Orientador: Joni Augusto Cirelli / Resumo: As cisteíno-peptidases e as citocinas desempenham um papel importante no inicio e progressão dos processos imuno-inflamatórios, dentre estes, a doença periodontal. As fitocistatinas são cistatinas derivadas das plantas, inibidoras naturais das cisteíno- peptidases. Entre elas a Citrus CPI-2, derivada da laranja e a Cane CPI-4, derivada da cana-de-açúcar tem sido recentemente investigadas. O estudo das mesmas pode levar a novas terapias para o controle da doença periodontal, bem como outras doenças imuno- inflamatórias. O objetivo do presente estudo foi avaliar o efeito inibitório das fitocistatinas (Cane CPI-4 e Citrus CPI-2) sobre mediadores da inflamação. Em estudo in vitro, foi avaliado o efeito da atividade inibitória das fitocistatinas sobre a expressão gênica (RT-PCR em tempo real) das catepsinas B e K e citocinas pró-inflamatórias (IL- 1β, IL-6 e TNF-α) em células de linhagem macrofágica de camundongos (RAW 264.7), após 12 e 24h de estímulo com Porphyromonas gingivalis inativada por calor. Em estudo in vivo, foi avaliada a ação de diferentes concentrações das fitocistatinas sobre a produção de TNF- a por células sanguíneas de ratos submetidos à injeção de LPS de E.coli . Todos os animais foram submetidos à implementação de cânulas na veia femoral para à injeção de LPS de E.coli e na artéria femoral para a extração de sangue em 6 diferentes tempos (de 30 a 180 minutos) após o estimulo com LPS de E.coli (IV, 100 Ug/Kg). A quan... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The cysteine proteinases and the cytokines play an important role in the initiation and progression of immune-inflammatory processes such as periodontal disease. The phytocystatins are cystatins derived from plants and they are natural inhibitors of cysteine proteinases. Among them, the Citrus CPI-2 derived from orange and Cane CPI- 4 derived from sugar cane have been investigated. The study of them may lead to new therapies for the control of periodontal disease and other immune inflammatory diseases. The overall objective of this study was to evaluate the effect of phytocystatins CaneCPI- 4 and CitrusCPI-2 on mediators of inflammation. The aim of the in vitro study was to assess the inhibitory activity of phytocystatins on gene expression (RT-PCR) of cathepsins B and K and pro-inflammatory cytokines (IL- 1β and IL-6 and TNF-α) in murine macrophage cells (RAW 264.7) after 12 and 24 hours of stimulation with heatinactivated bacteria Porphyromonas gingivalis. The aim of the in vivo study was to assess the inhibitory activity of both phytocystatins in the production of TNF-α by blood cells of rats submitted by an injection of lipopolysaccharide (LPS) of E.coli. All animals were subjected to the implementation of cannulas to femoral artery and vein for blood collection at 6 different time points (from 30 to 180 minutes) after LPS stimulus (IV, 100 ug/kg). Quantification of TNF-α was performed by ELISA. According to the results of the in vitro study, Citrus CPI-2 showed a signifi... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Introdução: Rhipicephalus microplus é um parasito importante na bovinocultura. Novas estratégias de controle dependem de um maior entendimento da sua fisiologia e da relação parasito-hospedeiro, e moléculas envolvidas na aquisição e digestão de sangue são alvos interessantes. Objetivo: determinar o mecanismo de ação do inibidor de coagulação BmGTI (Boophilus microplus Midgut Thrombin Inhibitor). Metodologia: BmGTI foi obtido a partir do homogenato de intestino de fêmeas de R. microplus parcialmente ingurgitadas utilizando técnicas de cromatografia de troca iônica, gel filtração e afinidade por trombina. A atividade inibitória foi monitorada pelo ensaio de coagulação do fibrinogênio induzida por trombina. A preparação de BmGTI foi avaliada por SDS-PAGE e analisada por LC-MS/MS. A provável ORF de BmGTI foi clonada no plasmídeo pPIC9, expressa em Pichia pastoris e purificada. Diferentes razões molares de trombina:rBmGTI foram examinadas para atividade inibitória de trombina sobre a clivagem do fibrinogênio em pH 7,5. E64 foi usado para bloquear o sítio ativo de rBmGTI e o ensaio de inibição foi realizado. Diferentes razões molares de trombina:rBmGTI foram incubadas e analisadas por SDS-PAGE para verificar interações entre as proteases. A atividade de rBmGTI sobre o fibrinogênio foi analisada pela incubação de ambos. Resultados e Discussão: Baseado na m/z dos fragmentos trípticos de BmGTI sua sequência foi identificada como BmCL1, uma catepsina Llike protease ativa em pH ácido, mas sem capacidade de hidrolisar substrato sintético em pH ≥7,0. rBmCL1/BmGTI foi expressa em P. pastoris como próenzima e após ativação, a enzima foi purificada. Diferentes razões molares de trombina:rBmCL1/BmGTI foram ensaiadas; quando a concentração de rBmCL1/BmGTI estava 64 vezes maior do que a de trombina, esta apresentou atividade residual de 37%. Quando rBmCL1/BmGTI teve seu sítio ativo bloqueado por E64, não houve inibição da atividade de trombina sobre fibrinogênio. A análise do fibrinogênio por SDS-PAGE, após incubação com rBmCL1/BmGTI, mostrou que as cadeias α e β do fibrinogênio são hidrolisadas. Conclusão: A partir destes resultados, concluímos que BmGTI inibe a coagulação sanguínea pela hidrólise das cadeias α e β do fibrinogênio. / Introduction: Rhipicephalus microplus is an important parasite of cattle. New strategies for control depend on a better knowledge of its physiology and hostparasite relationship, and molecules involved in acquisition and digestion of blood meal are interesting targets. Objectives: to determine how BmGTI (Boophilus microplus Midgut Thrombin Inhibitor) inhibits coagulation. Materials and Methods: BmGTI was obtained from partially engorged females midguts homogenate through ion exchange, size exclusion and thrombin-affinity chromatographies. Thrombin inhibition activity was measured by thrombin-induced fibrinogen clotting assay. BmGTI preparation was checked by SDS-PAGE and analyzed by LCMS/ MS. BmGTI putative ORF was cloned in pPIC9 plasmid, expressed in Pichia pastoris and purified. Different molar ratios of thrombin:BmGTI were examined for inhibitory activity of thrombin upon fibrinogen cleavage at pH 7.5. E64 was used to block BmGTI active site and inhibitory activity was assayed. Different molar ratio of thrombin:BmGTI were incubated and analyzed by SDS-PAGE to verify proteaseinhibitor interactions. BmGTI direct activity upon fibrinogen was analyzed after incubation by SDS-PAGE. Results and Discussion: Based on m/z of the BmGTI tryptic fragments it was identified as BmCL1, a cathepsin L-like proteinase active at acidic pH, but unable to hydrolyze synthetic substrate at pH ≥7.0. BmCL1/BmGTI was expressed in P. pastoris as pro-enzyme and after activation the enzyme was purified. Different molar ratios of thrombin:rBmCL1/BmGTI were assayed, and when rBmCL1/BmGTI concentration was 64-fold higher than thrombin concentration, this enzyme residual activity was 37%. When rBmCL1/BmGTI has its active site blocked with E-64, it was unable to inhibit thrombin activity upon fibrinogen. Analysis by SDS-PAGE of fibrinogen after incubation with rBmCL1/BmGTI showed that fibrinogen chains α and β were hydrolyzed. Conclusion: Based on these results, we concluded that rBmGTI/BmCL1 inhibits blood coagulation through hydrolyzes of fibrinogen chain- α and β.

