Cette thèse est consacrée à une enquête sur la structure et la dynamique, avec des modèles théoriques et essais de laboratoire, sur deux types communs de défauts arrivant dans la molécule d’ADN, après des dégâts de radiation ou le produit chimique: mésappariements des base(MB) et casseurs de brin.Tels défauts pourraient arriver naturellement, d’imperfections dans le processus cellulaire, induit par l’environnement et ou induit artificiellement, comme pour la radiothérapie de cancer. Nous avons utilisé la spectroscopie de force moléculaire exécutée par des pinces optiques accompagnées par des simulations all-atom en Dynamique Moléculaire (MD), pour caractériser des MB dans des hairpin d’ADN. Ensuite nous avons construit des modèles structurels pour les casseurs de brin d’ADN, dans les deux indexent les éléments constitutifs de la chromatine: le ADN linker et le nucléosome. Grâce à l'application de diffèrent techniques (Essential Dynamics, Steered MD, …) on a caractérisé les stades précoces de l’évolution de cette lésion d’ADN dans les deux éléments. / This thesis is dedicated to a combined theoretical and experimental investigation of the structure and dynamics of two common types of defects occurring in the DNA molecule, after chemical or radiation damage: basemismatches and strand breaks. We used single-molecule force spectroscopy performed by optical tweezers accompanied by Molecular Dynamics (MD) all-atom simulations, to characterize mismatches in short DNA hairpins. We demonstrate that it is possible to use SMFS. Subsequently, we designed structural models for the DNA strand-break defects, in the two key constitutive elements of the chromatin: the DNA linker and the nucleosome. Using different techniques (Essential Dynamics, steered MD, covariant mechanical stress, …) we characterized the early stages of the evolution of this DNA lesion in the two elements.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Rayons ionisants, dessiccation, ou encore métabolites secondaires exogènes sont autant de facteurs qui peuvent engendrer des dommages à l’ADN chez les bactéries du sol, notamment en provoquant la formation de cassures double-brin (DSB), préjudice majeur pour une cellule. Chez les procaryotes, l’évolution a sélectionné deux principaux mécanismes de réparation des DSB, à savoir la recombinaison homologue (RH) et le non-homologous end joining (NHEJ). La RH est un mécanisme quasi-ubiquiste dans le monde bactérien qui repose sur l’utilisation d’une copie intacte de la molécule endommagée comme matrice pour la réparation de la DSB. Contrairement à la RH, le NHEJ n’est présent que chez 20 à 25% des bactéries et est considéré comme un mécanisme mutagène puisque la réparation de la DSB se fait sans matrice homologue et peut entrainer l’ajout ou la délétion de nucléotides au site de cassure. Chez la bactérie modèle Mycobacterium, seuls deux acteurs sont nécessaires pour la réparation par NHEJ. Ainsi, un dimère de protéine Ku se fixe sur la cassure puis recrute la protéine multifonctionnelle LigD, qui catalyse le traitement puis la ligation des extrémités grâce à ses domaines polymérase, nucléase et ligase. Les mécanismes de réparation des DSB chez les Streptomyces étaient peu connus à l’initiation de ce travail. Cette bactérie présente des caractéristiques génomiques remarquables avec notamment un chromosome linéaire de grande taille (6 à 12 Mb). En ce qui concerne la RH, nous avons focalisé nos recherches sur les étapes tardives (post-synaptiques) et étudié le rôle du complexe RuvABC et de RecG impliqués chez Escherichia coli dans la migration de la croix de Holliday et de sa résolution. La construction de mutants simples et multiples a montré que bien que les gènes codant ces protéines soient très conservés chez les Streptomyces, leur déficience ne se traduit chez Streptomyces ambofaciens que par une faible baisse de la recombinaison suite à un événement de conjugaison. Aucune baisse de l’efficacité de recombinaison intrachromosomique n’a en revanche été observée. Ces résultats suggèrent que des acteurs alternatifs majeurs sont encore à découvrir chez les Streptomyces. Le décryptage du mécanisme de NHEJ chez S. ambofaciens constitue une première dans ce genre bactérien. Une étude génomique exhaustive a permis de révéler la très grande diversité du nombre d’acteurs potentiels de ce mécanisme (Ku, LigDom, PolDom, NucDom) et de l’organisation des gènes qui les codent.. L’analyse fonctionnelle a révélé que l’ensemble