A expressão do PIF/DCD em tumores tem sido relacionada ao crescimento e resistência à morte celular e à indução de caquexia em camundongos. O objetivo deste estudo foi investigar o papel do PIF/DCD nestes processos. Foram construídos três PIF/DCD-RNAi chamados de IBC-I, II, III e pKLO (controle), compreendendo diferentes áreas do mRNA, geramos clones celulares PIF/DCD-RNAi e comparamos a expressão do mRNA por RT-PCR em tempo real. Depois, foi avaliado o crescimento e formação de colônias dos clones RNAi in vitro e a progressão tumoral in vivo em camundongo Nude. Os RNAi IBC-I, II e III reduziram a expressão em 93,25% dos transcritos do PIF/DCD, alem de reduzir em 61,7% a capacidade de formação de colônias em comparação ao controle (p<0.001). Nos experimentos in vivo, os camundongos 2 meses do grupo pKLO tiveram um retardo no desenvolvimento muscular. O grupo pKLO de 8 meses apresentou uma redução de 35% do seu peso. Ambos mostraram diminuição da massa muscular (p<0,05). Estes resultados confirmam o papel do PIF/DCD na progressão tumoral. / The PIF/DCD expression in tumors has been related to the growth and resistance to cellular death and induction of cachexia in mice. The aim of this study was to investigate the role of PIF/DCD in these processes. It was designed three PIF/DCD-RNAi named IBC-I, II and III and one control pKLO, comprising different areas of the mRNA. Next, it was generated PIF/DCD-RNAi cell clones and compared mRNA expression by RT-PCR real time. After that, we evaluated the growth and colony formation ability of RNAi clones in vitro and in vivo tumorogenicity in Nude mice. The IBC-I, II and III RNAi reduced in 93,25% the expression of transcripts for PIF/DCD. There was also a significant reduction (61,7%) in the colony formation compared to the control (p<0.001). In the in vivo experiments, the 2-month-old mice in the pKLO group had muscular development retardation. The 8-month-old pKLO group presented a 35% reduction on its weight. Both groups had shown muscular mass reduction (p<0,05). These results confirm the role of PIF/DCD in the tumoral progression.

Submitted by (edna.saturno@ufrpe.br) on 2016-11-07T13:13:48Z No. of bitstreams: 1 Telga Lucena Alves Craveiro de Almeida.pdf: 3518080 bytes, checksum: d86396180de9528316281e363f148f12 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-11-07T13:13:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Telga Lucena Alves Craveiro de Almeida.pdf: 3518080 bytes, checksum: d86396180de9528316281e363f148f12 (MD5) Previous issue date: 2012-02-07 / Glutamine (GLN) is produced in different tissues through the enzime glutamine synthetase (GS). Muscular tissue, due to its extensiveness, is the largest producer of this amino acid, followed by lungs, liver and placenta. Enterocytes and immune system cells are the largest consumers. During severe infections and diseases that produce catabolism, there is an elevated breakdown of GLN, which can be compensated, up to a certain point, by an increase in GS expression. To better a understanding of GLN metabolism in dogs, whether healthy or not, we envisioned this experiment which had the objective of determining the [GLN] and other blood metabolites associated with protein metabolism in healthy dogs, blood donors, with cancer or with severe diseases. Blood samples were collected from 133 animals, divided into four groups: healthy, with cancer, severe infectious disease, and blood donors. [Glutamine], [Glutamate], [Urea], [Creatinine], [Total Plasma Protein] (TPP), [Glucose], [Fibrinogen] and hematocrit were determined in each sample. The body score index (BSI) was also determined. The results were analyzed using ANOVA, with a significance level of P<0,05, and Tukey's test with post hoc, with P<0,05. The results indicate thAT was no statistical difference in BSI between the group with cancer and the healthy group (P<0,05), but there was a difference when these were compared to the blood donor and infectious disease groups (P>0,05), where the latter had lower IEC. [GLN] and [GLN+GLU] were significantly lower than in the healthy animals (P<0,05), where the groups with cancer, infectious diseases and blood donors had a reduction of ~82%, ~73% e ~88%, respectively in their [GLN]. We observed a significant elevation in [Creatinine] in the blood donors and infectious diseases groups when compared to the healthy animals (P<0,05). There were no differences in [Urea], [Fibrinogen] and [Glucose] between groups (P>0,05). The [TPP] had higher values in the group with cancer (P<0,05) and the hematocrit in the group with blood donors (P<0,05). We conclude that, in the groups with sick animals and blood donors, there is an elevated degradation of GLN, which might compromise its availability for the consumer tissues during the evolution of an illness, which in turn could make for a difficult recovery. Establishing a hygienic and dietary management through GLN supplementation can be an important nutritional support for sick animals or blood donors. / A glutamina (GLN) é produzida por diferentes tecidos através da enzima glutamina sintetase (GS), sendo que o tecido muscular, devido à sua extensão, é o maior produtor desse aminoácido, seguido pelos pulmões, fígado, e placenta. Os enterócitos e as células do sistema imune são os maiores consumidores. Durante as infecções graves e enfermidades que produzam catabolismo há uma degradação elevada da GLN que pode ser compensada, até determinado ponto, pelo aumento da expressão da GS. Para se compreender melhor o metabolismo da GLN nos caninos, sadios ou não, foi desenvolvido um experimento que objetivou determinar a [GLN] e outros metabólitos sanguíneos associados ao metabolismo das proteínas em caninos sadios, doadores e não doadores de sangue, naqueles com câncer ou outras enfermidades graves. Foram colhidas amostras de sangue de cento e trinta e três (133) animais, divididos em quatro grupos: sadios, com câncer, doença infecciosa grave, e doadores de sangue. Nas amostras de sangue determinaram-se [Glutamina], [Glutamato], [Uréia], [Creatinina], [Proteína plasmática total] (PPT), [Glicose], [Fibrinogênio] e hematócrito. Também foi determinado o índice de escore corporal (IEC). Os resultados foram analisados pelo ANOVA, com significância de 5%, e pelo teste de Tukey com pos hoc, com P<0,05. Os resultados indicaram que não houve diferença estatística entre o IEC no grupo com câncer quando comparado ao grupo dos sadios (P>0,05), mas houve diferença quando estes foram comparados aos grupos doadores de sangue e os com doenças infecciosas (P<0,05), sendo que estes últimos apresentavam IEC mais baixos. As [GLN] e [GLN+GLU] foram significativamente mais baixas que nos animais sadios (P<0,05), sendo que o grupo com câncer, grupo com doenças infecciosas graves e o grupo de doadores apresentaram reduções de aproximadamente 73%, 88% e 82%, respectivamente, na [GLN]. Observou-se uma elevação significativa na [Creatinina] nos grupos doadores e com doenças infecciosas graves quando comparados aos animais sadios (P<0,05). Não ocorreram diferenças nas [Ureia], [Fibrinogênio] e [Glicose] entre os grupos (P>0,05). A [PPT] foi mais elevada no grupo com câncer (P<0,05) e o hematócrito no grupo doadores (P<0,05). Conclui-se, então, que nos grupos de animais enfermos e doadores de sangue, a degradação da GLN é elevada, o que pode comprometer a disponibilidade desse nutriente para os tecidos consumidores durante a evolução das enfermidades e pode dificultar a recuperação. O estabelecimento de um tratamento higiênico-dietético com a suplementação de GLN poderá ser um importante suporte nutricional para os enfermos ou doadores de sangue.

