Orientador: Gisela Ferreira / Banca: Giuseppina Pace Pereira Lima / Banca: Carmen Silvia Fernandes Boaro / Banca: Magali Ribeiro da Silva / Banca: Luciana Alves Fogaça / Resumo: A espécie Annona emarginata (Schltdl.) H. Rainer (araticum-de-terra-fria) é utilizada como portaenxerto para espécies da família Annonaceae. Sugere-se que a semeadura dessa espécie seja realizada logo após a extração das sementes, indicando que essas não toleram a dessecação. O objetivo do trabalho foi estudar a maturação e a aquisição de tolerância à dessecação de sementes de Annona emarginata correlacionando as fases do desenvolvimento das sementes, níveis de secagem e o armazenamento com o balanço hormonal, açúcares solúveis, lipídeos, proteínas solúveis, proteínas LEA e a atividade de enzimas de estresse. Os experimentos foram realizados no Laboratório de Fisiologia da Germinação de Sementes do Departamento de Botânica do Instituto de Biociências - IB, da Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho" (UNESP), Campus de Botucatu-SP. Foram realizadas cinco coletas e para cada uma delas os frutos foram analisados quanto ao tamanho, coloração, porcentagem de sólidos solúveis totais (°Brix), textura, peso, número e tamanho das sementes. As sementes provenientes desses frutos em diferentes estádios de maturação foram submetidas às análises anatômicas, determinação do teor de água inicial, curva de secagem, teste de germinação, armazenamento à baixa temperatura (-5°C) e análises bioquímicas (açúcares solúveis totais e açúcares redutores totais; proteínas totais; proteínas LEA; lipídeos totais; atividade da peroxidase; atividade da superóxido dismutase; quantificação dos teores de lipoperóxidos e quantificação hormonal). Os dados foram submetidos à análise de variância (teste F) e as médias comparadas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. Observamos que sementes de Annona emarginata adquirem tolerância à dessecação aos 116 DAF, quando o embrião já está desenvolvido com acúmulo de sacarose, proteínas LEA além de baixa atividade de enzimas de ... / Abstract: The species Annona emarginata (Schltdl.) H. Rainer (araticum-de-terra-fria) is used as rootstock to Annonaceae family species. Suggest that the sowing of this species is carried out right after the seeds extraction, indicating that those are not tolerate to desiccation. The objective of the study was the maturation and the tolerance acquisition to desiccation of seeds of Annona emarginata correlating to the phases of seeds development, drying levels and storage with hormonal balance, soluble sugars, lipids, soluble proteins, LEA proteins and stress enzyme activity. The experiments were performed at the Laboratory of Physiology of Seed Germination of the Department of Botany, Institute of Biosciences - IB, Universidade Estadual Paulista "Julio de Mesquita Filho" (UNESP), Botucatu-SP. Were performed five collections and for each one of them the fruits at different stages were analyzed for size, coloring, total soluble solids percentage (° Brix), texture, weight, number and size of seeds. The seeds from those fruits at different stages of maturation were subjected to anatomical analyzes, determination of initial water content, drying curve, germination test, storage at low temperature (-5°C) and biochemical analyzes (total soluble sugars and total reducing sugars; total proteins; LEA proteins; total lipids; peroxidase activity; superoxide dismutase activity; lipoperoxide content quantification and hormone quantification). Tha data were submitted to the ANOVA (F test) and the averages compared by the Tukey test at 5% probability. We observed that seeds of Annona emarginata acquire tolerance to desiccation at 116 DAF, when the embryo is already developed with sucrose accumulation, LEA proteins, beyond low activity of stress enzymes (SOD, POD and Lipoperoxide levels). However, these seeds have reduced longevity, completely losing viability after 180 days of storage, regardless of the water content showed that, due to the damage caused by low ... / Doutor

