Orientador: Cláudia Herrera Tambeli / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-22T19:36:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bonet_IvanJoseMagayewski_M.pdf: 8243433 bytes, checksum: a5cdaab90bdcc5bbba66a0e5e4a1293f (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: O Receptor Potencial Transiente Ankiryn 1 (TRPA1) é um canal não seletivo a cátions importante na fixação do limiar nociceptivos e pertencente à superfamília de canais TRP. É expresso em fibra C-nociceptiva e células não neuronais envolvidas na liberação de mediadores pró-inflamatórios. No presente estudo, investigamos se o TRPA1 contribui para a hiperalgesia induzida pela carragenina em ratos, e se essa contribuição é mediada por mecanismos de inflamação, tais como liberação de citocinas pró-inflamatórias e migração de neutrófilos e/ou sensibilização direta do neurônio aferente primário. Avaliamos a sensibilização do nociceptor induzida pela carragenina utilizando estímulos mecânico (analgesímetro mecânico) e químico (capsaicina), com ou sem bloqueio farmacológico local do receptor TRPA1 pelo seu antagonista seletivo HC 030031. A carragenina induziu hiperalgesia com pico na terceira hora, persistindo até vigésima quarta hora. O bloqueio farmacológico do receptor TRPA1 por co-administração de HC 030031 diminuiu significativamente a hiperalgesia induzida pela carragenina na terceira hora e a pós-administração de HC 030031 (2hrs 55min) reduziu na terceira e na sexta hora. O silenciamento do gene do TRPA1, induzido por um pré-tratamento intratecal com Oligonucleotídeo antisense, preveniu a hiperalgesia induzida pela carragenina após 24 horas além de reduzir significativamente a expressão de TRPA1 em células dos gânglios da raiz dorsal (GRD) (L5-6). O tratamento com carragenina, por sua vez, não alterou a expressão do receptor TRPA1 no GRD, e tampouco afetou os níveis de citocinas e a migração de neutrófilos no tecido periférico (patas). Concluímos que TRPA1 tem papel importante no desenvolvimento e manutenção da hiperalgesia inflamatória induzida pela carragenina por contribuir diretamente na excitabilidade do nociceptor. Baseado nesses achados, sugerimos que o bloqueio de TRPA1 é uma estratégia promissora no desenvolvimento de futuras drogas para o controle e tratamento da dor / Abstract: The Transient Receptor Potential Ankiryn 1 (TRPA1) is a nonselective cation channel, important in setting nociceptive threshold belonging to the superfamily of TRP channels. It is expressed in nociceptive C-fibers and in non-neuronal cells involved in pro-inflammatory mediators release. In this study, we asked whether TRPA1 contributes to carrageenan-induced hyperalgesia in rats, and whether this contribution is mediated by mechanisms in inflammation, such as cytokine release and neutrophil migration and/or by a direct sensitization of the primary afferent nociceptors. We measured the carrageenan-induced nociceptive sensitization using a mechanical (mechanical analgesymeter) and a chemical (capsaicin) stimulus, with or without pharmacological blockade of TRPA1 by its selective antagonist HC 030031. Carrageenan-induced Hiperalgesia has peaked at the third hour and persisted until the twenty-fourth hour. Pharmacological blockade of TRPA1 receptor by co-administration of HC 030031 significantly lowered carrageenan-induced hiperalgesia at the third hour and post-administration (2hrs 55min) decreased at both third and sixth hours. The neuronal TRPA1 gene silencing induced by intrathecal pre-treatment with antisense oligodoexynucleotide completely prevented carrageenan-induced hyperalgesia over 24 hours and significantly reduced TRPA1 expression in the dorsal root ganglia cells (DRG ) (L5-6). However, carrageenan treatment, did not affect the TRPA1 expression on DRG, neither affected the cytokines levels and neutrophil migration in peripheral tissue (paws). We conclude that TRPA1 plays an important role in the development and maintenance of carrageenan-induced inflammatory hyperalgesia by directly contributing to nociceptor excitability. Based on these findings, we suggest that TRPA1 blockade is a promising strategy for the development of future drugs to pain treatment and control / Mestrado / Fisiologia / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