des acteurs étaient impliqués dans la réponse à l’exposition à un faisceau d’électrons accélérés, connus pour induire, entre autre, la formation de DSB. La génération de DSB, par coupure endonucléasique I-SceI, a par ailleurs permis de mettre en évidence au niveau moléculaire des réparations de type NHEJ (délétions ou insertions de quelques nucléotides, intégration de fragments d’ADN). Les cassures dans les régions terminales du chromosome sont accompagnées de grandes délétions (jusqu’à 2,1 Mb) et de réarrangements de grande ampleur incluant circularisations du chromosome et amplifications d’ADN. Les conséquences de la réparation de DSB chez S. ambofaciens sont en tous points similaires aux réarrangements observés spontanément ou par comparaison des génomes des espèces types. Ainsi, il est possible de lier la plasticité du génome à la réparation de DSB. En outre, l’intégration de matériel génétique exogène serait favorisée au cours de la réparation NHEJ ce qui donnerait à ce système de réparation une place importante dans le processus de transfert horizontal, mécanisme d’évolution majeur chez les bactéries / Ionizing radiation, desiccation or exogenous secondary metabolites are all factors that can cause DNA damage in soil bacteria, especially by triggering double strand breaks (DSB), the most detrimental harm for the cell. In prokaryotes, evolution selected two main DSB repair pathways, namely homologous recombination (HR) and non-homologous end joining (NHEJ). HR is almost ubiquitous in bacteria and relies on an intact copy of the damaged DNA molecule as a template for DSB repair. In contrast to HR, NHEJ is only present in 20 to 25% of bacteria and is considered as a mutagenic pathway since DSB repair is performed without the need of any template and can lead to nucleotide addition or deletion at DSB site. In the bacterial model Mycobacterium, two partners are sufficient for a functional NHEJ pathway. Thus, Ku protein dimer recognizes and binds the DSB and then recruits the multifunctional LigD protein for extremities treatment and ligation thanks to its polymerase, nuclease and ligase domains. At the beginning of this work, few informations on DSB repair in Streptomyces were available. This bacteria exhibits remarkable genomic features including a large linear chromosome (6 to 12 Mb). Regarding HR, we focused on the late stage (post-synaptic step) in studying the role of RuvABC complex and RecG, involved in branch migration and Holliday junction resolution in E. coli. Construction of single and multiple mutants showed that although the genes encoding these proteins are highly conserved in Streptomyces, their deficiency in Streptomyces ambofaciens only results in a mild decrease of recombination after conjugation events. Besides, no decrease of intrachromosomal recombination efficiency could be observed. These results suggest that major alternative factors are still to be discovered in Streptomyces. This work was also the first occasion to decipher a NHEJ pathway in Streptomyces. An exhaustive genomic study revealed a great diversity in the number of factors potentially implicated in this pathway (Ku, LigDom, PolDom, NucDom) and in the organization of their encoding genes. Functional analyses revealed that all the factors, whatever they are conserved or not between species, were involved in the response to electron beam exposure, known to induce, amongst other things, DSB formation. Generation of DSB by I-SceI endonuclease cleavage was also used to evidence at a molecular level NHEJ type DSB repair (deletions or insertions of several nucleotides, integration of DNA fragments). Targeted breaks in the terminal regions of the chromosome were accompanied by large deletions (up to 2.1 Mb) and major rearrangements including chromosome circularizations and DNA amplifications. Consequences of DSB repair in S. ambofaciens are in all points similar to chromosome rearrangements observed spontaneously or by comparing genomes of different species. Thus, it is possible to link the genome plasticity to DSB repair. In addition, the integration of exogenous genetic material would be favoured during NHEJ repair which would give this repair system a major role in the horizontal transfer process, known to be a main evolution mechanism in bacteria

