Adesivos dentinários aplicados diretamente sobre dentina aumentam a atividade de enzimas endógenas deste tecido que degradam colágeno, colocando em risco a integridade da camada híbrida de restaurações estéticas. Estes adesivos podem também alcançar a polpa dentária indiretamente através do fluído dos túbulos dentinários por substâncias liberadas pelos mesmos. Desta forma, a polpa dentária poderia responder a estas substâncias por meio de síntese e/ou aumento da atividade de colagenases, o que poderia colaborar na degradação da camada híbrida. Sendo assim, o objetivo desse trabalho foi avaliar o efeito das substâncias liberadas por sistemas adesivos dos tipos autocondicionante e condicione e lave sobre a atividade e a expressão gênica de metaloproteinases (MMPs) e cisteíno-catepsinas (CTs) em células-tronco da polpa dentária humana. Foram aplicados meios de cultura condicionados por adesivos do tipo autocondicionante e condicione e lave polimerizados e não polimerizados sobre culturas celulares por 24 horas. O meio de cultivo fresco foi usado como controle. Depois de 24, 48, 72 e 96 horas, as atividades gelatinolíticas de MMP-2 e de MMP-9 foram avaliadas por meio da técnica de zimografia em gel de gelatina. Nos mesmos tempos experimentais, a modulação da expressão gênica das MMPs (1, 2, 3, 7, 9, 13 e 14) e das CTs (B e K) foi analisada por meio de reação de transcriptase reversa quantitativa em tempo real (qRT-PCR). Os resultados obtidos dos dois experimentos foram avaliados por meio do teste estatístico ANOVA, complementado pelo teste de Tukey (p<0.05). Todos os grupos mostraram atividade gelatinolítica aumentada de MMP-2 e MMP-9. Até 72 horas, as atividades foram similares em todos os grupos experimentais. Diferenças significativas apareceram somente em 96 horas. De forma geral, as maiores atividades de MMPs foram observadas nas culturas celulares tratadas com o adesivo autocondicionante. Para a MMP-2, o grupo do adesivo autocondicionante polimerizado mostrou atividade intermediária, enquanto o grupo não polimerizado mostrou a maior atividade. Os dois grupos do adesivo condicione e lave polimerizado e não polimerizado mostraram atividade de MMP-9 intermediária, enquanto o grupo autocondicionante polimerizado mostrou maior atividade que o grupo controle. O qRT-PCR revelou que a maioria das MMPs e CTs analisadas tiveram a expressão gênica positivamente modulada em 24 e 48 horas. MMP-7 e MMP-9 não foram expressos em nenhum grupo experimental. Baseados nas limitações deste estudo in vitro, concluímos que substâncias liberadas por sistemas adesivos são capazes de influenciar células-tronco de polpa dentária humana levando ao aumento da atividade de MMP-2 e MMP-9 e também à modulação positiva de genes das MMPs e CTS estudadas. / Adhesive systems directly applied to dentin increase the activity of endogenous collagen degrading proteinases of the dentin, which jeopardizes the integrity of the hybrid layer of aesthetic restorations. These adhesives can also reach the dental pulp through the dentinal fluid indirectly by substances leached from them. Then, the dental pulp tissue could respond by synthetizing and/or increasing the activity of collagen proteases, which in turn could collaborate to the hybrid layer degradation. Then, the aim of this study was to evaluate the effect of substances leached from self-etch and etch-and-rinse adhesive systems on the expression and activities of matrix metalloproteinases (MMPs) and cysteine cathepsins (CT-B and CT-K) in human dental pulp stem cells. Culture media conditioned by polymerized or non-polymerized self-etch and etch-and-rinse adhesive systems were applied to the cultures for 24 hours. Fresh medium was used as control. After 24, 48, 72 and 96 hours, the gelatinolytic activities of MMP-2 and MMP-9 were assessed by zymography technique. At the same experimental time gene expression of MMPs (1, 2, 3, 7, 9, 13 e 14) and CTs (B e K) were analyzed with quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR). Data was compared by ANOVA complemented by the Tukey´s test (p<0.05). All experimental groups showed increased gelatinolytic activity for MMP-2 and MMP-9. Until 72 hours, the activities were similar regardless the group. Significant differences appeared only after 96 hours. Overall, the highest activities of MMPs were observed in the cultures treated with the self-etch adhesive. For MMP-2, the group of polymerized self-etch adhesive showed intermediary activity, while the group of non-polymerized adhesive showed the highest activity. Both polymerized and non-polymerized etch-and-rinse adhesive groups showed intermediary MMP-9 activity, while the group of polymerized self-etch adhesive showed higher activity than control. The qRT-PCR revealed that most of MMPs and CTs analyzed presented the gene expression positively modulated at 24 and 48 hours. MMP-7 and MMP-9 were not expressed in any experimental group.Based on the limitations of this in vitro study, it was concluded that substances leached from adhesive systems are able to influence human dental pulp stem cells leading to the increase of the activity of MMP-2 and MMP-9 along with positive modulation of MMPs and CTS studied genes.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:34:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2112.pdf: 5693137 bytes, checksum: ed718439c222617a1ea873a2cb8344f3 (MD5) Previous issue date: 2008-10-24 / Universidade Federal de Minas Gerais / The present work describes the search of bioactive secondary metabolites isolated from plants, against enzymes: gGAPDH (glyceraldehydes-3- phosphate dehydrogenase from Trypanosoma cruzi and lysosomal cathepsins K, V, L and S. This work is divided in two parts: Part I: Study of the oil from the nut shells of Anacardium occidentale (Anacardiaceae) - Chagas disease, a parasitic infection caused by the flagellate protozoan Trypanosoma cruzi, is a major public health problem affecting millions of individuals in Latin America. On the basis of the essential role in the life cycle of T. cruzi, the enzyme gGAPDH has been considered an attractive target for the development of novel antitrypanosomatid agents. From the dicloromethane extract of A. occidentale were isolated phenolic compounds which were investigated on their inhibition