Introdução: Rhipicephalus microplus é um parasito importante na bovinocultura. Novas estratégias de controle dependem de um maior entendimento da sua fisiologia e da relação parasito-hospedeiro, e moléculas envolvidas na aquisição e digestão de sangue são alvos interessantes. Objetivo: determinar o mecanismo de ação do inibidor de coagulação BmGTI (Boophilus microplus Midgut Thrombin Inhibitor). Metodologia: BmGTI foi obtido a partir do homogenato de intestino de fêmeas de R. microplus parcialmente ingurgitadas utilizando técnicas de cromatografia de troca iônica, gel filtração e afinidade por trombina. A atividade inibitória foi monitorada pelo ensaio de coagulação do fibrinogênio induzida por trombina. A preparação de BmGTI foi avaliada por SDS-PAGE e analisada por LC-MS/MS. A provável ORF de BmGTI foi clonada no plasmídeo pPIC9, expressa em Pichia pastoris e purificada. Diferentes razões molares de trombina:rBmGTI foram examinadas para atividade inibitória de trombina sobre a clivagem do fibrinogênio em pH 7,5. E64 foi usado para bloquear o sítio ativo de rBmGTI e o ensaio de inibição foi realizado. Diferentes razões molares de trombina:rBmGTI foram incubadas e analisadas por SDS-PAGE para verificar interações entre as proteases. A atividade de rBmGTI sobre o fibrinogênio foi analisada pela incubação de ambos. Resultados e Discussão: Baseado na m/z dos fragmentos trípticos de BmGTI sua sequência foi identificada como BmCL1, uma catepsina Llike protease ativa em pH ácido, mas sem capacidade de hidrolisar substrato sintético em pH ≥7,0. rBmCL1/BmGTI foi expressa em P. pastoris como próenzima e após ativação, a enzima foi purificada. Diferentes razões molares de trombina:rBmCL1/BmGTI foram ensaiadas; quando a concentração de rBmCL1/BmGTI estava 64 vezes maior do que a de trombina, esta apresentou atividade residual de 37%. Quando rBmCL1/BmGTI teve seu sítio ativo bloqueado por E64, não houve inibição da atividade de trombina sobre fibrinogênio. A análise do fibrinogênio por SDS-PAGE, após incubação com rBmCL1/BmGTI, mostrou que as cadeias α e β do fibrinogênio são hidrolisadas. Conclusão: A partir destes resultados, concluímos que BmGTI inibe a coagulação sanguínea pela hidrólise das cadeias α e β do fibrinogênio. / Introduction: Rhipicephalus microplus is an important parasite of cattle. New strategies for control depend on a better knowledge of its physiology and hostparasite relationship, and molecules involved in acquisition and digestion of blood meal are interesting targets. Objectives: to determine how BmGTI (Boophilus microplus Midgut Thrombin Inhibitor) inhibits coagulation. Materials and Methods: BmGTI was obtained from partially engorged females midguts homogenate through ion exchange, size exclusion and thrombin-affinity chromatographies. Thrombin inhibition activity was measured by thrombin-induced fibrinogen clotting assay. BmGTI preparation was checked by SDS-PAGE and analyzed by LCMS/ MS. BmGTI putative ORF was cloned in pPIC9 plasmid, expressed in Pichia pastoris and purified. Different molar ratios of thrombin:BmGTI were examined for inhibitory activity of thrombin upon fibrinogen cleavage at pH 7.5. E64 was used to block BmGTI active site and inhibitory activity was assayed. Different molar ratio of thrombin:BmGTI were incubated and analyzed by SDS-PAGE to verify proteaseinhibitor interactions. BmGTI direct activity upon fibrinogen was analyzed after incubation by SDS-PAGE. Results and Discussion: Based on m/z of the BmGTI tryptic fragments it was identified as BmCL1, a cathepsin L-like proteinase active at acidic pH, but unable to hydrolyze synthetic substrate at pH ≥7.0. BmCL1/BmGTI was expressed in P. pastoris as pro-enzyme and after activation the enzyme was purified. Different molar ratios of thrombin:rBmCL1/BmGTI were assayed, and when rBmCL1/BmGTI concentration was 64-fold higher than thrombin concentration, this enzyme residual activity was 37%. When rBmCL1/BmGTI has its active site blocked with E-64, it was unable to inhibit thrombin activity upon fibrinogen. Analysis by SDS-PAGE of fibrinogen after incubation with rBmCL1/BmGTI showed that fibrinogen chains α and β were hydrolyzed. Conclusion: Based on these results, we concluded that rBmGTI/BmCL1 inhibits blood coagulation through hydrolyzes of fibrinogen chain- α and β.