Orientador: Maria Cristina Gomes Marcondes / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-06T10:54:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Salomao_EmilianneMiguel_M.pdf: 747643 bytes, checksum: a4d8091683306c9beadb732986faade9 (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo : A intensa mobilização de substratos dos tecidos da carcaça do hospedeiro, em função do crescimento neoplásico, promove no organismo o estado caracterizado como caquexia. Presente na maioria dos pacientes com câncer, a caquexia promove intensa perda involuntária de peso decorrente, preferencialmente, da depleção da proteína muscular em função do aumento da degradação e/ou da diminuição da síntese protéica, culminando na redução da qualidade e expectativa de vida. Trabalhos têm mostrado que o desenvolvimento do câncer dá-se de forma mais agressiva e severa quanto mais jovem for o paciente. Considerando-se que: a) os aminoácidos de cadeia ramificada, principalmente a leucina, participam ativamente na sinalização celular, estimulando a síntese como também inibindo a degradação protéica; b) a glutamina, aminoácido não essencial, participa indiretamente no aumento da síntese protéica muscular esquelética, como também da diminuição do catabolismo protéico; c) o exercício físico exerce grande estimulação da síntese protéica; temos por principal interesse, neste trabalho, minimizar as alterações metabólicas do tecido hospedeiro frente ao crescimento neoplásico. Assim, associando-se a suplementação nutricional de leucina e/ou glutamina e exercício físico aeróbio, de intensidade leve a moderada, ao crescimento do carcinossarcoma de Walker 256, avaliamos a composição corpórea, o metabolismo protéico do músculo gastrocnêmio, o estresse oxidativo e o perfil sérico (proteína, albumina, globulina, glicose, lípedes totais, colesterol total, colesterol HDL, triacilgliceróis e lactato) em ratos Wistar em pleno desenvolvimento corporal. Nossa tentativa foi, com a suplementação nutricional aliada ao exercício, prevenir ou atenuar o estado caquético do animal conseqüente a evolução tumoral. Os resultados mostraram que os grupos inoculados com tumor apresentaram redução do peso corpóreo e da ingestão alimentar no final dos experimentos. Verificamos alterações na composição corpórea química, tais como, elevado teor de água corpórea, redução do teor de gordura total e diminuição do nitrogênio colageno da carcaça nos ratos implantados com tumor de Walker 256. Houve, ainda, diminuição da síntese e aumento da degradação no músculo gastrocnêmio nos animais implantados com tumor. Além disso, observou-se aumento do conteúdo de malondialdeído (MDA), em relação ao conteúdo de antioxidantes como GST, nos músculos gastrocnêmio e cardíaco indicando aumento do estresse oxidativo associado à evolução tumoral. Observamos também, redução dos teores séricos de proteína, albumina, glicose, colesterol e HDL nesses animais portadores de tumor. A associação suplementação nutricional/exercício promoveu melhora no estado caquético dos animais, visto que provocou: ligeira melhora da eficiência alimentar; preservação de proteína total da carcaça, manutenção da incorporação de fenilalanina e menor degradação da proteína muscular no grupo suplementado com leucina, além de preservar a proteína total sérica, manutenção da glicemia, colesterol total sérico e reduzir o lactato sérico, principalmente no grupo suplementado com leucina. Esses dados sugerem que o efeito benéfico da associação entre suplementação nutricional e exercício ao crescimento neoplásico foi pouco pronunciado, provavelmente, ao fato do crescimento acelerado do tumor superar as adaptações ao programa de treinamento físico / Abstract: The intense nutrients mobilisation of the host carcass tissue, in function of the neoplastic growth, leads to the host cachexia. Present in most of the patients with cancer, the cachexia is the state characterized by the involuntary weight loss that overtakes the protein muscle depletion increasing the degradation and/or decreasing the protein synthesis process in the muscle. In these cases, there is reduction of the quality and the life expectancy. On the other hand, some studies have shown that the development of the cancer is more aggressive and severe in younger patients. The branched-chain amino acids (BCAA), especially leucine, actively participate on cell signalling, stimulating the synthesis as well as inhibiting the protein degradation. The glutamine, a non essential amino acid, indirectly activates the muscle protein synthesis, as well as inhibits the protein catabolism. Additionally, the physical exercise stimulates the protein synthesis. Knowing these facts, our main interests, were to minimize the metabolic alterations in tumor-bearing host. The nutritional supplementation of leucine and/or glutamine and moderate aerobic exercise associated to the Walker 256 tumor growth could avoid the muscular depletion, preserve the protein body mass and the energetic source, possibly preventing the cachetic state of the animal. For this purpose, we evaluated the body chemical composition, the protein metabolism, measuring the muscle protein synthesis and catabolism, as well as the oxidative stress and biochemical blood profile in young tumor-bearing rats. The results showed reduced body weight and food intake in tumorbearing rats. The tumor effects changed the chemical body composition, showing high body water content, reduced total body fat and low carcass nitrogen in Walker tumor bearing rats. Protein synthesis was reduced and proteolysis was increased in young tumor-bearing rats. Additionally, the malondyhaldeide content increased in skeletal and cardiac muscle suggesting high oxidative stress associated to the tumor development. We observed low blood protein, albumin, globulin, glucose and cholesterol in tumor-bearing rats. The improvement of the cachexia was less pronounced in tumor-bearing animal which received supplemented diet associated to physical exercise. In these groups, we verified that food efficiency was slightly increased in comparison to the non-exercised tumour-bearing group. The carcass protein was maintained as well as the phenylalanine incorporation in muscle and less tyrosine was released from skeletal muscle when tumour-bearing groups were fed leucine rich diet. In these groups, the total blood protein, glycemia, total blood cholesterol and reduced blood lactate were preserved, mainly in exercised