La digestion enzymatique des protéines est une méthode de base pour les études protéomiques ainsi que pour le séquençage en mode « bottom-up ». Les enzymes sont ajoutées soit en solution (phase homogène), soit directement sur le gel polyacrylamide selon la méthode déjà utilisée pour l’isolation de la protéine. Les enzymes protéolytiques immobilisées, c’est-à-dire insolubles, offrent plusieurs avantages tels que la réutilisation de l’enzyme, un rapport élevé d’enzyme-sur-substrat, et une intégration facile avec les systèmes fluidiques. Dans cette étude, la chymotrypsine (CT) a été immobilisée par réticulation avec le glutaraldehyde (GA), ce qui crée des particules insolubles. L’efficacité d’immobilisation, déterminée par spectrophotométrie d’absorbance, était de 96% de la masse totale de la CT ajouté. Plusieurs différentes conditions d’immobilisation (i.e., réticulation) tels que la composition/pH du tampon et la masse de CT durant la réticulation ainsi que les différentes conditions d’entreposage tels que la température, durée et humidité pour les particules GA-CT ont été évaluées par comparaison des cartes peptidiques en électrophorèse capillaire (CE) des protéines standards digérées par les particules. Les particules de GA-CT ont été utilisés pour digérer la BSA comme exemple d’une protéine repliée large qui requit une dénaturation préalable à la digestion, et pour digérer la caséine marquée avec de l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC) comme exemple d’un substrat dérivé afin de vérifier l’activité enzymatique du GA-CT dans la présence des groupements fluorescents liés au substrat. La cartographie peptidique des digestions par les particules GA-CT a été réalisée par CE avec la détection par absorbance ultraviolet (UV) ou fluorescence induite par laser. La caséine-FITC a été, en effet, digérée par GA-CT au même degré que par la CT libre (i.e., soluble). Un microréacteur enzymatique (IMER) a été fabriqué par immobilisation de la CT dans un capillaire de silice fondu du diamètre interne de 250 µm prétraité avec du 3-aminopropyltriéthoxysilane afin de fonctionnaliser la paroi interne avec les groupements amines. Le GA a été réagit avec les groupements amine puis la CT a été immobilisée par réticulation avec le GA. Les IMERs à base de GA-CT étaient préparé à l’aide d’un système CE automatisé puis utilisé pour digérer la BSA, la myoglobine, un peptide ayant 9 résidus et un dipeptide comme exemples des substrats ayant taille large, moyenne et petite, respectivement. La comparaison des cartes peptidiques des digestats obtenues par CE-UV ou CE-spectrométrie de masse nous permettent d’étudier les conditions d’immobilisation en fonction de la composition et le pH du tampon et le temps de réaction de la réticulation. Une étude par microscopie de fluorescence, un outil utilisé pour examiner l’étendue et les endroits d’immobilisation GA-CT dans l’IMER, ont montré que l’immobilisation a eu lieu majoritairement sur la paroi et que la réticulation ne s’est étendue pas si loin au centre du capillaire qu’anticipée. / Digesting proteins using proteolytic enzymes is a standard method in proteomic studies and bottom-up protein sequencing. Enzymes can be added in solution or gel phase depending on how the protein has been isolated. Immobilized, i.e., insoluble, proteolytic enzymes offer several advantages such as reusability of enzyme, high enzyme-to-substrate ratio, and integration with fluidic systems. In this study, we prepared glutaraldehyde-crosslinked chymotrypsin (GA-CT), which creates insoluble particles. The immobilization efficiency was determined by absorbance spectrophotometry and found to be 96% of the total amount of chymotrypsin added. Different immobilization (i.e., crosslinking) conditions such as buffer composition/pH and initial mass of CT during crosslinking as well as different storage conditions such as temperature, time and humidity for the GA-CT particles were evaluated by comparing capillary electrophoretic (CE) peptide maps of protein standards digested with the particles. The GA-CT particles were used to digest BSA as an example of a large folded protein that needs denaturation prior to digestion, and casein-fluorescein isothiocyanate (FITC) as an example of a small, labeled substrate to test enzyme activity in the presence of substrate-bound fluorescent groups. Peptide mapping of digests from GA-CT particles was achieved by CE with ultraviolet (UV) absorbance or laser induced fluorescence (LIF) detection. FITC-labeled casein was digested by GA-CT to the same extent as with free (i.e., soluble) CT. An immobilized enzyme microreactor (IMER) was fabricated by immobilizing CT inside a 250 µm i.d. fused-silica capillary tube pre-treated with 3-aminopropyltriethoxysilane to functionalize the inner walls with amine groups. Glutaraldehyde was reacted with the amine groups and then CT was immobilized by crosslinking to the GA. IMERs based on GA-CT were fabricated using an automated CE system and used to digest BSA, myoglobin, a 9-residue peptide and a dipeptide as examples of large, medium and small substrates. Digests were studied by comparing peptide maps obtained by CE coupled to either UV or mass spectrometric (MS) detection in order to evaluate immobilization conditions as a function of buffer composition/pH and reaction times. A separate study, which used fluorescence microscopy to investigate the extent and location of GA-CT immobilization in the IMER, showed that immobilization only takes place primarily near the capillary walls and that crosslinking does not extend as far into the center of the IMER as had been expected.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Os relaxantes neuromusculares não despolarizantes são fármacos indispensáveis nos procedimentos cirúrgicos que requerem entubação endotraqueal, visto que diminuem o tônus muscular. Quimicamente são divididos em derivados isoquinolinicos e derivados de esteróides, esses últimos com maior aplicação clinica e comercialização no Brasil. Assim sendo, é importante a validação de métodos analíticos para o controle de qualidade com alternativas confiáveis que garantam sua eficácia e segurança. Os brometos de vecurônio, de pancurônio e de rocurônio são fármacos relaxantes neuromusculares não despolarizantes derivados de esteróides. As propriedades farmacológicas destes fármacos são significativamente diferentes entre si, porém, as propriedades químicas são bastante similares. Na presente pesquisa foram desenvolvidos e validados métodos analíticos de separação (cromatografia líquida de alta eficiência e eletroforese capilar) para cada fármaco. Estes métodos foram aplicados a medicamentos comercializados no Brasil. Para todos os métodos cromatográficos foi utilizada uma coluna amino devido a seu caráter polar. Em função da baixa absorção dos três fármacos na região ultravioleta, os métodos eletroforéticos foram aplicados com detecções indiretas utilizando substâncias cromóforas. Comparando-se as técnicas utilizadas para determinação dos fármacos nos medicamentos isoladamente, não houve diferença significativa com nível de confiança de 95,0%. Nos testes de hipótese aplicados (F-Snedecor e t-Student), não foram observadas diferenças na precisão (variâncias) e no valor encontrado dos fármacos contidos nas amostras estudadas (comparação de duas médias). / The non-depolarizing neuromuscular relaxant drugs are essential in surgical procedures requiring endotracheal intubation, as they decrease muscle tonics. These drugs are chemically divided in isoquinolines derivatives and steroid derivatives, this latter group, with greater clinical application and commercialization in Brazil. Therefore, the study and validation of analytical methods are important for quality control with reliable alternatives to ensure their effectiveness and safety. The vecuronium, pancuronium and rocuronium bromides are steroid derivatives presenting non-depolarizing neuromuscular relaxant action. Pharmacological properties of these drugs differ significantly, however, its chemical properties are quite similar. In this research, analytical separation methods (high performance liquid chromatography and capillary electrophoresis), for each drug, were developed and fully validated. The methods were applied to pharmaceutical formulations commercialized in Brazil. For all chromatographic methods, an amino column was used, due to its polar characteristics. Due to the low absorption of the three drugs in the ultraviolet region, electrophoretic methods has been applied with indirect detection using chromophoric substances. When comparing both techniques used for quantitative determination of these drugs in pharmaceutical products, no significant difference was observed using a confidence level of 95.0%. By applying hypothesis tests (F-Snedecor and t-Student), it was not observed difference in precision (variance) and in the found amount of drugs contained in the selected samples (comparison of two means).