Submitted by Elizabete Silva (elizabete.silva@ufes.br) on 2015-01-16T17:25:09Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) DISSERTAÇÃO THALES ALTOE.pdf: 3213727 bytes, checksum: 96d2b70431eff46b0a70195326e6e2b1 (MD5) / Approved for entry into archive by Elizabete Silva (elizabete.silva@ufes.br) on 2015-03-04T19:27:57Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) DISSERTAÇÃO THALES ALTOE.pdf: 3213727 bytes, checksum: 96d2b70431eff46b0a70195326e6e2b1 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-04T19:27:57Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) DISSERTAÇÃO THALES ALTOE.pdf: 3213727 bytes, checksum: 96d2b70431eff46b0a70195326e6e2b1 (MD5) Previous issue date: 2014 / Este trabalho descreve a investigação química e biológica do extrato bruto e das partições hexano e acetato de etila, das folhas de Pyrostegia venusta (Ker Gawl.) Miers, popularmente conhecida como “cipó de São João”. P. venusta é classificada botanicamente como uma liana de porte mediano, tendo como característica uma exuberante floração vermelha, e por isso, sendo utilizada como planta ornamental. Essa planta possui uma larga utilização na medicina popular, sendo utilizada no tratamento de vitiligo, diarreia, bronquite, resfriado, icterícia e infecções. Os objetivos deste trabalho foram identificar as classes de metabólitos secundários presentes, avaliar o potencial antioxidante das amostras de P. vesnuta (extrato bruto, frações acetato de etila e hexano), quantificar o teor de flavonoides no extrato bruto, verificar a segurança do uso dessa planta, em termos de viabilidade celular (VC) frente à macrófagos murinos (RAW 264.7) (ensaio de imunotoxicidade). Adicionalmente os resultados de viabilidade celular foram comparados com quatro compostos anti-inflamatórios comerciais (ácido acetilsalicílico, indometacina, betametasona e piroxicam), e testar o extrato bruto quanto à inibição de catepsinas K e V. Os testes de identificação fitoquímica confirmaram a presença de flavonoides, cumarinas e esteroides nas amostras. A metodologia cromatográfica associada à análises por espectrometria de massas, levou a identificação dos compostos: fitol (1), sitosterol (2), estigmasterol (3) e campesterol (4). O extrato bruto demonstrou ter atividade inibitória frente as duas catepsinas testadas (K e V). A fração acetato de etila foi a que apresentou maior atividade antioxidante nas metodologias de inibição do radical DPPH (IC50 38,62 μg/mL) e radical ABTS (IC50 27,58 μg/mL). O teor de flavonoides total para o extrato bruto foi de 148,5±7,65 μg/mg (14,85 % (m/m)), o que justifica a observada atividade antioxidante, já que estes possuem atividade antioxidante. As amostras de P. venusta obtiveram valores de VC maiores do que os anti-inflamatórios comerciais, estes apresentaram VC abaixo do controle negativo, assim como o extrato bruto e a fração acetato de etila, a fração hexano obteve valores acima do controle negativo, sendo estes os maiores resultados de VC entre as amostras de P. venusta. / This paper describes the chemical and biological investigation of the crude extract and the hexane and ethyl acetate partitions, of the leaves of Pyrostegia venusta (Ker Gawl.) Miers, popularly known as "cipó de São João". Pyrostegia venusta is classified botanically as a median size vine, having a characteristically exuberant red flowering and so, being used as an ornamental plant. This plant has a wide use in folk medicine, being used in the treatment of vitiligo, diarrhea, bronchitis, flu, icterus and infections. The objectives of this work were to identify the classes of secondary metabolites present, identify secondary metabolites of this species, evaluate the antioxidant potential of samples of P. venusta (crude extract, ethyl acetate and hexane fractions), to quantify the amount of flavonoids in the crude extract, verify safety use of this plant in terms of cell viability (CV) front of murine macrophages (RAW 264.7) (immuno assay). Additionally, the viability results were compared with four commercial anti-inflammatory compounds (acetylsalicylic acid, indometacin, piroxicam and betamethasone), and test crude extracts for inhibition of cathepsins K and V. The identification tests confirmed the presence of flavonoids, coumarins and steroids in the samples. The chromatographic method associated to mass spectrometry analysis, led to the identification of compounds: phytol (1), sitosterol (2), stigmasterol (3) and campesterol (4). The crude extract had inhibitory activity against both tested cathepsins (K e V). The ethyl acetate fraction showed the highest antioxidant activity in the methodologies of DPPH inhibition (IC50 38.62 mg/mL) and ABTS radical (IC50 27.58 mg/mL). The total flavonoids content in the crude extract was 148.5 ± 7.65 mg / mg (14.85% (w/w)), which explains the observed antioxidant activity, since these have antioxidant activity. Samples of P. venusta had CV values greater than the commercial anti-inflammatory, which showed CV below the negative control, as well as the crude extract and the ethyl acetate fraction, the hexane fraction obtained values above the negative control, being these larger VC results between samples of P. venusta.

