Chez les patients porteurs d'un cancer bronchique avancé non éligible à un traitement curatif, l'objectif du traitement n'est pas la guérison mais le soulagement des symptômes et l'amélioration de la survie. Le pronostic est lié aux caractéristiques du patient et de la tumeur, à la réponse tumorale après chimiothérapie et à la prise en charge globale décidée conjointement avec l'équipe médicale, le patient et son entourage. Il convient donc d'évaluer précocement ces facteurs pronostiques pour optimiser le rapport bénéfice-risque des traitements entrepris, dans le cadre des thérapeutiques anti-cancéreuses ou de façon plus globale.Dans le cadre de ce travail, des déterminants éthiques, cliniques et paracliniques de la prise en charge et du pronostic des patients porteurs d'un cancer bronchique localement avancé ou métastatique ont été recherchés. Dans une 1ère partie, les déterminants du pronostic de patients traités par chimiothérapie (étude « Pharmacogenoscan-poumon ») ont été étudiés : association entre le niveau d'expression de biomarqueurs tumoraux protéiques et la réponse à la chimiothérapie et intérêt de l'évaluation de la réponse tumorale selon les critères RECIST. Nous avons, dans une seconde partie, analysé les éléments influençant la prise en charge et le pronostic de patients porteurs d'un cancer bronchique développant une défaillance d'organe. Trois situations ont été décrites : celle de patients dès l'apparition de cette défaillance d'organe, celle de l'ensemble des patients porteurs d'un cancer bronchique admis en réanimation, et uniquement de ceux porteurs d'une mutation tumorale oncogénique. / In patients with advanced lung cancer non-eligible for curative treatment, the goal of care is not healing but improving symptoms and survival. The prognosis is related to patient and tumor characteristics, response to chemotherapy and its overall management decided jointly with the medical team, the patient and his family. It is therefore necessary to assess early these prognostic factors to optimize the risk-benefit ratio of treatment undertaken.As part of this work, ethical, clinical and laboratory determinants of management and prognosis of locally advanced or metastatic lung cancer patients were investigated. In the first part, the prognosis' determinants of patients treated with chemotherapy (« Pharmacogenoscan-poumon » study) were studied: association between the level of expression of protein biomarkers and tumor response to chemotherapy and assessment of interest of tumor response according to RECIST criteria. We have, in the second part, analyzed the factors influencing the management and prognosis of lung cancer patients developing organ failure. Three situations were described: patients at the time of the development of this organ failure, lung cancer patients admitted to intensive care units, the overall population and only those carrying an oncogenic mutation.

Depuis peu, l’immunothérapie a émergé comme une nouvelle stratégie chez les patients atteint de Cancer Bronchique Non à Petites Cellules (CBNPC), confirmant ainsi le rôle du système immunitaire dans cette maladie. Malgré ces nouveaux traitements (thérapies ciblées, immunothérapie), les taux de réponses restent faibles avec un impact modeste sur la survie globale. Des biomarqueurs sont donc nécessaire pour définir les populations cibles de ces traitements. Une des pistes explorées est le statut immunitaire des patients, en effet celui-ci a un impact pronostic et pourrait influencer la réponse aux traitements standards tels que la chimiothérapie, les thérapies ciblées et même l’immunothérapie. Parmi les cellules du système immunitaire, les cellules Natural Killer (NK) auraient un rôle effecteur dans le CBNPC. Il est maintenant clairement établit que les cellules NK favorisent la mise en place d’une immunité adaptative fonctionnelle et efficace. Ainsi une altération des fonctions NK pourrait être un mécanisme associé à l’échappement à l’immunité adaptative de la tumeur. Dans notre première étude, nous avons mis en évidence que les exosomes de cellules dendritiques stimulaient les cellules NK via NKp30, cette activité étant associée à un gain de survie sans progression chez des malades inopérables porteurs d’un CBNPC avancé. Notre second projet a révélé, pour la première fois, un rôle pronostic des transcrits de NCR3 (gène de NKp30) chez des patients naïfs de tout traitement. L’activation des cellules NK via NKp30 pourrait être une stratégie efficace d’immunomodulation chez les patients atteints de CBNPC avancé. Ces travaux confirment le rôle important des cellules NK dans le CBNPC avancé. / Recently, immunotherapy has emerged as a new strategy in Non-Small Cell Lung Cancer (NSCLC) patients, confirming the key role of the immune system in this disease. Despite these new treatments (targeted therapies, immunotherapy), response rates remain low with a modest impact on overall survival. Biomarkers are needed to define the target population of these treatments. One of the options explored is the immune status; indeed the immune status of cancer patients has a prognosis impact and may influence the response to standard treatments such as chemotherapy, targeted therapies and even immunotherapy. Among the immune cells, Natural Killer cells (NK) have an effector role in NSCLC. It is now established that NK cells can promote a functional and efficient adaptive immunity. Therefore, an impaired NK functions could be a mechanism associated with the escape from adaptive immunity of the tumor. In our first study, we demonstrated that exosomes from dendritic cells stimulated NK cells through NKp30, this activity is being associated with improved survival in advanced NSCLC. Our second project has revealed, for the first time, a independent prognostic role of NCR3 transcript (NKp30 gene) for naïve advanced NSCLC. Activation of NK cells via NKp30 could be an effective strategy for immunomodulation in advanced NSCLC patients. These studies confirm a major role of NK cells in advanced NSCLC.