Les cassures double-brin (CDBs) de l'ADN sont décrites comme étant les lésions de l'ADN les plus délétères puisqu'elles conduisent systématiquement à la mort de la cellule si elles ne sont pas réparées. Les CDBs peuvent être réparées par différents mécanismes et notamment par Non-Homologous End-Joining (NHEJ). Chez les eucaryotes, les protéines centrales de la NHEJ, Ku70 et Ku80, forment un hétérodimère capable de se lier aux extrémités de l'ADN générées par la cassure. Par la suite, Ku70 et Ku80 recrutent de nombreuses autres protéines permettant la modification des extrémités et la réparation de la CDB par ligation. La NHEJ a également été caractérisée chez un nombre limité de bactéries chez qui le mécanisme semble moins complexe que chez les eucaryotes. Chez les bactéries, la NHEJ nécessite seulement deux protéines : un homodimère de Ku, et la protéine multifonctionnelle LigD capable de modifier les extrémités et d'effectuer la ligation. La majorité des études faites sur la NHEJ ont été menées chez des bactéries ne possédant qu'une seule paire des gènes ku/ligD. Cependant, de nombreux autres génomes bactériens possèdent plusieurs copies de ces deux gènes et le fonctionnement de la NHEJ chez ces organismes est inconnu. Le génome de la bactérie symbiotique Sinorhizobium meliloti code quatre Ku putatives (ku1-4) et quatre LigD putatives (ligD1-4). A ce jour, une seule étude a été menée chez ce modèle bactérien montrant que chacun des simples mutants ku est plus sensible que la souche sauvage à un traitement aux rayonnements ionisants, suggérant que chacune des Ku joue un rôle dans la réparation des CDBs par NHEJ. Par l'utilisation de différentes approches in vivo, nous avons mené une caractérisation génétique de la NHEJ chez S. meliloti permettant de clarifier les contributions relatives des gènes ku et ligD dans le mécanisme. Pour la première fois chez une bactérie, nous avons pu obtenir des résultats montrant la présence de plusieurs systèmes indépendants de NHEJ chez S. meliloti, et suggérant l'existence d'un possible hétérodimère de Ku. Nous avons également mis en évidence que la NHEJ est activée dans différentes conditions de stress, telles que le stress thermique et la carence nutritive, et qu'une partie de cette réparation est sous le contrôle du régulateur central de la réponse générale au stress RpoE2. Par ailleurs, nous avons montré que la NHEJ, et plus généralement les mécanismes de réparation des CDBs sont impliqués dans la résistance à la dessiccation chez S. meliloti. Enfin, nous avons généré la première preuve expérimentale d'une implication de la NHEJ dans le transfert horizontal de gène chez les bactéries. Dans leur ensemble, ces travaux enrichissent nos connaissances sur les mécanismes de réparation des CDBs chez les bactéries possédant plusieurs orthologues de Ku et LigD. Ils suggèrent également que la NHEJ pourrait contribuer à l'évolution des génomes, en particulier en condition de stress, non seulement en raison du caractère mutagène de ce type de réparation mais également en participant à l'acquisition d'ADN exogène originaire de bactéries distantes. / DNA double-strand breaks (DSBs) are described as the most deleterious DNA damages as they can lead to cell death if they are not repaired. DSBs can be repaired through several mechanisms, including Non-Homologous End-Joining (NHEJ). In eukaryotes, the main NHEJ proteins, Ku70 and Ku80, bind DNA ends as a heterodimer, and then recruit several additional proteins including enzymes which catalyze the processing and ligation of DNA ends. NHEJ has also been characterized in a limited number of bacteria, where the repair mechanism appears to be less complex than in eukaryotes. Indeed, only two proteins are required: a homodimeric Ku protein, and a multifunctional LigD enzyme able to process and ligate the DNA ends. However, most studies were performed on bacterial species encoding a single pair of ku/ligD. Actually, many bacterial species encode multiple copies of these genes, whose relative contributions to NHEJ in vivo are so far unknown. The Sinorhizobium meliloti genome encodes four putative Ku (ku1-4) and four putative LigD (ligD1-4). To date, a single study conducted on this model bacterium showed that every ku single mutant is more sensitive than the wild type strain to ionizing radiations showing that all ku genes are involved in NHEJ repair of DSBs in this organism. Here, using several in vivo approaches, we performed a comprehensive genetic characterization of NHEJ repair in S. meliloti, and clarified the respective contributions of the various ku and ligD genes. For the first time in bacteria, we obtained results showing