group. Those data suggest that the beneficial effect of the association among amino acids rich diet, exercise and tumor growth was not so expressive, probably due to the exponential tumor growth overcame the physical training program / Mestrado / Fisiologia / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Maria Cristina Gomes Marcondes / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-16T01:32:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Salomao_EmilianneMiguel_D.pdf: 2085353 bytes, checksum: b304c86280f34965140b320d344cce46 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: A intensa mobilização de substratos dos tecidos da carcaça do hospedeiro, em função do crescimento neoplásico, promove no organismo o estado caracterizado como caquexia. Presente na maioria dos pacientes com câncer, a caquexia promove intensa perda involuntária de peso decorrente, preferencialmente, da depleção da proteína muscular em função do aumento da degradação e/ou da diminuição da síntese protéica, culminando na redução da qualidade e expectativa de vida. Sabendo-se que a leucina (BCAA) é utilizada como fonte energética pelo músculo esquelético, podendo ser transaminada e oxidada para produzir acetil-CoA, caracterizada, também, como precursora da gliconeogênese, a partir da sua degradação e formação de alanina no músculo e age, principalmente, como sinalizadora celular e que o exercício físico promove aumento do consumo de glicose, diminuindo assim os níveis de glicose e insulina circulantes, conseqüentemente, reduzindo a oferta desse substrato às células tumorais. Temos por principal interesse minimizar as alterações metabólicas do tecido hospedeiro frente ao crescimento do carcinossarcoma de Walker associado ao exercício físico aeróbio de intensidade leve a moderada e suplementação nutricional de leucina, avaliando o metabolismo protéico, através de analise do processo de síntese e catabolismo protéico, e o metabolismo glicídico, analisando-se a via glicolítica e receptor de glicose muscular, bem como a concentração sérica de citocinas, em ratos Wistar. Desse modo nossos resultados verificamos: 1) Diminuição do ganho de peso corpóreo após o implante tumoral. 2) Diminuição da síntese e aumento da degradação protéica muscular acompanhada com menor conteúdo de proteína e expressão de miosina. 3) Consequente, aumento da expressão das subunidades ubiquitina-proteossomo. 4) Aumento das citocinas pró-inflamatórias. 5) Redução da concentração sérica de glicose, insulina e aumento de glucagon. 6) Redução da expressão gênica do transportador de glicose muscular, Glut-4. 7) Diminuição do diâmetro da fibra muscular esquelética. Já a suplementação nutricional com leucina e/ou exercício físico, a longo prazo, promove nos animais com tumor: 1) Melhora no ganho de peso corpóreo, com redução do peso tumoral em alguns grupos. 2) Diminui a degradação muscular esquelética, associada a maior expressão de miosina muscular. 3) Melhora a concentração de citocinas próinflamatórias. 4) Melhora a expressão gênica de transportador de glicose muscular, Glut- 4. 5) Melhora, também, o diâmetro da fibra muscular / Abstract: The intense nutrients mobilization of host tissues, due to neoplastic growth, leads to host cachexia state. Most cancer patients have cachexia, which is characterized by involuntary weight loss through increase in protein muscle depletion and decrease in protein synthesis process. In these cases, there is reduction in quality and life expectancy. Leucine (BCAA) is used as an energy source by skeletal muscle, precursor of gluconeogenesis or acts as cell signaling and physical exercise promotes increased consumption of glucose, reducing the levels of circulating glucose and insulin, providing less supply of substrate to tumour. In this work, our main interests were to minimize the metabolic alterations in tumor-bearing host associated with nutritional supplementation of leucine and moderate aerobic exercise during Walker 256 tumour growth and whether this association could avoid or protect muscular depletion, analyzing protein metabolism through protein synthesis and catabolism process, and muscle carbohydrate metabolism through analysis of glucose metabolism, by evaluating glycolytic pathway and muscle glucose receptor in rats. Thus our results found: 1) Decrease in body weight gain after tumor implantation. 2) Decreased synthesis and increased muscle protein degradation accompanied with lower protein content and expression of myosin. 3) Accordingly, increased expression of ubiquitin-subunits proteosome. 4) Increase of pro-inflammatory cytokines. 5) Reduction of serum glucose, insulin and glucagon increase. 6) Reduction of gene expression of muscle glucose transporter, Glut-4. 7) Decrease in diameter of skeletal muscle fibers. Since dietary supplementation with leucine and / or exercise in the long run, promote the animals with tumor: 1) Improvement in body weight gain, reducing the tumor burden in some groups. 2) Decrease in skeletal muscle degradation, associated with increased expression of muscle myosin. 3) Improve the concentration of pro-inflammatory cytokines. 4) Improve the gene expression of muscle glucose transporter, Glut-4. 5) It also improves the diameter of muscle fiber / Doutorado / Fisiologia / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Introdução: O câncer da confluência biliopancreática tem alta letalidade e prognóstico reservado, atribuído à associação da agressividade biológica e ao quadro clínico silencioso. A inflamação tem papel fundamental no desenvolvimento e na progressão da caquexia, induzida pela expressão de citocinas produzidas pelo tumor e/ou liberadas pelo sistema imunológico. Nos últimos anos, tem sido documentada a variabilidade na expressão gênica de citocinas que regulam os mecanismos envolvidos na caquexia neoplásica. Objetivos: Em amostras de sangue periférico de pacientes com neoplasia da confluência biliopancreática, avaliar a concentração da interleucina 6 (IL-6), fator de necrose tumoral alfa (TNF-?), interferon-gama (INF- ?) e interleucina 10 (IL-10), além da expressão gênica dessas citocinas, do receptor tipo 1 do fator de necrose tumoral (TNFR1), do receptor tipo 2 do fator de necrose tumoral (TNFR2), da zinco-alfa2-glicoproteina (ZAG) e do receptor ativado por proliferador de peroxissoma gama (PPAR-?). Além disso, o estudo visou identificar possíveis diferenças nos dados avaliados entre os pacientes classificados de