O diabetes mellitus (DM) é uma síndrome na qual o metabolismo de hidratos de carbono, gorduras e proteínas está alterado, por falta de secreção de insulina ou por diminuição da sensibilidade tissular a este hormônio. O DM pode ser do tipo I, também denominado diabetes mellitus insulinodependente (DMID), caracterizado pela falta de secreção da insulina, e do tipo II, também denominado diabetes mellitus não insulinodependente (DMNID), caracterizado pela menor sensibilidade dos tecidos efetores às ações metabólicas da insulina. Embora ainda não haja cura definitiva, há vários tratamentos disponíveis que proporcionam qualidade de vida para o paciente portador, como a administração de hipoglicemiantes orais. Nesta pesquisa, objetivou-se desenvolver métodos indicativos de estabilidade para a glibenclamida e o cloridrato de metformina. Assim, foram desenvolvidos métodos de rastreamento ortogonais utilizando a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) e a eletroforese capilar (CE), metodologias que foram desafiadas com os estudos da degradação forçada. Realizou-se, também, a identificação do principal produto de degradação da glibenclamida utilizando a cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massa (LC-MS). O método por HPLC teve o melhor desempenho no monitoramento dos produtos de degradação da glibenclamida, apresentando boa linearidade nas concentrações entre 0,210 e 0,360 mg/mL; com coeficiente de correlação maior de 0,99. A precisão calculada como desvio padrão relativo (DPR) foi menor de 3%, exatidão do método comprovada mediante teste de recuperação, obtendo-se valores de 100±3,0%. No teste de especificidade, foram detectados três potenciais produtos de degradação, com os seguintes tempos de retenção relativos (TRR) de 0,33; 0,46 e 0,83. O método CZE teve o melhor desempenho no monitoramento dos produtos de degradação do cloridrato de metformina, apresentando boa linearidade nas concentrações entre 0,210 e 0,360 mg/mL, com coeficiente de correlação maior de 0,99. A precisão, calculada como DPR, foi menor do que 5%, exatidão do método comprovada mediante o teste de recuperação, obtendo-se valores de 100±3,5%. No teste de especificidade, foram detectados cinco potenciais produtos de degradação com os seguintes TRRs de 0,90; 1,14; 1,35; 1,45 e 1,56. / Diabetes mellitus (DM) is a syndrome which alters the metabolism of carbohydrates, fats and proteins by lack of insulin secretion or a decrease in tissue sensitivity to insulin. Type 1 DM is also known as insulin-dependent diabetes mellitus is characterized by lack of insulin secretion. The second type of diabetes known as Type II, also called non-insulin dependent, is characterized by the reduced sensitivity of target tissues to the metabolic actions of insulin. Although there is no definitive cure, there are several treatments available that provide quality of life for the patient how treatment with oral hypoglycemic agents. This study had as objective to developed stability-indicating methods for glibenclamide and metformin hydrochloride. Thus, the techniques used in this study involved high performance liquid chromatography (HPLC) and capillary electrophoresis (CE), and both were challenged with forced degradation studies. The identification of degradation products of glibenclamide was also performed, utilizing the mass spectrometry (MS) technique. However, the HPLC technique had the best performance for monitoring the degradation products of glibenclamide, which showed a good linearity in concentrations between 0.210 - 0.360 mg/ml, with a correlation coefficient greater than 0.99. The precision was calculated as a relative standard deviation (RSD) which was less than 3%; the accuracy of the method calculated as the percent recovery was obtained with the following values: 100 ± 3.0%. On the specificity were detected three potential products of degradation utilizing forced degradation, with the following relative retention times (RRT) 0.33, 0.46 and 0.83. The CZE method had the best performance to monitoring the degradation products of metformin hydrochloride, which showed good linearity of concentrations between 0.210 and 0.360 mg/ml, with a correlation coefficient greater than 0.99. The intra-day and inter-day precision calculated as DPR was less than 5%, and an accuracy of this method was achieved using the values of 100 ± 3.5%. In the specificity were five potential degradation products were detected with the following TRRS: 0.90, 1.14, 1.35, 1.45 and 1.56.

Os diuréticos aumentam o fluxo urinário e a excreção de sódio e são utilizados para ajustar o volume e/ou a composição dos líquidos corporais em uma variedade de situações clínicas. A furosemida é um agente diurético potente que induz uma poderosa diurese. É utilizada no tratamento de edema associado com o coração e doenças renais. Nesta pesquisa objetivou-se desenvolver métodos indicativos de estabilidade para a furosemida, por eletroforese capilar em solução livre (FSCE) e cromatografia liquida de alta eficiência (CLAE). O método por FSCE utilizou um capilar de sílica fundida com comprimento total de 30,2 cm x 50,0 µm d.i. O tampão utilizado foi tetraborato de sódio 2,0 mmol L-1 e 10% de metanol, injeção hidrodinâmica 0,5 psi/5s, tensão aplicada +25 kV, detecção em 273 nm e temperatura a 25ºC. O tempo de migração da furosemida foi de 1,8 minutos. O método obteve boa linearidade no intervalo de 70,0 a 130,0 µg.mL-1 com coeficiente de correlação maior de 