A hiperalgesia inflamatória é o processo pelo qual ocorre a sensibilização dos neurônios nociceptores aferentes primários por mediadores químicos inflamatórios, gerando assim uma diminuição do limiar nociceptivo e como consequência episódios de dor. Entre os principais mediadores envolvidos com a sensibilizacão das fibras nociceptivas periféricas está a prostaglandina E2 (PGE2), que é liberada como um produto final de uma cascata de mediadores inflamatórios. Dentro desta cascata de liberação hierárquica podemos destacar a interleucina -1? (IL)-1?, uma citocina importante na gênese da dor inflamatória, devido à sua capacidade de induzir a produção da enzima cicloxigenase-2 (COX-2), e consequentemente PGE2. O mecanismo de controle da produção da IL-1 ? envolvem dois passos intracelulares: a indução da expressão de uma forma protêica inativa (a pró-IL-1 ?) e a geração da forma biologicamente ativa (IL-1?) a partir da pró-IL-1 ?. Este último passo envolve a ação de uma cisteína-protease ativada em decorrência de um processo inflamatório, conhecida como Caspase-1, a qual cliva a pró-IL-1? em IL1?. Recentemente, nosso grupo demonstrou que a caspase-1 tem um papel importante na gênese da dor inflamatória, sendo crucial para a geração de IL-1? e consequentemente COX2/PGE2. Porém, não são conhecidos os mecanismos de ativação da caspase-1 na hiperalgesia inflamatória. Sabe-se que a ativação da Caspase-1 e clivagem da pro-IL-1? são dependentes de uma plataforma molecular intracelular denominada inflamassoma. Os principais inflamassomas ativadores de caspase-1 são formados pelas proteínas NLRP3, IPAF (NLRC4) e por sua molécula adaptadora ASC. O objetivo desse trabalho então foi avaliar a participação do inflamassoma na gênese da dor inflamatória. Nós identificamos que as moléculas IPAF e ASC, mas não o NLRP3, participa no desenvolvimento da hiperalgesia inflamatória mecânica e térmica induzida pela carragenina. Observou-se que estas moléculas são cruciais para a ativação da Caspase-1 e, consequentemente, para a produção da IL-1? ativa. Estes resultados evidenciam pela primeira vez um papel importante do inflamassoma no desenvolvimento da hiperalgesia inflamatória. / The inflammatory hyperalgesic is the process by which occurs the sensitization of nociceptors primary afferent neurons by inflammatory chemical mediators, that generating a decreased nociceptive threshold and result in episodes of pain. Among the main of nociceptive mediators involved with sensitization of peripheral nociceptive fibers are prostaglandin E2 (PGE2), which is released as a final product of a cascade of inflammatory mediators. Within this hierarchical cascade of release can highlight interleukin-1? (IL)-1?, a cytokine important in the genesis of inflammatory pain due to their ability to induce the production of the enzyme cyclooxygenase-2 (COX-2) and consequently PGE2. The control mechanism production of intracellular IL-1 ? involved two steps: induction of expression of a protein inactive form (pro-IL-1 ?) and the generation of the biologically active form from pro-IL-1 ? (IL-1?). This last step involves the action of a cysteine protease-activated due to an inflammatory process, known as Caspase-1, which cleaves pro-IL-1? to IL-1?. Recently our group has demonstrated that caspase-1 plays an important role in the genesis of inflammatory pain, crucial for the generation of IL-1? and consequently COX2/PGE2. However, there aren\'t known mechanisms of activation of caspase-1 in inflammatory hyperalgesic. It is known that the activation of Caspase-1 cleavage and pro-IL-1? are dependent on an intracellular molecular platform called inflammassome. The main inflammassome activators of caspase-1 proteins are formed by NLRP3, IPAF (NLRC4) and its adapter molecule ASC. The aim of this study was to evaluate the inflammassome participation in the genesis of inflammatory pain. We have identified molecules IPAF and ASC, but not NLRP3, is participate in the development of mechanical and thermal inflammatory hyperalgesic induced by carrageenan. It was observed that these molecules are crucial for the activation of Caspase-1 and thus for the production of active IL-1?. These results demonstrate for the first time an important role of the inflammassome in the development of inflammatory hyperalgesic.