acordo com a presença ou não de caquexia neoplásica. Casuística: O estudo transversal foi conduzido com 17 pacientes adultos de ambos os gêneros em pré-operatório imediato de neoplasia da confluência biliopancreática (Grupo Câncer), além de 15 indivíduos controles em pré-operatório de herniorrafia (Grupo Controle). Os pacientes com neoplasia foram classificados de acordo com a presença de caquexia (Subgrupo Caquexia, n=8) e aqueles sem diagnóstico de caquexia (Subgrupo Semcaquexia, n=9). Métodos: A ingestão alimentar e a composição corporal foram avaliadas em todos os voluntários. O questionário de fadiga foi aplicado nos indivíduos com neoplasia. O diagnóstico de caquexia foi feito a partir de critérios pré-estabelecidos. As citocinas inflamatórias IL-6, TNF-?, INF-? e IL-10 foram dosadas no sangue periférico. A expressão gênica dessas citocinas inflamatórias, dos receptores de TNF-?, da ZAG e do PPAR-? foi feita em sangue total. A análise estatística foi realizada com o auxílio de software Statistica, versão 8.0®. Resultados: Não houve diferença na ingestão energética [1827 (1489-2166) vs 1691 (1380-2003) kcal, p=0,56] e proteica [91,6 (74-109) vs 101 (89-114) g, p=0,30] dos indivíduos com câncer ou controles, exceto pela maior ingestão de lipídeos [69,0 (53,5-84,5) vs 42,7 (33,4-52,1) g, p=0,01] e menor consumo de vitamina A [382 (152-612) vs 1346 (1032-1659) ?g, p=0,001] no Grupo Câncer em relação ao Grupo Controle, respectivamente. Houve perda de peso em relação ao habitual em 15 dos 17 pacientes (13,1 ? 11,0%) antes do procedimento cirúrgico, embora as variáveis de composição corporal estivessem semelhantes entre os dois grupos de estudo. Os pacientes com neoplasia apresentavam menores concentrações plasmáticas de albumina [3,8 (3,5-4,0) vs 4,4 (4,3-4,5) g/dL, p<0,001], transferrina [166 (140-192) vs 241 (212-270) mg, p=0,001], ferro [80,8 (67,7-93,9) vs 107 (82-131) ?g/dL, p=0,003], zinco [79,9 (66-93,7) vs 97,4 (88-107) ?g%, p=0,001] e vitamina A [0,7 (0,6-0,8) vs 1,3 (1,0-1,5) umol/L, p<0,001], além de maiores níveis de glicemia [115 (118-193) vs 98,6 (82-115) mg/dL, p=0,003], proteína C reativa [2,7 (0,9-4,5) vs 0,2 (0,2-3,3) mg/dL, p<0,001], ferritina [985 (347-1623) vs 170 (85-255) ng/dL, p=0,003] e cobre [147 (122-177) vs 107 (92-121) ?g%, p=0,03] em relação aos controles, respectivamente. A concentração sérica das citocinas IL-6 [7,2 (4,2-10,1) vs 2,0 (1,4-2,5) pg/mL, p<0,001], TNF- ? [24,6 (18,7-30,5) vs 15,2 (11,3-19,1) pg/mL, p=0,02] e IL-10 [13,3 (8,5-18,2) vs 4,4 (2,8- 6,1) pg/mL, p<0,001] foram maiores no Grupo Câncer. O RNAm do INF-? (p=0,008), 8 TNFR1 (p=0,003), IL-10 (p=0,002) e PPAR-? (p=0,002) foram mais expressos nos pacientes com neoplasia. O Subgrupo Caquexia apresentou menor ingestão energética (p=0,03) e proteica (p=0,04), maior intensidade de fadiga (p=0,003), maior perda de peso (p=0,02) e menores níveis séricos de zinco (p=0,05). Dentre as citocinas, apenas a concentração de IL-6 (p=0,04) foi maior no Subgrupo Caquexia, enquanto que a expressão gênica do INF-? (p=0,04) foi maior nos pacientes com caquexia. Conclusões: Apesar da perda de peso, os marcadores de ingestão alimentar e composição corporal foram pouco alterados nos pacientes com neoplasia da confluência biliopancreática. As alterações laboratoriais foram evidentes nos pacientes com neoplasia, mostrando uma resposta inflamatória sistêmica. O aumento da expressão gênica da IL-10 sugere que as células do sangue periférico estão envolvidas no aumento sérico desta citocina. Apesar do aumento da concentração sérica do IL-6 e TNF-? nos pacientes com neoplasia, não houve aumento da expressão gênica dessas citocinas em sangue periférico. Tais dados sugerem que a IL-6 e o TNF-? são produzidos por outras células do sistema imune, distintas dos macrófagos circulantes. O aumento da expressão gênica de INF-? no sangue periféricos dos pacientes com neoplasia não foi acompanhado por maior concentração sérica dessa citocina, por possíveis mecanismos epigenéticos. Os genes do PPAR-? e do TNFR1 foram mais expressos nos pacientes com neoplasia. A caquexia foi definida em 8 pacientes, que apresentaram maior perda ponderal e menor ingestão nutricional. A concentração sérica de IL-6 foi maior no Subgrupo Caquexia, indicando a relação entre essa citocina e o estado caquético. Embora a concentração sérica de INF-? fosse semelhante entre sujeitos com ou sem caquexia, a expressão gênica dessa citocina foi maior nos pacientes caquéticos. / Introduction: Biliopancreatic confluence cancer has a high lethality and a reserved prognosis, attributed to the association of biological aggressiveness and the silent clinical picture. Inflammation plays a key role in the development and progression of cachexia, induced by the expression of cytokines produced by the tumor and/or released by the immune system. In recent years, it has been documented the variability in the genetics of cytokines regulating the mechanisms involved in neoplastic cachexia. Objectives: To evaluate the concentration of interleukin-6 (IL-6), tumor necrosis factor alpha (TNF-?), interferon-gamma (IFF-?) and interleukin 10 (IL-10) in samples of peripheral blood from patients with biliopancreatic confluence neoplasia, in addition to the gene expression of these cytokines, tumor necrosis factor receptor 1 (TNFR1), type 2 receptor tumor necrosis factor (TNFR2), zinc receptor alpha2-glycoprotein (ZAG) and peroxisome proliferator-activated gamma (PEAR-?). Besides, this study aimed to identify possible differences in the data among patients who were classified according to the presence or absence of neoplastic cachexia. Casuistic: The cross-sectional study was carried out with 17 patients of both genders in the immediate preoperative period of neoplasia of the biliopancreatic confluence (Cancer Group), in addition to 15 individual control in the preoperative period of hernia removal surgery (Control Group). Patients with neoplasia were classified according to the presence of cachexia (Subgroup Cachexia, n=8) and those without it (Subgroup Without-cachexia, n=9). Methods: Food intake and body composition were evaluated in all volunteers. The fatigue questionnaire was applied in individuals with neoplasia. The diagnosis of cachexia was based on pre-established criteria. Inflammatory cytokines IL-6, TNF-?, INF-? and IL-10 were measured in peripheral blood. The gene expression of inflammatory cytokines, TNF-?