0,99. Os limites de detecção e de quantificação foram 6,2 µg.mL-1 e 20,6 µg.mL-1, respectivamente. A precisão do sistema foi inferior a 2,0%. A repetibilidade e precisão intermediária foram inferiores a 5,0%. A recuperação média foi de 102,1 %. No teste de especificidade, foram detectados três potenciais produtos de degradação com os seguintes tempos de retenção 1,3 2,0 e 2,2 min. O método por CLAE utilizou uma coluna Shim-pack CLC-ODS(M)® (250mm x4.6mm, 5µm). A fase móvel era constituída de acetonitrila:água (50:50) com 0,1% de ácido fórmico. O fluxo foi de 1.0 mL min-1 e detecção em 273 nm e temperatura a 30 ± 1 ºC. O método apresentou boa linearidade nas concentrações entre 7,0 e 13 µg.mL-1; com coeficiente de correlação maior de 0,99. E tempo de retenção para furosemida foi de 4,9 minutos. Os limites de detecção e de quantificação foram 0,6 µg.mL-1 e 1,9 µg.mL-1, respectivamente. A precisão do sistema foi inferior a 1,0%. A repetibilidade e precisão intermediária foram inferiores a 3,0%. A recuperação média foi de 105,1 %. No teste de especificidade, foram detectados três potenciais produtos de degradação com os seguintes tempos de retenção 2,4, 3,1 e 3,8 min. / Diuretics increase urine flow and sodium excretion and are used to adjust volume and / or composition of body fluids in a variety of clinical situations. Furosemide is a potent diuretic agent that induces a strong diuresis. It is used in the treatment of edema associated with heart and kidney disease. This research aimed to develop stability indicative methods for furosemide, by capillary electrophoresis in free solution (FSCE) and high-performance liquid chromatography (HPLC). The method FSCE used a fused silica capillary with a total length of 30.2 cm x 50.0 um di The buffer used was sodium tetraborate 2.0 mmol L-1 and 10% methanol, hydrodynamic injection 0.5 psi / 5s, +25 kV applied voltage, detection at 273 nm and 25 °C. The furosemide migration time was 1.8 minutes. The method achieved good linearity in the range of 70.0 to 130.0 µg.mL-1 with correlation coefficient higher of 0.99. The limits of detection and quantification were 6.2 and 20.6 µg.mL-1 µg.mL-1, respectively. The system accuracy was less than 2.0%. The repeatability and intermediate precision were less than 5.0%. The average recovery was 102.1%. The specificity test detected three potential degradation products with the following retention times 1.3, 2.0 and 2.2 min. The HPLC method used a Shim-pack CLC-ODS (M)® column (250mm x 4.6mm, 5µm). The mobile phase consisted of acetonitrile: water (50:50) with 0.1% formic acid. The flow rate was 1.0 mL min-1, detection at 273 nm and temperature at 30 ± 1°C. The method showed good linearity in concentrations between 7.0 and 13.0 µg.mL-1; with correlation coefficient higher of 0.99. Retention time for furosemide was 4.9 minutes. The limits of detection and quantification were 0.6 µg.mL-1 and 1.9 µg.mL-1, respectively. The system accuracy was less than 1.0%. The repeatability and intermediate precision were less than 3.0%. The average recovery was 105.1%. The specificity test detected three potential degradation products of the following retention times of 2.4, 3.1 and 3.8 min.

A esquistossomose ou bilharziose, é uma doença produzida por trematódeos do gênero Schistosoma. Dentre as 19 espécies reconhecidas, cinco infectam primariamente o homem: S. mansoni, S. haematobium, S. intercalatum, S. japonicum e S. Mekongi.O número de pessoas com infecção esquistossomótica, em todo o mundo, foi estimado em 200 milhões sendo sua maioria na Ásia e África. Na América do Sul e Caribe encontram-se vários milhões de casos sendo uma estimativa de mais de seis milhões de casos no Brasil. Os fármacos utilizados para o tratamento desta enfermidade são o praziquantel e o oxamniquina, sendo este último o princípio ativo do produto Mansil® cápsulas produzido pela indústria farmacêutica Pfizer. O presente trabalho teve como objetivo desenvolver e validar métodos analíticos por eletroforese capilar (CE) e por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), rápidos, seletivos e confiáveis para a determinação de oxamniquina em formulações farmacêuticas e de sua impureza (uk-3883), quando houver. A separação cromatográfica foi realizada usando a coluna Thermo® Nucleosil C18 (150 mm x 4,6 mm x 5 &#181;m), com fase móvel constituída por água acidificada com 0,1% ácido ortofosfórico:metanol (40:60 v/v), trabalhando com vazão de 1,0 mL min-1 e volume de injeção de 2 &#181;L. A temperatura da coluna foi controlada em 20 ºC e a detecção foi realizada na região do UV em 254 nm. O tempo de retenção da oxamniquina foi de 1,9 min e da uk-3883 5,1 min. O método por eletroforese capilar de zona (CZE) foi desenvolvido utilizando capilar de sílica fundida de 20 cm (comprimento efetivo) x 50 &#181;m d.i. e eletrólito constituído da solução tampão fosfato de sódio monobásico 30 mmol L-1, pH 2,5 ajustado com ácido orto-fosfórico 10%: metanol 18% v/v. Injeção hidrodinâmica 0,5 psi/3 s; voltagem aplicada de +25 kV, temperatura de 20 ºC e detecção no UV de 254 nm. Os métodos analíticos foram validados de acordo com os requerimentos vigentes da ANVISA, ICH e Farmacopéia Americana. Portanto, os métodos propostos demonstraram linearidade (R2>0,99), precisão (%DPR < 2%), exatidão (>98%, expressado em porcentagem de recuperação) e adequabilidade para a quantificação da oxamniquina em formas farmacêuticas comerciais. / Schistosomiasis or bilharzia, is a disease caused