activity against gGAPDH and trypomastigote forms of T. cruzi. The most promising compound was the 6-n-pentadecylsalicylic acid (AC1) with IC50 values of 28 &#956;M against gGAPDH and 66.7 &#956;g/mL against trypomastigote forms. In addition, a detailed mechanistic characterization of the effects of AC1 on the T. cruzi gGAPDHcatalyzed reaction showed clear noncompetitive inhibition with respect to both substrate G-3-P and cofactor NAD+. Part II: Study of natural products and synthetic derivatives searching for inhibitors of lysosomal cysteine peptidases - After completing the human genome, eleven lysosomal cysteine peptidases were identified. Those enzymes are involved in general protein degradation. The lysosomal cysteine peptidases are found in various tissues and those are found in many organs. Cathepsin K is associated to bone resorption, cathepsin L to skin cancer, at last cathepsins V and S are associated to the immune system. In this work, four enzymes (cathepsins K, V, L and S) were selected as a molecular target for the identification of new inhibitors. Some potent inhibitors of cathepsin V were found, and a study including kinetic characterization of the most potent inhibitors, including potency (IC50), mechanism of action and constant Ki was carried out. The most promising compound is the acridone alkaloid citbrasine (107), with values of IC50 of 1.2 &#956;M and Ki of 0.24 &#956;M. Moreover, it was determined that citbrasine is a competitive inhibitor against cathepsin V in relation to the substrate ZFRMCA. Additionally, it was carried out the study of molecular modeling for acridone alkaloids that showed significant inhibition of cathepsin V. / Este trabalho descreve a busca de metabólitos secundários bioativos de plantas, com o intuito de serem avaliados contra as enzimas: gGAPDH (gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase glicossomal) do Trypanosoma cruzi e as catepsinas lisossomais K, V, L e S. A descrição deste trabalho está dividida em duas partes. Parte I: Estudo do óleo das cascas da castanha de Anacardium occidentale (Anacardiaceae) - A doença de Chagas, uma infecção parasitária causada pelo protozoário flagelado Trypanosoma cruzi, é um importante problema de saúde pública que afeta milhões de pessoas na América Latina. Com base no papel essencial no ciclo de vida de T. cruzi, a enzima gGAPDH tem sido considerada um alvo atraente para o desenvolvimento de novos agentes tripanocidas. Do extrato diclorometânico das cascas da castanha de A. occidentale obtiveram-se compostos fenólicos que foram avaliados frente à enzima gGAPDH e as formas tripomastigotas de T. cruzi. A substância mais promissora foi o ácido 2-pentadecenil-6- hidroxibenzóico (AC 1), com valores de IC50 de 28 &#956;M na enzima gGAPDH e 66,7 &#956;g/mL nas formas tripomastigostas. Além disso, foi determinado que AC1 é um inibidor do tipo não-competitivo para a enzima gGAPDH em relação tanto ao substrato G-3-P (Ki = 2 &#956;M ) quanto ao cofator NAD+ (Ki = 4 &#956;M). Parte II: Estudo de produtos naturais e derivados sintéticos buscando inibidores de cisteíno peptidases lisossomais - Depois de completado o genoma humano, onze cisteíno peptidases lisossomais foram identificadas. Essas enzimas têm a função primária de degradar proteínas, de forma não seletiva, dentro do lisossomo e são encontradas em vários órgãos e tecidos. A catepsina K está associada ao processo de reabsorção óssea, catepsina L ao câncer de pele e as catepsinas V e S ao sistema imune. Neste trabalho, foram selecionadas quatro enzimas (catepsinas K, V, L e S) como alvos moleculares para a identificação de novos inibidores. Foi realizada a caracterização cinética dos inibidores mais potentes frente à catepsina V, através da potência biológica (IC50), mecanismo de ação e constante Ki. A substância mais promissora foi o alcalóide acridônico citibrasina (107), com valor de IC50 de 1,2 &#956;M e Ki de 0,24 &#956;M. Além disso, foi determinado que citibrasina é um inibidor do tipo competitivo para a catepsina V em relação ao substrato ZFRMCA. Adicionalmente foi realizado o estudo de modelagem molecular para os alcalóides acridônicos que apresentaram inibição significativa frente à catepsina V.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:34:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 5168.pdf: 8720586 bytes, checksum: 0dc0ddbacccaf3e2f1fcfb515b343484 (MD5) Previous issue date: 2013-03-28 / Universidade Federal de Minas Gerais / Cathepsins are lysosomal cysteine proteases responsible for protein turnover in our organism. In non-lysosomal environment they are related to a number of diseases such as cancer, Alzheimer, autoimmune diseases and osteoporosis. Tellurium compounds have proved to be promising therapeutic agents against these diseases due to inhibition of the proteases through the formation of a Te S covalent bond with the sulfur of a catalytic cysteine. In this work the crystal and molecular structures of compounds (ptol)Te[C(H)=C(Cl)Ph]X2 (X = Cl, Br, I), butyldiiodo[(1Z)-(2- iodopent-1-en-yl)-&#61472;&#61548;4- tellane and their docking in Catepsine B are described. The results showed that these compounds, whose activity has not been measured, should have an inhibitory activity very similar to that of a known compound with a close structure. Moreover, it is shown that the substitution of a phenyl group for an aliphatic one should not have any influence on the activity of these kind of compounds. Also the structures of a series of dipnones were determined which were used as basis for the molecular modeling of others that could not be crystallized and for the docking studies in catepsins B, K, L and S. The results allowed establishing a model that explains their different inhibitory activities. / As catepsinas são cisteíno proteases lisossômicas presentes no nosso organismo. Quando em ambiente não lisossômico, estão relacionadas a uma série de doenças como câncer, Alzheimer, doenças autoimunes e osteoporose. Neste contexto, compostos de telúrio têm sido promissores agentes terapêuticos contra estas doenças por apresentarem ação inibitória das catepsinas. Isso ocorre devido à formação de uma ligação covalente entre telúrio e o enxofre da cisteína catalítica. Neste trabalho são descritas as estruturas cristalinas e moleculares dos compostos (ptol)Te[C(H)=C(Cl)Ph]X2 (X = Cl, Br, I), butildiiodo[(1Z)-(2-iodopent-1-em-1-il) &#61548;4- telano, e o docking destes compostos em Catepsina B. Os resultados mostram que estes compostos, cujas atividades não foram medidas, poderão apresentar atividades inibitórias semelhantes à de um composto de estrutura similar e com atividade conhecida. Mais ainda, foi mostrado que a substituição de um grupo fenila por um grupo alifático não deverá ter influência na atividade deste tipo de compostos. Foram também determinadas as estruturas cristalinas e moleculares de três dipnonas. Estas estruturas serviram de base para a modelagem das estruturas de outros compostos que não puderam ser cristalizados e para a realização de docking nas catepsinas B, K, L, e S. Foi então estabelecido um modelo para explicar as diferentes atividades inibitórias dos compostos de telúrio.