Submitted by Elizabete Silva (elizabete.silva@ufes.br) on 2015-10-16T20:39:32Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Estudo Químico de Pavonia multiflora A. St-Hil..pdf: 1574613 bytes, checksum: 0a457043026e9a78a99a76ca8854da51 (MD5) / Approved for entry into archive by Patricia Barros (patricia.barros@ufes.br) on 2015-11-17T13:19:09Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Estudo Químico de Pavonia multiflora A. St-Hil..pdf: 1574613 bytes, checksum: 0a457043026e9a78a99a76ca8854da51 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-17T13:19:09Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Estudo Químico de Pavonia multiflora A. St-Hil..pdf: 1574613 bytes, checksum: 0a457043026e9a78a99a76ca8854da51 (MD5) Previous issue date: 2014 / CAPES / Este trabalho descreve o estudo químico das folhas da espécie Pavonia multiflora, visando o isolamento e a identificação de seus metabólitos secundários que possam ser direcionados à busca por atividade biológica. A espécie de estudo é endêmica do Estado do Espírito Santo, e é encontrada na região de Mata Atlântica. Essa espécie ainda não possui registros de estudos fitofarmacológicos na comunidade científica. Portanto, neste trabalho, as partições hexano e acetato de etila, provenientes do extrato etanólico das folhas de P. multiflora, foram submetidos a diversas metodologias cromatográficas, com objetivo no isolamento dos seus constituintes químicos. Tais métodos cromatográficos incluíram Cromatografia em Camada Delgada Comparativa, Cromatografia Líquida em Coluna, Cromatografia em Camada Delgada Preparativa, Cromatografia Líquida de Alta Eficiência e Cromatografia Líquida à Vácuo, as quais tiveram diversificadas fases estacionárias e eluentes. Através de técnicas espectroscópicas e espectrométricas, foram identificadas pela primeira vez nessa espécie, dez substâncias, sendo quatro compostos fenólicos: ácido p-hidroxibenzoico, ácido p-cumárico, ácido vanílico e ácido ferúlico; cinco derivados terpênicos: loliolida, vomifoliol, 4,5 dihidroblumenol A, 3-oxo-α-ionol e o blumenol C; e um triterpenoide esterificado derivado do taraxerol, o p-metoxibenzoato de taraxerol, ainda não descrito na literatura. O extrato total das folhas foi ensaiado em diferentes concentrações como inibidor das catepsinas K, L e V, o qual apresentou atividade inibitória da catepsina K e V com concentração de 500 μg/mL. / This paper describes the chemical study of Pavonia multiflora leaves. The study targeted the isolation and identification of the species’ secondary metabolites, which can be used to search for biological activity. P. multiflora is endemic of the state of Espírito Santo and is found in the Atlantic Forest region. This species has not yet been recorded in phytopharmacologics studies in the scientific community. Therefore, in this work, the ethanolic extract, from the leaves of the P. multiflora, was partitioned to the partitions of hexane and of ethyl acetate. Such partitions were subjected to various chromatographic methodologies, including a thin layer chromatography , an in column liquid chromatography, preparative thin layer chromatography, vacuum liquid chromatography, and a high-performance liquid chromatography using diverse stationary phases and eluents, to isolate the chemical components. Using spectroscopic and spectrometric techniques, ten substances, including four phenolic compounds (p-hydroxybenzoic acid, p-coumaric acid, vanillic acid and ferulic acid), five terpene derivatives (loliolide, vomifoliol, 4,5 dihydroblumenol A, 3-oxo-α-ionol and blumenol C), and an esterified derivative of triterpenoid taraxerol, taraxerol p-methoxybenzoate (novel compound), not previously described in this species. The total leaf extract was tested at different concentrations to determine if it is an inhibitor of cathepsins K, L and V, and these tests showed cathepsin K and V inhibitory properties at a concentration of 500 μg/mL.

Introdução: Rhipicephalus microplus é um parasito importante na bovinocultura. Novas estratégias de controle dependem de um maior entendimento da sua fisiologia e da relação parasito-hospedeiro, e moléculas envolvidas na aquisição e digestão de sangue são alvos interessantes. Objetivo: determinar o mecanismo de ação do inibidor de coagulação BmGTI (Boophilus microplus Midgut Thrombin Inhibitor). Metodologia: BmGTI foi obtido a partir do homogenato de intestino de fêmeas de R. microplus parcialmente ingurgitadas utilizando técnicas de cromatografia de troca iônica, gel filtração e afinidade por trombina. A atividade inibitória foi monitorada pelo ensaio de coagulação do fibrinogênio induzida por trombina. A preparação de BmGTI foi avaliada por SDS-PAGE e analisada por LC-MS/MS. A provável ORF de BmGTI foi clonada no plasmídeo pPIC9, expressa em Pichia pastoris e purificada. Diferentes razões molares de trombina:rBmGTI foram examinadas para atividade inibitória de trombina sobre a clivagem do fibrinogênio em pH 7,5. E64 foi usado para bloquear o sítio ativo de rBmGTI e o ensaio de inibição foi realizado. Diferentes razões molares de trombina:rBmGTI foram incubadas e analisadas por SDS-PAGE para verificar interações entre as proteases. A atividade de rBmGTI sobre o fibrinogênio foi analisada pela incubação de ambos. Resultados e Discussão: Baseado na m/z dos fragmentos trípticos de BmGTI sua sequência foi identificada como BmCL1, uma catepsina Llike protease ativa em pH ácido, mas sem capacidade de hidrolisar substrato sintético em pH ≥7,0. rBmCL1/BmGTI foi expressa em P. pastoris como próenzima e após ativação, a enzima foi purificada. Diferentes razões molares de trombina:rBmCL1/BmGTI foram ensaiadas; quando a concentração de rBmCL1/BmGTI estava 64 vezes maior do que a de trombina, esta apresentou atividade residual de 37%. Quando rBmCL1/BmGTI teve seu sítio ativo bloqueado por E64, não houve inibição da atividade de trombina sobre fibrinogênio. A análise do fibrinogênio por SDS-PAGE, após incubação com rBmCL1/BmGTI, mostrou que as cadeias α e β do fibrinogênio são hidrolisadas. Conclusão: A partir destes resultados, concluímos que BmGTI inibe a coagulação sanguínea pela hidrólise das cadeias α e β do fibrinogênio. / Introduction: Rhipicephalus microplus is an important parasite of cattle. New strategies for control depend on a better knowledge of its physiology and hostparasite relationship, and molecules involved in acquisition and digestion of blood meal are interesting targets. Objectives: to determine how BmGTI (Boophilus microplus Midgut Thrombin Inhibitor) inhibits coagulation. Materials and Methods: BmGTI was obtained from partially engorged females midguts homogenate through ion exchange, size exclusion and thrombin-affinity chromatographies. Thrombin inhibition activity was measured by thrombin-induced fibrinogen clotting assay. BmGTI preparation was checked by SDS-PAGE and analyzed by LCMS/ MS. BmGTI putative ORF was cloned in pPIC9 plasmid, expressed in Pichia pastoris and purified. Different molar ratios of thrombin:BmGTI were examined for inhibitory activity of thrombin upon fibrinogen cleavage at pH 7.5. E64 was used to block BmGTI active site and inhibitory activity was assayed. Different molar ratio of thrombin:BmGTI were incubated and analyzed by SDS-PAGE to verify proteaseinhibitor interactions. BmGTI direct activity upon fibrinogen was analyzed after incubation by SDS-PAGE. Results and Discussion: Based on m/z of the BmGTI tryptic fragments it was identified as BmCL1, a cathepsin L-like proteinase active at acidic pH, but unable to hydrolyze synthetic substrate at pH ≥7.0. BmCL1/BmGTI was expressed in P. pastoris as pro-enzyme and after activation the enzyme was purified. Different molar ratios of thrombin:rBmCL1/BmGTI were assayed, and when rBmCL1/BmGTI concentration was 64-fold higher than thrombin concentration, this enzyme residual activity was 37%. When rBmCL1/BmGTI has its active site blocked with E-64, it was unable to inhibit thrombin activity upon fibrinogen. Analysis by SDS-PAGE of fibrinogen after incubation with rBmCL1/BmGTI showed that fibrinogen chains α and β were hydrolyzed. Conclusion: Based on these results, we concluded that rBmGTI/BmCL1 inhibits blood coagulation through hydrolyzes of fibrinogen chain- α and β.