O gene TrSNF1, homólogo aos membros da subfamília das proteínas serina-treonina quinases ativadas por AMP (AMPK) e relacionadas a SNF1, foi isolado do fungo filamentoso trichoderma reesei. A seqüência de aminoácidos putativa possui um domínio de quinase com 42% de identidade e 59% de similaridade com outras proteínas quinases da mesma subfamília. Em S. cerevisiae a SNFl é essencial para a expressão de genes reprimidos por glicose, em resposta a privação de glicose do meio de cultura. A expressão de TrSNFl em levedura mutante para SNF1, restaura a função de SNF1. A expressão de um antisense de TrSNFl em T. reesei causa um atraso na expressão do gene regulado por glicose, CBHI. Além disso, em experimento utilizando matrizes de DNA foi possível observar uma alteração da tendência global da expressão gênica entre a cepa selvagem e a cepa antisense. A observação da homologia estrutural com proteínas quinase da mesma subfamília, a similaridade funcional com SNFl de S. cerevisiae, e a alteração no padrão da expressão gênica in vivo, sugerem que TrSNFl pode estar envolvido na regulação do metabolismo de carboidratos em T. reesei. / A gene homologue to the members of the AMP-activated/SNFl protein kinase subfamily, TrSNF1, was isolated from the filamentous fungus Trichoderma reesei. The predicted protein of 692 amino acids has a kinase domain, that share 42 % identity and 59 % similarity to that of serine/threonine protein kinase of this family. In Saccharomyces cerevisiae, the SNFl protein kinase is required for expression of glucose repressed genes in response to withdrawal of glucose from the medium. Expression of the Trichoderma reesei SNF1-related sequence in yeast SNFl mutant restores SNFl function. The TrSNFl antisense expression in T. reesei causes a control alteration in the glucose-regulated gene CBHI. The observed structural identity with the AMP-activated/SNFl protein kinase subfamily, and the functional similarity to the yeast SNFl suggest that the TrSNFl may be involved in the regulation of sugar metabolism in Trichoderma reesei.

A banana é um fruto climatérico que apresenta alta taxa respiratória e alta produção de etileno após a colheita, o que a torna altamente perecível. Acredita-se que o 1-MCP é capaz de ligar-se ao receptor do hormônio etileno, bloqueando sua ação e, consequentemente, retardando o amadurecimento do fruto. Bananas (Musa acuminata AAA cv. Nanicão) com aproximadamente 110 dias pós-antese foram armazenadas em condições controladas de umidade e temperatura. Parte da amostra foi tratada com 1-MCP (100 nl/L), outra parte foi tratada com etileno (100 ppm - 7L/min), e, uma terceira parte, foi mantida como controle. Os frutos foram caracterizados, durante o período de amadurecimento, em relação à produção de etileno e CO2 (por cromatografia à gás), à concentração de amido (pelo método enzimático descrito por Cordenunsi e Lajolo 1995) e açúcares (glicose, frutose, sacarose e maltose - por HPLC-PAD). Também foram analisados os comportamentos das enzimas α e β- amilases, fosforilase, DPE 1 e DPE 2 por atividade enzimática in vitro ou por P.A.G.E. nativo e, quando possível, foram avaliados os comportamentos destas enzimas frente a tradução (Western blotting) e transcrição proteica (Northern blotting). A degradação de amido, assim como a respiração, a produção de etileno e síntese de açúcares foram retardadas nos frutos tratados com o 1-MCP. Como consequência destas mudanças, também houve uma alteração nos perfis das atividades enzimáticas. Os resultados indicaram que o 1-MCP, além de atrasar o climatério respiratório, foi capaz de provocar descompasso no padrão de degradação de amido e síntese de açúcares sugerindo também que outros fatores temporais, necessários ao processo, foram prejudicados. Dentre as enzimas envolvidas no metabolismo de carboidratos de bananas, as α-amilases não demonstraram ser etileno-dependentes (?) as β-amilases mostraram ser enzimas bastante dependentes do etileno e