by trematodes of the gender Schistosoma. Among the 19 recognized species, five primarily infect humans: S. mansoni, S. haematobium, S. intercalatum, S. japonicum and S. mekongi. The number of people with schistosomiasis infection worldwide was estimated at 200 million being mostly living in Asia and Africa. In South America and the Caribbean are several million of cases and in Brazil it is stimated of more than six million of cases. The drugs used for the treatment of this disease is praziquantel and oxamniquine, the latter being the active principle of the Mansil® capsules produced by Pfizer pharmaceutical industry. This study aimed to develop and validate fast, selective and reliable analytical methods through capillary electrophoresis (CE) and high-performance liquid chromatography (HPLC), for the determination of oxamniquine in pharmaceutical formulations and its impurity (UK-3883) if any. The chromatographic separation was performed using a Thermo® Nucleosil C18 column (150 mm x 4.6 mm x 5 &#181;m) the mobile phase was composed of water with 0.1% orthophosphoric acid: methanol (40:60 v/v); the flow rate was 1.0 ml min-1. The column temperature was controlled at 20 ° C and the detection was performed with UV detector at 254 nm. The retention time for oxamniquine and its impurity (uk-3883) were 1.9 and 5.1 minutes, respectively. The capillary zone electrophoresis method was developed using an uncoated fused-silica capillary of 20 cm effective length x 50 &#181;m i.d. the electrolyte was composed of 30 mmol L-1 sodium phosphate monobasic buffer solution, pH 2.5 adjusted with ortho-phosphoric acid 10%: 18% methanol v(/v). Samples were injected hydrodynamically at 0.3 psi for 3 s, the detection was made by UV absorption at 254 nm, the capillary temperature was 20ºC and the applied voltage was +25 kV. Analytical methods were validated in accordance with the ANVISA, ICH and United States Pharmacopoeia guidelines. Therefore, the porposed methods showed linearity (R2>0,99), precision (%RSD <2%), accuracy (>98%, expressed as recovery percentage) and suitability for the quantification of oxamniquine in commercial dosage forms.

A presente tese de doutorado propõe investigar mapas peptídicos urinários via eletroforese capilar acoplada ao espectrômetro de massas e avaliar se existe correlação entre estes e a presença de refluxo vésico-ureteral (RVU), visando desenvolver um novo método não invasivo para diagnosticar RVU em crianças, e ainda averiguar a existência de possíveis biomarcadores para a doença. Vinte e quatro amostras de urina de crianças positivas para RVU e quinze saudáveis, anteriormente submetidas à uretrocistografia miccional, foram disponibilizadas ao nosso grupo. Estas foram filtradas para eliminar proteínas de alta massa molar e pré-concentradas em coluna de fase reversa C2. Os mapas peptídicos foram obtidos via CE-MS em um eletrólito composto por 0,8% de ácido metanóico e 20% de metanol; já o líquido auxiliar consistia em 0,8% de ácido metanóico e 60% de metanol. Diversos métodos de classificação de aglomerados foram experimentados com os mapas peptídicos. Todos indicaram que as variáveis mais importantes para este discernimento eram os picos mais intensos ordenados em blocos de tempo. Entre os métodos de classificação não supervisionada, PCA (Principal Component Analysis) foi o mais perceptível na tarefa de distribuir os conjuntos de amostras. Para este, a porcentagem de acertos entre as amostras positivas foi de 75% e, entre as amostras negativas foi de 86,7%. No entanto, a taxa de erro encontrada por este método foi de 20,5%, não cumprindo o objetivo proposto. Entre os métodos de classificação supervisionada, SVM (Support Vector Machines) foi o selecionado, exprimindo melhor habilidade em prever que os modelos lineares e boa capacidade de generalização. O método otimizado apontou para o uso da função de base radial, o que está de acordo com outros trabalhos na área. Outras três variáveis ajustadas foram o parâmetro capacidade, o responsável por controlar a amplitude da função gaussiana e o &#949;-insensitive loss function. A validação cruzada LOO (leave-one-out) realizada para a rede treinada pelo SVM exibiu 0,00454 para a raiz quadrada da média dos erros e coeficiente de correlação próximo de um, indicando que o ajuste dos dados foi bem realizado. Empregando um mínimo de 80% das amostras para treinamento e 10% para verificação, o modelo foi capaz de classificar corretamente as amostras restantes. Três grupos de amostras para testes foram separados e a rede foi capaz de classificá-los corretamente. Biomarcadores específicos para RVU foram pesquisados durante o trabalho. Peptídeos que apareceram em mais de 70% das amostras de urina positivas para RVU e em menos de 15% das amostras de urina saudáveis foram selecionados. Espectros MS2 foram obtidos para estes peptídeos, e a pesquisa em bancos de espectros indicou um fragmento da imunoglobulina G como um possível candidato. No entanto, a existência de um biomarcador específico para RVU é ainda incerta, carecendo de uma investigação mais aprofundada para se concretizar este objetivo. Nos mapas peptídicos existem disparidades entre os dois grupos de amostras, que foram correlacionadas nesta tese com a presença de refluxo vésico-ureteral, sendo o nosso espaço amostral classificado corretamente / The present doctorate thesis intends to investigate urinary peptides maps by capillary electrophoresis coupled with mass spectrometry (CE-MS) to evaluate whether there is a correlation between these maps and vesicoureteral reflux (VUR) pathology, with the purpose of developing a new non invasive method for RVU diagnosis in children, and to investigate possible biomarkers for the illness. Twenty four urine samples of positive children for RVU and fifteen healthy children samples, previously submitted to the miccional cystourethrography, were available. Samples were filtered to eliminate proteins of high molar mass and preconcentrated in reversed-phase C2 columns. Peptide enriched samples were submitted to analysis by CE-MS in an electrolyte consisted of 0.8% formic acid and 20% methanol; sheath liquid was composed of 0.8% formic acid and 60% methanol. Diverse cluster analysis techniques were attempted to classify the peptide maps. The most important variables for screening were the most intense peaks organized by blocks of time. Among the non supervised methods, PCA (Principal Component Analysis) performed best in the task of discriminating the sample sets. For PCA, 75% of positive samples and 86.7% of negative samples were correctly assigned. However, the error found for this method was 20.5%, not fulfilling the purpose. Among the supervised methods, SVM (Support Vector Machines) performed best, exhibiting better prediction ability than the linear models and good generalization. The optimized method used a radial basis function, which is in agreement with literature. Three other variables were adjusted: the capacity parameter, responsible for controlling the Gaussian function amplitude and the e- insensitive loss function. The LOO (leave-one-out) cross-validation for the training set showed 0.005011 for the root-mean-square error (RMS) and a coefficient of correlation close to one, indicating good fitting and consistency. With a minimum of 80% samples for training and 10% for verification, the model was capable to classify correctly the remaining samples. Three sample groups for tests had been separated and the net was capable to classify them correctly. Specific biomarkers for VUR were searched. Peptides that appeared in more than 70% of positive urine samples for VUR and less than 15% of negative samples were selected. MS2 spectra were acquired for these peptides and database search pointed to an IgG fragment as a possible candidate biomarker. However, the existence of a specific biomarker for VUR is not conclusive with the present data and a more thorough investigation must be pursued. Nevertheless, the peptidic maps inspected in this work carried enough information that allowed discrimination of two sample sets, one of them correctly associated with VUR

O clopidogrel é um fármaco antiplaquetário, pertencente à classe das tienopiridinas. A literatura relata poucos trabalhos para a determinação deste fármaco em preparações farmacêuticas. Este trabalho teve como objetivos desenvolver métodos para a análise quali e quantitativa do bissulfato de clopidogrel, bem como, avaliar de forma preliminar a estabilidade da substância. A caracterização da substância química de referência (SQR) foi realizada por Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC), Espectrofotometria Infravermelho, e Espectroscopia de RMN 13C e 1H. Os métodos desenvolvidos para a identificação do clopidogrel nos comprimidos revestidos foram a Cromatografia em Camada Delgada (CCD), Espectrofotometria Ultravioleta (UV), CLAE e Eletroforese Capilar (EC). Para a quantificação do clopidogrel nos comprimidos revestidos foram validados os métodos de UV, CLAE e EC de acordo com os parâmetros preconizados pelas Guias Oficiais. Todos os métodos atenderam aos requisitos de validação avaliados, sendo, portanto, adequados para a determinação do clopidogrel em comprimidos revestidos. Os estudos de degradação forçada demonstraram que a substância sofre degradação em condições alcalinas e quando exposta à luz ultravioleta a 254 nm. Na determinação da cinética de degradação foi possível verificar que o clopidogrel, em solução ácida, quando exposto à luz ultravioleta, apresenta T90% de 12,25 min, e possui cinética de reação de segunda ordem. / Clopidogrel is an antiplatelet drug that belongs to the class of thienopyridines. There are few reports in the literature about the determination of this drug in formulations. The aim of this work was to develop methods for qualitative and quantitative analysis of clopidogrel hydrogensulphate, and a preliminary evaluation of the stability of the substance. The characterization of the reference standard was made by Infrared Spectroscopy, Differential Scanning Calorimetry and 13C and 1H Nuclear Magnetic Resonance. The developed methods for the identification of clopidogrel in coated tablets were Thin-layer Chromatography, Ultraviolet Spectrophotometry, HPLC and Capillary Electrophoresis. For the quantification of clopidogrel UV Spectrophotometry, HPLC and Capillary Electrophoresis methods were validated according to the parameters of the Official Guidelines. All the methods attended to the validation specifications, and so they are adequate to the determination of clopidogrel in coated tablets. Accelerated degradation studies demonstrated that the drug suffers degradation in alkaline conditions and when exposed at UV light at 254 nm. In the study of degradation kinetics it was possible to verify that clopidogrel, in acid solution, exposed to UV radiation, presents T90% of 12.25 minutes and has a second order degradation kinetics.