Les résultats insuffisants de la radiochimiothérapie conventionnelle dans les cancers bronchiques non à petites cellules (CBNPC) ont motivé l’évaluation d’une nouvelle stratégie de modulation pharmacologique de la radiosensibilité tumorale basée sur les modifications épigénétiques. Pour cela nous avons évalué la combinaison de la radiothérapie et d’un nouvel pan-inhibiteur des histones déacétylases (HDACi), l’abexinostat en préclinique in vitro et in vivo sur deux modèles de CBNPC puis en phase clinique précoce chez l’homme dans le cadre d’un essai de phase I. Nous avons d’abord montré que l’abexinostat augmente la radiosensibilité des cellules de CBNPC de manière dépendante de la séquence thérapeutique en normoxie et en hypoxie en augmentant l’apoptose caspase dépendante ainsi que les cassures doubles brins radio-induites et en réduisant la signalisation et la réparation de ces dommages de l’ADN. L’abexinostat potentialise également le retard de croissance tumorale induit par la radiothérapie in vivo dans des xénogreffes sous-cutanées de CBNPC avec un profil de toxicité acceptable. Nous avons également montré pour la première fois que la triple combinaison de radiothérapie, abexinostat et cisplatine potentialise le retard de croissance tumorale in vivo.Les premiers résultats in vitro et in vivo confortant le rationnel pour la combinaison abexinostat-radiothérapie nous avons réalisé étude de phase I exploratoire d’escalade de dose combinant l’abexinostat à la radiothérapie palliative hypofractionnée standard délivrant 30y en 10 fractions pour des tumeurs solides métastatiques. Parmi les 58 patients traités, d’âge médian 61 ans (20-82), on note 71% de stade M1 et 88% de patients ayant déjà reçu des traitements préalables par chimiothérapie et/ou radiothérapie et/ou chirurgie. La dose recommandée pour un essai de phase 2 que nous avons établie est de 90mg/m². Sur les 51 patients évaluables, on observe un taux de réponse globale de 7,8% (1 réponse complète (RC) et 3 réponses partielles (RP)) et un taux de réponse locorégionale de 11,8% (1 RC et 5 RP) avec un suivi médian de 16 semaines. Les patients présentant des lésions (cibles ou non) cérébrales ont présenté des taux de réponse encourageant avec notamment un patient en RC. Nous avons retrouvé peu d’effets secondaires de grade ≥3, les plus fréquents étant la thrombopénie (17,2%), la lymphopénie (12,1%) et l’hypokaliémie (6,9%). Au total, 6 patients (10%) ont interrompu leur traitement du fait des effets secondaires. Nous n’avons pas observé de prolongation de l’intervalle QTc de grade ≥3 et il n’y a pas eu d’interruption de traitement en rapport avec cet effet secondaire. Dans l’ensemble nos données in vitro et in vivo montrent une potentialisation de l’effet antitumoral par la combinaison d’abexinostat et radiothérapie. Chez les patients présentant des tumeurs solides avancées l’abexinostat oral en combinaison à la radiothérapie est bien toléré. Cette combinaison pourrait avoir un potentiel particulièrement intéressant dans le traitement des métastases cérébrales.De plus nos travaux précliniques suggèrent pour la première fois un effet prometteur d’une triple combinaison avec HDACi, cisplatine et radiothérapie qui justifie de plus amples investigations et pourrait guider de nouvelles stratégies thérapeutiques dans les CBNPC.Nos travaux s’inscrivent dans une stratégie de recherche translationnelle et montrent l’importance de la recherche préclinique pour les études d’association aux rayonnements ionisants. Seuls un développement préclinique rationnel et un développement clinique méthodique permettront l’émergence de combinaisons modulant la radiosensibilité tumorale de manière suffisamment efficace pour modifier nos standards de traitement et améliorer le pronostic de nos patients. / Insufficient results of conventional chemoradiotherapy in non-small cell lung carcinomas (NSCLC) have encouraged assessment of new pharmacological strategies for modulation of radiosensitization based on epigenetic changes. We have investigated the combination of radiotherapy and a novel pan-histone deacetylase inhibitor (HDACi), abexinostat in vitro and in vivo in two NSCLC models and in an early phase clinical trial. Our findings demonstrate that abexinostat enhances radiosensitivity of NSCLC cells in a time dependent way in vitro in normoxia and hypoxia increasing radio-induced caspase dependent apoptosis and persistent DNA double strand breaks associated with decreased DNA damage signaling and repair. Interestingly, abexinostat potentiates tumor growth delay in vivo in combined modality treatments associating not only abexinostat and irradiation but also in the triplet combination of abexinostat, irradiation and cisplatin.We conducted an exploratory phase 1, dose-escalation study of abexinostat in combination with standard hypofractionated radiotherapy (30Gy in 10 fractions) in patients with advanced solid tumors treated in a palliative setting. Among 58 treated patients, the median age was 61.5 years (range, 20-82); 47% of the patients had M1 stage disease, and 95% had received previous chemotherapy alone or chemotherapy in combination with surgery and/or radiotherapy. The recommended phase 2 dose was determined to be 90 mg/m2. Of the 51 patients evaluable for response, best overall response was 8% (1 complete response [CR], 3 partial responses [PRs]), and best loco-regional response was 12% (1 CR and 5 PRs) at a median follow-up of 16 weeks. Of note, patients with target or non-target brain lesions showed encouraging responses, with 1 patient achieving a best loco-regional response of CR. Treatment-emergent grade ≥3 adverse events (AEs) were few, with most common being thrombocytopenia (17%), lymphopenia (12%), and hypokalemia (7%). Six patients (10%) discontinued treatment due to AEs. No grade ≥3 prolongation of the QTc interval was observed, with no treatment discontinuations due to this AE.Altogether, our data demonstrate in vitro and in vivo a potentiation of anti-tumor effect by abexinostat in combination with irradiation in NSCLC. Oral abexinostat combined with radiotherapy was well tolerated in patients with advanced solid tumors. The combination may have potential for treatment of patients with brain lesions.Moreover, our work suggest for the first time to our knowledge promising triple combination opportunities with HDACi, irradiation and cisplatin which deserves further investigations and could be of major interest in the treatment of NSCLC.Our studies which are part of a translational research strategy highlight the importance of preclinical investigations in the area of radiotherapy and drug combination research. Only rationale preclinical development and methodologically well conducted clinical development will allow new standards of treatment to emerge and improve patient’s prognostic.