parecem ter importância especial quando se trata do metabolismo da maltose, em conjunto com a DPE 2; atividade fosforolítica foi induzida ao longo do amadurecimento, mas parece ter resposta mais significativa a alterações basais do hormônio etileno e, portanto, sugere-se que esta enzima esteja envolvida com mais de uma forma de regulação; a DPE 1 apresentou maior atividade ao início da degradação do amido, indicando sua atuação sobre glicanos liberados pelas α-amilases. A presença de DPEs na banana torna o seu metabolismo de carboidratos mais próximo daquele presente em folhas. / Banana is a climateric fruit that has a high respiration rate and a high ethylene production after harvest, what makes this fruit very perishable. It is believe that 1- MCP is capable to interact with the hormone ethylene receptors, blocking its action and, as result, delaying the fruit ripening. Bananas (Musa acuminata AAA cv. Nanicão) with 110 days after anthesis were stored in controlled conditions of umidity and temperature. Part of the sample was treated with 1-MCP (100 nl/L), another part was treated with ethylene (100 ppm - 7L1min), and, a third part, was kept as control.The fruits were characterized, along the ripening process, based on the ethylene and CO2 production (by gas chromatography), the starch amount (enzymatic method described by Cordenunsi and Lajolo, 1995) and sugars content (glucose, fructose, sucrose and maltose - by HPLC-PAD). Enzymes behaviors were also followed α and β-amylases, phosphorylase, DPE 1 and DPE 2 by enzymatic activity (in vitro ar native P.A.G .E.) and, when it was possible, the translation (Western blotting) and protein transcription (Northern blotting) were also analyzed. The starch degradation, as well as the CO2 and ethylene production and sugars synthesis were delayed in the fruits treated with the 1-MCP. As consequence of these changes, we also had an alteration in the enzymatic activity profiles. The results indicated that the 1-MCP, besides delaying the respiratory climateric, was capable to change the standard profile of starch degradation and synthesis of sugars, suggesting that other factors, necessary to the process, were damaged. Considering the involved enzymes in the carbohydrates metabolism of bananas, the α-amylases did not demonstrated to be ethylene-dependents (?) β-amylases seem to be ethylene-dependent and seem to have special importance in the maltose metabolism, working on it with the DPE 2; phosphorolytic activity was induced along the ripening, but it seems to have more significant relation to the basal alterations of the hormone ethylene, therefore, it suggests that this enzyme is involved with more than one type of regulation; DPE 1 presented greater activity in the beginning of the starch degradation, indicating its performance on glucans released by the α-amylases activity. The presence of DPEs in bananas approximates its metabolism of carbohydrates to the leaves metabolism.

Orientador: Dora Maria Grassi Kassisse / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-20T06:22:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ishizu_LarissaYuri_M.pdf: 1236160 bytes, checksum: d3b83c5f6882f0bbaa5b2be15aa753a0 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Dados do Laboratório de Estudo do Estresse revelaram que a produção de lactato por adipócitos isolados de tecido adiposo visceral de humanos eutróficos e obesos mórbidos está sob estímulo de adrenoceptores ?1. Observou-se também hiperlactatemia no jejum de obesos mórbidos, aumento na liberação de lactato e na lipólise basal e estimulada em adipócitos viscerais isolados destes indivíduos, comparados com eutróficos. Porém dados de nosso laboratório e da literatura sugerem uma relação antagônica entre lipólise e lactatogênese, da qual participa o receptor GPR81, o qual está envolvido com lactato, inibindo a lipólise. Dados da literatura também sugerem a supressão da lipogênese e maior lipólise basal e estimulada dos adipócitos de obesos, com aumento da expressão