A hiperalgesia inflamatória é o processo pelo qual ocorre a sensibilização dos neurônios nociceptores aferentes primários por mediadores químicos inflamatórios, gerando assim uma diminuição do limiar nociceptivo e como consequência episódios de dor. Entre os principais mediadores envolvidos com a sensibilizacão das fibras nociceptivas periféricas está a prostaglandina E2 (PGE2), que é liberada como um produto final de uma cascata de mediadores inflamatórios. Dentro desta cascata de liberação hierárquica podemos destacar a interleucina -1? (IL)-1?, uma citocina importante na gênese da dor inflamatória, devido à sua capacidade de induzir a produção da enzima cicloxigenase-2 (COX-2), e consequentemente PGE2. O mecanismo de controle da produção da IL-1 ? envolvem dois passos intracelulares: a indução da expressão de uma forma protêica inativa (a pró-IL-1 ?) e a geração da forma biologicamente ativa (IL-1?) a partir da pró-IL-1 ?. Este último passo envolve a ação de uma cisteína-protease ativada em decorrência de um processo inflamatório, conhecida como Caspase-1, a qual cliva a pró-IL-1? em IL1?. Recentemente, nosso grupo demonstrou que a caspase-1 tem um papel importante na gênese da dor inflamatória, sendo crucial para a geração de IL-1? e consequentemente COX2/PGE2. Porém, não são conhecidos os mecanismos de ativação da caspase-1 na hiperalgesia inflamatória. Sabe-se que a ativação da Caspase-1 e clivagem da pro-IL-1? são dependentes de uma plataforma molecular intracelular denominada inflamassoma. Os principais inflamassomas ativadores de caspase-1 são formados pelas proteínas NLRP3, IPAF (NLRC4) e por sua molécula adaptadora ASC. O objetivo desse trabalho então foi avaliar a participação do inflamassoma na gênese da dor inflamatória. Nós identificamos que as moléculas IPAF e ASC, mas não o NLRP3, participa no desenvolvimento da hiperalgesia inflamatória mecânica e térmica induzida pela carragenina. Observou-se que estas moléculas são cruciais para a ativação da Caspase-1 e, consequentemente, para a produção da IL-1? ativa. Estes resultados evidenciam pela primeira vez um papel importante do inflamassoma no desenvolvimento da hiperalgesia inflamatória. / The inflammatory hyperalgesic is the process by which occurs the sensitization of nociceptors primary afferent neurons by inflammatory chemical mediators, that generating a decreased nociceptive threshold and result in episodes of pain. Among the main of nociceptive mediators involved with sensitization of peripheral nociceptive fibers are prostaglandin E2 (PGE2), which is released as a final product of a cascade of inflammatory mediators. Within this hierarchical cascade of release can highlight interleukin-1? (IL)-1?, a cytokine important in the genesis of inflammatory pain due to their ability to induce the production of the enzyme cyclooxygenase-2 (COX-2) and consequently PGE2. The control mechanism production of intracellular IL-1 ? involved two steps: induction of expression of a protein inactive form (pro-IL-1 ?) and the generation of the biologically active form from pro-IL-1 ? (IL-1?). This last step involves the action of a cysteine protease-activated due to an inflammatory process, known as Caspase-1, which cleaves pro-IL-1? to IL-1?. Recently our group has demonstrated that caspase-1 plays an important role in the genesis of inflammatory pain, crucial for the generation of IL-1? and consequently COX2/PGE2. However, there aren\'t known mechanisms of activation of caspase-1 in inflammatory hyperalgesic. It is known that the activation of Caspase-1 cleavage and pro-IL-1? are dependent on an intracellular molecular platform called inflammassome. The main inflammassome activators of caspase-1 proteins are formed by NLRP3, IPAF (NLRC4) and its adapter molecule ASC. The aim of this study was to evaluate the inflammassome participation in the genesis of inflammatory pain. We have identified molecules IPAF and ASC, but not NLRP3, is participate in the development of mechanical and thermal inflammatory hyperalgesic induced by carrageenan. It was observed that these molecules are crucial for the activation of Caspase-1 and thus for the production of active IL-1?. These results demonstrate for the first time an important role of the inflammassome in the development of inflammatory hyperalgesic.

