species (ROS) such as hydrogen peroxide and the oxidation of compounds with antioxidant activity such as quercetin. It was demonstrated that presence of Cu2+ ions on the electrode surface can shift the equilibrium of the RSSR/R-SH redox coupled into oxidative direction. Hydrogen peroxide and Quercetin were detected at these modified electrodes using amperometry and hydrodynamic cyclic voltammetry.

O presente trabalho descreve o uso de eletrodos de carbono vítreo como eletrodo-base para modificação com hexacianoferratos de Fe (FeHCF), Co (CoHCF) e Ni (NiHCF) por meio da adsorção destes complexos utilizando a técnica de voltametria cíclica. Os eletrodos quimicamente modificados (EQMs) preparados por este método apresentam características diferenciadas tais como robustez e estabilidade ao longo das medidas eletroquímicas, além de boas propriedades redox. Os EQMs com FeHCF e NiHCF foram avaliados em função da sua atividade eletrocatalítica para a reação de oxidação do Ácido Ascórbico em solução de KCl 0,1 mol L-1 (pH 6,6). O EQM com CoHCF foi avaliado nas mesmas condições dos outros filmes, porém não apresentou uma diminuição no sobrepotencial de oxidação do Ácido Ascórbico. Embora não tenha apresentado uma resposta semelhante aos EQMs com FeHCF e NiHCF, o EQM com CoHCF apresentou a melhor sensibilidade da resposta de corrente de pico quando comparado aos demais. A fim de proporcionar a renovação da superfície do eletrodo foi avaliada a utilização de eletrodos de pasta de carbono modificada com FeHCF, CoHCF ou NiHCF. Os parâmetros de composição da pasta, o eletrólito suporte e o pH foram avaliados utilizando o EPCM com FeHCF por meio da técnica de voltametria cíclica e os parâmetros otimizados foram aplicados no uso dos EPCM com CoHCF e NiHCF. Para avaliar a sensibilidade na deteccção da L-Cisteína, do Glifosato e da N-Acetilcisteína, os EPCMs modificados foram submetidos a estudos com a técnica de voltametria de onda quadrada. Todos os analitos apresentaram resposta eletroquímica em todos os EPCMs, porém as melhores respostas foram para o FeHCF na presença de L-Cisteína, CoHCF na presença de Glifosato e NiHCF na presença de N-Acetilcisteína. Na presença de 1 x 10-8 mol L-1 dos analitos os EPCMs com hexacianoferratos apresentaram um boa resposta eletroquímica, embora não tenha sido possível observar uma linearidade entre o aumento da concentração dos analitos propostos e a corrente de pico. Essa sensibilidade demonstrada pelos EPCMs na presença de moléculas com grupos funcionais, como ácidos carboxílicos, aminoácidos e tióis abre novas perspectivas para a análise direta de compostos de interesse clínico, farmacêutico e amostras de interesse ambiental. / This work describes the use of glassy carbon electrodes as the base for electrode modification with hexacyanoferrates of Fe (FeHCF), Co (CoHCF) and Ni (NiHCF) through adsorption of these complexes using cyclic voltammetry. The chemically modified electrodes (CMEs) prepared by this method have specific features such as robustness and stability along the electrochemical measurements, and good redox properties. The CME with FeHCF and NiHCF were evaluated take into accounting their electrocatalytic activity for oxidation reaction of Ascorbic Acid in KCl 0.1 mol L-1 (pH 6.6). The CME with CoHCF was evaluated under the same conditions, but did not show a decrease on the overpotential for Ascorbic Acid oxidation. Although the CME with CoHCF has not showed the same behavior presented by CMEs with FeHCF and NiHCF, the CME with CoHCF presented the best sensitivity in order to relationship between peak current and concentration of Ascorbic Acid when compared to CMEs with either. In order to provide the renewal of the electrode surface was evaluated the use of carbon paste electrodes (CPEs) modified with FeHCF, CoHCF and NiHCF. The CPE parameters such as composition, supporting electrolyte and pH were evaluated using the CPE with FeHCF by cyclic voltammetry and these optimized parameters were applied for CPEs with CoHCF and NiHCF. The studies about the sensitivity of the detection for L-Cysteine, glyphosate and N-acetylcysteine using the modified CPEs with hexacyanoferrates were performed by square wave voltammetry. All analytes showed electrochemical response at all CPEs, but the best electrochemical responses were obtained for FeHCF in the presence of L-Cysteine, CoHCF in the presence of glyphosate and NiHCF in the presence of N-acetylcysteine. The CPEs with hexacyanoferrates in the presence of 1 x 10-8 mol L-1 of L-Cysteine, glyphosate or N-acetylcysteine had showed a good electrochemical response, although were not possible to observe a linear correlation between the concentration of analytes and peak current. This sensitivity demonstrated by CPEs with hexacyanoferrates electrodes in presence of specific functional groups such as carboxylic acids, amino acids and thiols opens new perspectives for the direct analysis of compounds with clinical, pharmaceutical and environmental samples.