\' receptors, ZAG and PPAR were made in whole blood. Statistical analysis was performed using Statistica software, version 8.0®. Results: There was no difference in energy intake [1827 (1489-2166) vs 1691 (1380-2003) kcal, p=0.56] and protein [91.6 (74-109) vs 101 (89-114) g, p=0.30] of individuals with cancer or controls, except for the higher lipid intake [69.0 (53.5-84.5) vs 42.7 (33.4-52.1) g, p=0,01] and lower intake of vitamin A [382 (152-612) vs 1346 (1032-1659) ,µg, p=0.001] in the Cancer Group related to Control Group, respectively. There was weight loss from the usual in 15 of the 17 patients (13.1 + 11.0%) prior to the surgical procedure, although body composition variables were similar between the two study groups. Patients with neoplasia had lower plasma albumin concentrations [3.8 (3.5-4.0) vs 4.4 (4.3-4.5) g/dL, p <0.001], transferrin [166 (140-192) vs 241 (212-270) mg/dL, p=0,001], iron [80.8 (67.793.9) vs 107 (82-131) ,µg/dL, p=0.003], zinc [79.9 (66-93.7) vs 97.4 (88-107) µg%, p=0.001] and vitamin A [0.7 (0.6-0.8) vs 1.3 (1, 0-1.5) umol/L, p <0.001], as well as higher glycemia levels [115 (118-193) vs 98.6 (82-115) mg/dL, p=0.003], C-reactive protein 2.7 (0.9-4.5) vs 0.2 (0.2-3.3) mg/dL, p <0.001], ferritin [985 (347-1623) vs 170 (85-255) ng/dL, p=0.003] and copper ~147 (122-177) vs 107 (92-121) µg%, p=0.03] relative to the controls, respectively. The serum concentration of IL-6 cytokines [7.2 (4.2-10.1) vs. 2.0 (1.4-2.5) pg/mL, p <0.001], TNF-? [24.6 (18.7-30.5) vs 15.2 (11.3-19.1) pg/mL, p=0.02] and IL-10 [13.3 (8.5-18.2) vs 4.4 (2.8-6.1) pg/mL, p=0.008) were higher in the Cancer Group. The mRNA of INF-? (p=0.008), TNFR1 (p=0.003), IL-10 (p=0.002) and PPAR-? (p=0.002) were more expressed in patients with neoplasia. The Caquexy Subgroup had lower energetic (p=0.03) and protein intake (p=0.04), higher fatigue intensity (p=0.003), greater weight loss (p=0.02) and lower serum levels of zinc (p=0.05). Among the cytokines, only a concentration of IL-6 (p=0.04) was higher than the Cachexia Subgroup, whereas the gene expression of INF-? (p=0.04) was higher in patients with cachexia. Conclusions: Despite the weight loss, dietary intake markers and body composition were slightly altered in patients with biliopancreatic confluence neoplasia. In patients with neoplasia, laboratory findings were evident showing a systemic inflammatory response. The increasing gene expression of IL-10 suggests that peripheral blood cells are involved in the serum increase of this cytokine. Despite the increased concentration of IL-6 and TNF-? in neoplasia patients, there was no increase in gene expression in peripheral blood cytokines. These data suggest that IL-6 and TNF-? are produced by other cells of the immune system, other than circulating macrophages. The increasing gene expression of INF-? in the peripheral blood of patients with neoplasia was not accompanied by a higher serum concentration of this cytokine, due to possible epigenetic mechanisms. The PPAR-? and TNFR1 genes were more expressed in patients with neoplasia. Cachexia was defined in 8 patients, who presented greater weight loss and lower nutritional intake. The serum concentration of IL-6 was higher in the Cachexia Subgroup, indicating the relation between this cytokine and the cachectic state. Although the serum INF-? concentration was similar between individuals with or without cachexia, the gene expression of this cytokine was higher in cachectic patients

A desnutrição freqüentemente está presente em pacientes com insuficiência cardíaca (IC), podendo trazer aumento de complicações e mortalidade. O objetivo do estudo foi o de avaliar o estado nutricional de pacientes portadores de IC refratária, aguardando a realização de transplante cardíaco. Avaliação nutricional foi realizada utilizando-se da avaliação subjetiva global, avaliação antropométrica completa [índice de massa corpórea (IMC), circunferência do braço (CB), prega cutânea tricipital (PCT), circunferência muscular do braço (CMB) e área gordurosa do braço (AGB)], avaliação laboratorial e realização de anamnese alimentar em dois momentos: no momento de admissão na fila de transplante (1a avaliação) e 4 meses após (2a avaliação). Na 1ª avaliação foram estudados 56 pacientes, idade média de 46±12 anos, 67,8% homens, 33,9% com miocardiopatia chagásica. Análise de dados antropométricos revelou com base no IMC: 73,2% eutróficos e 5,3% com baixo peso; CMB: 66% apresentavam depleção. Houve correlação negativa e significativa entre IMC e fator de necrose tumoral (r= - 0,305; p= 0,022). Análise laboratorial demonstrou: baseado na albumina, 50% dos pacientes apresentavam-se com algum grau de depleção, na transferrina 40% e na contagem de linfócitos 80%. Houve correlação negativa e significativa entre albumina e interleucina-6 (r = - 0,464; p< 0,001), transferrina e interleucina-6 (r= -0,269; p= 0,047) e contagem de linfócitos e interleucina-6 (r= - 0,394; p=0,003). Na 2ª avaliação 18 pacientes foram estudados. Não foram observadas diferenças significativas entre as duas avaliações quanto aos parâmetros estudados. Com base na realização da anamnese alimentar os pacientes atingiram aproximadamente 85% e 84% de suas necessidades calóricas na 1ª e 2ª avaliações, e com relação à ingestão protéica, tanto na 1ª como na 2ª avaliação mais de 70% dos pacientes apresentaram consumo adequado de proteínas. Foi observado consumo abaixo das necessidades nutricionais de cálcio, potássio, magnésio, zinco, folato e vitamina E. Quanto ao sódio verificamos um consumo acima do recomendado. Foram transplantados 14 pacientes com idade de 44 ± 21 anos, 57,1% do sexo masculino, quatro pacientes morreram no pós operatório. Não houve diferenças significativas quanto aos dados antropométricos, laboratoriais, de adequação alimentar e idade entre o grupo de transplantados que sobreviveram (n=9) comparados com os que faleceram (n=4). Concluímos que a desnutrição é comum em pacientes com IC grave aguardando transplante cardíaco. A avaliação nutricional baseada no IMC não mostrou ser um bom método, necessitando ser complementada com as medidas de CB, CMB, PCT e AGB. A avaliação laboratorial permitiu a detecção de comprometimento nutricional. A participação das citocinas inflamatórias no processo de desnutrição foi evidenciada em nossa população. Portanto, a avaliação nutricional completa deve fazer parte do atendimento em pacientes com IC crônica, particularmente aqueles com IC refratária à espera por um transplante cardíaco / Malnutrition is frequently present in patients with heart failure (HF) and is associated with an increase in morbidity and mortality. The objective of this study was to evaluate nutritional status of patients with refractory HF waiting for cardiac transplantation. Nutritional evaluation was done with the use of subjective global assessment, complete anthropometric measurements (body mass index (BMI), mid-arm circumference (MAC), triceps skinfold thickness (TSF), mid-arm muscle circumference (MAMC) and arm fat area), laboratory evaluation and food intake assessment in two moments: at the admission to the cardiac transplantation waiting list (1st evaluation) and after 4 months (2nd evaluation). On the 1st evaluation, we studied 56 patients, mean age 46±12 years, 67.8% were men, and 33.9% had Chagas disease. Analyzing anthropometric measurements, we found that, based on BMI 73.2% of patients were normal and 5.3% had underweight; MAMC revealed 66% with depletion. There was a negative and significant correlation between BMI and tumor necrosis factor-a (r= - 0.305; p<0.022). Laboratory evaluation showed that based on albumin levels, 50% of patients had some degree of depletion, based on transferrin 40% and on lymphocyte count 80%. There were negative and significant correlations between albumin and interleukin-6 (r= - 0.464; p<0.001), transferrin and interleukin-6 (r= -0.269; p<0.047) and lymphocyte count and interleukin-6 (r= -0.394; p<0.003). On the 2nd evaluation 18 patients were studied. There were no significant differences in the studied parameters between the 1st and 2nd evaluations. Based on the food intake assessment, percentage of adequacy of calories intake was 85% and 84% on 1st and 2nd evaluations, and more than 70% of patients had adequate protein intake on both evaluations. Low intake of calcium, potassium, magnesium, zinc, folate and vitamin E was detected. Daily sodium intake was found to be above the recommended levels. Fourteen patients were submitted to cardiac transplantation, mean age 44±21 years, 57.1% were men. Four patients died in post operative period. No relation was observed between anthropometric, laboratory, alimentary adequacy and age variables between patients transplanted that survive (n=9) and that died (n=4). We concluded that malnutrition is common in patients with refractory HF listed for cardiac transplantation. Nutritional assessment based on BMI did not show to be a good index to detect nutritional disorders and need to be used together with MAC, TSF, MAMC and arm fat area. Laboratory evaluation permitted the detection of compromised nutritional status. The participation of inflammatory cytokines in the process of malnutrition was evidenced in our population. Therefore, a complete nutritional evaluation should be part of routine care of patients with chronic HF, particularly in those with refractory HF waiting for cardiac transplantation

A caquexia associada ao câncer, cujo o sintoma mais notável é a severa e rápida perda de peso, afeta cerca de 80% dos pacientes com câncer avaçado e constitui causa direta de morte em 22 a 40% dos casos. Estudos recentes têm mostrado que os mediadores inflamatórios têm um papel importante no desenvolvimento de caquexia, hoje em dia considerada como uma doença inflamatória crónica. Um possível contribuinte é o tecido adiposo branco (TAB) que sofre diversas alterações, como por exemplo, reorganização morfológica e aumento da lipólise, liberando assim ácidos graxos livres (AGL), que por sua vez, podem acentuar a produção de citocinas pró-inflamatórias. O objetivo do presente estudo foi analisar a expressão gênica de citocinas pró-inflamatórias no TAB e estabelecer se os ácidos graxos que são liberados pelos adipócitos na vigência da caquexia deflagram e/ou contribuem para inflamação local e sistêmica. O estudo envolveu 122 pacientes divididos em 3 grupos: controle (N), câncer sem caquexia (WSC) e câncer com caquexia (CC). O grupo CC foi composto por pacientes com uma perda de peso não intencional superior a 5% nos últimos 12 meses e atendeu a no mínimo três dos cinco critérios utilizados para a classificação da caquexia e o grupo WSC foi composta por pacientes em tratamento para o câncer, sem declarar a perda de peso> 5% nos últimos 12 meses. O tecido adiposo subcutâneo (TASC) apresentou aumento da expressão gênica de TNF- e uma tendência do aumento para a expressão gênica de CCL-2 no CC comparado ao N, enquanto o conteúdo de RNAm da IL-10 diminuiu no mesmo grupo. Sugerimos que o TASC enconta-se inflamado nos pacientes com caquexia associado ao câncer e um possível ativador da secreção de proteínas pró-inflamatórias nesse tecido poderia ser a maior presença de acidos graxos livres. / The cachexia associated with cancer, whose most notable symptom is severe and rapid weight loss, affecting about 80% of patients with cancer and avacado is the direct cause of death in 22 to 40% of cases. Recent studies have shown that inflammatory mediators play an important role in the development of cachexia, nowadays considered as a chronic inflammatory disease. A possible contributory is white adipose tissue (TAB) that undergoes various changes, such as morphological reorganization and increased lipolysis, thereby releasing free fatty acids (AGL), which in turn, can enhance the production of pro-inflammatory cytokines. The aim of this study was to analyse the gene expression of proinflammatory cytokines in the TAB and establish whether the fatty acids are released by fat cells in the presence of cachexia trigger and / or contribute to local and systemic inflammation. The study involved 122 patients divided into 3 groups: control (N) without cancer cachexia (WSC) and cancer cachexia (CC). The CC group consisted of patients with a loss of unintentional weight more than 5% in the last 12 months and met at least three of the five criteria used for classification of cachexia and the WSC group was composed of patients on treatment for cancer without declaring weight loss> 5% in the last 12 months. The subcutaneous adipose tissue (TASC) showed an increase in TNF- and increase the tendency of gene expression for CCL-2 gene expression in the CC as compared to N, while the mRNA content of IL-10 decreased in the same group. We suggest that the TASC is ignited in patients with cachexia associated with cancer and possible activator of secretion of proinflammatory proteins that fabric could be increased presence of free fatty acids.