Made available in DSpace on 2015-04-01T14:16:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 2775324 bytes, checksum: ce5694da4c072e08c6fa70d415e06035 (MD5) Previous issue date: 2013-02-21 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Lectins are proteins or glycoproteins of non-immune origin that have at least one non-catalytic site which binds reversibly to carbohydrates and glycoconjugates, which makes them ideal models for studies of cell-cell interactions and cell-virus, being good models for the design of new drugs. Some carbohydrate-binding proteins resembling the lectins but with some structural and functional differences, that exclude of this group. The Fabaceae Acacia farnesiana has in its seeds an agglutinin chitin-binding (AFAL), classified as PHA-like1. Its standard chromatographic revealed time-dependent oligomerization. This dynamic behavior complicates the protein crystallization and determining of the three dimensional structure. To better understand the structure-function relationship, this study aimed to examine AFAL anti-inflammatory activity through structural comparison with legume lectins. For both, it was the molecular modeling and docking with a glycan and carrageenan. AFAL model is folded as a β sandwich, which differs from the template used (Pisum sativum lectin) in loop regions, number of β-sheets and carbohydrate site. The docking showed that the protein binds to the carrageenan and glycan at different sites, which can be explained by absence of the sixth β-sheet (frontal β-sheets) and two β-sheets in posterior region. The A. farnesiana agglutinin can inhibit carrageenan induced inflammation due binding it, preventing its entrance into the cell and triggers the inflammatory process reactions. / Lectinas são proteínas e/ou glicoproteínas de origem não imune que possuem, no mínimo, um sítio não-catalítico que se liga de forma reversível a carboidratos e glicoconjugados, o que as tornam modelos ideais de estudos de interações célula-célula, célula-vírus, sendo bons modelos para o desenho de novos fármacos. Algumas proteínas possuem capacidade de se ligar a carboidratos, assemelhando-se às lectinas, porém com algumas diferenças estruturais e funcionais, que as excluem desse grupo. A Fabaceae Acacia farnesiana possui em suas sementes uma aglutinina ligante de quitina (AFAL), classificada como PHA-like1. Seu padrão cromatográfico revelou oligomerização tempo-dependente. Esse comportamento dinâmico dificulta a cristalização dessa proteína, bem como determinação da estrutura tridimensional. Visando compreender melhor a relação estrutura-função, este trabalho teve por objetivo analisar a atividade anti-inflamatória de AFAL através de comparação estrutural com lectinas de leguminosas. Para tanto, fez-se a modelagem e docking molecular com um glicano e a carragenina. A AFAL apresentou um modelo dobrado como um sanduiche de folhas β, que difere do molde utilizado (lectina de Pisum sativum) em regiões de loops, no número de folhas β e no sítio de ligação à carboidratos. O docking revelou que a proteína se liga à carragenina e ao glicano em sítios diferentes, o que pode ser explicado pela ausência de uma sexta folha β frontal e de duas folhas β na região posterior. A aglutinina de A. farnesiana pode inibir a inflamação causada por carragenina, por se ligar a ela, impedindo sua entrada na célula e o desencadeamento de reações típicas do processo inflamatório.

Submitted by Automa??o e Estat?stica (sst@bczm.ufrn.br) on 2017-06-02T21:45:30Z No. of bitstreams: 1 JonasGabrielDeOliveiraPinheiro_DISSERT.pdf: 2688247 bytes, checksum: d2a64eed33cb23425b53e9d128e55479 (MD5) / Approved for entry into archive by Arlan Eloi Leite Silva (eloihistoriador@yahoo.com.br) on 2017-06-07T19:42:15Z (GMT) No. of bitstreams: 1 JonasGabrielDeOliveiraPinheiro_DISSERT.pdf: 2688247 bytes, checksum: d2a64eed33cb23425b53e9d128e55479 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-07T19:42:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 JonasGabrielDeOliveiraPinheiro_DISSERT.pdf: 2688247 bytes, checksum: d2a64eed33cb23425b53e9d128e55479 (MD5) Previous issue date: 2017-03-31 / As ?rvores da esp?cie Copaifera multijuga Hayne crescem abundantemente na regi?o da Amaz?nia, apresentando grande visibilidade por seu ?leo-resina, que apresenta atividade anti-inflamat?ria. A forma??o de complexo de inclus?o (CI) com a ciclodextrina (CD) tem sido aplicada como alternativa para resolver algumas limita??es que os ?leos tem em comum, principalmente a baixa solubilidade em ambientes aquosos. Ent?o, o objetivo deste trabalho foi desenvolver CI?s do ?leo-resina de Copaifera multijuga (OCM) com a ?