O cloridrato de raloxifeno é um fármaco utilizado para o tratamento e prevenção da osteoporose em mulheres na pós-menopausa e foi aprovado pelo FDA para prevenção de câncer de mama invasivo. Pertence à classe de moduladores seletivos de receptor estrogênico. Foi desenvolvido pela Ely Lilly Company e é comercializado como Evista® na forma de comprimidos na dosagem de 60mg. Devido à importância do fármaco e interesse do Instituto Nacional de Ciências e Tecnologia – Inovações Farmacêuticas no desenvolvimento métodos de síntese e de controle de qualidade, o presente trabalho teve como objetivo o desenvolvimento de métodos analíticos para assegurar a qualidade tanto da matéria-prima quanto do produto acabado. A matéria-prima foi analisada quanto às suas características físico-químicas através da determinação da solubilidade, do ponto de fusão e da calorimetria exploratória diferencial. A caracterização e identificação da matéria-prima foram realizadas identificando grupos característicos como o cloreto e grupo fenol e também por espectrofotometria na região do infravermelho e do ultravioleta e por cromatografia líquida de alta eficiência. A forma farmacêutica comprimidos também foi caracterizada e identificada através dos mesmos métodos que a matéria-prima e adicionalmente através de cromatografia em camada delgada e eletroforese capilar. Os métodos desenvolvidos e validados para quantificação da matéria-prima foram volumetria em meio não-aquoso e cromatografia líquida. Para os comprimidos, foram desenvolvidos métodos por espectrofotometria na região do ultravioleta, cromatografia líquida e eletroforese capilar. Os resultados de todos os métodos foram analisados estatisticamente para verificar equivalência nas determinações. / Raloxifene hydrochloride is used for the treatment and prevention of osteoporosis in post-menopausal women. It was approved by FDA for the prevention of invasive breast cancer. It was developed by Ely Lilly Company and marketed as Evista® in form of tablets of 60mg. Due to the importance of this substance and the interest of INCT-IF in its synthesis and quality control, the present work developed analytical methods to assure the quality of the raw substance and the pharmaceutical form. Qualitative and quantitative methods were developed for the analysis of raloxifene hydrochloride as raw substance and tablets. The raw substance was characterized by its physical and chemical characteristics by solubility, melting point and differencial scaning calorimetry. It was also identified by the analysis of characteristic groups such as chloride and phenol, and by infrared and ultraviolet spectrophotometry; also by high performance liquid chromatography. The tablets were also characterized and identified by the same methods as for the raw substance, but in addition by thin layer chromatography and capillary electrophoresis. The developed and validated methods for the assay of the raw substance were: non-aqueous titration and liquid chromatography. For the tablets, the assays were: ultraviolet spectrophotometry, liquid chromatography and capillary electrophoresis. The results of all methods were analyzed statistically to verify the equivalence of the determinations.