da aquaporina 7, pelo qual o glicerol gerado na lipólise, é liberado. Por outro lado, estudos da literatura relatam a ocorrência da reesterificação dos produtos liberados após a lipólise de triacilgliceróis (TAGs) no tecido adiposo, na obesidade. Possivelmente, este seria o processo que promoveria a manutenção de grandes estoques de TAGs no tecido adiposo, apesar da maior lipólise e menor lipogênese. Frente aos nossos dados funcionais e os presentes na literatura sobre tecido adiposo visceral na obesidade, o objetivo deste estudo foi detectar alterações no metabolismo glicídico e lipídico neste tecido isolado de humanos obesos, em comparação com eutróficos, sob o enfoque da expressão gênica. Para tanto, quantificamos a expressão de genes envolvidos com a lactatogênese (lactato desidrogenase A, LDHA), lipogênese (acetil-CoA carboxilase, ACACA; glicerol quinase, GK; lipoproteína lipase, LPL) e lipólise (lipase hormônio sensível, LIPE; fosfodiesterase 3b, PDE3b; aquaporina 7, AQP7), e o gene relacionado com a inibição da lipólise via lactato (receptor-órfão acoplado à proteína G 81, GPR81) através do Real- Time PCR. Os resultados obtidos mostraram que o tecido adiposo de mulheres obesas expressa significativamente 49% a mais o gene LIPE e 66% a mais o gene LPL o de que mulheres eutróficas (p<0,05), enquanto que no tecido adiposo de homens não foi encontrada diferença significativa, apenas uma tendência a aumento do gene LPL nos obesos, comparados com eutróficos. Os adipócitos isolados do tecido adiposo visceral de homens obesos são morfometricamente maiores que os provenientes de eutróficos tendo como provável fator o aumento da expressão de LPL sem ser acompanhado de alterações na expressão de LIPE. Por outro lado, os adipócitos isolados do tecido adiposo visceral de mulheres obesas não apresentaram alterações morfométricas quando comparados aos adipócitos isolados de eutróficas, estes resultados são explicados pela análise da expressão dos genes LPL e LIPE do tecido adiposo desta região que se apresentou significativamente elevada em obesas. Desta forma, para este tecido estudado, existem alterações, dependente de gênero, que devem ser consideradas para estudos futuros sobre a obesidade. Neste trabalho, com as condições e a população estudada, referente a obesos e eutróficos de ambos os gêneros, podemos indicar as seguintes conclusões: a expressão de enzimas relacionadas à lipólise e a lipogênese em adipócitos isolados da região visceral de obesos é dependente do gênero enquanto que não há alterações significativas na expressão gênica relacionada à lactatogênese / Abstract: Previous data from the Laboratory of Stress Study showed that lactate production by adipocytes isolated from visceral adipose tissue of human normal and morbidly obese is under ?1-adrenoceptor stimulation. It was also observed hyperlactatemia in fasting from morbidly obese, an increase basal and stimulated lactate and glycerol production in visceral adipocytes isolated from these individuals, compared with normal weight. But data from our laboratory and the literature suggest an antagonistic relationship between lipolysis and lactatogênese, which participates in the GPR81 receptor, which is involved with lipolysis inhibition by lactate. Literature data also suggest the suppression of lipogenesis and increased basal and stimulated lipolysis in adipocytes of obese, with increased expression of aquaporin 7, whereby the glycerol generated in lipolysis, is released. Furthermore, published studies have reported the occurrence of re-esterification of the products released after lipolysis triacylglycerols (TAGs) in adipose tissue, in obesity. Possibly, this would be the process that would promote the maintenance of large stocks of TAGs in adipose tissue, despite the increased lipolysis and reduced lipogenesis. Front of our functional data and the literature on visceral adipose tissue in obesity, the aim of this study was to detect changes in glucose and lipid metabolism in this tissue isolated