Filarien persistieren bis zu 15 Jahren in ihren Wirten. Als eine Ursache dieser Persistenz diskutiert man die Fähigkeit der Filarien, die Immunantwort des Wirtes gezielt zu modulieren und eine zelluläre Hyporeaktivität zu induzieren. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob ein sezernierter Cysteinproteasen-Inhibitor (Onchocystatin) der humanpathogenen Filarie Onchocerca volvulus immunmodulierende Eigenschaften besitzt und an der Herausbildung eines hyporeaktiven Immunstatus des Wirtes beteiligt ist. Für die Untersuchungen wurde Onchocystatin als full length Molekül (rOv17) und als verkürztes Molekül (trOv17) rekombinant hergestellt. Das verkürzte trOv17 besitzt aufgrund des Fehlens des N-terminalen Bereiches eine verminderte proteaseinhibitorische Aktivität. Die in vitro Studien mit den rekombinant hergestellten O. volvulus Cystatinen verdeutlichen, daß rOv17 und auch trOv17 potente Immunmodulatoren sind, die sowohl die antigenspezifische als auch die polyklonal-stimulierte Proliferation von humanen PBMC inhibieren. Die zelluläre Hyporeaktivität ist dabei auf die Modulation von Monozytenfunktionen zurückzuführen. rOv17 und trOv17 modulieren die Antigenpräsentation, die Zytokinproduktion und die Expression kostimulatorischer Signale von humanen Monozyten. So konnte gezeigt werden, daß rOv17 und trOv17 die Aktivität von humanem Cathepsin L und S inhibieren und die Expression von HLA-DR, CD40 und CD86 vermindern. Die Modulation der Zytokinproduktion durch rOv17 und trOv17 ist durch eine verstärkte TNF-alpha und IL-10 Produktion und durch eine verminderte IL-12 Produktion charakterisiert. Desweiteren konnte in Neutralisationsstudien mit anti-IL-10 Ak gezeigt werden, daß die verminderte Expression von HLA-DR, CD40 und CD86 Folge der durch rOv17 und trOv17 induzierten verstärkten IL-10 Produktion ist. Im Gegensatz dazu bleibt die verminderte IL-12 Produktion und die verminderte polyklonal-stimulierte Proliferation humaner PBMC auch nach der Neutralisation von IL-10 bestehen. Die Studien mit den rekombinant hergestellten O. volvulus Cystatinen zeigen, daß rOv17 und trOv17 ihr immunologisches Umfeld auf vielfältige Art und Weise modulieren. Dabei spielt vermutlich die Inhibition der Aktivität einer Wirtscysteinprotease, aber auch ein von der Funktion als Cysteinproteasen-Inhibitor unabhängiger Mechanismus eine Rolle. Der Cysteinproteasen-Inhibitor der Filarie O. volvulus besitzt somit die Eigenschaft, die Immunantwort des Wirtes zu modifizieren, und ist vermutlich eine wesentliche Komponente, die dem Parasiten eine lange Persistenz im Wirt ermöglicht. / Immune responses of individuals infected with filarial nematodes are characterized by a marked cellular hyporesponsiveness. The establishment of this hyporesponsiveness is considered as an important mechanism to avoid host immune responses which could eliminate the parasites. The present study is investigating the immunomodulatory potential of a 17 kD secreted cysteine protease inhibitor (onchocystatin) of the human pathogenic filaria Onchocerca volvulus. In vitro studies using recombinant onchocystatin (rOv17) identified this inhibitor as a potent immunomodulator. rOv17 suppresses the antigen-driven and the polyclonally-stimulated proliferation of human PBMC. This cellular hyporeactivity is due to the modulation of monocytic function by rOv17, comprising the modulation of antigenpresentation, the expression of costimulatory molecules and the production of cytokines. Thus rOv17 strongly inhibits the activity of human cathepsin L and S and reduces the expression of MHC class II molecules as well as the expression of CD40 and CD86 on human monocytes. The modulation of cytokine production by rOv17 is characterized by an initial increase of TNF-alpha which is followed by an increase of IL-10 and a decrease of IL-12. By neutralization studies it was shown that the suppression of MHC class II molecules and of CD86 and CD40 is mediated by the rOv17 induced increase of IL-10. In contrast cellular hyporeactivity and the reduced IL-12 production remain unaffected by neutralization of IL-10. In comparison to rOv17 a truncated onchocystatin (trOv17) with lowered protease inhibitory activity was investigated. Surprisingly even trOv17 is immunomodulatory active suggesting that immunomodulation by onchocystatin is mediated by both an inhibitor-dependent and an inhibitor-independent mechanism. These data demonstrate that onchocystatin is a potent immunomodulator of host immune responses and in consequence is an essential component that enables the parasites a long persistence within their hosts.