A presente tese de doutorado propõe investigar mapas peptídicos urinários via eletroforese capilar acoplada ao espectrômetro de massas e avaliar se existe correlação entre estes e a presença de refluxo vésico-ureteral (RVU), visando desenvolver um novo método não invasivo para diagnosticar RVU em crianças, e ainda averiguar a existência de possíveis biomarcadores para a doença. Vinte e quatro amostras de urina de crianças positivas para RVU e quinze saudáveis, anteriormente submetidas à uretrocistografia miccional, foram disponibilizadas ao nosso grupo. Estas foram filtradas para eliminar proteínas de alta massa molar e pré-concentradas em coluna de fase reversa C2. Os mapas peptídicos foram obtidos via CE-MS em um eletrólito composto por 0,8% de ácido metanóico e 20% de metanol; já o líquido auxiliar consistia em 0,8% de ácido metanóico e 60% de metanol. Diversos métodos de classificação de aglomerados foram experimentados com os mapas peptídicos. Todos indicaram que as variáveis mais importantes para este discernimento eram os picos mais intensos ordenados em blocos de tempo. Entre os métodos de classificação não supervisionada, PCA (Principal Component Analysis) foi o mais perceptível na tarefa de distribuir os conjuntos de amostras. Para este, a porcentagem de acertos entre as amostras positivas foi de 75% e, entre as amostras negativas foi de 86,7%. No entanto, a taxa de erro encontrada por este método foi de 20,5%, não cumprindo o objetivo proposto. Entre os métodos de classificação supervisionada, SVM (Support Vector Machines) foi o selecionado, exprimindo melhor habilidade em prever que os modelos lineares e boa capacidade de generalização. O método otimizado apontou para o uso da função de base radial, o que está de acordo com outros trabalhos na área. Outras três variáveis ajustadas foram o parâmetro capacidade, o responsável por controlar a amplitude da função gaussiana e o &#949;-insensitive loss function. A validação cruzada LOO (leave-one-out) realizada para a rede treinada pelo SVM exibiu 0,00454 para a raiz quadrada da média dos erros e coeficiente de correlação próximo de um, indicando que o ajuste dos dados foi bem realizado. Empregando um mínimo de 80% das amostras para treinamento e 10% para verificação, o modelo foi capaz de classificar corretamente as amostras restantes. Três grupos de amostras para testes foram separados e a rede foi capaz de classificá-los corretamente. Biomarcadores específicos para RVU foram pesquisados durante o trabalho. Peptídeos que apareceram em mais de 70% das amostras de urina positivas para RVU e em menos de 15% das amostras de urina saudáveis foram selecionados. Espectros MS2 foram obtidos para estes peptídeos, e a pesquisa em bancos de espectros indicou um fragmento da imunoglobulina G como um possível candidato. No entanto, a existência de um biomarcador específico para RVU é ainda incerta, carecendo de uma investigação mais aprofundada para se concretizar este objetivo. Nos mapas peptídicos existem disparidades entre os dois grupos de amostras, que foram correlacionadas nesta tese com a presença de refluxo vésico-ureteral, sendo o nosso espaço amostral classificado corretamente / The present doctorate thesis intends to investigate urinary peptides maps by capillary electrophoresis coupled with mass spectrometry (CE-MS) to evaluate whether there is a correlation between these maps and vesicoureteral reflux (VUR) pathology, with the purpose of developing a new non invasive method for RVU diagnosis in children, and to investigate possible biomarkers for the illness. Twenty four urine samples of positive children for RVU and fifteen healthy children samples, previously submitted to the miccional cystourethrography, were available. Samples were filtered to eliminate proteins of high molar mass and preconcentrated in reversed-phase C2 columns. Peptide enriched samples were submitted to analysis by CE-MS in an electrolyte consisted of 0.8% formic acid and 20% methanol; sheath liquid was composed of 0.8% formic acid and 60% methanol. Diverse cluster analysis techniques were attempted to classify the peptide maps. The most important variables for screening were the most intense peaks organized by blocks of time. Among the non supervised methods, PCA (Principal Component Analysis) performed best in the task of discriminating the sample sets. For PCA, 75% of positive samples and 86.7% of negative samples were correctly assigned. However, the error found for this method was 20.5%, not fulfilling the purpose. Among the supervised methods, SVM (Support Vector Machines) performed best, exhibiting better prediction ability than the linear models and good generalization. The optimized method used a radial basis function, which is in agreement with literature. Three other variables were adjusted: the capacity parameter, responsible for controlling the Gaussian function amplitude and the e- insensitive loss function. The LOO (leave-one-out) cross-validation for the training set showed 0.005011 for the root-mean-square error (RMS) and a coefficient of correlation close to one, indicating good fitting and consistency. With a minimum of 80% samples for training and 10% for verification, the model was capable to classify correctly the remaining samples. Three sample groups for tests had been separated and the net was capable to classify them correctly. Specific biomarkers for VUR were searched. Peptides that appeared in more than 70% of positive urine samples for VUR and less than 15% of negative samples were selected. MS2 spectra were acquired for these peptides and database search pointed to an IgG fragment as a possible candidate biomarker. However, the existence of a specific biomarker for VUR is not conclusive with the present data and a more thorough investigation must be pursued. Nevertheless, the peptidic maps inspected in this work carried enough information that allowed discrimination of two sample sets, one of them correctly associated with VUR