the presence of several independent NHEJ systems in S. meliloti and suggesting the existence of a putative heterodimeric form of Ku. We also demonstrated that NHEJ repair is activated under various stress conditions, including heat and nutrient starvation, and that part of this repair is under the control of the general stress response regulator RpoE2. We showed that NHEJ and more generally DSB repair mechanisms are involved in desiccation resistance in S. meliloti. Finally, for the first time in bacteria, we provided evidence that NHEJ not only repairs DSBs, but can also erroneously integrate heterologous DNA molecules into the breaks. Altogether, our data provide new insights into the mechanisms of DSB repair in bacteria which encode multiple Ku and LigD orthologues. It also suggest that NHEJ might contribute to the evolution of bacterial genomes under adverse environmental conditions not only through error-prone repair of DSB by its mutagenesis repair characteristic but also by participating in the acquisition of foreign DNA from distantly related organisms during horizontal gene transfer events.

La méiose est essentielle pour tous les organismes à reproduction sexuée car cette division cellulaire spécialisée conduit à la formation de gamètes. Au cours de la méiose, la formation de bivalents est une étape clé dans la répartition équilibrée des chromosomes homologues. Dans la majorité des espèces, la formation de ces bivalents repose sur le mécanisme de la recombinaison homologue qui est un mécanisme de réparation des cassures double brin (CDB) de l’ADN. En méiose, la cassure est programmée et provoquée par l’action de Spo11. A.thaliana contient deux homologues SPO11-1 et SPO11-2 qui ne sont pas redondants dans la formation des CDB. Spo11 est une protéine apparentée à la sous-unité A des topoVI d’Archaea. Or, les topoVI d’Archaea fonctionnent en hétérotétramère composé de deux sous-unités A et deux sous-unités B pour former une cassure double brin (CDB) mais jusqu'à mon travail de thèse, aucun homologue méiotique de sous unité B n'avait été identifié. Au cours de ma thèse, j’ai caractérisé la fonction méiotique de la protéine MTOPVIB et montré que c’est un homologue structural de la sous-unité B des TopoVI d’Archaea. Par différentes approches, j’ai montré que MTOPVIB est nécessaire à l’hétérodimérisation de SPO11-1 avec SPO11-2 et je propose que chez A. thaliana, un complexe catalytique de type TopoVI composé de MTOPVIB, SPO11-1, et SPO11-2 est nécessaire à la formation des CDB méiotiques. Chez A. thaliana, en plus de SPO11-1, SPO11-2 et MTOPVIB, quatre autres protéines sont nécessaires à la formation des CDB : PRD1, PRD2, PRD3 et DFO. Par des approches double hybride, j’ai analysé le réseau d’interaction entre ces protéines de « cassure ». Les résultats suggèrent que ces protéines interagiraient au sein d’un « super » complexe essentiel à la formation des CDB méiotiques. / Meiosis is an essential step in sexual reproduction because it leads to the formation of haploid gametes. During meiosis, the formation of bivalents is a key step for the balanced chromosome distribution. In most species, the formation of bivalents lies on the mechanism of homologous recombination that is a repair mechanism for double stranded DNA breaks (DSB). In meiosis, DSB formation is programmed and provoked by the action of Spo11. A.thaliana contains two SPO11-1 and SPO11-2 counterparts which are not redundant in the formation of DSB. Spo11 is related to the A subunit of Archaea topoVI. However, Archaea topoVI operate through a heterotetramer composed of two A subunits and two B subunits but until my thesis work, no meiotic homolog of the B subunit had been identified. During my thesis, I characterized the meiotic function of the new protein MTOPVIB and showed that it shares structural similarities with the B subunit of Archaea TopoVI. Using different strategies, I also demonstrated that MTOPVIB is necessary to the SPO11-1/ SPO11-2 heterodimerization strongly suggesting that in A. thaliana, a catalytic TopoVI like complex is necessary for the formation of meiotic DSB. In addition to SPO11-1, SPO11-2, and MTOPVIB, four other proteins are necessary for the formation of meiotic DSB in A. thaliana : PRD1, PRD2, PRD3 and DFO. By yeast two hybrid approach, I analysed the interaction network between the "DSB" proteins. The results suggest that these proteins could act in a "super" complex which would be essential to the formation of DSBs.