Chez la drosophile, l’activation du récepteur Toll menant à une réponse antimicrobienne peut se faire par deux voies différentes. Ces deux voies sont activées soit par des récepteurs dédiés, les Pattern Recognition Receptors (PRRs) reconnaissant des motifs moléculaires microbiens, soit par la coupure d’une molécule circulante appelée Perséphone par des protéases microbiennes extrêmement diverses sécrétées pendant une infection. Cependant, le mécanisme par lequel Perséphone est activée demeurait ambigu. Nous avons identifié une région unique dans Perséphone fonctionnant comme un appât pour les protéases exogènes indépendamment de leur origine, type ou spécificité. Une coupure dans cette région constitue la première étape d’une activation séquentielle de Perséphone ; elle permet de recruter la cathepsine circulante 26-29-p, qui va générer la forme active de Perséphone.Ces travaux montrent comment un récepteur de l’immunité innée, Perséphone, peut être activé par un signal de danger, en l’occurrence des enzymes microbiennes, et non par la détection de motifs moléculaires qui peuvent être présents dans la flore microbienne hébergée par les animaux. / In Drosophila, the antimicrobial response against infections can be triggered by two different extracellular mechanisms that both lead to the activation of the Toll receptor. These two mechanisms are activated either by the recognition of specific microbial determinants by Pattern Recognition Receptors (PRRs), or by the cleavage of the circulating serine protease Persephone by a wide range of microbial proteases secreted during infections. However, the molecular mechanism underlying Persephone activation remained ambiguous. We identified a unique region in Persephone pro-domain that functions as a bait for exogenous proteases independently of their origin, type or specificity. Cleavage of Persephone in this bait region constitutes the first step of a sequential activation and licenses the subsequent maturation of Persephone to the endogenous circulating cysteine cathepsin 26-29-p. Our data establish Persephone itself as an immune receptor able to sense a broad spectrum of microbes through the recognition of danger signals rather than molecular patterns.

A atividade de cisteíno proteases (CP) tem sido relacionada a diferentes patologias, como no caso da leishmaniose, doença de Chagas de alguns tipos de câncer. Devido a homologia entre as cisteíno proteases presentes em altos níveis nesses sistemas celulares, foi investigada aqui a importância dessas enzimas para o desenvolvimento e estabelecimento dessas doenças a partir da atividade biológica in vitro de novos inibidores reversíveis de cisteíno proteases. De maneira geral, as substâncias apresentaram relevante atividade inibitória de cisteíno proteases expressas pelos diferentes sistemas celulares, com máximo de inibição de 42% para o Neq0554 em relação à atividade de CP expressas por Leishmania spp. e 76% em relação a atividade de CP expressas por células de câncer de pâncreas. Diferentes níveis de atividade biológica foram observados entre os sistemas celulares, porém todos apresentaram supressão em relação aos parâmetros citostáticos após a inibição da atividade de CP. Quando testados em Leishmania spp. o crescimento celular foi suprimido em pelo menos 67%, com máximo de inibição de 95% para o Neq0551 a 10 μM. Da mesma maneira, em células de câncer de pâncreas, alterações no ciclo celular e supressão dos processos de migração e formação de colônias foram os resultados mais evidentes, comretenção de 50% da capacidade de formação de colônias das células Mia-Paca2 pelo Neq0554 a 10 μM. Já em relação aos protozoários da capa Y de Trypanosoma cruzi os inibidores testados apresentaram interessante seletividade contra os parasitos, em relação à célula hospedeira LLC-MK2, além de promoverem a supressão de cerca de 80% do processo de invasão celular in vitro quando a célula hospedeira foi previamente tratada com 10 μM do inibidor Neq0662 por 2 h antes do processo de infecção. Por fim, a encapsulação do Neq0554 em apoferritina promoveu um incremento na atividade anticancerígena para células de câncer de pâncreas, com IC50 de 79 μM contra > 200 μM em relação às células de fibroblasto, aumentando sua seletividade. De maneira geral, os resultados corroboram a hipótese de a inibição de cisteíno proteases nos sistemas celulares é eficiente para promover efeitos citostáticos, podendo ser utilizada com controle e supressão do desenvolvimento das patologias. Além disso, a atividade de CP nas células de protozoários e câncer de pâncreas apresentou perfil semelhante de ação, no qual inibidores de CP não promoveram a morte em nível significativo das células, mas ressaltaram os efeitos citostáticos em relação ao crescimento celular. / Cysteine proteases (CP) activity has been related to different