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:35:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 6656.pdf: 3440001 bytes, checksum: e741a521796c90cb1416917d9ca4cb14 (MD5) Previous issue date: 2015-03-27 / Universidade Federal de Sao Carlos / The aim of this work is search for cysteine proteases inhibitors using a bioactivity-guided assay. We have selected different plants for the initial screening. Among all evaluated extracts, the ones obtained from Myrcia lingua Berg. showed to be the most potent. Cathepsin B and L are cysteine proteases which play a role in the degradation of extracellular matrix and facilitate tumor progression. Among the obtained inhibitors, flavonoids were the most active against CTSB (IC50 values from 4.9 to 37.2 &#956;M). On the other side, triterpenes were more potent against CTSL (IC50 values from 2.4 to 39.5 &#956;M). The triterpenes showed competitive inhibition and the flavonoids showed uncompetitive inhibition. Aiming to explore enzyme inhibition on tumor cells, we report proteolysis assay using live cell 3D model that allows to localize and to quantify proteolysis in live triple negative breast cancer cells. The natural inhibitors isolated from plants were evaluated against proteases on cell lysate but did not demonstrate good inhibition and we decided to evaluate synthetic cathepsin B inhibitors. A dipeptide nitrile compound (JK_1) was synthesized and then complexed with ruthenium II (JK_2). Caged bioactive molecules that can be active upon irradiation became a strategy to reduce side effects in surrounding tissues and facilitate spatial control over cysteine protease activity. On pure enzyme activity assay JK_2 was less active under dark (IC50 3.4 &#956;M) comparing with light irradiation (IC50 0.3 &#956;M), corresponding to a ratio of 12:1. Proteolysis assay using live cell demonstrated the inhibition of DQ-collagen IV by reducing fluorescence. Thus, the outcomes of this study could contribute to identify new hits for the development of potential anticancer drugs, once live cell imaging proteolysis assay is useful for verifying the efficacy of cathepsin inhibitors prior to testing in in vivo models. / Este trabalho apresenta o estudo biomonitorado de espécies de plantas do cerrado paulista na busca de inibidores enzimáticos de catepsinas B e L. Dentre todos os extratos avaliados, a espécie Myrcia lingua Berg. se destacou pela elevada potência. Para avaliação da inibição enzimática foram selecionadas as catepsinas B e L, que são cisteíno proteases responsáveis pela degradação da matriz extracelular. Foram isolados compostos bioativos de diferentes classes sendo que os flavonoides foram os mais ativos sobre CTSB (IC50 entre 4,9 - 37,2 &#956;M) e os triterpenos mais eficazes sobre CTSL (IC50 entre 2,4 - 39,5 &#956;M). Os triterpenos foram identificados como inibidores competitivos da CTSL e os flavonoides como inibidores incompetitivos da CTSB. Com intuito de realizar investigação mais detalhada ao nível celular, optou-se por realizar ensaios de avalição da proteólise tumoral in vitro em linhagens de câncer de mama triplamente negativa. Os inibidores naturais apresentaram resultados pouco satisfatórios e com isso buscou-se avaliação de inibidores sintéticos de proteases. O composto sintético dipeptídeo nitrila (JK_1), inibidor da CTSB, foi complexado com rutênio II (JK_2) e através da reação de fotoativação buscou-se uma estratégia para delimitar a ação tecidual dos inibidores como forma de obter uma melhor localização do efeito terapêutico na região tumoral. Sobre a catepsina B o inibidor JK_2 foi menos ativo no escuro (IC50 3,4 &#956;M) quando comparado ao exposto a radiação (IC50 0,3 &#956;M) apresentando uma razão de 12:1. Nos ensaios de proteólise tumoral 3D vizualizou-se inibição da degradação de DQ-colágeno IV através da redução da fluorescência. Deste modo, os resultados obtidos contribuem para a busca de novos protótipos, uma vez que os ensaios proteolíticos em células permitem uma avaliação mais detalhada dos inibidores das proteases, antes de serem encaminhados para testes in vivo.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:36:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 3752.pdf: 3408960 bytes, checksum: 6c7acb0ed95bf974942c00994cacd869 (MD5) Previous issue date: 2011-01-31 / Universidade Federal de Minas Gerais / The present work describes the search of bioactive secondary metabolites in plant species of genus Zanthoxylum and synthetic derivatives seeking specific inhibitors of cathepsins L and V. The natural products are involved in approximately 50% of all drugs marketed. Cathepsins represent a class of enzymes that has the primary function of randomly degrade proteins at lysosomes, but are also involved in different pathologies, such as, atherosclerosis, rheumatoid arthritis, osteoporosis and various cancers. This work was carried out monitoring Zanthoxylum extracts by fluorimetric assays and by Highperformance liquid chromatography (HPLC). Among the species studied, the most promising extracts were methanol and dichloromethane extracts of Zanthoxylum acuminatum, the latter being selected for isolation. The chromatographic methodology afforded the isolation of a triterpene: lupeol (1), the coumarins umbelliferone (2), heradenol (3), nordentatin (4), anisocoumarin (5), derivated of 6´,7´-epoxy-7-geranyloxycoumarin (6); canthinonic alkaloids 