Les cellules tumorales circulantes (CTC) représentent un large champ de recherche susceptible de fournir des informations tant cliniques que fondamentales. Les CTC proviennent de tumeurs primitives ou métastatiques et représentent une population hétérogène de cellules très rares dans le flux sanguin. Leur caractérisation moléculaire est un défi technologique qui requiert des méthodes très sensibles et spécifiques. Dans les cancers bronchiques non à petites cellules (CBNPC), les CTC ont un véritable intérêt car les biopsies tumorales ne permettent pas toujours de réaliser les analyses moléculaires nécessaires au choix du traitement. De plus, elles ne sont probablement pas représentatives de l’hétérogénéité tumorale.L’objectif de ma thèse a été de rechercher dans les CTC de patients atteints de CBNPC porteurs du remaniement de gène ALK, des anomalies génomiques connues pour être des biomarqueurs de sensibilité et de résistance aux thérapies ciblant cet oncogéne, ainsi qu’à caractériser les CTC porteuses de ces anomalies. La première partie du projet a consisté au développement d’une méthode d’hybridation in situ de l’ADN (fluorescent in situ hybridization, FISH) adaptée à un système d’enrichissement des CTC par filtration, la FA-FISH (filter adapted FISH) (brevet PCT/FR2011/052688). Nous avons ensuite développé une approche de microscopie semi-automatisée permettant la digitalisation et l’analyse de ces CTC enrichies par filtration (Pailler, BMC Cancer, 2016). Dans la seconde partie du projet, nous avons mis en œuvre cette méthode et montré pour la première fois qu’il est possible d’identifier le remaniement de gène ALK dans les CTC de patients porteurs de ce réarrangement dans la tumeur (Pailler, J Clin Oncol, 2013). Les CTC remaniées présentent un unique réarrangement de type break-apart, y compris chez des patients présentant exclusivement une autre forme de réarrangement dans la tumeur, et un phénotype mésenchymateux. Cette observation nous a amené à émettre l’hypothèse que ces CTC ont acquis des propriétés migratoires et d’invasivité, et pourraient résulter d’une forte sélection clonale. Nous avons ensuite étendu cette observation aux patients porteurs du remaniement ROS1 et rapporté pour la première fois la détection de ce remaniement dans des CTC (Pailler, Ann Oncol, 2015). Dans la troisième partie du projet, nous avons émis l’hypothèse que certaines sous-populations de CTC anormales pour le gène ALK, mesurées avant et à deux mois de traitement par le crizotinib, pourraient prédire l’évolution clinique des patients traités. Dans une cohorte élargie de patients, nous avons montré que l’évolution sous crizotinib du nombre de CTC présentant exclusivement des gains de copies natives du gène ALK est un biomarqueur « surrogate » d’efficacité du traitement pouvant permettre d’identifier les patients qui ont un risque élevé de progresser rapidement (Pailler, soumis). Finalement, dans la quatrième partie du projet, nous avons recherché dans des CTC des mutations de résistance aux inhibiteurs de ALK. Nous avons mis au point des technologies permettant de caractériser phénotypiquement, isoler et analyser moléculairement (séquençages ciblés et d’exomes) des CTC à l’échelle de cellule unique. Les expériences sur lignées cellulaires ont permis de valider les approches et les analyses d’échantillons de patients sont en cours.Dans ce travail, nous montrons qu’il est possible de caractériser des anomalies génomiques dans les CTC de patients porteurs du remaniement ALK à différentes étapes de leur maladie, et ainsi d’identifier des biomarqueurs de sensibilité et d’efficacité à une thérapie ciblée. Ce travail ouvre des perspectives sur la personnalisation des traitements qui pourraient reposer sur l’analyse génomique non invasive des CTC. Il apporte en outre des éléments nouveaux sur les caractéristiques biologiques des CTC chez ces patients, certaines étapes du processus métastatique et la diversité génomique de ces cancers. / Circulating tumor cells (CTCs) are a broad field of research which may provide both clinical and basic information. CTCs migrate from primitive or metastatic tumors and represent a heterogeneous population of very rare cells in the blood stream. The molecular characterization of CTCs is a technical challenge requiring highly sensitive and specific methods. Because tumor biopsies are invasive and in some cases associated with risk in non-small-cell lung cancer (NSCLC), CTCs may offer an attractive option to analyze tumor genomic alterations and detect molecular biomarkers. CTCs could provide a more comprehensive picture of the tumor content than single tumor biopsies.The aim of my thesis was to characterize genomic abnormalities in CTCs from ALK-rearranged NSCLC patients and identified biomarkers of sensitivity and resistance to targeted therapies. The first part of the project consisted in the development of a fluorescent in situ hybridization (FISH) method adapted to CTCs enriched by filtration, the FA-FISH (filter-adapted-FISH) (patent PCT/FR2011/052688). Then, we developed a method for the semi-automated microscopy of filtration enriched CTCs (Pailler, BMC Cancer, 2016). In the second part of my project, using this method, we provided the first proof-of-concept that ALK-rearrangement can be detected in CTCs of patients with ALK-rearranged NSCLC (Pailler, J Clin Oncol, 2013). We showed that CTCs from these patients harbor a unique ALK break-apart rearrangement, including patients presenting another form of rearrangement in the biopsy, and a mesenchymal phenotype. This suggests that these CTCs may arise from a clonal selection of tumor cells that have acquired invasive and migratory properties and possibly the potential to drive metastatic progression. Then, we characterized CTCs from patients with ROS1-rearranged NSCLC and reported for the first time the detection of ROS1-rearrangement in CTCs (Pailler, Ann Oncol, 2015). In the third part of the project, we evaluated whether CTCs with abnormal ALK-FISH patterns monitored under crizotinib (baseline and early sampling at 2 months) may inform on treatment benefit in a cohort of ALK-rearranged patients treated by crizotinib. In an extended cohort of patients, the dynamic change in the numbers of CTCs with a gain of ALK-native copies was associated with the progression-free survival and thus may be a surrogate biomarker for crizotinib efficacy (Pailler, submitted). These results show that the molecular analysis of CTCs performed under treatment could help to stratify patients at risk of early resistance to crizotinib. Finally, in the last part of my project, we sought to evaluate whether CTCs could be used for identifying resistance mutations to ALK inhibitors. We developed technologies to characterize, isolate and molecularly (targeted sequencing and exome sequencing) analyze CTCs at the single cell level. Experiments on cell lines allowed to validate these technical processes; Experiments on patient samples are ongoing.In this work, we characterize genomic abnormalities present in CTCs from ALK-rearranged patients at different stages of the disease and identify biomarkers of sensitivity and efficacy to targeted therapies. Our results provide new perspectives on the potential of CTCs for personalizing treatments in NSCLC patients. Furthermore, our findings may offer new insights on the biological characteristics of CTCs in ALK-rearranged patients, their overall role in the metastatic progression and the genomic diversity of these cancers.