pathologies, such as leishmaniasis, Chagas disease and some types of cancer. Due to the homology between cysteine proteases expressed by these cellular systems, it was investigated here the importance of these enzymes for the development and establishment of these diseases based on the in vitro biological activity of novel reversible cysteine protease inhibitors. In general, the inhibitor showed a significant inhibitory activity of cysteine proteases expressed by the different cellular systems, with a maximum inhibition of 42% for Neq0554 concerning the CP activity expressed by Leishmania spp. and 76% to CP activity expressed by pancreatic cancer cells. Different profiles of biological activity were observed between the cellular systems, but all substances had significant CP activity suppression, in cytostatic levels after the inhibition of CPA. When the inhibitors were tested against Leishmania spp., the cell growth was suppressed by at least 67%, with maximum inhibition of 95% for Neq0551 at 10 μM. Similarly in pancreatic cancer cells, changes in the cell cycle profile were the most evident results, as well as the suppression of migration and colony formation ability, with 50% retention of the colony development of Mia-Paca2 cells by Neq0554 at 10 μM. In contrast, to protozoa from Trypanosoma cruzi Y strain, the inhibitors tested showed an interesting selectivity against the parasites concerning the host cell LLC-MK2, also promoting the in vitro cell invasion suppression in about 80% when the host cell was pre-treated with Neq0662 10 μM for 2 h. Finally, the encapsulation of Neq0554 promoted an increase in its anticancer activity against pancreatic cancer cells, with IC50 of 79 μM alongside > 200 μM to fibroblast cells, besides increasing its selectivity. In general, the results corroborate the hypothesis that the inhibition of cysteine proteases in the cellular systems is efficient to promote cytostatic effects, being an interesting tool to be used as control and development suppression of some pathologies. Also, CP activity in protozoa cells and pancreatic cancer showed a similar profile of action, in which cysteine protease inhibitors did not promote death at a significant level for the cells, but emphasized cytostatic effects about cell growth.

Moléculas de L-cisteína (CSH) e L-glutationa (GSH) foram ancoradas na superfície de eletrodos de ouro, previamente modificados com uma camada autoarranjada de ácido 3-mercaptopropiônico (MPA). Esta arquitetura molecular foi importante para preservar a atividade redox dos grupos tiólicos da CSH e GSH na interface eletrodo/solução. A identificação do par redox R-S-S-R/R-SH, bem como a determinação do pKa dos grupos -SH superficiais, foram efetuadas usando voltametria cíclica em soluções de eletrólito em diferentes pH contedo ferricianeto de potássio. A presença dos grupos -SH e -S-S- na superfície dos eletrodos modificados foi ainda confirmada por Espectroscopia Raman de Superfície. Determinaram-se as constantes de velocidade de transferência de carga do processo quase reversível R-S-S-R / R-SH. Estes eletrodos modificados apresentaram resposta eletrocatalítica para a redução de espécies reativas de oxigênio (ROS), como peróxido de hidrogênio e para a oxidação de compostos com atividade antioxidante como a quercetina. Demonstrou-se que a presença de íons Cu2+ na superfície destes eletrodos é capaz de deslocar o equilíbrio do par R-SS-R/R-SH, no sentido oxidativo. Métodos de quantificação para estes compostos foram desenvolvidos por amperometria hidrodinâmica e voltametria cíclica. / L-cysteine molecules (CSH) and L-glutathione (GSH) were anchored on the surface of gold electrodes, previously modified with a self assembled monolayer of 3-mercaptopropionic acid (MPA). This molecular architecture was important to preserve the redox properties of the thiol groups of CSH and GSH in the interface electrode / solution. The identification of the redox couple RSSR / R-SH and the determination of the pKa of -SH groups surface were made using cyclic voltammetry in electrolyte solutions at different pH contents potassium ferricyanide. The presence of the -SH and -SS- modified electrode surface was further confirmed by Raman spectroscopy of surface. It was determined the rate constants of direct electron transfer of quasi-reversible coupled R-SS-R/R-SH. The modified electrodes showed electrocatalytic response to the reduction of reactive oxygen species (ROS) such as hydrogen peroxide and the oxidation of compounds with antioxidant activity such as quercetin. It was demonstrated that presence of Cu2+ ions on the electrode surface can shift the equilibrium of the RSSR/R-SH redox coupled into oxidative direction. Hydrogen peroxide and Quercetin were detected at these modified electrodes using amperometry and hydrodynamic cyclic voltammetry.