from obese humans, compared with normal weight, with a focus on gene expression. To this end, we quantified the expression of genes involved in lactatogênese (lactate dehydrogenase A LDHA), lipogenesis (acetyl- CoA carboxylase, ACACA, glycerol kinase, GK, lipoprotein lipase, LPL) and lipolysis (hormone sensitive lipase, LIPE; phosphodiesterase 3b , PDE3b; aquaporin 7 AQP7), and the gene related to the inhibition of lipolysis via lactate (orphan receptor-G protein coupled 81, GPR81) using Real-Time PCR. The results showed that adipose tissue isolated from obese women expressed significantly 49% more gene LIPE and 66% more LPL gene that women with normal weight (p <0.05), whereas in men no significant difference was found, only a tendency towards increased LPL gene in obese compared with normal weight. The isolated adipocytes visceral adipose tissue of obese men morphometrically are larger than those from normal weight bearing as the most probable cause increased expression of LPL without being accompanied by alterations in the expression of LIPE. Moreover, the isolated adipocytes visceral adipose tissue of obese women showed no morphological changes compared to normal weight of isolated adipocytes. These results are explained by analysis of gene expression of LPL and LIPE adipose tissue in this region which was significantly higher in obese women. Thus, there are changes, in this tissue studied, dependent on gender, which should be considered for future studies on obesity. In this work, the conditions and the population studied, referring to obese and normal for both genders, we can state the following conclusions: the expression of enzymes related to lipolysis and lipogenesis in adipocytes isolated from visceral fat of obese people is dependent on the gender while not there are significant changes in enzyme expression related to lactatogenesis / Mestrado / Fisiologia / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

O gene TrSNF1, homólogo aos membros da subfamília das proteínas serina-treonina quinases ativadas por AMP (AMPK) e relacionadas a SNF1, foi isolado do fungo filamentoso trichoderma reesei. A seqüência de aminoácidos putativa possui um domínio de quinase com 42% de identidade e 59% de similaridade com outras proteínas quinases da mesma subfamília. Em S. cerevisiae a SNFl é essencial para a expressão de genes reprimidos por glicose, em resposta a privação de glicose do meio de cultura. A expressão de TrSNFl em levedura mutante para SNF1, restaura a função de SNF1. A expressão de um antisense de TrSNFl em T. reesei causa um atraso na expressão do gene regulado por glicose, CBHI. Além disso, em experimento utilizando matrizes de DNA foi possível observar uma alteração da tendência global da expressão gênica entre a cepa selvagem e a cepa antisense. A observação da homologia estrutural com proteínas quinase da mesma subfamília, a similaridade funcional com SNFl de S. cerevisiae, e a alteração no padrão da expressão gênica in vivo, sugerem que TrSNFl pode estar envolvido na regulação do metabolismo de carboidratos em T. reesei. / A gene homologue to the members of the AMP-activated/SNFl protein kinase subfamily, TrSNF1, was isolated from the filamentous fungus Trichoderma reesei. The predicted protein of 692 amino acids has a kinase domain, that share 42 % identity and 59 % similarity to that of serine/threonine protein kinase of this family. In Saccharomyces cerevisiae, the SNFl protein kinase is required for expression of glucose repressed genes in response to withdrawal of glucose from the medium. Expression of the Trichoderma reesei SNF1-related sequence in yeast SNFl mutant restores SNFl function. The TrSNFl antisense expression in T. reesei causes a control alteration in the glucose-regulated gene CBHI. The observed structural identity with the AMP-activated/SNFl protein kinase subfamily, and the functional similarity to the yeast SNFl suggest that the TrSNFl may be involved in the regulation of sugar metabolism in Trichoderma reesei.