Les inhibiteurs de tyrosine kinase (ITK) du récepteur à l’Epidermal Growth Factor (EGFR) constituent un nouveau traitement du cancer bronchique non à petites cellules (CBNPC), particulièrement efficace chez les patients porteurs d’une mutation d’EGFR (EGFR M+). Néanmoins, certains de ces patients peuvent avoir une résistance primaire à ces traitements, et les autres développent inéluctablement une rechute correspondant au phénomène de résistance acquise. L’objectif de ce travail était d’étudier les mécanismes de résistances primaire et acquise chez les patients avec CBNPC EGFR M+.Nous avons montré que le statut mutationnel de KRAS était le même dans la tumeur primitive et les métastases dans la majorité des cas de CBNPC. Dans quelques cas cependant, le statut différait entre tumeur primitive et métastase, ce qui soulève la question d’une dissociation de la réponse aux ITK, les mutations de KRAS étant associées à une résistance primaire au traitement.Nous avons par ailleurs mis en évidence la fréquente inactivation de la voie p53, soit par mutation de TP53 soit par diminution d’expression de p14arf, dans les tumeurs EGFR M+, qui pourrait être une des causes des variations de réponse aux ITK chez les patients EGFR M+. Enfin, nous avons montré que la résistance à deux ITK de nouvelle génération, PF299804 et WZ4002, passait par un phénomène en deux étapes impliquant d’une part l’activation de la voie IGF1R, via la diminution de l’expression d’IGFBP3, et d’autre part celle de la voie des MAP kinases. Ces travaux pourraient déboucher sur des stratégies thérapeutiques innovantes chez les patients présentant une résistance acquise aux ITK de nouvelle génération. / Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) Tyrosine Kinase Inhibitors (TKI) provide clinical efficacy in Non Small Cell Lung Cancer (NSCLC) patients, especially in the presence of an EGFR mutation. However, some EGFR mutated patients display primary resistance to EGFR TKI, and the others will ultimately develop acquired resistance. We focused our work on mechanisms of primary and acquired resistance in EGFR mutated NSCLC.We first showed that KRAS mutational status is the same in primary NSCLC and matched metastases in most of the cases. However, in some patients, we found a discordant KRAS status between primary tumors and metastases, which could translate into a discordant response to EGFR TKI, since KRAS mutations are associated with resistance to EGFR TKI.We also showed that EGFR mutated tumors are associated in most of the cases with an inactivation of the p53 pathway, either through a TP53 mutation or through loss of expression of p14arf, which could account for some of the variations observed in the response to TKI in EGFR mutated patients.Last, we showed that acquired resistance to two new generation EGFR TKI, PF299804 and WZ4002, occurred through a multistep process involving activation of the IGF1R pathway through downregulation of IGFBP3 and activation of the MAP kinase pathway. These results provide new insights into the treatment of NSCLC in EGFR mutated patients with acquired resistance to new generation TKI.

Excision Repair Cross-Complementation group 1 (ERCC1) est une enzyme de réparation de l’ADN fréquemment déficiente dans le cancer bronchique non-à-petites cellules. Bien qu’une expression faible d’ERCC1 soit prédictive de réponse aux sels de platine, l’efficacité des chimiothérapies à base de platine est limitée par leur toxicité et l’apparition de résistance, justifiant la nécessité de stratégies thérapeutiques alternatives. Par ailleurs, l’absence de test compagnon diagnostic permettant d’évaluer la fonctionnalité d’ERCC1 dans la pratique clinique empêche actuellement toute thérapie personnalisée basée sur le statut ERCC1.Afin d’identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les tumeurs ERCC1-déficientes en exploitant le concept de létalité synthétique, des screens à haut-débit , utilisant des composés pharmaceutiques ou par ARN interférence, ont été réalisés dans un modèle isogénique de CBNPC déficient en ERCC1. Cette approche a permis d’identifier plusieurs inhibiteurs de poly(ADP-ribose) polymerase 1 et 2 (PARP1/2), tels l’opalarib (AZD2281), le niraparib (MK-24827) et BMN 673 comme sélectifs pour les cellules ERCC1-déficientes. Les mécanismes sous-tendant cette sensibilité sélective ont été étudiés, et les résultats suivants ont été mis en évidence : (i) les cellules ERCC1-déficientes présentent un blocage prolongé en phase G2/M après exposition à l’olaparib ; (ii) l’isoforme 202 d’ERCC1, dont le rôle a été récemment mis en évidence dans la résistance aux sels de platine, module également la sensibilité aux inhibiteurs de PARP ; (iii) la déficience en ERCC1 est épistatique avec les défauts de recombinaison homologue (RH), malgré une capacité normale des cellules ERCC1-déficientes à former des foyers RAD51 ; ceci suggère qu’ERCC1 pourrait intervenir dans la réparation d’une lésion de l’ADN induite par l’inhibiteur de PARP1/2 en amont de l’invasion du brin d’ADN lors de la RH ; (iv) l’inhibition de l’expression de PARP1 par ARN interférence permet de restaurer la résistance aux inhibiteurs de PARP1/2, dans les cellules ERCC1-déficientes uniquement. Ces résultats suggèrent que les inhibiteurs de PARP1/2 pourraient représenter une nouvelle stratégie thérapeutique chez les patients dont la tumeur est déficiente en ERCC1 et un essai clinique va être mis en place pour évaluer cette hypothèse.Afin d’explorer la présence de biomarqueurs de la fonctionnalité d’ERCC1, quatre approches ont été entreprises en parallèle dans le modèle isogénique de CBNPC déficient en ERCC1: (i) irradiation aux UV, afin d’évaluer la voie NER (Nucleotide Excision Repair); (ii) séquençage d’exome, dans le but de rechercher une signature génomique (ADN) ; (iii) analyse du transcriptome cellulaire, pour identifier des modifications d’expression d’ARN ; et (iv) SILAC (Stable Isotope Labeling by Amino acids in Cell culture) afin de comparer le protéome des cellules ERCC1-déficientes et ERCC1-proficientes. Ces approches ont permis d’identifier une potentielle signature génomique, ainsi que de biomarqueurs d’activité – guanine deaminase (GDA) et nicotinamide phosphoribosyltransferase (NAMPT). De plus amples validations et investigations mécanistiques de ces observations préliminaires sont actuellement requises. / Excision Repair Cross-Complementation group 1 (ERCC1) is a DNA repair enzyme that is frequently deficient in non-small cell lung cancer (NSCLC). Although low ERCC1 expression correlates with platinum sensitivity, the clinical effectiveness of platinum therapy is limited - mainly by toxicities and occurrence of resistance - highlighting the need for alternative treatment strategies. In addition, the lack of a reliable assay evaluating ERCC1 functionality in the clinical setting currently precludes personalising therapy based on ERCC1 status. To discover new synthetic lethality-based therapeutic strategies