5-methoxycantin-6-one (7), 4,5-dimehoxycantin-6-ona (8); &#946;-carboline alkaloid; 7-hydroxi-1-ethyl-&#946;-carboline (9); and acridone alkaloid arborinine (10). All were tested at concentration of 25 mM and coumarin 5 inhibited over 50%, showing more activity and selective against cathepsin L. The value potency (IC50) of this compound was 30 &#956;M for cathepsin L and 102 &#956;M for cathepsin V. Furthermore, were determined the potency values, selectivity and mechanism of action acridones alkaloids isolated from Swinglea glutinosa, N-aryl anthranilic acids, synthetic acridone alkaloids and a series of alkaloids 4-quinoline-2-substituted. The most promising compound was the alkaloid acridone AC_05 with a IC50 of 0.5 &#956;M and Ki of 0.18 &#956;M. Moreover, the compound AC_05 presented as a competitive inhibitor against both cathepsins, which is consistent with the interaction model proposed by molecular modeling. / Este trabalho descreve a busca de metabólitos secundários bioativos em espécies de plantas do gênero Zanthoxylum e a partir de derivados sintéticos visando inibidores específicos das catepsinas L e V. Os produtos naturais estão envolvidos em cerca de 50% de todos os fármacos comercializados. As catepsinas representam uma classe de enzimas que têm função primária de degradar aleatoriamente proteínas nos lisossomos e também estão envolvidas em diferentes patologias, tais como aterosclerose, artrite reumatóide, osteoporose e diferentes tipos de cânceres. Neste trabalho foi realizado o monitoramento dos extratos do gênero Zanthoxylum por ensaios fluorimétricos e cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). Dentre as espécies avaliadas, os extratos mais promissores foram os extratos metanólico e diclorometânico e de Zanthoxylum acuminatum, sendo este último selecionado para isolamento. A metodologia cromatográfica levou ao isolamento de um triterpeno; o lupeol (1), as cumarinas; a umbeliferona (2), heradenol (3), nordentatina (4), anisocumarina (5),derivado do 6´, 7´-epoxi-7-geraniloxicumarina (6); alcalóides do tipo cantinônicos; 5-metoxicantin-6-ona (7), 4,5-dimetoxicantin-6-ona (8); um alcalóide &#946;-carbonílico; 7- hidroxi-1-etil-&#946;-carbolina (9); e um do tipo acridônico; arborinina (10). Todos foram ensaiados na concentração de 25 &#956;M e a cumarina 5 apresentou inibição superior a 50%, mostrando maior ativade e seletivade frente a catepsina L. O valor de potência (IC50) deste composto foi 30 &#956;M para a catepsina L e de 102 &#956;M para a catepsina V. Além disso, foram determinados os valores de potência, seletividade e mecanismo de ação para alcalóides acridônicos isolados de Swinglea glutinosa, ácidos N-aril antranílicos, alcalóides acridônicos sintéticos e uma série de alcalóides 4- quinolínicos-2-substituídos. O composto considerado mais promissor foi o alcalóide acridônico AC_05, com valor IC50 de 0,5 &#956;M e Ki 0,18 &#956;M. Além disto, este composto AC_05 apresentou-se como um inibidor competitivo frente as duas catepsinas, estando de acordo com o modelo de interação proposto por modelagem molecular.

Na dentina, a matriz orgânica desmineralizada tem um papel protetor contra desafios erosivos subsequentes. Porém, essa camada pode ser degradada por proteases, como as metaloproteinases da matriz (MMPs) e cisteína catepsinas (CCs). Recentemente, o uso de inibidores de proteases da matriz surgiu como uma importante ferramenta preventiva contra a erosão dentinária. Entretanto, o(s) mecanismo(s) exato(s) pelo(s) qual(is) os inibidores de proteases podem prevenir a erosão dentinária, bem como os tipos de proteases mais envolvidas neste processo ainda não são completamente conhecidos. O projeto foi desenvolvido em 2 subprojetos, com os seguintes objetivos: A)Subprojeto 1:Avaliar o papel das proteases na progressão da erosão dentária; B)subprojeto 2: Testar o potencial inibitório do NaF em CCs dentinárias. Para cumprir esses objetivos, foram utilizadas dentina de terceiros molares humanos para a preparação dos espécimes. A)Subprojeto1:Blocos de dentina (4 X 4 x 2 mm) (n=119) foram obtidos de raízes. Os espécimes foram divididos em 7 grupos de acordo com o seu tratamento (E-64, inibidor especifico II de catepsinas B, clorexidina, galardina NaF, placebo) ou sem tratamento, géis foram aplicados uma única vez sobre a superfície e feito o desafio erosivo (90s, 4x por dia por 5 dias) e feita analise perfilométrica. Os espécimes foram incubadas em solução contendo colagenase de Clostridium histolyticum tipo VII por 96hrs e então feita uma segunda analise perfilometrica para se determinar a espessura da MOD. Dois espécimes foram separados para análise de microscopia eletrônica de varredura. B)Subprojeto 2: Palitos de dentina (6 mm X 2 mm X 1 mm) (n=60) foram cortados da porção médio coronária dos dentes e completamente desmineralizados por imersão em EDTA 0,5 M (pH7,4) por 30 dias e lavados em água deionizada sob constante agitação a 4ºC por 72 h. Os espécimes foram divididos em 6 grupos (E-64, NaF e controle negativo, pH 5,5 ou 7,2) e incubados em saliva artificial contendo seus respectivos inibidores por 24 h 7 dias e 21 dias; ao termino de cada período, os espécimes eram pesados para avaliar a perda de massa e analisada a presença de CTX. A)Subprojeto 1: a perda de tecido desmineralizado (m, média± SD) foi: CHX 8,4±1,7b, Gala 8,6±1,9b, IECB 9,6±1,4a, E64 9,9±1,3a, NaF 9,9±1,7a, P 10,9±2,2a, ST 11,0±1,5a. A perda de tecido mineralizado foi: CHX 15,4±2,2b, Gala 16,0±1,8b, IECB 17,6±2,4a, E64 17,6±2,0a, NaF 17,3±2,8a, P 19,1±2,1a, ST 18,9±2,4a. Os inibidores de MMP reduziu significativamente a perda de matriz orgânica e tecido mineralizado em comparação com os outros grupos (p<0,05). Não foi achada diferença significante entre a espessura da matriz orgânica desmineralizada remanescente (p=0,845). B)Subprojeto 2: Na perda de massa houve diferença significante em relação ao inibidor (F=20,047, p<0,0001) e tempo de incubação (F=222,462, p<0,0001) com significante interação entre esses critérios, nos período de menor tempo de incubação, a perda foi similar para todos os grupos testados, no período de maior tempo de incubação, o grupo contendo NaF demostrou os melhores resultados. Na analise de CTX, houve diferença significante em relação aos inibidores (F46,543, p<0,0001), pH (F=14,836, p<0,0004) e tempo de incubação (F=161,438, p<0,0001) com significante interação entre esses critérios, como ocorrido na perda de massa, não houve diferença estatística nos períodos de menor incubação. No período de maior tempo de incubação, mais uma vez o grupo NaF mostrou os melhores resultados. No valor acumulado de CTX, os grupos E64 e controle negativo tiveram os maiores valores de CTX acumulado, o grupo NaF, independente do pH mostrou redução significante em relação aos demais grupos. Após analise dos resultados dos dois subprojetos, podemos indicar que as MMPs são as proteases de maior importância na progressão da erosão dentinária, assim, sua inibição é de maior importância para a redução desta patologia. Mesmo as CCs não exercendo papel direto para a progressão da erosão, elas são efetivas na cascata da ativação de outras proteases, como as próprias MMPs. Com isso, sua inibição também pode ser importante para a redução indireta da progressão da erosão. Neste presente estudo, pudemos comprovar que o NaF tem potencial inibitório sobre as CCs dentinárias, assim, sugerindo um novo inbidor de CCs. Com os resultados deste estudo, podemos afirmar que as MMPs são as principais proteases na progressão da erosão dentinária e que o NaF tem potencial inibitório nas CCs dentinárias. / In the dentine, the demineralized organic matrix has a protector part against the following erosive challenges. Nevertheless, this layer can be degraded by proteases, like the matrix metalloproteinases (MMPS) and cystein cathepsins (CCs). Recently, the use of proteases of the matrix´s inhibitors, emerged as an important preventive tool against the dentinária erosion. However, the exact mechanisms from which the inhibitors of the proteases may prevent the dentin erosion, as much as the kinds of proteases more involved in this process are not completely known yet. Therefore, the general objective of this project was to investigate the part of the two main proteases of the matrix (MMPs and CCs) in the dental erosion. The project was developed in 2 subprojects, with the following objectives: A)Subproject 1: Evaluate the part of the proteases in the progression of the dental erosion; B)subproject 2: To test the NaF inhibitory potencial in the dentin CCs. To accomplish these objectives, human third molar dentin were used for the preparation of the specimens, obtained in the surgery and urgency clinics of FOB-USP (subproject 1) or granted by the University of Oulu (subproject 2). A) Subproject 1: Dentine blocks 4 X 4 X 2 mm) (n=119) were obtained from the roots of the obtained teeth. The specimens were divided in 7 groups according with their treatment. Gels containing inhibitors (E-64, specific cathepsin B inhibitor II, chlorhexidine, galardin NaF, placebo), or without treatment, were produced, applied only one time over the surface and made the erosive challenge (90s, 4x a day for 5 days) and made profilometric analysis. The specimens were incubated in a solution containing collagenase of Clostridium histolyticum type VII for 96 hours and then a second profilometric analysis was made to determine the thickness of the MOD. Two specimens were separated for the electronic microscopy scan analysis. B) Subproject 2: Dentine sticks (6 mm X 2 mm X 1 mm) (n=60) were cut from the medium coronary portion of the teeth and completely demineralized by immersion in EDTA 0,5 M (pH7,4) ifor 30 days and washed in deionized water under constant agitation in 4º C for 72 hours. The specimens were divided in 6 groups (divided by inhibitors: E-64, NaF and negative control, pH 5,5 or 7,2) and incubated in artificial saliva containing their respective inhibitors for 24 hours, 7 days and 21 days; by the end of each period, the specimens were weighted to evaluate the loss of mass and analised the presence of CTX. A)Subproject 1: the loss of demineralized tissue (m, média± SD) was : CHX 8,4±1,7b, Gala 8,6±1,9b, IECB 9,6±1,4a, E64 9,9±1,3a, NaF 9,9±1,7a, P 10,9±2,2a, ST 11,0±1,5a. The loss of demineralized tissue was: CHX 15,4±2,2b, Gala 16,0±1,8b, IECB 17,6±2,4a, E64 17,6±2,0a, NaF 17,3±2,8a, P 19,1±2,1a, ST 18,9±2,4a. The MMP inhibitors reduced significantly the loss of organic matrix and demineralized tissue in comparison with other groups (p<0,05). There was no significant difference found between the thickness of the remaining demineralized organic matrix.(p=0,845). B)Subproject: In the loss of mass, there was a significant difference in relation to the inhibitor (F=20,047, p<0,0001) and incubation time (F=222,462, p<0,0001) with significant interaction between these criteria, in the periods of lesser time of incubation, the loss was similar for all the tested groups, in the period of higher time of incubation, the group containing NaF demonstrated the best results. In the analysis of CTX, there was significant difference in relation the inhibitors (F46,543, p<0,0001), pH (F=14,836, p<0,0004) and time of incubation (F=161,438, p<0,0001)with significant interaction between these criteria, as occurred in the mass loss, there was no statistic difference in the period of lesser incubation. In the period of higher time of incubation, once again, the NaF group demonstrated the best results. The CTX accumulated value, the E64 groups and negative control had the greater accumulated values of CTX, the NaF group, regardlessof the pH, demonstrated significant reduction in relation to the other groups. After the analysisof the results of both subprojects, we can indicate that the MMPs are the proteases of greater importance in the progression of the dentin erosion, thus, its inhibition is of graeter importance for the reduction of this pathology. Even the CCs don´t playing the part directly for the progression of erosion, they are effective in the cascade of the activation of other proteases, like the MMPs themselves. In this manner, its inhibition can also be important for the indirect reduction of the progression of the erosion. In this present study, we can prove that the NaF has inhibiting potential over the dentin CCs, thus, suggesting a new inhibitor of CCs. With the results of this study, we can affirm that the MMPs are the main proteases in the progression of the dentin erosion and that the NaF has inhibiting potential in the dentin CCs.