Orientador: Marcela Rocha de Oliveira Carrilho, Mario Fernando de Góes / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-22T04:19:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Scaffa_PollianaMendesCandia_D.pdf: 3692601 bytes, checksum: 6b5331b03a6d5fcfc0192039b767ea01 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Para o entendimento do processo de adesão à dentina é fundamental conhecer a estrutura bioquímica e biomecânica deste substrato em condições normais ou quando submetido às diferentes etapas do procedimento restaurador adesivo. Evidências indicam que a reportada degradação da camada híbrida pode ocorrer pela ação de enzimas proteolíticas, pertencentes à família das metaloproteinases da matriz (MMPs) e das cisteíno-catepsinas (CTs). No entanto, é ainda necessário elucidar as funções biológicas dessas enzimas nesse processo, bem como, definir uma estratégia para prolongar a durabilidade das restaurações adesivas. O presente estudo teve como objetivo caracterizar o perfil proteolítico da dentina humana frente a sua exposição a diferentes concentrações de digluconato de clorexidina (CHX), um potente inibidor da atividade de MMPs. O efeito da CHX sobre a atividade proteolítica intrínseca da dentina foi avaliado a partir da análise do comportamento mecânico e bioquímico da matriz dentinária e da durabilidade de restaurações adesivas. No primeiro estudo, foi analisada a capacidade da CHX em inibir a atividade das CTs (B, K e L) por hidrólise de substratos fluorogênicos específicos, verificando a afinidade de ligação entre a CHX e as enzimas. No segundo estudo, o tratamento da matriz de dentina com diferentes concentrações de CHX foi avaliado pela análise do módulo de elasticidade e do grau de hidrólise do colágeno (liberação de hidroxiprolina) após armazenagem das amostras em solução fisiológica por 1 dia, 7 ou 30 dias. Finalmente, a função terapêutica da CHX como agente inibitório da atividade proteolítica da dentina foi investigada a partir de sua capacidade em preservar a integridade mecânica (resistência de união) e morfológica de interfaces adesivas tratadas com diferentes concentrações de CHX (0,2; 2,2 e 22 mM) e armazenadas por 6 a 18 meses. No terceiro estudo, a presença das CT-B e CT-K na dentina humana foram avaliadas por imunomarcação em MEV e MET. A atividade enzimática das MMPs e CTs na dentina e uma possível interação entre as duas famílias de enzimas foram verificadas por zimografia in situ e por espectrofluorimetria. Os resultados mostraram, de forma até então inédita, que a CHX é um potente inibidor das CTs presentes no complexo dentino-pulpar. No entanto, a CHX não foi capaz de preservar integralmente o módulo de elasticidade (E) da matriz dentinária após o período mais longo de armazenagem. De modo similar, maior grau de hidrólise do colágeno ocorreu após 30 dias de armazenamento para as amostras que não foram tratadas com CHX ou que foram tratadas com baixa concentração da mesma (0,2 mM) (p<0,05). Notavelmente, o grau de hidrólise do colágeno foi mínimo ou insignificante quando a matriz dentinária foi tratada com concentração mais elevada de CHX (22 mM) (p>0,05). A CHX não afetou a resistência de união imediata da interface adesiva e preservou a resistência da união dentina/resina mesmo após 6 ou 18 meses de armazenamento. Similarmente, menor grau de nanoinfiltração com prata, significando maior integridade morfológica, foi observado para os espécimes tratados com CHX e envelhecidos por 6 ou 18 meses em comparação com as amostras do grupo controle. As imagens de imuno-histoquímica mostraram que as proteases CT-B e CT-K estão presentes na dentina humana, e não apenas na região de pré-dentina e interior dos túbulos dentinários como anteriormente antecipado. A zimografia in situ sugere que a atividade gelatinolítica das MMPs na dentina parece ser preponderante em relação à atividade das CTs, embora a espectrofluorimetria sugira que a atividade proteolítica de ambas as famílias de enzimas esteja presente no tecido dentinário. Dessa forma, concluiu-se que MMPs e CTs podem atuar sinergicamente na degradação da matriz orgânica dentinária, mas que parte dessa atividade proteolítica pode ser controlada pela presença de CHX, sobretudo, se essa estiver confinada no interior da camada híbrida / Abstract: To better understand the process of adhesion to dentin is essential to understand the biochemical and biomechanical structures of this substrate under normal conditions or when subjected to the different steps of the adhesive restorative procedure. Evidences indicate that the hybrid layer degradation can result from the activity of proteolytic enzymes, belonging to the family of matrix metalloproteinases (MMPs) and cysteine-cathepsins (CTs). However, it is still necessary to comprehend the role of these enzymes in this degrading process as well as to determine the best way to extend the durability of adhesive restorations. The general purpose of the present study was to characterize the human dentin proteolytic profile when exposed to different concentration of chlorhexidine digluconate (CHX), a potent inhibitor of MMPs activity. The effect of CHX on the dentin endogenous proteolytic activity was evaluated by the analysis of dentin matrix mechanical and biochemical properties and adhesive restorations durability. The first study evaluated the CHX ability to inhibit CTs (B, K and L) activity by the hydrolysis of fluorogenic substrates, verifying the binding affinity between CHX and enzymes. The dentin matrix treatment with different CHX concentrations was evaluated in the second study by the elastic modulus (E) and degree of collagen hydrolysis (hydroxyproline release) after storage for 1, 7 or 30 days in saline solution. Finally, the CHX therapeutic action as an inhibitor of dentin proteolytic activity