for ERCC1-defective tumours, high-throughput drug and siRNA screens in an isogenic NSCLC model of ERCC1 deficiency were performed. This approach identified multiple clinical poly(ADP-ribose) polymerase 1 and 2 (PARP1/2) inhibitors such as olaparib (AZD-2281), niraparib (MK-4827) and BMN 673 as being selective for ERCC1 deficiency. The mechanism underlying ERCC1-selective effects was dissected by studying molecular biomarkers of tumour cell response, and revealed that: (i) ERCC1-deficient cells displayed a significant delay in double-strand break repair associated with a profound and prolonged G2/M arrest following PARP1/2 inhibitor treatment; (ii) ERCC1 isoform 202, which has recently been shown to mediate platinum sensitivity, also modulated PARP1/2 sensitivity; (iii) ERCC1-deficiency was epistatic with homologous recombination deficiency, although ERCC1-deficient cells did not display a defect in RAD51 foci formation. This suggests that ERCC1 might be required to process PARP1/2 inhibitor induced DNA lesions prior to DNA strand invasion; and (iv) PARP1 silencing restored PARP1/2 inhibitor resistance in ERCC1-deficient cells but had no effect in ERCC1-proficient cells, supporting the hypothesis that PARP1 might be required for the ERCC1 selectivity of PARP1/2 inhibitors. This study indicated that PARP1/2 inhibitors as a monotherapy could represent a novel therapeutic strategy for NSCLC patients with ERCC1-deficient tumours, and a clinical protocol is being written to evaluate this hypothesis.To investigate whether a surrogate biomarker of ERCC1 functionality could be developed, four parallel approaches were undertaken in the ERCC1-isogenic NSCLC model: (i) UV irradiation, to evaluate the Nucleotide Excision Repair (NER) pathway; (ii) whole exome sequencing, to look for an ERCC1-associated genomic scar at the DNA level; (iii) transcriptomic analysis, to investigate changes at the RNA expression level; and (iv) SILAC (Stable Isotope Labeling by Amino acids in Cell culture) analysis, to compare proteomic profiles between ERCC1-proficient and ERCC1-deficient cells. These approaches allowed the identification of putative genomic signature and potential metabolic surrogate biomarkers - guanine deaminase (GDA) and nicotinamide phosphoribosyltransferase (NAMPT). Further validation and mechanistic investigations of these latter preliminary observations are warranted.

Introduction : Le traitement des cancers bronchiques non à petites cellules (CBNPC) EGFR mutés repose sur les inhibiteurs de tyrosine kinase (ITK) du récepteur de l’Epidermal Growth Factor (EGFR). Cependant tous les patients traités par ITK EGFR finissent par présenter une progression tumorale, du fait de mécanismes de résistance comme l’amplification du gène codant pour le récepteur tyrosine kinase MET. Il n’existe actuellement aucune donnée sur les modifications phénotypiques induites par l’activation de MET dans ce contexte. L’objectif de cette thèse est de déterminer si l’amplification de MET, lors de la résistance aux ITK EGFR dans les CBNPC EGFR mutés, confère aux cellules tumorales un phénotype plus agressif et modifie l’histoire naturelle de la maladie.Méthodes : Les capacités de prolifération, de croissance sans ancrage, de formation de sphéroïdes, de résistance à l’anoïkis et de migration ont été étudiées in vitro dans la lignée HCC827, dérivée d’un CBNPC EGFR muté, et dans sa lignée fille HCC827-GR6 (GR6) devenue résistante aux ITK EGFR via une amplification du gène MET. L’expression de la vimentine, de ZEB1, et de la E-cadherine a également été étudiée dans les deux lignées cellulaires afin d’évaluer l’impact de l’amplification de MET sur la transition épithélio-mésenchymateuse (TEM). In vivo la croissance tumorale et le potentiel métastatique ont respectivement été analysés dans des modèles murins de xénogreffe ectopique et d’injection intracardiaque. Enfin les données cliniques de patients issus de 15 centres avec un CBNPC EGFR muté métastatique, présentant une forte surexpression de MET en immunohistochimie (score 3+) ou une amplification de MET en FISH sur une re-biopsie réalisée après la progression sous ITK EGFR ont été analysées rétrospectivement. Résultats : In vitro, l’amplification de MET induisait une augmentation significative de la prolifération, de la croissance sans ancrage, de la formation de sphéroïdes, de la résistance à l’anoïkis et de la migration. En présence d’un inhibiteur de MET, le PHA-665752, ces différentes propriétés biologiques étaient réduites de façon significative dans les cellules GR6 porteuses de l’amplification de MET. Il était également mis en évidence dans les cellules GR6 une augmentation de l’expression de la vimentine et de ZEB1. In vivo, l’amplification de MET augmentait significativement la croissance tumorale et le potentiel métastatique. Un traitement par crizotinib, ITK ciblant MET, diminuait de façon significative le potentiel métastatique des cellules porteuses de l’amplification de MET. Enfin les patients atteints d’un CBNPC EGFR muté, porteur d’une amplification de MET à la résistance à l’ITK EGFR, présentaient une durée jusqu’à apparition de nouvelles métastases plus courte après progression sous ITK EGFR que les patients avec une forte surexpression de MET sans amplification génique. Conclusion L’amplification de MET dans un contexte de résistance aux ITK EGFR est associée à un phénotype tumoral plus agressif. Ces résultats plaident en faveur d’une utilisation précoce d’inhibiteurs de MET en association avec les ITK EGFR afin d’éviter l’émergence d’un clone tumoral résistant plus agressif. / Introduction: Treatment of Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) mutated non-small cell lung cancers (NSCLC) relies on EGFR tyrosine kinase inhibitors (TKI). However, all patients treated with EGFR TKI eventually present tumor progression, due to mechanisms of resistance such as the MET amplification. There is currently no data on phenotypic changes induced by MET activation in this context. The objective of this thesis is to determine whether the MET amplification during EGFR TKI resistance in the EGFR mutated NSCLC induces a more aggressive phenotype in tumor cells and alters the natural history of the disease.Methods: Proliferation, anchorage independent growth, spheroid formation, anoïkis resistance and migration were studied in vitro in the HCC827 cell line, derived from an EGFR mutated NSCLC, and in its daughter cell line HCC827-GR6 (GR6) which became resistant to EGFR TKI through MET amplification. The expression of vimentin, ZEB1, and E-cadherin was evaluated in these cellular models in order to investigate an epithelial to mesenchymal transition (EMT) process induced by the MET amplification. In vivo, the tumor growth and the metastatic potential were analyzed by subcutaneous xenograft and intracardiac injection in mouse models. Finally, the clinical data of patients from 15 centers with a metastatic EGFR mutated NSCLC, exhibiting high MET