L’organisation non-aléatoire du noyau des cellules eucaryotes et la compaction de l’ADN en chromatine plus ou dense peuvent influencer de nombreuses fonctions liées au métabolisme de l’ADN, y compris la stabilité du génome. Les cassures double-brin sont les dommages à l’ADN les plus néfastes pour la cellule. Pour préserver l’intégrité de leur génome, les cellules eucaryotes ont développé des mécanismes de réparation des cassures double-brin qui sont conservés de la levure à l’homme. Parmi ceux-ci, la recombinaison homologue utilise une séquence homologue intacte présente ailleurs dans le génome et peut se diviser en deux sous voies de réparation. La conversion génique transfère l’information génétique d’une molécule à son homologue, tandis que le Break Induced Replication (BIR) établit une fourche de réplication qui peut procéder jusqu’à la fin du chromosome.Mon travail de thèse s’est attaché à caractériser la contribution du statut chromatinien et de l’organisation tridimensionnelle du génome à la réparation des cassures double-brin. L’organisation du noyau de la levure S. cerevisiae ainsi que la propagation de l’hétérochromatine au niveau des régions subtélomériques peuvent être modifiées via la surexpression des protéines Sir3 et sir3A2Q. Nous avons montré que le groupement des télomères accroit la conversion génique entre deux séquences subtélomériques, soulignant le rôle clé de la proximité spatiale et de la recherche d’homologie. Nous avons également constaté que la présence d’hétérochromatine au niveau du site de cassure limite la résection, ce qui permet une disparition plus lente des extrémités, qui resteraient disponibles plus longtemps pour réaliser la recherche d’homologie et achever la réparation. Enfin, nous avons observé que la présence d’hétérochromatine au site donneur diminue l’efficacité de recombinaison et qu’elle doit moduler une étape commune aux deux voies de réparation, à savoir l’invasion de brin. Ces travaux nous ont permis de décrire de nouvelles voies de régulation de la réparation de l’ADN. / The non-random organization of the eukaryotic cell nucleus and the folding of genome in chromatin more or less condensed can influence many functions related to DNA metabolism, including genome stability. Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA damages for the cells. To preserve genome integrity, eukaryotic cells thus developed DSB repair mechanisms conserved from yeast to human, among which homologous recombination (HR) that uses an intact homologous sequence to repair a broken chromosome. HR can be separated in two sub-pathways: Gene Conversion (GC) transfers genetic information from one molecule to its homologous and Break Induced Replication (BIR) establishes a replication fork than can proceed until the chromosome end.My doctorate work was focused on the contribution of the chromatin context and 3D genome organization on DSB repair. In S. cerevisiae, nuclear organization and heterochromatin spreading at subtelomeres can be modified through the overexpression of the Sir3 or sir3A2Q mutant proteins. We demonstrated that reducing the physical distance between homologous sequences increased GC rates, reinforcing the notion that homology search is a limiting step for recombination. We also showed that heterochromatinization of DSB site fine-tunes DSB resection, limiting the loss of the DSB ends required to perform homology search and complete HR. Finally, we noticed that the presence of heterochromatin at the donor locus decreased both GC and BIR efficiencies, probably by affecting strand invasion. This work highlights new regulatory pathways of DNA repair.