Adesivos dentinários aplicados diretamente sobre dentina aumentam a atividade de enzimas endógenas deste tecido que degradam colágeno, colocando em risco a integridade da camada híbrida de restaurações estéticas. Estes adesivos podem também alcançar a polpa dentária indiretamente através do fluído dos túbulos dentinários por substâncias liberadas pelos mesmos. Desta forma, a polpa dentária poderia responder a estas substâncias por meio de síntese e/ou aumento da atividade de colagenases, o que poderia colaborar na degradação da camada híbrida. Sendo assim, o objetivo desse trabalho foi avaliar o efeito das substâncias liberadas por sistemas adesivos dos tipos autocondicionante e condicione e lave sobre a atividade e a expressão gênica de metaloproteinases (MMPs) e cisteíno-catepsinas (CTs) em células-tronco da polpa dentária humana. Foram aplicados meios de cultura condicionados por adesivos do tipo autocondicionante e condicione e lave polimerizados e não polimerizados sobre culturas celulares por 24 horas. O meio de cultivo fresco foi usado como controle. Depois de 24, 48, 72 e 96 horas, as atividades gelatinolíticas de MMP-2 e de MMP-9 foram avaliadas por meio da técnica de zimografia em gel de gelatina. Nos mesmos tempos experimentais, a modulação da expressão gênica das MMPs (1, 2, 3, 7, 9, 13 e 14) e das CTs (B e K) foi analisada por meio de reação de transcriptase reversa quantitativa em tempo real (qRT-PCR). Os resultados obtidos dos dois experimentos foram avaliados por meio do teste estatístico ANOVA, complementado pelo teste de Tukey (p<0.05). Todos os grupos mostraram atividade gelatinolítica aumentada de MMP-2 e MMP-9. Até 72 horas, as atividades foram similares em todos os grupos experimentais. Diferenças significativas apareceram somente em 96 horas. De forma geral, as maiores atividades de MMPs foram observadas nas culturas celulares tratadas com o adesivo autocondicionante. Para a MMP-2, o grupo do adesivo autocondicionante polimerizado mostrou atividade intermediária, enquanto o grupo não polimerizado mostrou a maior atividade. Os dois grupos do adesivo condicione e lave polimerizado e não polimerizado mostraram atividade de MMP-9 intermediária, enquanto o grupo autocondicionante polimerizado mostrou maior atividade que o grupo controle. O qRT-PCR revelou que a maioria das MMPs e CTs analisadas tiveram a expressão gênica positivamente modulada em 24 e 48 horas. MMP-7 e MMP-9 não foram expressos em nenhum grupo experimental. Baseados nas limitações deste estudo in vitro, concluímos que substâncias liberadas por sistemas adesivos são capazes de influenciar células-tronco de polpa dentária humana levando ao aumento da atividade de MMP-2 e MMP-9 e também à modulação positiva de genes das MMPs e CTS estudadas. / Adhesive systems directly applied to dentin increase the activity of endogenous collagen degrading proteinases of the dentin, which jeopardizes the integrity of the hybrid layer of aesthetic restorations. These adhesives can also reach the dental pulp through the dentinal fluid indirectly by substances leached from them. Then, the dental pulp tissue could respond by synthetizing and/or increasing the activity of collagen proteases, which in turn could collaborate to the hybrid layer degradation. Then, the aim of this study was to evaluate the effect of substances leached from self-etch and etch-and-rinse adhesive systems on the expression and activities of matrix metalloproteinases (MMPs) and cysteine cathepsins (CT-B and CT-K) in human dental pulp stem cells. Culture media conditioned by polymerized or non-polymerized self-etch and etch-and-rinse adhesive systems were applied to the cultures for 24 hours. Fresh medium was used as control. After 24, 48, 72 and 96 hours, the gelatinolytic activities of MMP-2 and MMP-9 were assessed by zymography technique. At the same experimental time gene expression of MMPs (1, 2, 3, 7, 9, 13 e 14) and CTs (B e K) were analyzed with quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR). Data was compared by ANOVA complemented by the Tukey´s test (p<0.05). All experimental groups showed increased gelatinolytic activity for MMP-2 and MMP-9. Until 72 hours, the activities were similar regardless the group. Significant differences appeared only after 96 hours. Overall, the highest activities of MMPs were observed in the cultures treated with the self-etch adhesive. For MMP-2, the group of polymerized self-etch adhesive showed intermediary activity, while the group of non-polymerized adhesive showed the highest activity. Both polymerized and non-polymerized etch-and-rinse adhesive groups showed intermediary MMP-9 activity, while the group of polymerized self-etch adhesive showed higher activity than control. The qRT-PCR revealed that most of MMPs and CTs analyzed presented the gene expression positively modulated at 24 and 48 hours. MMP-7 and MMP-9 were not expressed in any experimental group.Based on the limitations of this in vitro study, it was concluded that substances leached from adhesive systems are able to influence human dental pulp stem cells leading to the increase of the activity of MMP-2 and MMP-9 along with positive modulation of MMPs and CTS studied genes.