overexpression in immunohistochemistry (score 3+) or MET amplification assessed by FISH on a re-biopsy performed after TKI EGFR progression were analyzed retrospectively.Results: In vitro, the MET amplification induced a significant increase in proliferation, anchorage independent growth, spheroid formation, anoïkis resistance and migration. Treatment with PHA-665752, a MET TKI, significantly reduced these biological properties in the GR6 cells harboring the MET amplification. An increase in the expression of vimentin and ZEB1 was also observed in the GR6 cells. In vivo, the MET amplification significantly increased the tumor growth and the metastatic potential. Treatment with crizotinib, another MET TKI, significantly decreased the metastatic potential of cells carrying MET amplification. Finally, patients with an EGFR mutated NSCLC, displayed a time to new metastases after TKI EGFR progression shorter than patients with high MET overexpression without MET amplification.Conclusion: The MET amplification during EGFR TKI resistance is associated in EGFR muted NSCLC with a more aggressive tumor phenotype. These results argue for the early use of MET inhibitors in combination with EGFR TKIs to avoid the emergence of a more aggressive resistant tumor clone.

Les revues systématiques sont des outils indispensables à la synthèse des connaissances en évaluation thérapeutique. Il est désormais fréquent que plusieurs traitements soient disponibles pour une même indication. L’objectif des patients et des cliniciens est alors de savoir quels sont, parmi l’ensemble des traitements disponibles, le(s) meilleur(s). Compte tenu de la nécessité de synthétiser les données disponibles pour tous les traitements et de maintenir cette synthèse à jour, notre objectif était d’évaluer les limites du système actuel de synthèse et de développer une méthodologie alternative. Nous avons d’abord évalué la capacité des revues systématiques à prendre en compte l’ensemble des preuves disponibles sur l’effet des multiples traitements. Nous avons utilisé l’exemple des traitements de deuxième ligne du cancer bronchique non à petites cellules métastatique non muté pour EGFR ou de statut inconnu. Nous avons montré que les 29 revues systématiques publiées jusque 2015 sur cette question, considérées collectivement, fournissaient une synthèse fragmentée et non à jour de la preuve disponible. Au moins 40% des 77 essais, des 45 traitements, des 54 comparaisons de traitements et des 28 636 patients n’étaient constamment pas pris en compte dans les revues systématiques. Nous avons discuté les raisons pour lesquelles le système de synthèse des données actuel ne permettait pas de couvrir l’ensemble des données disponibles. Nous avons ensuite développé une nouvelle forme de synthèse de la preuve disponible au cours du temps, la méta-analyse en réseau cumulative et dynamique. Elle consiste à passer d’une série de méta-analyses à une méta-analyse en réseau unique, incluant l’ensemble des traitements disponibles pour une indication donnée, avec une mise à jour du réseau d’essais et de la synthèse des données dès que les résultats d’un nouvel essai deviennent disponibles. Elle débute par une méta-analyse en réseau initiale suivie d’une succession de mises à jour répétées à intervalles réguliers. Nous avons décrit les étapes méthodologiques, et développé le protocole d’une étude de preuve de concept, appliquée aux traitements de deuxième ligne du cancer bronchique non à petites cellules. Enfin, nous avons réalisé la méta-analyse en réseau initiale sur ce même exemple. Nous avons inclus 98 essais randomisés évaluant 60 traitements chez 34 179 patients. Nous avons montré que les traitements par immunothérapie (nivolumab et pembrolizumab) avaient un effet sur la survie globale supérieur aux chimiothérapies et thérapeutiques ciblées actuellement recommandées (nivolumab versus docetaxel HR=0,68 (IC95% 0,55-0,83) ; versus pemetrexed HR=0,65 (0,5-0,83) ; versus erlotinib HR=0,66 (0,51-0,84) and versus gefitinib HR=0,65 (0,51-0,82)). Les résultats étaient similaires pour le pembrolizumab. Pour la survie sans progression, le nivolumab avait aussi un effet supérieur aux quatre traitements recommandés. La méta-analyse en réseau cumulative et dynamique pourrait devenir l’outil permettant de changer de paradigme dans la synthèse des connaissances afin d’améliorer la prise de décision médicale. / Systematic reviews are essential tools to synthesize available evidence for therapeutic evaluation. Multiple treatments are now frequently available for a given condition. Patients and physicians want to know which one is the best among all treatments. Thus we need to retrieve and synthesize all available evidence across all treatments and furthermore to maintain it updated when new evidence and new treatments become available. Our objective was to evaluate the limits of the current ecosystem of evidence synthesis and to develop an alternative methodology. We have first assessed the capacity of systematic reviews to cover all available evidence of multiple treatments. We took the example of second-line treatments of advanced non-small cell lung cancer with EGFR wild-type or unknown status. We have shown that the 29 systematic reviews published in this condition up to 2015, considered collectively, failed to provide a complete and updated synthesis of all available evidence. Almost 40% of the 77 trials, of the 45 treatments, of the 54 treatment comparisons and of the 28,636 patients were always missing from systematic reviews. We have discussed the reasons why the ecosystem of evidence synthesis fails to encompass all available evidence. We then developed a new paradigm to synthesize evidence over time called live cumulative network meta-analysis. This new concept consists in switching from a series of standard meta-analyses to a single network meta-analysis covering all treatments and systematically updated as soon as the results of a new trial become available. Live cumulative network meta-analysis is initiated with a network meta-analysis which is iteratively updated. We have described the methodological steps, developed the protocol of a proof-of-concept study applied to second-line treatments of advanced non-small cell lung cancer. Finally, we have performed the initial network meta-analysis in this condition. We have included 98 trials including 34,179 patients and assessing 60 treatments. We have shown that nivolumab was more effective in term of overall survival compared to docetaxel HR=0.68 (IC95% 0.55-0.83), to pemetrexed HR=0.65 (0.5-0.83), to erlotinib HR=0.66 (0.51-0.84) and to gefitinib HR=0.65 (0.51-0.82). Similar results were found with pembrolizumab. In progression free survival, nivolumab had a more important treatment effect compared to the four recommended treatments. Live cumulative network meta-analysis should become a paradigmatic shift for systematic reviews and meta-analysis in order to improve medical decision making.