Au cours de son cycle sexuel, le cilié Paramecium tetraurelia procède à de massifs réarrangements programmés de son génome (RPG). Ils consistent, entre autres choses, en l’excision de 45 000 séquences précisément délimitées, appelées IES (Internal Eliminated Sequences). La transposase domestiquée Piggymac (Pgm) introduit les cassures double-brin (CDB) à l’extrémité des IES. La réparation très précise de ces dommages est réalisée par la voie de réparation des extrémités non-homologues (NHEJ). Un des acteurs de cette voie est l’hétérodimère Ku70/Ku80. Suite à des duplications globales du génome, la paramécie possède trois gènes KU80, Un seul de ces gènes est induit lors des RPG (KU80c) et une expérience d’ARN interférence (ARNi) contre KU80c montre une complète inhibition de l’introduction des CDB. De plus, des expériences de Co-IP en système hétérologue montrent que Ku70/Ku80c interagit avec Pgm. Ces résultats prouvent le rôle essentiel de Ku dans l’introduction des CDB lors des RPG et soulèvent la question du mécanisme impliqué. Au cours de ma thèse j’ai caractérisé le couplage entre Ku et Pgm en analysant des expériences d’immunofluorescence avec ou sans pré-extraction, permettant de déterminer les interdépendances de ces protéines pour leur localisation et pour leur stabilité nucléaire. Ces approches ont permis de démontrer que Pgm requiert la présence de Ku pour être stablement localisé dans les noyaux lors des RPG. Ku80c partage 74% de sa séquence protéique avec Ku80a. Des expériences de complémentations fonctionnelles surexprimant Ku80a lors des RPG ont montré que Ku80a n’est pas capable ni de se localiser stablement dans les noyaux ni de participer à la stabilisation nucléaire de Pgm. De plus, les RPG sont inhibés. Ces résultats montrent que Ku80c s’est spécialisé dans le couplage avec Pgm pour l’introduction des CDB lors des RPG. L’utilisation de protéines chimériques a permis de déterminer que la spécialisation de Ku80c est portée par son domaine N-terminal ∝-β. / During its sexual cycle, the ciliate Paramecium tetraurelia undergoes massive Programmed Genome Rearrangements (PGR). They consist, among others, in excision of 45,000 precisely delimited sequences, called IES (Internal Eliminated Sequences). A domesticated transposase, PiggyMac (Pgm), introduces double-strand DNA breaks (DSB) at IES ends. The Non Homologous End Joining pathway (NHEJ) handles highly precise repair of DSB. One of the actors of this pathway is the heterodimer Ku70/Ku80. In P. tetraurelia, the KU80 gene is present in three paralogous copies. Only KU80c is specifically expressed during PGR and RNA interferences against KU80c showed a complete inhibition of DNA cleavage. Furthermore, a Co-IP experiment in a heterologous system showed that both Ku70/Ku80c interact with Pgm. These results provide evidence that Ku is an essential partner of Pgm for DSB introduction; raising the question of the activating mechanism involved. During my PhD, I characterized the coupling between Ku and Pgm by analyzing immunofluorescence experiments, with or without pre-extraction, allowing the determination of inter-dependencies between those proteins for their nuclear localization and stability. Those methods demonstrated that Pgm requires the presence of Ku for a stable nuclear localization during the PGR. Ku80c shares 74% of the protein sequence with Ku80a. Functional complementation assays overexpressing Ku80a during the PGR showed that Ku80a is not capable to stably localize in nuclei nor to participate in Pgm nuclear stability. Furthermore, PGR are inhibited. Those results show that Ku80c has specialized for the DSB introduction during PGR. The use of chimeric proteins allowed to determine that Ku80c specialization was carried out by its N terminal domain.