Submitted by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2015-01-16T18:15:52Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Marcos Henrique Faleiros Santos - 2013.pdf: 2285336 bytes, checksum: 78a2ab8bfe99316b5245e1f9aada8eb0 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2015-01-16T18:16:06Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Marcos Henrique Faleiros Santos - 2013.pdf: 2285336 bytes, checksum: 78a2ab8bfe99316b5245e1f9aada8eb0 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-01-16T18:16:06Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Marcos Henrique Faleiros Santos - 2013.pdf: 2285336 bytes, checksum: 78a2ab8bfe99316b5245e1f9aada8eb0 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2013-07-26 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The study described in this work contributed to the chemical and biological knowledge of species B. coccolobifoliaand E. malaccensis,known popularly as "murici" and "jambo-vermelho", respectively. These species are found in various regions of Brazil, especially in Cerrado areas, and are widely appreciated by ediblefruit. Several applications in folk medicine are related to these species,such as antibacterial activity, antidiarrheal, anti-inflammatory and on control diabetes (antidiabetic). The study of roots ethanolic extract of B. coccolobifolialed to the identification of mixture of triterpenes α-amiryn and β-amiryn, mixture of steroids campesterol, stigmasterol and β-sitosterol, oleanolic acid(olenene-type triterpene) and glochidonol (lupane-type triterpene), reported for the first time in the Byrsonima genus. Of the leaves ethanolic extract of E. malaccensiswas possible to isolate two flavonoids, mearnsetin and mearnsitrin, both of flavonol class. The structural identification was carried out on the basis of 1D- and 2D-NMR experiments, GC/MS and comparison with literature data. It was also measured the inhibition potential of extracts and your fractions of these plants against cathepsins K, V and L. These enzymes are found mainly in lysosomes and may also involved in selective and controlled pathological processes, such as cardiovascular diseases, osteoporosis, atherosclerosis, malignant, pancreatitis, many others. The extracts and most partitions showed considerable inhibition against cathepsins (concentration of 125 and 50 µg/mL), and the best results are observed for cathepsin V. The flavonoids mearnsetin and mearnsitrin have not presented activity when evaluated in cathepsins K and V (concentration of 25 µM). / O estudo descrito neste trabalho contribui para o conhecimento químico e biológico das espécies B. coccolobifoliae E. malaccensis, conhecidas popularmente como“murici” e “jambo-vermelho”, respectivamente. Estas espécies são encontradas em diversas regiões do Brasil, principalmente nasáreas do Cerrado, e são largamente apreciadas pelos frutos comestíveis. Diversas aplicações na medicina popular estão relacionadas a estas espécies, como atividade antibacteriana, antidiarreica, anti-inflamatória e no controle de diabetes. O estudo do extrato etanólico das raízes de B. coccolobifolialevou à identificação da mistura dos triterpenos αe β-amirina, mistura dos esteroides campesterol, estigmasterol e β-sitosterol, ácido oleanólico (triterpeno do tipo oleaneno) e glochidonol (triterpeno do tipo lupano), relatado pela primeira vez no gênero Byrsonima. Do extrato etanólico das folhas de E. malaccensisfoi possível isolar dois flavonoides pertencentes à classe dos flavonois, mearnsetina e mearnsitrina. As substâncias foram identificadas com base nos dados de RMN de 1 H, 13 C, HSQC, HMBC e/ou CG/EM, em comparação com a literatura. Foi tambémverificado o potencial de inibição dos extratos e suas frações, frente às catepsinas K, V e L. Essas enzimas são encontradas majoritariamente nos lisossomos e podem participar de processos celulares bastante especializados levando ao desenvolvimento de diversas patologias como doenças cardiovasculares, osteoporose, aterosclerose, tumores malignos, pancreatite, entre outras. Os extratos e a maioria das partições mostraram atividade inibitória significativa frente a estas enzimas, quando avaliados nas concentrações de 125 e 50 µg/mL, sendo os melhores resultados observados para a catepsina V. Os flavonoides mearnsetina e mearnsitrina não apresentaramatividade quandoavaliados nas catepsinas K e V, na concentração de 25 µM.