Introdução: As proteinases tem um papel importante no desenvolvimento, na destruição tecidual e na produção de muco causada pela DPOC. O inibidor de proteinase de origem vegetal Enterolobium contortisiliquum Tripsin Inhibitor (EcTI) inibe tanto as proteinases da classe serina quanto da classe cisteína. Objetivos: Avaliar os efeitos do tratamento com EcTI nas alterações pulmonares induzidas pela elastase em camundongos. Métodos: Camundongos C57Bl6 receberam elastase via intratraqueal (50 uL/animal, grupo ELA) ou salina (grupo SAL). Os camundongos foram tratados com EcTI (2mg/kg) nos dias 1, 15 e 21 após a instilação de elastase (grupo ELA-EcTI) ou salina (grupo SAL-EcTI). No dia 28 do protocolo, os animais foram anestesiados, a mecânica pulmonar foi medida e o óxido nítrico exalado coletado. Posteriormente, foi realizado o lavado broncoalveolar e os pulmões foram removidos para a preparação de lâminas de histoquímica e imunohistoquímica. Por meio de morfometria analisamos o número de células positivas para neutrófilos, TNF-alfa, MMP-9, MMP-12, TIMP-1, iNOS, eNOS assim como a fração de volume de 8-iso-PGF2alfa, fibras colágenas e elásticas, nos septos alveolares e nas vias aéreas. Também foram avaliados o número de células positivas para macrófagos nos septos alveolares e MUC5ac nas vias aéreas. Resultados: O inibidor de proteinase EcTI reduziu as alterações de mecânica pulmonar (Ers, Htis e Raw), destruição do septo alveolar (Lm) e o número de células no lavado broncoalveolar (células totais, macrófagos, neutrófilos, linfócitos e eosinógilos) induzidos pela elastase. Em relação a resposta inflamatória, o EcTI reduziu o número de neutrófilos e de células TNFalfa positivas no septo alveolar e nas vias aéreas além de reduzir o número de macrófagos no septo alveolar. Considerando o remodelamento de matriz extracelular, o inibidor de proteinase atenuou a fração de volume de fibras colágenas e o número de células MMP-9 e MMP-12 positivas nos septos alveolares e nas vias aéreas. Além disso, nas vias aéreas ocorreu uma atenuação da fração de volume de fibras elásticas, e nos septos alveolares uma atenuação da quantidade de células que expressam TIMP-1. Em relação a resposta de estresse oxidativo, o EcTI reduziu a fração de volume de isoprostano e o número de células iNOS e eNOS positivas tanto nos septos alveolares quanto nas vias aéreas. O EcTI também reduziu o número de células MUC5ac positivas nas vias aéreas. Conclusões: O tratamento como inibidor EcTI modulou a mecânica pulmonar e reduziu as alterações inflamatórias, de remodelamento e de estresse oxidativo induzidas pela elastase intratraqueal. Embora sejam necessários mais estudos para elucidar os mecanismos envolvidos neste processo, o inibidor de proteinase EcTI pode ser considerado como um potencial instrumento terapêutico para o tratamento da DPOC / Background: Proteinases play a key role on emphysema development, tissue destruction and mucus production. Enterolobium contortisiliquum Tripsin Inhibitor (EcTI) is a proteinase inhibitor from plant that neutralizes serine and cysteine proteinases. Aims: To evaluated the effects of the EcTI treatment in pulmonary alterations induced by elastase in mice. Methods: C57Bl6 mice received elastase intratracheally (50 uL/animal, ELA group) or saline (SAL group). Afterwards, mice were treated with EcTI (2 mg/kg) at days 1, 15 and 21 after elastase instillation (ELA-EcTI group). Control group received saline and EcTI using the same protocol (SAL-EcTI group). At day 28, mice were anesthetized, respiratory mechanics were collected, and exhaled nitric oxide were analyzed. Afterwards, broncoalveolar lavage fluid was obtained and lungs were removed to perform histochemistry and immunohistochemistry stains. By morphometry, the number of neutrophils, TNF-alfa, MMP-9, MMP-12, TIMP-1, iNOS, eNOS positive cells as well as the volume proportion of 8-iso-PGF2alfa, collagen and elastic fibers content in alveolar septum and airways walls were performed. In airways walls, we also analyzed the number of MUC-5 positive cells and the number of macrophages. Results: The proteinase inhibitor EcTI was able to reduce the pulmonary mechanical alterations (Ers, Htis and Raw), alveolar septum disruption (Lm) and the BAL cell count (total cells, macrophages, neutrophils, lymphocytes and eosinophils) induced by elastase. Regarding the inflammatory response, EcTI also reduced the number of neutrophils and TNFalfa positive cells in both alveolar septum and airway walls, and also reduced the number of macrophages in alveolar septum. Considering the extracellular matrix remodeling, the proteinase inhibitor attenuated the volume fraction of