was investigated by its ability to maintain the mechanical (bond strength) and morphological (nanoleakage) properties of adhesive interfaces treated with different CHX concentrations (0.2, 2.2 and 22 mM) after aging for 6 to 18 months. The third study evaluated the presence of CT-B and CT-K in human dentin using immunolabeling in SEM and TEM. MMPs and CTs proteolytic activities and a possible interaction between these two families were verified by in situ zymography and by spectrofluorimetry. Results showed, for the first time, that the CHX is a potent inhibitor of CTs in the pulp-dentin complex. However, CHX was not able to preserve the integrity of the dentin matrix E after the longest storage period. Likewise, higher collagen hydrolysis occurred after 30 days of storage when the samples were not treated or treated with low CHX concentration (0.2 mM) (p<0.05). It was noticeable that the collagen hydrolysis was minimum or insignificant when the dentin matrix was treated with the highest CHX concentration (22 mM) (p>0.05). CHX did not affect the immediate bond strength of adhesive interfaces and preserved the resin/dentin bond strength even after 6 or 18 months of storage. Similarly, less nanoleakage with silver particles, which means better morphological integrity, was observed for specimens treated with CHX and aged for 6 or 18 months in comparison with control samples. Immunohistochemistry images showed that the proteases CT-B and CT-K are present in human dentin matrix, not only in pre-dentin region and inside the dentin tubules as previous suggested. In situ zymography suggests that the MMPs gelatinolytic activity in dentin seems to be predominant when compared to CTs activities, although the spectrofluorimetry suggests that the proteolytic activity of both families of enzymes are present in dentin. In this way, it was concluded that MMPs and CTs may synergistically act in the dentin organic matrix degradation, but part of this proteolytic activity can be controlled by the presence of CHX, especially when it is restrained inside the hybrid layer / Doutorado / Materiais Dentarios / Doutora em Materiais Dentários

Na dentina, a matriz orgânica desmineralizada tem um papel protetor contra desafios erosivos subsequentes. Porém, essa camada pode ser degradada por proteases, como as metaloproteinases da matriz (MMPs) e cisteína catepsinas (CCs). Recentemente, o uso de inibidores de proteases da matriz surgiu como uma importante ferramenta preventiva contra a erosão dentinária. Entretanto, o(s) mecanismo(s) exato(s) pelo(s) qual(is) os inibidores de proteases podem prevenir a erosão dentinária, bem como os tipos de proteases mais envolvidas neste processo ainda não são completamente conhecidos. O projeto foi desenvolvido em 2 subprojetos, com os seguintes objetivos: A)Subprojeto 1:Avaliar o papel das proteases na progressão da erosão dentária; B)subprojeto 2: Testar o potencial inibitório do NaF em CCs dentinárias. Para cumprir esses objetivos, foram utilizadas dentina de terceiros molares humanos para a preparação dos espécimes. A)Subprojeto1:Blocos de dentina (4 X 4 x 2 mm) (n=119) foram obtidos de raízes. Os espécimes foram divididos em 7 grupos de acordo com o seu tratamento (E-64, inibidor especifico II de catepsinas B, clorexidina, galardina NaF, placebo) ou sem tratamento, géis foram aplicados uma única vez sobre a superfície e feito o desafio erosivo (90s, 4x por dia por 5 dias) e feita analise perfilométrica. Os espécimes foram incubadas em solução contendo colagenase de Clostridium histolyticum tipo VII por 96hrs e então feita uma segunda analise perfilometrica para se determinar a espessura da MOD. Dois espécimes foram separados para análise de microscopia eletrônica de varredura. B)Subprojeto 2: Palitos de dentina (6 mm X 2 mm X 1 mm) (n=60) foram cortados da porção médio coronária dos dentes e completamente desmineralizados por imersão em EDTA 0,5 M (pH7,4) por 30 dias e lavados em água deionizada sob constante agitação a 4ºC por 72 h. Os espécimes foram divididos em 6 grupos (E-64, NaF e controle negativo, pH 5,5 ou 7,2) e incubados em saliva artificial contendo seus respectivos inibidores por 24 h 7 dias e 21 dias; ao termino de cada período, os espécimes eram pesados para avaliar a perda de massa e analisada a presença de CTX. A)Subprojeto 1: a perda de tecido desmineralizado (m, média± SD) foi: CHX 8,4±1,7b, Gala 8,6±1,9b, IECB 9,6±1,4a, E64 9,9±1,3a, NaF 9,9±1,7a, P 10,9±2,2a, ST 11,0±1,5a. A perda de tecido mineralizado foi: CHX 15,4±2,2b, Gala 16,0±1,8b, IECB 17,6±2,4a, E64 17,6±2,0a, NaF 17,3±2,8a, P 19,1±2,1a, ST 18,9±2,4a. Os inibidores de MMP reduziu significativamente a perda de matriz orgânica e tecido mineralizado em comparação com os outros grupos (p<0,05). Não foi achada diferença significante entre a espessura da matriz orgânica desmineralizada remanescente (p=0,845). B)Subprojeto 2: Na perda de massa houve diferença significante em relação ao inibidor (F=20,047, p<0,0001) e tempo de incubação (F=222,462, p<0,0001) com significante interação entre esses critérios, nos período de menor tempo de incubação, a perda foi similar para todos os grupos testados, no período de maior tempo de incubação, o grupo contendo NaF demostrou os melhores resultados. Na analise de CTX, houve diferença significante em relação aos inibidores (F46,543, p<0,0001), pH (F=14,836, p<0,0004) e tempo de incubação (F=161,438, p<0,0001) com significante interação entre esses critérios, como ocorrido na perda de massa, não houve diferença estatística nos períodos de menor incubação. No período de maior tempo de incubação, mais uma vez o grupo NaF mostrou os melhores resultados. No valor acumulado de CTX, os grupos E64 e controle negativo tiveram os maiores valores de CTX acumulado, o grupo NaF, independente do pH mostrou redução significante