Orientador: Maria Cristina Cintra Gomes Marcondes / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-19T11:39:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Oliveira_AndreGustavode_M.pdf: 2220744 bytes, checksum: ad8fc9b9eb42ef7af7f4733b165e19b0 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: O crescimento do câncer promove o desenvolvimento de caquexia em função de intensa espoliação de nutrientes, principalmente, de gordura e proteína corpórea total. A via de sinalização da mTOR controla o crescimento celular e alguns estudos apontam que a inibição dessa via por metformina (M) pode diminuir a taxa de desenvolvimento tumoral. Desse modo, o presente estudo avaliou os efeitos da administração de metformina associada à dieta rica em leucina (L), em animais com tumor de Walker 256 (W), sobre o metabolismo protéico muscular, na hipótese de melhorar o estado caquético. Ratos Wistar jovens foram distribuídos em oito grupos, de acordo com a presença ou não de tumor, tratamento com metformina (36 mg x Kg-1) e/ou dieta rica em leucina (dieta com excesso de 3%). Foram analisados parâmetros somáticos e bioquímicos bem como vias de sinalização celular no músculo gastrocnêmico. No grupo W, o crescimento tumoral induziu perda de 20% da massa corpórea; proporcionou redução de 70% na massa gorda, alem da diminuição da concentração sérica de glicose, de proteínas totais e albumina. As concentrações de GH e IGF-1 foram reduzidas, porém a concentração de ACTH foi elevada em todos os grupos com tumor. Os grupos portadores de tumor tiveram maiores taxas de degradação protéica muscular, embora as taxas de síntese não tenham sido alteradas. A suplementação com leucina estimulou a síntese protéica nos animais não portadores de tumor, e os resultados sugerem que esse efeito tenha sido via Akt ou Erk, enquanto que a metformina estimulou a sinalização via IRS-1, levando à ativação de Erk. A evolução tumoral promoveu espoliação da massa protéica e modulação dos processos de síntese protéica, através da inibição da Erk e IRS-1. A suplementação com leucina foi capaz de estimular a síntese protéica nos animais não portadores de tumor, porém o tratamento com metformina não foi eficaz em diminuir o crescimento das células tumorais, provavelmente em função da baixa concentração que foi administrada aos animais / Abstract: Tumour growth induces cachexia by intense nutrient waste, characterized by involuntary host weight loss, mainly depleting the total body protein and fat. mTOR signaling pathway controls the cell growth regulating translation of mRNA, and the inhibition of this pathway by compounds such as metformin (M) could decrease tumour growth rate. Knowing these facts, the aim of this study was to evaluate metformin effects associated to leucine-rich diet in Walker 256 (W) tumour-bearing animals, on muscle protein metabolism, trying to improve the cachectic state. Young male Wistar rats were distributed into 8 groups, according to the tumour implant, the treatment with metformin (36 mg x kg-1) and/or leucine-rich diet (3% leucine). After the sacrifice of the animals we evaluated some somatic and biochemical parameters as well as the muscle cell signaling pathways.. Tumour growth promotes 20%reduction of body mass and 70% of fat mass. Glucose serum was 50% decreased and also the total serum proteins (20% less) and albumin (25% reduced). GH and IGF-1 concentrations were decreased in all tumour-bearing groups, while ACTH concentration was increased. Tumour-bearing groups had higher protein degradation rates while protein synthesis rates were not changed, showing decreased protein turnover. Leucine rich-diet stimulated protein synthesis in non-tumour-bearing groups and these results suggest that this effect was through Akt or Erk pathways and metformin stimulated signaling through IRS-1, leading to Erk activation. Tumour growth promoted lean body mass spoliation and modulated protein synthesis through Erk and IRS-1 inhibition. Leucine-rich diet was able to stimulate protein synthesis in non tumour-bearing animals, although the treatment with metformina was not thus effective in decreasing tumour's cells growth, probably by low dose concentration / Mestrado / Fisiologia / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Sarah Monte Alegre / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-19T20:32:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Carvalho_ThalytaMorandiRidolfide_M.pdf: 1082546 bytes, checksum: 8844f3f5a4c8f2d69eee5b1aa85f8f02 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Mundialmente estimam-se 644.000 novos casos de câncer de cabeça e pescoço no mundo com dois terços dos casos ocorrendo em países em desenvolvimento. Os principais sinais e sintomas clínicos são dificuldade para engolir os alimentos, aumento do volume da região cervical, rouquidão, sangramento e em alguns casos dor que guiam o paciente à perda de peso. O presente estudo teve como objetivo avaliar o gasto energético basal e os fatores que mais influenciam na perda de peso de trinta e dois pacientes com carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço em estádios III e IV do sistema TNM antes e após 30 dias do término da radioterapia e quimioterapia,compreendidos numa faixa etária de 30 a 65 anos, de ambos os sexos. A seleção dos indivíduos foi realizada no ambulatório de Oncologia do Hospital das Clinicas -Universidade Estadual de Campinas. A coleta de dados realizou-se na Unidade Metabólica, 6° andar do HC-UNICAMP que englobou o preenchimento de um questionário com informações pessoais (idade, sexo, tabagismo), avaliação do estado nutricional (peso, altura e avaliação subjetiva global preenchida pelo próprio paciente), avaliação da composição corporal (bioempedância elétrica, circunferência braquial, prega cutânea do tríceps e circunferência muscular do braço), avaliação do gasto energético basal (calorimetria indireta), avaliação metabólica/bioquímica (colesterol total e frações, triglicérides, glicemia, insulinemia, adiponectina, leptina, fator de necrose tumoral (TNF-?), interleucina 1 (IL-1?), interleucina 6 (IL-6) e avaliação da sensibilidade à insulina (HOMA). Além disso os pacientes foram avaliados em relação à ingestão alimentar por meio do recordatório de 24 horas e do Índice de Alimentação Saudável. Os dados foram digitados em banco de dados utilizando-se o programa Excel e para a análise estatística utilizou-se o programa SAS para Windows versão 9.1.3. com nível de significância ? 