Chez les eucaryotes, la transmission correcte du patrimoine génétique au cours de la division cellulaire repose en partie sur l'existence de voies de surveillance ou « checkpoints » contrôlant d'une part l'intégrité de l'ADN et d'autre part la répartition équitable du génome dupliqué dans les cellules-filles au cours de la mitose. Des altérations dans la machinerie de ségrégation des chromosomes activent le checkpoint du fuseau mitotique, tandis que les checkpoints de l'ADN sont activés suite à des lésions de l'ADN ou à des défauts de la réplication. Ces systèmes de surveillance contrôlent de multiples réponses dont des arrêts de la progression du cycle de division cellulaire. Ces voies de surveillance sont très conservées chez les eucaryotes et des mutations affectant leurs composants sont fréquemment retrouvées dans des lignées tumorales humaines.<br />L'activation des checkpoints de l'ADN est, à ce jour, assez bien appréhendée et met en jeu de nombreux événements de phosphorylation. La reprise du cycle concomitante à la désactivation de ces checkpoints est moins bien comprise alors qu'elle constitue une étape tout aussi essentielle à la survie cellulaire. Nous avons montré que la surexpression de la protéine phosphatase de type 1 Glc7 facilitait l'inactivation des checkpoints de l'ADN en cas de cassures double-brin de l'ADN chez un eucaryote modèle, la levure Saccharomyces cerevisiae.<br />Les checkpoints de l'ADN et du fuseau étaient considérés comme des voies indépendantes, mais nos travaux ont montré qu'il existe des interconnections entre les deux. Nous avons observé que, d'une part, l'activité du checkpoint du fuseau et ses composants influencent la réponse au stress génotoxique, et que, d'autre part, l'état de phosphorylation de deux composants centraux des checkpoints de l'ADN, Rad53 et Rad9, était modifié en cas d'activation du checkpoint du fuseau. Nous présentons ici la caractérisation de ces modifications post-traductionnelles ainsi que la recherche de leurs significations physiologiques.

Deinococcus radiodurans est une bactérie à gram-positive connue pour son extrême résistance à une grande variété d'agents endommageant l'ADN. Parmi ces derniers, les rayonnements ionisants et la dessiccation sont les plus nocifs pour la cellule, car ils introduisent des cassures dans le génome. Les cassures double brin (CDB) sont particulièrement dangereuses et doivent être réparées de façon très efficace, afin d'éviter l'apparition de mutations pouvant mener à la mort de la cellule ou de l'organisme. La recombinaison homologue (RH) est le mécanisme le plus efficace pour la réparation des CDBs. D. radiodurans est capable de restaurer entièrement son génome en à peine 3 heures, et elle accomplit la totalité du processus par la voie RecFOR. Afin d'être réparées, les CDBs doivent d'abord être reconnu. Cette étape importante, qui a lieu peu de temps après l'apparition du dommage dans la cellule, implique la protéine RecN. RecN est recrutée dès les premières étapes de la réparation de l'ADN et des études in vivo ont démontré qu'elle avait tendance à se localiser dans des foyers discrets. Des études in vitro suggèrent également que RecN favorise l'assemblage de fragments d'ADN, une fonction décrite précédemment pour les protéines SMC (telle que cohesin), qui sont structurellement similaires à RecN. De nombreuses études structurales ont été effectuées sur la protéine de type SMC, Rad50, alors qu'à présent aucune information structurale n'est disponible pour RecN. Le travail présenté ici a porté sur la caractérisation structurale de RecN et de ses domaines. Nous avons obtenu les structures cristallines de trois constructions (se chevauchant partiellement) de RecN et une étude de diffusions des rayons X aux petits angles a été effectuée sur les domaines séparés de RecN et sur la protéine entière. Les données obtenues en solution ont complété notre étude cristallographique et nous ont permis de construire un modèle atomique de la protéine entière. Des mutations ont été conçues et les protéines mutées ont été produites et utilisées pour la caractérisation de l'activité d'hydrolyse de l'ATP caractéristique de cette famille de protéines. Des études biochimiques approfondies ont été effectuées sur les différentes constructions et mutants de RecN afin de déterminer le rôle de chacun des ses domaines. Nos résultat nous ont permis de proposer un modèle qui explique comment RecN reconnaît les CDB, maintient les deux extrémités de l'ADN, et prépare l'ADN pour la réparation par les protéines RecFOR.