em relação aos demais grupos. Após analise dos resultados dos dois subprojetos, podemos indicar que as MMPs são as proteases de maior importância na progressão da erosão dentinária, assim, sua inibição é de maior importância para a redução desta patologia. Mesmo as CCs não exercendo papel direto para a progressão da erosão, elas são efetivas na cascata da ativação de outras proteases, como as próprias MMPs. Com isso, sua inibição também pode ser importante para a redução indireta da progressão da erosão. Neste presente estudo, pudemos comprovar que o NaF tem potencial inibitório sobre as CCs dentinárias, assim, sugerindo um novo inbidor de CCs. Com os resultados deste estudo, podemos afirmar que as MMPs são as principais proteases na progressão da erosão dentinária e que o NaF tem potencial inibitório nas CCs dentinárias. / In the dentine, the demineralized organic matrix has a protector part against the following erosive challenges. Nevertheless, this layer can be degraded by proteases, like the matrix metalloproteinases (MMPS) and cystein cathepsins (CCs). Recently, the use of proteases of the matrix´s inhibitors, emerged as an important preventive tool against the dentinária erosion. However, the exact mechanisms from which the inhibitors of the proteases may prevent the dentin erosion, as much as the kinds of proteases more involved in this process are not completely known yet. Therefore, the general objective of this project was to investigate the part of the two main proteases of the matrix (MMPs and CCs) in the dental erosion. The project was developed in 2 subprojects, with the following objectives: A)Subproject 1: Evaluate the part of the proteases in the progression of the dental erosion; B)subproject 2: To test the NaF inhibitory potencial in the dentin CCs. To accomplish these objectives, human third molar dentin were used for the preparation of the specimens, obtained in the surgery and urgency clinics of FOB-USP (subproject 1) or granted by the University of Oulu (subproject 2). A) Subproject 1: Dentine blocks 4 X 4 X 2 mm) (n=119) were obtained from the roots of the obtained teeth. The specimens were divided in 7 groups according with their treatment. Gels containing inhibitors (E-64, specific cathepsin B inhibitor II, chlorhexidine, galardin NaF, placebo), or without treatment, were produced, applied only one time over the surface and made the erosive challenge (90s, 4x a day for 5 days) and made profilometric analysis. The specimens were incubated in a solution containing collagenase of Clostridium histolyticum type VII for 96 hours and then a second profilometric analysis was made to determine the thickness of the MOD. Two specimens were separated for the electronic microscopy scan analysis. B) Subproject 2: Dentine sticks (6 mm X 2 mm X 1 mm) (n=60) were cut from the medium coronary portion of the teeth and completely demineralized by immersion in EDTA 0,5 M (pH7,4) ifor 30 days and washed in deionized water under constant agitation in 4º C for 72 hours. The specimens were divided in 6 groups (divided by inhibitors: E-64, NaF and negative control, pH 5,5 or 7,2) and incubated in artificial saliva containing their respective inhibitors for 24 hours, 7 days and 21 days; by the end of each period, the specimens were weighted to evaluate the loss of mass and analised the presence of CTX. A)Subproject 1: the loss of demineralized tissue (m, média± SD) was : CHX 8,4±1,7b, Gala 8,6±1,9b, IECB 9,6±1,4a, E64 9,9±1,3a, NaF 9,9±1,7a, P 10,9±2,2a, ST 11,0±1,5a. The loss of demineralized tissue was: CHX 15,4±2,2b, Gala 16,0±1,8b, IECB 17,6±2,4a, E64 17,6±2,0a, NaF 17,3±2,8a, P 19,1±2,1a, ST 18,9±2,4a. The MMP inhibitors reduced significantly the loss of organic matrix and demineralized tissue in comparison with other groups (p<0,05). There was no significant difference found between the thickness of the remaining demineralized organic matrix.(p=0,845). B)Subproject: In the loss of mass, there was a significant difference in relation to the inhibitor (F=20,047, p<0,0001) and incubation time (F=222,462, p<0,0001) with significant interaction between these criteria, in the periods of lesser time of incubation, the loss was similar for all the tested groups, in the period of higher time of incubation, the group containing NaF demonstrated the best results. In the analysis of CTX, there was significant difference in relation the inhibitors (F46,543, p<0,0001), pH (F=14,836, p<0,0004) and time of incubation (F=161,438, p<0,0001)with significant interaction between these criteria, as occurred in the mass loss, there was no statistic difference in the period of lesser incubation. In the period of higher time of incubation, once again, the NaF group demonstrated the best results. The CTX accumulated value, the E64 groups and negative control had the greater accumulated values of CTX, the NaF group, regardlessof the pH, demonstrated significant reduction in relation to the other groups. After the analysisof the results of both subprojects, we can indicate that the MMPs are the proteases of greater importance in the progression of the dentin erosion, thus, its inhibition is of graeter importance for the reduction of this pathology. Even the CCs don´t playing the part directly for the progression of erosion, they are effective in the cascade of the activation of other proteases, like the MMPs themselves. In this manner, its inhibition can also be important for the indirect reduction of the progression of the erosion. In this present study, we can prove that the NaF has inhibiting potential over the dentin CCs, thus, suggesting a new inhibitor of CCs. With the results of this study, we can affirm that the MMPs are the main proteases in the progression of the dentin erosion and that the NaF has inhibiting potential in the dentin CCs.