Le cancer du poumon est la principale cause de décès par cancer chez les hommes et les femmes dans le monde. Malgré les avancées majeures dans les traitements, les thérapies à base de platine restent la thérapie standard pour les patients atteints du cancer du poumon induit par la mutation KRAS. Bien que les composés de platine aient un premier effet sur ces patients, l’apparition d’une rechute constitue le principal défi au niveau clinique.Dans ce contexte, notre projet actuel vise à caractériser l’activation de la voie Notch dans la réponse aux sels de platines d’adénocarcinomes mutés pour K-Ras ainsi que son rôle dans l’acquisition de la résistance à ce traitement. Nous avons mis en évidence que la voie Notch est activée en réponse à divers agents induisant des dommages à l’ADN dans des lignées de cancer du poumon. Nous avons montré que cette activation est dépendante de la voie de checkpoint de Réponse aux Dommages de l’ADN (DDR) via ATM, ATM qui est une des principales kinases de la réponse cellulaire aux lésions de l’ADN telles que les cassures double-brin, causé notamment par la chimiothérapie conventionnelle. Parmi les nombreux substrats d’ATM en réponse à ces dommages, nous montrons un effet direct de MDM2 dans l’activation de la voie Notch en réponse aux dommages à l’ADN causé par le carboplatine. Nos données montrent une nouvelle interaction entre ATM, MDM2 et Notch, lors du traitement au carboplatine, qui pourrait jouer un rôle dans la cascade de signalisation favorisant la survie des cellules tumorales pulmonaires.En utilisant des xénogreffes dérivées de patients atteints d’adénocarcinomes du poumon, ainsi qu’un modèle cellulaire de xénogreffe résistant à la carboplatine, nous avons montré que l’association d’inhibiteurs de Notch et de MDM2 associé au traitement au carboplatine ont un effet accru sur le ralentissement de la croissance de la tumeur et sur la survie, en comparaison avec le traitement actuel de référence que représente le carboplatine.Nos résultats offrent une nouvelle possibilité de thérapie pour les adénocarcinomes de poumons mutés pour KRAS, et pourrait donc répondre à un besoin clinique urgent notamment pour contrecarrer la résistance aux chimiothérapies conventionnelles à base de sels de platine. / Lung cancer is the leading cause of cancer death among men and women worldwide. Despite the major advances in the treatments, platinum-based therapy remains the standard of care for patients affected by KRAS-driven lung cancer. Even though the platinum-compounds display an initial effect on these patients, the onset of the relapse constitutes the main challenge for the clinic. The molecular mechanisms underlying lung adenocarcinoma (LUAD) relapse are not completely elucidated yet, thus it is fundamental to understand them in order to improve survival of patients. Our data show that upon carboplatin treatment, the Notch pathway is activated in vitro. Since this effect was common for several other DNA damage insults, our driving hypothesis connected the DNA Damage Response (DDR) to the activation of the Notch pathway. Our data demonstrates that protein kinase ataxia telangiectasia-mutated (ATM) is a key mediator in the activation of the Notch pathway during DNA damage signalling. ATM is well-known as the chief mobilizer of the cellular response to the most toxic lesions to the DNA, the double-strand breaks which are also the type of damage caused by the conventional chemotherapy. Among the several substrates of ATM in response to the damage, there is the mouse double minute 2 protein (MDM2) that it is known to interact with the Notch pathway. Our data uncovered a new pathway connecting ATM, MDM2 and NICD during carboplatin treatment in LUAD cells.Using LUAD Patient-Derived Xenografts and a new generated carboplatin resistant cellular model, we show in vivo that the combination of Notch and MDM2 inhibitors with carboplatin showed a therapeutic benefit in tumour growth and survival compared to the standard of care, i.e. carboplatin.Our results can offer a new therapeutic window for KRAS-driven LUAD that become resistant to platinum-based therapy, hence tackling an urgent and unmet clinical need.