5%. Nosso estudo mostrou que não podemos justificar a perda de peso pelo aumento do gasto energético basal e/ou diminuição do gasto energético basal, sendo a mesma influenciada por fatores derivados do tumor e pelo início de um processo inflamatório e sugerimos que o aporte nutricional precoce e a ressecção tumoral antes de iniciar o tratamento poderiam melhorar o prognóstico do paciente / Abstract: Worldwide, an estimated 644,000 new cases of head and neck cancer are diagnosed each year, with two- thirds of cases occurring in undeveloped countries. They are usually seen as a set of signs and symptoms which include lesions of the oral cavity, swelling of the neck, difficulty in swallowing food, hoarseness, bleeding and ultimately pain that in some cases can lead to malnutrition. Furthermore, the standard treatment increases weight loss. The main of this study was to evaluate the resting energy expenditure and the factors that had the most influence on weight loss of thirty two patients (aged between 30 and 65 years of both genders) with squamous cell carcinoma of head and neck in stage III and IV of the TNM system before and after 30 days of completion radiotherapy and chemotherapy. The selection of subjects was performed at the Hospital Oncology Clinic, University of Campinas. Data collection took place in the Metabolic Unit which included filling out a questionnaire with personal information such as (age, sex, smoker or non-smoker ...), assessment of nutritional status (weight, height and subjective global assessment completed by the patient), evaluation of body composition (bioelectrical impedance, arm circumference, triceps skinfold and arm muscle circumference), evaluation of resting energy expenditure (indirect calorimetry), evaluation of metabolic / biochemical factors (total cholesterol and fractions , triglycerides, glucose, insulin, adiponectin, leptin, tumor necrosis factor ? (TNF-?), interleukin 1 ? (IL-1?), interleukin 6 (IL-6) and evaluation of insulin sensitivity (HOMA). In addition, the patient was evaluated in relation to food intake by 24-hour recall and the Healthy Eating Index. The data were entered into the database using the program Excel and the statistical analysis used the SAS for Windows version 9.1. 3. with a significance level ? 5%. Our study demonstrated that we cannot justify the weight loss either by increasing the resting energy expenditure or decreasing; it is influenced by factors derived from the tumor and the beginning of an inflammatory process. Nutritional support and early tumor resection before starting treatment improves the nutritional prognosis / Mestrado / Ciencias Basicas / Mestre em Clinica Medica

Objetivo do estudo foi estudar a participação dos adipócitos e do fígado na inflamação e o papel da microbiota ao longo da progressão da caquexia. Para verificar o comportamento dos adipócitos e do fígado utilizamos ratos Wistar macho de 8 semanas, divididos em dois grupos: i) controle; ii) tumor. Este último foi subdividido em 2 grupos: a) 7º. e b) 14º. dia após a inoculação das células tumorais. Para avaliar o comportamento da microbiota durante o quadro de caquexia utilizamos camundongos C57Bl/6 convencional e germ free de 8-10 semanas, divididos em quatro grupos: i) Convencional controle; ii) Germ Free controle; iii) Convencional tumor; iv) Germ Free tumor. A célula tumoral usada para esse modelo foi Lewis Lung Carcinoma. Adipócitos isolados dos TAB, mesentérico, mais o fígado, mostraram que a via do inflamassoma esta ativa na fase terminal da caquexia. No modelo Germ Free, observamos que a caquexia apresenta-se é acelerada no tecido adiposo epididimal comparado aos camundongos convencionais tumor. Em conclusão, os adipócitos e o fígado desempenha papel importante no estabelecimento da inflamação, enquanto que a simbiose da microbiota parece ser essencial para combater a redução do tecido adiposo. / The goal of this study the role of adipocytes and liver inflammation and the role of microbiota along the progression of cachexia. The main aspects evaluated were increased of the inflammation, alteration in both pathways NF-kB and the inflammasome, and importance of the microbiota during progression of cachexia. To verify the behavior of adipocytes and liver I used Eight weeks-old male rats, I divided into two main groups: i) control; ii) tumor. The latter was divided into 2 groups: a) 7º. and b) 14º. day after tumor cell. To assess the microbial behavior during the development of cachexia I used C57BL/6 conventional mice and Germ Free 8-10 weeks, they were divided into four groups: i) Conventional control; ii) Germ Free control; iii) Conventional tumor; iv) Germ Free tumor. The tumor cell used in this model was Lewis Lung Carcinoma. Adipocytes isolated from TAB, mesenteric further the liver, showed that the inflammasome pathway is active in the terminal phase of cachexia. In model of Germ free mice we observed that cachexia is accelerated in epididymal adipose tissue compared to conventional tumor. In conclusion, adipocytes and liver seem to play a relevant role in the establishment of inflammation, while the microbial symbiosis seems to be essential for combating the reduction of adipose tissue.