A banana é um fruto climatérico que apresenta alta taxa respiratória e alta produção de etileno após a colheita, o que a torna altamente perecível. Acredita-se que o 1-MCP é capaz de ligar-se ao receptor do hormônio etileno, bloqueando sua ação e, consequentemente, retardando o amadurecimento do fruto. Bananas (Musa acuminata AAA cv. Nanicão) com aproximadamente 110 dias pós-antese foram armazenadas em condições controladas de umidade e temperatura. Parte da amostra foi tratada com 1-MCP (100 nl/L), outra parte foi tratada com etileno (100 ppm - 7L/min), e, uma terceira parte, foi mantida como controle. Os frutos foram caracterizados, durante o período de amadurecimento, em relação à produção de etileno e CO2 (por cromatografia à gás), à concentração de amido (pelo método enzimático descrito por Cordenunsi e Lajolo 1995) e açúcares (glicose, frutose, sacarose e maltose - por HPLC-PAD). Também foram analisados os comportamentos das enzimas &#945; e &#946;- amilases, fosforilase, DPE 1 e DPE 2 por atividade enzimática in vitro ou por P.A.G.E. nativo e, quando possível, foram avaliados os comportamentos destas enzimas frente a tradução (Western blotting) e transcrição proteica (Northern blotting). A degradação de amido, assim como a respiração, a produção de etileno e síntese de açúcares foram retardadas nos frutos tratados com o 1-MCP. Como consequência destas mudanças, também houve uma alteração nos perfis das atividades enzimáticas. Os resultados indicaram que o 1-MCP, além de atrasar o climatério respiratório, foi capaz de provocar descompasso no padrão de degradação de amido e síntese de açúcares sugerindo também que outros fatores temporais, necessários ao processo, foram prejudicados. Dentre as enzimas envolvidas no metabolismo de carboidratos de bananas, as &#945;-amilases não demonstraram ser etileno-dependentes (?) as &#946;-amilases mostraram ser enzimas bastante dependentes do etileno e parecem ter importância especial quando se trata do metabolismo da maltose, em conjunto com a DPE 2; atividade fosforolítica foi induzida ao longo do amadurecimento, mas parece ter resposta mais significativa a alterações basais do hormônio etileno e, portanto, sugere-se que esta enzima esteja envolvida com mais de uma forma de regulação; a DPE 1 apresentou maior atividade ao início da degradação do amido, indicando sua atuação sobre glicanos liberados pelas &#945;-amilases. A presença de DPEs na banana torna o seu metabolismo de carboidratos mais próximo daquele presente em folhas. / Banana is a climateric fruit that has a high respiration rate and a high ethylene production after harvest, what makes this fruit very perishable. It is believe that 1- MCP is capable to interact with the hormone ethylene receptors, blocking its action and, as result, delaying the fruit ripening. Bananas (Musa acuminata AAA cv. Nanicão) with 110 days after anthesis were stored in controlled conditions of umidity and temperature. Part of the sample was treated with 1-MCP (100 nl/L), another part was treated with ethylene (100 ppm - 7L1min), and, a third part, was kept as control.The fruits were characterized, along the ripening process, based on the ethylene and CO2 production (by gas chromatography), the starch amount (enzymatic method described by Cordenunsi and Lajolo, 1995) and sugars content (glucose, fructose, sucrose and maltose - by HPLC-PAD). Enzymes behaviors were also followed &#945; and &#946;-amylases, phosphorylase, DPE 1 and DPE 2 by enzymatic activity (in vitro ar native P.A.G .E.) and, when it was possible, the translation (Western blotting) and protein transcription (Northern blotting) were also analyzed. The starch degradation, as well as the CO2 and ethylene production and sugars synthesis were delayed in the fruits treated with the 1-MCP. As consequence of these changes, we also had an alteration in the enzymatic activity profiles. The results indicated that the 1-MCP, besides delaying the respiratory climateric, was capable to change the standard profile of starch degradation and synthesis of sugars, suggesting that other factors, necessary to the process, were damaged. Considering the involved enzymes in the carbohydrates metabolism of bananas, the &#945;-amylases did not demonstrated to be ethylene-dependents (?) &#946;-amylases seem to be ethylene-dependent and seem to have special importance in the maltose metabolism, working on it with the DPE 2; phosphorolytic activity was induced along the ripening, but it seems to have more significant relation to the basal alterations of the hormone ethylene, therefore, it suggests that this enzyme is involved with more than one type of regulation; DPE 1 presented greater activity in the beginning of the starch degradation, indicating its performance on glucans released by the &#945;-amylases activity. The presence of DPEs in bananas approximates its metabolism of carbohydrates to the leaves metabolism.