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-01-27T14:18:58Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Dissertação - Michelle Nauara Gomes do Nascimento - 2014.pdf: 1938197 bytes, checksum: a67bc5040425a846cdd4a7a73cefa5cd (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-01-28T12:06:41Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Dissertação - Michelle Nauara Gomes do Nascimento - 2014.pdf: 1938197 bytes, checksum: a67bc5040425a846cdd4a7a73cefa5cd (MD5) / Made available in DSpace on 2015-01-28T12:06:41Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Dissertação - Michelle Nauara Gomes do Nascimento - 2014.pdf: 1938197 bytes, checksum: a67bc5040425a846cdd4a7a73cefa5cd (MD5) Previous issue date: 2014-07-17 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / This work describes the chemical study of E. suberosum, aiming to elucidate structures of secondary metabolites in the leaves, stem and roots. Cathepsins assays were used to evaluate in vitro activity of extracts, fractions and isolated compounds, using fluorogenic substrate ZFR-MCA. These enzymes, also known as lysossomal cysteine peptidases are involved in many physiological processes, and are associated with many pathological conditions. Cathepsins K, L and V are involved in the development of diseases such as osteoporosis, skin cancer and atherosclerosis, respectively. Based on pathological processes in which cathepsins are involved, the search for specific inhibitors can be a new approach for the treatment these diseases. The study of ethanolic extract from leaves led to the identification of four flavonoids belonging to the flavonol class: quercetin and its derivatives 3-O-monoglycosides hyperin and isoquercitrin, and 3-O-diglycosides, ombuin-3-rutinoside, all previously reported for this species. The mixture of flavanols, catechin and epicatechin were isolated from ethanolic extract from roots, besides the fatty ester of sitosterol. The mixture of steroids campesterol, stigmasterol and β-sitosterol were identified from the stem extract. This study also suggests the presence of tropane alkaloids, tropacocaine and nortropacocaine, in the ethanolic extract from leaves of E. suberosum, reported for the first time in this species. In the evaluation for cathepsins K, L and V, the extracts (concentration of 50 mg/mL), showed significant inhibition of all enzymes with percentage inhibition values above 60%. The fractions showed significant activity against cathepsin V and L when evaluated at concentrations of 5 and 50 mg/mL. The quercetin flavonol showed IC50 value of 2.2 ± 0.2 μM against cathepsin V and low affinity for cathepsins K and L (100 μM). This is an important result since literature reports for flavonoids as inhibitors of cathepsin V are quite limited. / O presente trabalho descreve o estudo químico de E. suberosum, no intuito de elucidar estruturas de metabólitos secundários presentes nas folhas, caule e raiz, além de avaliar, por meio de teste in vitro, a atividade dos extratos, frações e, quando possível das substâncias isoladas, em busca de inibidores de catepsinas utilizando como ferramenta o substrato fluorogênico ZFR-MCA. Estas enzimas, também conhecidas como cisteíno peptidases lisossomais, estão envolvidas em diversos processos fisiológicos, além de estarem associadas a muitas condições patológicas, estando as catepsinas K, L e V, envolvidas no desenvolvimento de doenças como osteoporose, câncer de pele e aterosclerose, respectivamente. Baseado nos processos patológicos em que estas catepsinas estão envolvidas, a busca de inibidores específicos pode ser uma nova abordagem para o tratamento destas doenças. O estudo do extrato etanólico das folhas levou a identificação de quatro flavonoides pertencentes à classe dos flavonois, sendo estes a quercetina e seus derivados 3-Omonoglicosídeos hiperina e isoquercitrina e 3-O-diglicosídeo, ombuina-3- rutinosídeo, todos já relatados para esta espécie. Do extrato etanólico da raiz, foi isolada a mistura dos flavanois catequina e epicatequina, além do éster graxo do β-sitosterol. No caule foram identificados a mistura dos esteroides campesterol, estigmasterol e β-sitosterol. Este estudo também sugere a presença dos alcaloides tropanos, tropacocaína e nortropacocaína no extrato etanólico das folhas, sendo estes relatados pela primeira vez na espécie. Nos ensaios frente às catepsinas K, L e V, todos os extratos apresentaram inibição superior a 60% quando avaliados na concentração de 50 μg/mL. Já as frações oriundas da partição líquido-líquido, apresentaram inibição mais expressiva frente às catepsinas V e L, quando avaliadas nas concentrações de 5 e 50 μg/mL. O flavonol quercetina apresentou um valor de IC50 de 2,2 ± 0,2 μM para a catepsina V e baixa afinidade para as catepsinas K e L quando avaliado na concentração de 100 μM. Este é um resultado importante, uma vez que os relatos na literatura para flavonoides como inibidores de catepsinas são bastante restritos.

El principal objetivo fue el estudio de la variabilidad genética entre tres líneas de conejo en características de calidad de la carne. Se compararon conejos procedentes de tres líneas sintéticas. La línea V y A fueron seleccionadas por tamaño de camada al destete y la línea R se seleccionó por velocidad de crecimiento entre el destete y el tiempo de sacrificio. Se sacrificaron 40 animales de cada línea a las 9 semanas de edad. Las comparaciones entre las líneas se realizaron usando técnicas de estadística Bayesiana. La línea R tuvo un mayor ratio músculo/hueso y mayor porcentaje de lomo que las líneas A y V, pero presentó un menor rendimiento al sacrificio y menor porcentaje de parte trasera. Se encontraron algunas diferencias entre líneas en el color de la canal y la carn de conejo. No se encontraron diferencias en la actividad de los enzimas metabólicos. También se estudió la textura de la carne y diversas características bioquímicas que influyen en la terneza de la carne. Se midieron las actividades de catepsinas, el contenido en colágeno y las propiedades de textura medidas por los métodos de Warner-Bratzler (WB) y Análisis de Perfil de Textura. La línea R que la línea V y la línea A presentó una terneza intermedia. La carne de conejo de la línea R tuvo una mayor actividad de catepsinas B y B+L, menor contenido total de colágeno, menor cohesividad, elasticidad y masticabilida, y menor fuerza de corte y trabajo total (área bajo la curva obtenida con el método WB) que la línea V. La línea A presentó valores intermedios entre las líneas R y V en las propiedades de textura. Se realizó un análisis sensorial del músculo Longissimus. Los parámetros evaluados fueron: jugosidad (J), dureza (H), fibrosidad (F), harinosidad (F1), intensidad de flavor a carne de conejo (IRF), olor y flavor anisado (AO y AF), olor y sabor a hígado (LO, LF). La línea V fue solamente un 82% tan jugosa como la línea R. La línea V fue un 18% más dura y un 17% mas fibrosa que la línea R. / Ariño Lorente, B. (2006). Variabilidad genética de la calidad de la carne de conejo [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/5642 / Palancia