Neste trabalho está descrito a síntese e avaliação biológica de uma série de compostos de selênio(IV) e telúrio(IV). Esta série foi planejada para que diferentes fatores estruturais pudessem ser avaliados e as possíveis relações entre a estrutura e atividade biológica dos compostos pudessem ser determinadas. Para tanto, selênio, telúrio, cloro e bromo foram diferentemente combinados em um esqueleto carbônico simples, contendo ou não um centro assimétrico. Os compostos de interesse foram sintetizados empregando metodologias quimio-enzimáticas, quando necessário, e reações clássicas da química do selênio e telúrio, levando aos compostos de interesse em poucas etapas e com bons rendimentos. No caso dos ensaios biológicos, parâmetros como potência relativa, constante de inibição de segunda-ordem, mecanismo de inibição, CI50 e viabilidade celular foram determinados dentro das possibilidades experimentais envolvendo cada enzima. As possíveis combinações deram origem a 12 compostos que foram avaliados como inibidores de cisteíno catepsinas B, K, V e S onde a potência relativa dos mesmos pode ser determinada. Para as cisteíno catepsinas V e S, as constantes de inibição de segunda-ordem foram determinadas e ficou evidenciado que a combinação entre telúrio e bromo leva aos compostos mais potentes para estas proteases, enquanto que a combinação entre selênio e cloro origina os inibidores menos potentes. A combinação, selênio e bromo, ou telúrio e cloro forneceu inibidores com potências intermediárias. Este foi o primeiro estudo descrevendo compostos de selênio(IV) como inibidores de proteases. Os mesmos compostos também foram avaliados como inibidores do proteassomo 20S, uma treonino protease, onde se pode observar pela primeira vez que compostos de selênio e telúrio atuam como inibidores desta protease. Os valores de CI50 dos compostos foram determinados e novamente os compostos de telúrio mostraram-se mais potentes do que seus congêneres de selênio. Por outro lado, ensaios em células demonstraram que os compostos de telúrio são direcionados a outro alvo biológico, diferentemente dos compostos de selênio que continuaram a inibir o proteassomo em um lisado celular. Em ensaios de viabilidade celular ficou evidenciado que os compostos de selênio foram mais citotóxicos do que os de telúrio, o que se mostrou muito interessante para desenvolvimento de um agente anticancer onde a resposta biológica desejada é a morte celular. / The synthesis and biological evaluation of a series of selenium(IV) and tellurium(IV) compounds have been described in this research. This series was designed to allow different structural factors to be evaluated, and the possible strutucture-activity relationships determinated. Selenium, tellurium, chlorine and bromine were differently combined in a carbon backbone with or without an asymmetric center. The compounds were synthetized by using both chemo-enzymatic methodology and classical selenium and tellurium chemistry. From biological assays, relative potency, second-order inactivation constant, inhibition mechanism, IC50 and cell viability were determinated according to the experimental possibilities involving each enzyme protocol. The 12 compounds synthesized from the possible combinations among selenium, tellurium, chlorine and bromine were evaluated as cysteine cathepsins B, K, V and S inhibitors, and their relative potencies were determined. By determining the second-order inactivation constant for cysteine cathepsins V and S, it was shown that a tellurium and bromine combination led to most powerfull inhibitors. Selenium and chlorine combination led to less potent inhibitiors, while selenium and bromine, and tellurium and chlorine led to inhibitors with intermediate potency. Those compounds were also evaluated as 20S proteasome inhibitors, a threonine protease. We first observed selenium and tellurium-containing compounds acting as inhibitors of 20S proteasome. The IC50 values were determinate and tellurium compounds were more potent again. On the other hand, tellurium compound did not inhibit proteasome in cells, while selenium-containing compound does it. By cell viability assays it was verified that selenium-containing compounds were more cytotoxic than their tellurium analogs. This data is interesting for someone that wishes to develop an anti-cancer agent where the biological response desired is death of cancerous cells.

Neste trabalho está descrito a síntese e avaliação biológica de uma série de compostos de selênio(IV) e telúrio(IV). Esta série foi planejada para que diferentes fatores estruturais pudessem ser avaliados e as possíveis relações entre a estrutura e atividade biológica dos compostos pudessem ser determinadas. Para tanto, selênio, telúrio, cloro e bromo foram diferentemente combinados em um esqueleto carbônico simples, contendo ou não um centro assimétrico. Os compostos de interesse foram sintetizados empregando metodologias quimio-enzimáticas, quando necessário, e reações clássicas da química do selênio e telúrio, levando aos compostos de interesse em poucas etapas e com bons rendimentos. No caso dos ensaios biológicos, parâmetros como potência relativa, constante de inibição de segunda-ordem, mecanismo de inibição, CI50 e viabilidade celular foram determinados dentro das possibilidades experimentais envolvendo cada enzima. As possíveis combinações deram origem a 12 compostos que foram avaliados como inibidores de cisteíno catepsinas B, K, V e S onde a potência relativa dos mesmos pode ser determinada. Para as cisteíno catepsinas V e S, as constantes de inibição de segunda-ordem foram determinadas e ficou evidenciado que a combinação entre telúrio e bromo leva aos compostos mais potentes para estas proteases, enquanto que a combinação entre selênio e cloro origina os inibidores menos potentes. A combinação, selênio e bromo, ou telúrio e cloro forneceu inibidores com potências intermediárias. Este foi o primeiro estudo descrevendo compostos de selênio(IV) como inibidores de proteases. Os mesmos compostos também foram avaliados como inibidores do proteassomo 20S, uma treonino protease, onde se pode observar pela primeira vez que compostos de selênio e telúrio atuam como inibidores desta protease. Os valores de CI50 dos compostos foram determinados e novamente os compostos de telúrio mostraram-se mais potentes do que seus congêneres de selênio. Por outro lado, ensaios em células demonstraram que os compostos de telúrio são direcionados a outro alvo biológico, diferentemente dos compostos de selênio que continuaram a inibir o proteassomo em um lisado celular. Em ensaios de viabilidade celular ficou evidenciado que os compostos de selênio foram mais citotóxicos do que os de telúrio, o que se mostrou muito interessante para desenvolvimento de um agente anticancer onde a resposta biológica desejada é a morte celular. / The synthesis and biological evaluation of a series of selenium(IV) and tellurium(IV) compounds have been described in this research. This series was designed to allow different structural factors to be evaluated, and the possible strutucture-activity relationships determinated. Selenium, tellurium, chlorine and bromine were differently combined in a carbon backbone with or without an asymmetric center. The compounds were synthetized by using both chemo-enzymatic methodology and classical selenium and tellurium chemistry. From biological assays, relative potency, second-order inactivation constant, inhibition mechanism, IC50 and cell viability were determinated according to the experimental possibilities involving each enzyme protocol. The 12 compounds synthesized from the possible combinations among selenium, tellurium, chlorine and bromine were evaluated as cysteine cathepsins B, K, V and S inhibitors, and their relative potencies were determined. By determining the second-order inactivation constant for cysteine cathepsins V and S, it was shown that a tellurium and bromine combination led to most powerfull inhibitors. Selenium and chlorine combination led to less potent inhibitiors, while selenium and bromine, and tellurium and chlorine led to inhibitors with intermediate potency. Those compounds were also evaluated as 20S proteasome inhibitors, a threonine protease. We first observed selenium and tellurium-containing compounds acting as inhibitors of 20S proteasome. The IC50 values were determinate and tellurium compounds were more potent again. On the other hand, tellurium compound did not inhibit proteasome in cells, while selenium-containing compound does it. By cell viability assays it was verified that selenium-containing compounds were more cytotoxic than their tellurium analogs. This data is interesting for someone that wishes to develop an anti-cancer agent where the biological response desired is death of cancerous cells.