-ciclodextrina (?CD) e com a hidroxipropil-?-ciclodextrina (HP?CD) e avaliar a atividade anti-inflamat?ria deles. Inicialmente, foram realizados estudos te?ricos computacionais nos quais foram calculadas as energias de intera??o entre a ?CD e o ?-cariofileno (?CF), composto mais abundante do OCM. Em seguida, foram preparados os CI?s com ?CD e HP?CD pelos m?todos da mistura f?sica (MF), malaxagem (MAL) e co-precipita??o (CP). Foi realizada a caracteriza??o f?sico-qu?mica dos CI?s por espectroscopia de absor??o na regi?o do infravermelho com transformada Fourier (FTIR), microscopia eletr?nica de varredura (MEV), difra??o de raios X pelo m?todo do p? (DRX), an?lise termogravim?trica (TG) e calorimetria explorat?ria diferencial (DSC). Por fim, os CI?s de ?CD e HP?CD foram comparadas em rela??o ? suas atividades anti-inflamat?rias com o OCM puro. Os estudos te?ricos computacionais mostraram valores energ?ticos de -20,8 kcal?mol-1 e -17,0 kcal?mol-1 da complexa??o com a face menor e com a face maior do ?CF, respectivamente, entrando pela cavidade maior da ?CD. Pelo FTIR, foi poss?vel observar que ocorreu a intera??o entre a ?CD e o OCM por MAL e CP, e entre a HP?CD e o OCM, pelo CP. Na MEV, na DRX e na TG, foi poss?vel concluir que houve intera??o entre a ?CD e o OCM por MAL e CP. No caso da DSC foi observado que ocorreu intera??o entre a ?CD e o OCM e entre a HP?CD e o OCM pelos dois m?todos. O OCM e os CI?s de ?CD e de HP?CD (preparados por CP) mostraram evidente atividades anti-inflamat?rias pela diminui??o do edema de pata, nos n?veis de nitrito e da atividade da enzima mieloperoxidase, evidenciando que os CI?s do OCM com a ?CD e a HP?CD mantiveram a atividade anti-inflamat?ria do OCM. / Copaifera multijuga Hayne trees grows abundantly in Amazon region, presenting wide visibility for its oleoresin, which shows anti-inflammatory activity. The inclusion complex (IC) formation with cyclodextrin (CD) has been applied as alternative to solve some limitations that oils have in common, principally the poor aqueous solubility. Thus, this work aimed the ICs development of Copaifera multijuga oleoresin (CMO) with ?-cyclodextrin (?CD) and with hydroxypropyl-?-cyclodextrin (HP?CD) and evaluating of its anti-inflammatory activities. Initially, it were realized computational theoretical studies, in which were calculated the interaction energies between ?CD e o ?-caryophyllene (?CP), most abundant compound in CMO. Next, it were prepared ?CD and HP?CD IC?s by physical mixture, kneading method (KND) and slurry method (SL). ICs physical-chemical characterization was realized by Fourier transform infrared absorption region spectroscopy (FTIR), scanning electronic microscopy (SEM), powder X-ray diffraction (XRD), thermogravimetric analysis (TGA) and differential scanning calorimetry (DSC). Finally, ?CD and HP?CD IC?s were compared to pure CMO, in relation to its anti-inflammatory activity. Computational theoretical studies showed energetic values of -20.8 kcal?mol-1 and -17.0 kcal?mol-1 of complexation with ?CP minor and lager face, respectively, entering through the ?CD larger cavity side. In FTIR, it was possible observing that occurred interaction between ?CD and CMO by KND and SL, and between HP?CD and CMO by SL. In SEM, in XRD and in TGA, it was possible conclude that there was interaction between ?CD and CMO by KND and SL. In DSC case, it was observed that occurred interaction between ?CD and CMO and between HP?CD and CMO by KND and SL. CMO and ?CD and HP?CD ICs showed evident anti-inflammatory activity by paw edema, nitrite concentration and myeloperoxidase activity decreasing, evidencing that ICs of CMO with ?CD and HP?CD, which keeping the CMO anti-inflammatory activity.