collagen fibers, MMP-9 and MMP-12 positive cells in both alveolar septum and airway walls. Besides, in airway there were attenuation in the volume fraction of elastic fibers, and in the alveolar septa a decrease of the amount of the cells expressing TIMP-1. Regarding the oxidative stress response, EcTI reduced the volume fraction of isoprostane and the number of iNOS and eNOS positive cells in both airways walls and alveolar septa, Finally, EcTI reduced the number of MUC5ac positive cells in airway walls. Conclusions: The treatment with EcTI modulated lung mechanics and reduced inflammatory, remodeling and oxidative stress alterations induced by elastase. Although more studies need to be performed to elucidate the mechanisms involved in this process, we may considerate EcTI as a potential therapeutic tool for COPD management

Introdução: As proteinases tem um papel importante no desenvolvimento, na destruição tecidual e na produção de muco causada pela DPOC. O inibidor de proteinase de origem vegetal Bauhinia bauhinioides Cruzipain Inhibitor (BbCI) inibe tanto as proteinases da classe serina quanto da classe cisteína. Objetivos: Deste modo consideramos relevante estudar os efeitos do tratamento com BbCI nas alterações pulmonares induzidas pela elastase em camundongos. Métodos: Camundongos C57Bl6 receberam elastase via intratraqueal (50 uL/animal, grupo ELA) ou salina (grupo SAL). Os camundongos foram tratados com BbCI (2mg/kg) nos dias 1, 15 e 21 após a instilação de elastase (grupo ELABC) ou salina (grupo SALBC). No dia 28 do protocolo, os animais foram anestesiados, a mecânica pulmonar foi medida e o óxido nítrico exalado coletado. Posteriormente, foi realizado o lavado broncoalveolar e os pulmões foram removidos para a preparação de lâminas de histoquímica e imunohistoquímica. Por meio de morfometria analisamos o número de células positivas para neutrófilos, TNF-alfa, MMP-9, MMP-12, TIMP-1, iNOS, eNOS assim como a fração de volume de 8-iso-PGF2alfa, fibras colágenas e elásticas, nos septos alveolares e nas vias aéreas. Também foram avaliados o número de células positivas para macrófagos nos septos alveolares e MUC5ac nas vias aéreas. Resultados: O inibidor de proteinase Tese de Doutorado Rafael Almeida-Reis BbCI reduziu as alterações de mecânica pulmonar (Ers, Htis e Raw), destruição do septo alveolar (Lm) e o número de células no lavado broncoalveolar (células totais, macrófagos e neutrófilos) induzidos pela elastase. Em relação a resposta inflamatória, o BbCI reduziu o número de neutrófilos e de células TNFalfa positivas no septo alveolar e nas vias aéreas além de reduzir o número de macrófagos no septo alveolar. Considerando o remodelamento de matriz extracelular, o inibidor de proteinase atenuou a fração de volume de fibras elásticas e colágenas e o número de células MMP- 9 e MMP-12 positivas nos septos alveolares e nas vias aéreas. Em relação a resposta de estresse oxidativo, o BbCI reduziu a fração de volume de isoprostano nas vias aéreas e o número de células iNOS positivas tanto nos septos alveolares quanto nas vias aéreas. O BbCI também reduziu o número de células MUC5ac positivas nas vias aéreas. Conclusões: O tratamento como inibidor BbCI modulou a mecânica pulmonar e reduziu as alterações inflamatórias, de remodelamento e de estresse oxidativo induzidas pela elastase intratraqueal. Embora sejam necessários mais estudos para elucidar os mecanismos envolvidos neste processo, o inibidor de proteinase BbCI pode ser considerado como um potencial instrumento terapêutico para o tratamento da DPOC / Background: Proteinases play a key role on emphysema development, tissue destruction and mucus production. Bauhinia bauhinioides Cruzipain Inhibitor (BbCI) is a proteinase inhibitor from plant that neutralizes serine and cysteine proteinases. The present study evaluated the effects of the BbCI treatment in pulmonary alterations induced by elastase in mice. Methods: C57Bl6 mice received elastase intratracheally (50 uL/animal, ELA group) or saline (SAL group). Afterwards, mice were treated with BbCI (2 mg/kg) at days 1, 15 and 21 after elastase instillation (ELABC group). Control group received saline and BbCI using the same protocol (SALBC group). At day 28, mice were anesthetized, respiratory mechanics were collected, and exhaled nitric oxide were analyzed. Afterwards, broncoalveolar lavage fluid was obtained and lungs were removed to perform histochemistry and immunohistochemistry stains. By morphometry, the number of neutrophils, TNFalfa, MMP-9, MMP-12, TIMP-1, iNOS, eNOS positive cells as well as the volume proportion of 8-iso-PGF2alfa, collagen and elastic fibers content in alveolar septum and