Deinococcus radiodurans est une bactérie à gram-positive connue pour son extrême résistance à une grande variété d'agents endommageant l'ADN. Parmi ces derniers, les rayonnements ionisants et la dessiccation sont les plus nocifs pour la cellule, car ils introduisent des cassures dans le génome. Les cassures double brin (CDB) sont particulièrement dangereuses et doivent être réparées de façon très efficace, afin d'éviter l'apparition de mutations pouvant mener à la mort de la cellule ou de l'organisme. La recombinaison homologue (RH) est le mécanisme le plus efficace pour la réparation des CDBs. D. radiodurans est capable de restaurer entièrement son génome en à peine 3 heures, et elle accomplit la totalité du processus par la voie RecFOR. Afin d'être réparées, les CDBs doivent d'abord être reconnu. Cette étape importante, qui a lieu peu de temps après l'apparition du dommage dans la cellule, implique la protéine RecN. RecN est recrutée dès les premières étapes de la réparation de l'ADN et des études in vivo ont démontré qu'elle avait tendance à se localiser dans des foyers discrets. Des études in vitro suggèrent également que RecN favorise l'assemblage de fragments d'ADN, une fonction décrite précédemment pour les protéines SMC (telle que cohesin), qui sont structurellement similaires à RecN. De nombreuses études structurales ont été effectuées sur la protéine de type SMC, Rad50, alors qu'à présent aucune information structurale n'est disponible pour RecN. Le travail présenté ici a porté sur la caractérisation structurale de RecN et de ses domaines. Nous avons obtenu les structures cristallines de trois constructions (se chevauchant partiellement) de RecN et une étude de diffusions des rayons X aux petits angles a été effectuée sur les domaines séparés de RecN et sur la protéine entière. Les données obtenues en solution ont complété notre étude cristallographique et nous ont permis de construire un modèle atomique de la protéine entière. Des mutations ont été conçues et les protéines mutées ont été produites et utilisées pour la caractérisation de l'activité d'hydrolyse de l'ATP caractéristique de cette famille de protéines. Des études biochimiques approfondies ont été effectuées sur les différentes constructions et mutants de RecN afin de déterminer le rôle de chacun des ses domaines. Nos résultat nous ont permis de proposer un modèle qui explique comment RecN reconnaît les CDB, maintient les deux extrémités de l'ADN, et prépare l'ADN pour la réparation par les protéines RecFOR. / Deinococcus radiodurans is a Gram-positive bacterium known for its extreme resistance to a broad variety of DNA damaging agents. Among these, Ionizing Radiations and desiccation are the most harmful for the cell, since they introduce breaks in the genome. Double Strand Breaks (DSB) are particularly hazardous for the cell and they need to be repaired very efficiently, in order to avoid mutations leading to altered, if not lethal, phenotypes. Homologous Recombination (HR) is the most efficient mechanism by which DSBs are repaired. D. radiodurans is able to completely restore its genome in only 3 hours, and it accomplishes the entire process through the RecFOR pathway. In order to be repaired, DSBs first need to be recognized. The protein believed to be responsible for this important step that takes place soon after the damage occurs in the cell, is RecN. RecN is recruited at the early stages of DNA repair and in vivo studies have demonstrated its propensity to localize to discrete foci. In vitro studies also suggest that RecN possesses a DNA end-joining activity previously observed for SMC proteins (such as cohesin), which are structurally related to RecN. Several structural studies have been carried out on the SMC-like protein, Rad50, but so far no structural information is available for RecN. The work presented here focused on the structural characterization of RecN and its constitutive domains. We obtained crystal structures of three partially overlapping constructs of RecN and Small Angle X-ray Scattering was performed on the individual domains and the full-length protein. The study of RecN in solution complemented our crystallographic study and enabled us to build a reliable, atomic model of the full-length protein. Mutations were designed and the mutant RecN proteins were produced in order to characterize the ATP hydrolysis activity of RecN, which is a conserved feature of this family of proteins. Extensive biochemical studies were carried out on wild-type and mutants of both the full-length protein and the single domains, in order to determine the role and function of each of the domains. Our results led us to propose a model for how RecN might recognize DSBs, tether two broken DNA ends and prepare the DNA for subsequent repair by the RecFOR machinery.