Introduction Le cancer bronchique est un problème de santé publique en étant la première cause de décès par cancer dans le monde. Il reste de mauvais pronostic avec une résistance au Cisplatine qui est inéluctable dans l’histoire naturelle de la maladie. Nous nous sommes intéressés à l’association du CDDP aux inhibiteurs de la Poly(ADP-ribose) polymérase. Les inhibiteurs pharmacologiques de PARP sont source d’optimisme en oncologie clinique en monothérapie pour des tumeurs déficientes pour une voie de réparation de l’ADN et en association aux cytotoxiques classiques.Matériel et méthodes Nous avons généré 9 clones résistants au CDDP après culture de la lignée A549 dans des faibles doses de CDDP. Deux inhibiteurs pharmacologiques de PARP, CEP8983 (CEP) et PJ34 (PJ), ainsi que des siRNA spécifiques de PARP1 sont utilisés pour l’inhibition de PARP. L’apoptose est mesurée en cytométrie de flux par l’intermédiaire du potentiel membranaire de la mitochondrie DiOC6(3) et la perméabilisation de la membrane plasmique est évaluée par l’iodide de propidium. Le test de clonogénicité permet d’évaluer la capacité des cellules à échapper à la mort et à former une colonie. L’activité métabolique des cellules est mesurée par la mesure de clivage du sel de tetrazolium WST-1. L’immunofluorescence sur cellules fixées a permis d’étudier les dommages de l’ADN (γH2AX), la voie intrinsèque de l’apoptose (l’activation de la caspase 3 et la libération du cytochrome c) et la recombinaison homologue (BRCA1, RAD51). En Western Blot nous avons mesuré l’expression et l’activité de PARP (PAR) ainsi que l’expression d’acteurs de la réparation par excision de base (BER) (XRCC1 and polymérase β). Nous avons développé une méthode de détection de PAR en immunohistochimie sur des tissus inclus en paraffine. Résultats Nous avons trouvé un effet synergique pour l’association du CDDP aux inhibiteurs de PARP in vitro. De façon inattendue nous avons observé que les clones résistants au CDDP développent une addiction à PARP et sont spécifiquement tués par l’inhibition de PARP contrairement à la lignée parentale. Ces clones exhibent une hyperexpression et une hyperactivité de PARP. La réponse aux inhibiteurs de PARP corrèle plus précisément avec l’activation plutôt qu’avec l’expression de PARP, pointant que PAR est un biomarqueur plus précis que PARP. Nous avons observé que l’hyperactivation de PARP accompagne une résistance induite au CDDP et prédispose à une sensibilité aux inhibiteurs de PARP dans d’autres lignées de cancer bronchique (H460 et H1650), de mésothéliome (P31), de cancer de l’ovaire (TOV112D) et de col (HeLa). Dans des expériences in vivo nous avons noté que dans les xénogreffes obtenues à partir de clones résistants au CDDP, l’expression de PAR est stablement retrouvée en immunohistochimie. Ces tumeurs répondaient à l’inhibition de PARP par le PJ en diminuant l’expression de PAR. Les clones résistants au CDDP sensibilisés aux I PARP ont une recombinaison homologue conservée, cependant ont un déficit dans les étapes terminales du BER.Conclusion Nous avons identifié un effet synergique pour l’association des inhibiteurs de PARP au CDDP de des lignées de cancer bronchique. Nous avons observé une dépendance à PARP dans des lignées de cancer bronchique résistantes au CDDP et déficientes pour l’élongation du BER. Nous postulant que PAR est un biomarqueur spécifique de la réponse aux inhibiteurs de PARP. / Introduction Driven by the facts that non small cell lung cancer (NSCLC) is the leading cause of cancer-related morbidity and mortality worldwide and that NSCLC patients often develop resistance against Cisplatin (CDDP)-based therapies, we addressed the question of the combination therapy of CDDP with poly(ADP-ribose) polymerases (PARP) inhibitors. Inhibitors of PARP have raised great expectations for the treatment of a variety of cancers, either as monotherapeutic agent against DNA repair-deficient tumours or combined to DNA-damaging compounds.Material and methods We generated nine CDDP-resistant clones by prolonged exposure to low dose CDDP of the A549 NSCLC parental cell line. Two distinct PARP inhibitors, CEP8983 (CEP) and PJ34 (PJ) as well as PARP1 knockdown with small interfering RNAs (siRNAs) were used for PARP inhibition. Apoptosis was measured by the simultaneous assessment for the loss of the mitochondrial transmembrane potential (m) and the breakdown of the plasma membrane using the m-sensitive fluorochrome DiOC6(3) and the vital dye propidium iodide, respectively. Moreover clonogenic survival was assessed. In vitro assessments of the enzymatic activity of cells were based on the reduction of the colorless tetrazolium salt. Immunofluorescence microscopy determinations were performed with antibodies specific for DNA damage (γH2AX), intrinsic apoptosis (cleaved Caspase-3 and cytochrome c), and homologous recombination (RAD51 and BRCA1). Immunoblotting was assed for PARP1 expression and activity (PAR) and base excision repair (BER) effectors (XRCC1 and polymerase β). We developed an immunohistochemical staining method that specifically detects PAR on paraffin-embedded cell pellets and tissue sections.Results We found that PARP inhibitors and PARP1 siRNAs synergized with CDDP in the killing of NSCLC cells in vitro. Unexpectedly, CDDP-resistant NSCLC cell clones developed addiction to PARP hyperactivation, thereby becoming susceptible to apoptosis induction by PARP inhibition. We showed that these cisplatin-resistant clones, exhibited high PARP protein levels and increased PARP activity, leading to an increased poly-ADP ribosylation of cellular proteins, as compared to their parental, cisplatin-sensitive counterparts. These cisplatin-resistant cells become susceptible to cell death as induced by PARP inhibition, correlating with the hyperactivity of PARP (elevated PAR levels) more accuratly than with the overexpression of PARP. Suggesting that PAR levels may constitute a more accurate biomarker than PARP to predict the sensitivity of cells to PARP inhibition. We expanded the observation that cisplatin resistance causes PARP upregulation and hyperactivation and subsequent sensitization to PARP inhibition to additional five human cancer cell lines including two NSCLC (H1650 and H460), one mesothelioma (P31), one ovarian (TOV112D) and one cervical cancer (HeLa) cell line. To get further insight into this issue, we generated in vivo experiments. Tumors derived from CDDP-resistant cells were characterized by elevated levels of PAR suggesting that PAR levels are preserved during tumor formation. Those PAR-overexpressing tumors responded to the administration of PJ in vivo with a consistent reduction in PAR immunoreactivity. CDDP resistant clones that are specifically killed by PARP inhibitors assessed efficient homologous recombination repair however deficient BER elongation.Conclusion We showed a beneficial effect for the association therapy of PARP inhibitors with CDDP in several NSCLC cell lines. We have identified an addiction to PARP in CDDP resistant cell lines with deficient BER elongation. We postulate that PAR is a specific predictive biomarker for the response to PARP inhibitors.