airways walls were performed. In airways walls, we also analyzed the number of MUC-5 positive cells and the number of macrophages. Results: The proteinase inhibitor BbCI was able to reduce the pulmonary mechanical alterations (Ers, Htis and Raw), alveolar septum disruption (Lm) and the BAL cell count (total cells, macrophages and neutrophils) induced by elastase. Regarding the Tese de Doutorado Rafael Almeida-Reis inflammatory response, BbCI also reduced the number of neutrophils and TNFalfa positive cells in both alveolar septum and airway walls, and also reduced the number of macrophages in alveolar septum. Considering the extracellular matrix remodeling, the proteinase inhibitor attenuated the volume fraction of elastic and collagen fibers, MMP-9 and MMP-12 positive cells in both alveolar septum and airway walls. Regarding the oxidative stress response, BbCI reduced the volume fraction of isoprostane in airways and the number of iNOS positive cells in both airways walls and alveolar septum. Finally, BbCI reduced the number of MUC5ac positive cells in airway walls. Conclusions: The treatment with BbCI modulated lung mechanics and reduced inflammatory, remodeling and oxidative stress alterations induced by elastase. Although more studies need to be performed to elucidate the mechanisms involved in this process, but we may considerate BbCI as a potential therapeutic tool for COPD management

Made available in DSpace on 2014-12-17T15:42:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 NathaliaCVN_DISSERT.pdf: 2020842 bytes, checksum: efcd9ca5e5cfd7d63412f72c80546c39 (MD5) Previous issue date: 2013-07-31 / In this paper, the technique of differential pulse voltammetry (DPV) has been studied for monitoring the concentration of oxalic acid (OA) during their electrochemical oxidation (EO) in acidic medium using platinum anode supported on titanium (Ti / Pt). The DPV was standardized and optimized using a glassy carbon electrode modified with cysteine. The modification with cysteine was developed electrochemically, forming a polymeric film on the surface of the glassy carbon electrode. The formation of the polymer film was confirmed by analysis of scanning electron microscope and atomic force microscope, confirming the modification of the electrode. The electrochemical degradation was developed using different current densities 10, 20 30 and 40 mA cm -2 electrode with Ti / Pt observing the degradation of oxalic acid, and monitored using the method of KMnO4 titration. However, the analyzes with DPV showed the same behavior elimination of oxalic acid titration. Compared with the titration method classical observed and DPV could be a good fit, confidence limits of detection and confirming the applicability of the technique electroanalytical for monitoring the degradation of oxalic acid / No presente trabalho, a t?cnica de voltametria de pulso diferencial (DPV) foi estudada para o monitoramento da concentra??o de ?cido ox?lico (OA) durante a sua oxida??o eletroqu?mica (EO) em meio ?cido utilizando o ?nodo de platina suportada em tit?nio (Ti/Pt). A t?cnica de DPV foi padronizada e otimizada usando um eletrodo de carbono v?treo modificado com ciste?na. A modifica??o com ciste?na foi desenvolvida eletroquimicamente, formando um filme polim?rico na superf?cie do eletrodo de carbono v?treo. A forma??o do filme polim?rico foi confirmada por an?lise de Microsc?pio Eletr?nico de Varredura e Microsc?pio de For?a At?mica, confirmando a modifica??o na superf?cie do eletrodo. A degrada??o eletroqu?mica foi desenvolvida usando diferentes densidades de corrente, 10, 20 e 30 mA cm-? com eletrodo de Ti/Pt, observando a degrada??o do ?cido ox?lico, sendo monitorado empregando a metodologia de titula??o com KmnO4. No entanto, as an?lises com DPV mostraram o mesmo comportamento de elimina??o do acido ox?lico, observado com a titula??o. Comparado com o m?todo de titula??o cl?ssica e DPV conseguiu-se um bom ajuste, intervalos de confian?a e limites de detec??o confirmando a aplicabilidade da t?cnica eletroanal?tica para o monitoramento da degrada??o de ?cido ox?lico

Introdução: As proteinases tem um papel importante no desenvolvimento, na destruição tecidual e na produção de muco causada pela DPOC. O inibidor de proteinase de origem vegetal Bauhinia bauhinioides Cruzipain Inhibitor (BbCI) inibe tanto as proteinases da classe serina quanto da classe cisteína. Objetivos: Deste modo consideramos relevante estudar os efeitos do tratamento com BbCI nas alterações pulmonares induzidas pela elastase em camundongos. Métodos: Camundongos C57Bl6 receberam elastase via intratraqueal (50 uL/animal, grupo ELA) ou salina (grupo SAL). Os camundongos foram tratados com BbCI (2mg/kg) nos dias 1, 15 e 21 após a instilação de elastase (grupo ELABC) ou salina (grupo SALBC). No dia 28 do protocolo, os animais foram anestesiados, a mecânica pulmonar foi medida e o óxido nítrico exalado coletado. Posteriormente, foi realizado o lavado broncoalveolar e os pulmões foram removidos para a preparação de lâminas de histoquímica e imunohistoquímica. Por meio de morfometria analisamos o número de células positivas para neutrófilos, TNF-alfa, MMP-9, MMP-12, TIMP-1, iNOS, eNOS assim como a fração de volume de 8-iso-PGF2alfa, fibras colágenas e elásticas, nos septos alveolares e nas vias aéreas. Também foram avaliados o número de células positivas para macrófagos nos septos alveolares e MUC5ac nas vias aéreas. Resultados: O inibidor de proteinase Tese de Doutorado Rafael Almeida-Reis BbCI reduziu as alterações de mecânica pulmonar (Ers, Htis e Raw), destruição do septo alveolar (Lm) e o número de células no lavado broncoalveolar (células totais, macrófagos e neutrófilos) induzidos pela elastase. Em relação a resposta inflamatória, o BbCI reduziu o número de neutrófilos e de células TNFalfa positivas no septo alveolar e nas vias aéreas além de reduzir o número de macrófagos no septo alveolar. Considerando o remodelamento de matriz extracelular, o inibidor de proteinase atenuou a fração de volume de fibras elásticas e colágenas e o número de células MMP- 9 e MMP-12 positivas nos septos alveolares e nas vias aéreas. Em relação a resposta de estresse oxidativo, o BbCI reduziu a fração de volume de isoprostano nas vias aéreas e o número de células iNOS positivas tanto nos septos alveolares quanto nas vias aéreas. O BbCI também reduziu o número de células MUC5ac positivas nas vias aéreas. Conclusões: O tratamento como inibidor BbCI modulou a mecânica pulmonar e reduziu as alterações inflamatórias, de remodelamento e de estresse oxidativo induzidas pela elastase intratraqueal. Embora sejam necessários mais estudos para elucidar os mecanismos envolvidos neste processo, o inibidor de proteinase BbCI pode ser considerado como um potencial instrumento terapêutico para o tratamento da DPOC / Background: Proteinases play a key role on emphysema development, tissue destruction and mucus production. Bauhinia bauhinioides Cruzipain Inhibitor (BbCI) is a proteinase inhibitor from plant that neutralizes serine and cysteine proteinases. The present study evaluated the effects of the BbCI treatment in pulmonary alterations induced by elastase in mice. Methods: C57Bl6 mice received elastase intratracheally (50 uL/animal, ELA group) or saline (SAL group). Afterwards, mice were treated with BbCI (2 mg/kg) at days 1, 15 and 21 after elastase instillation (ELABC group). Control group received saline and BbCI using the same protocol (SALBC group). At day 28, mice were anesthetized, respiratory mechanics were collected, and exhaled nitric oxide were analyzed. Afterwards, broncoalveolar lavage fluid was obtained and lungs were removed to perform histochemistry and immunohistochemistry stains. By morphometry, the number of neutrophils, TNFalfa, MMP-9, MMP-12, TIMP-1, iNOS, eNOS positive cells as well as the volume proportion of 8-iso-PGF2alfa, collagen and elastic fibers content in alveolar septum and airways walls were performed. In airways walls, we also analyzed the number of MUC-5 positive cells and the number of macrophages. Results: The proteinase inhibitor BbCI was able to reduce the pulmonary mechanical alterations (Ers, Htis and Raw), alveolar septum disruption (Lm) and the BAL cell count (total cells, macrophages and neutrophils) induced by elastase. Regarding the Tese de Doutorado Rafael Almeida-Reis inflammatory response, BbCI also reduced the number of neutrophils and TNFalfa positive cells in both alveolar septum and airway walls, and also reduced the number of macrophages in alveolar septum. Considering the extracellular matrix remodeling, the proteinase inhibitor attenuated the volume fraction of elastic and collagen fibers, MMP-9 and MMP-12 positive cells in both alveolar septum and airway walls. Regarding the oxidative stress response, BbCI reduced the volume fraction of isoprostane in airways and the number of iNOS positive cells in both airways walls and alveolar septum. Finally, BbCI reduced the number of MUC5ac positive cells in airway walls. Conclusions: The treatment with BbCI modulated lung mechanics and reduced inflammatory, remodeling and oxidative stress alterations induced by elastase. Although more studies need to be performed to elucidate the mechanisms involved in this process, but we may considerate BbCI as a potential therapeutic tool for COPD management