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Diferenciação de células tronco mesenquimais em células tipo-hepatócitosAngiolini, Virgínia Andrea January 2017 (has links)
Introdução: O fígado é um órgão chave na manutenção da homeostasia corpórea e o transplante hepático ainda continua sendo o padrão-ouro no tratamento da insuficiência hepática aguda. A falta de doadores tem favorecido o desenvolvimento da terapia celular. Células derivadas de medula óssea podem se diferenciar em células tipo-hepatócitos em menos de 24 horas e a comunicação através de vesículas extracelulares (VEs) é um dos mecanismos propostos para explicar essa capacidade. Muitos estudos têm demonstrado que as células-tronco mesenquimais (CTMs) da medula tem alta plasticidade para se diferenciar em hepatócitos, mas os protocolos normalmente utilizados levam entre 7 e 28 dias. Objetivo: Analisar a capacidade de diferenciação das CTMs da medula em se tornar uma célula tipo-hepatócito através do mecanismo de comunicação celular por VEs em cultura (6 e 24 horas). Materiais e métodos: Para avaliar o efeito de hepatócitos primários isolados de ratos saudáveis e lesados com CCl4 na diferenciação das CTMs foi utilizado um sistema de co-cultivo com insertos que não permitem o contato entre as células colocando as CTMs na câmera superior e os hepatócitos na câmera inferior do sistema. Meio condicionado de hepatócitos com lesão foi utilizado para avaliar a capacidade das CTMs de capturar VEs e se diferenciar em célula-tipo hepatócito. Os marcadores de célula tipo-hepatócito avaliados foram expressão gênica (alfa fetoproteina, albumina e citoqueratina-18), armazenamento de glicogênio e liberação de ureia. Para rastrear VEs, hepatócitos de ratos lesados foram marcados com PKH-26. As VEs foram obtidas por ultracentrifugação do sobrenadante e analisadas por citometria de fluxo. Hepatócitos e CTMs também foram analisados por citometria de fluxo na busca de marcação positiva. Resultados: CTMs co-cultivadas durante 6 e 24 horas com hepatócitos não apresentaram expressão de genes hepáticos, mesmo quando expostas a um ambiente de lesão. Os ensaios funcionais confirmaram a falta de sinais de diferenciação, sendo que não foi observado armazenamento de glicogênio nem liberação de ureia nas CTMs. Um achado interessante foi que ao analisar o sobrenadante da câmera superior do sistema de co-cultivo, não foram achadas VEs marcadas com PKH-26 nem CTMs com rastros do marcador. Por outro lado, os experimentos utilizando meio condicionado mostraram que as CTMs têm capacidade de capturar VEs. A citometria de fluxo mostrou que às 6 horas e 24 horas respetivamente 2,28% e 3,97% das CTMs eram positivas para o marcador PKH-26. Quando analisadas no microscópio de fluorescência, foram vistos pontos vermelhos nas CTMs alguns dos quais parecem carregar a proteína albumina. Porém a expressão gênica e analise de ureia não se adequaram a um perfil de célula tipo-hepatócito. Conclusões: O sistema de co-cultivo não foi adequado para permitir a transferência e comunicação através de VEs entre hepatócitos e CTMs sendo que as VEs não conseguem atingir a câmara superior. Os experimentos com meio condicionado sugerem que as CTMs têm capacidade de capturar VEs derivadas de hepatócitos, porém a captação não conduz ao desenvolvimento de um perfil de célula tipo-hepatócito em 6 e 24 horas. São necessários mais estudos para esclarecer a dinâmica de transferência das VEs e suas consequências em longo prazo. / Introduction: Liver is a key organ for corporeal homeostasis maintenance and whole organ replacement still remains the gold standard procedure to treat acute liver failure. Shortage of liver donor has promoted the increase on cell-therapy research. Bone marrow (BM) derived cell have shown potential for differentiation into hepatocyte-like cells in a short time and extracellular vesicles communication (EVs) is one of the proposed mechanisms. Plasticity of bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSCs) is extensively supported by scientific literature but protocols applied to differentiation usually take from 7 to 28 days. Objective: To analyze in vitro differentiation potential of BM-MSCs into hepatocyte-like cells through EVs transfer mechanism in 6 and 24 hours. Materials and Methods: Co-culture system with cell-impermeable inserts and conditioned medium experiments were used to explore the effects of healthy and CCl4-injured hepatocytes, over BM-MSCs differentiation. Assessment of hepatocyte-like cell profile on BM-MSCs was revealed by gene expression (alpha fetoprotein, albumin and cytokeratin-18), glycogen storage and urea release. Hepatocytes from CCl4-injured rats were labeled by PKH-26 to track EVs. Ultracentrifugation was used to isolate EVs from supernatant medium of the two chamber of the co-culture system. PKH-26 positive EVs and PKH-26 positive cells were revealed by flow cytometry analysis and fluorescent microscopy. BM-MSCs cultured with conditioned medium were stained with ALB-FITC antibody. Results: Co-cultured BM-MSCs for 6 and 24 hours, showed no expression of hepatocyte-like genes, even after exposure to damaged microenvironment. Functional assays confirm the lack of differentiation signs there were no glycogen storage or urea release. Interestingly, EVs traffic analysis revealed no PKH-26 positive EVs at the upper chamber of co-culture system and no positive BM-MSCs were found either. On the other hand, conditioned medium experiment showed that BM-MSCs could uptake EVs. Flow cytometry analysis showed positive PKH-26 BM-MSCs at 6 (2.28%) and 24 (3.97%) hours. Flourescence microscopy revealed red points into BM-MSCs and immunofluorescence suggest that some EVs contain albumin. Gene expression and urea assay of BM-MSCs were not in accordance with a hepatocyte-like profile. Conclusions: Co-culture system, by using cell-impermeable membrane, was not adequate to promote EVs transfer between hepatocyte and BM-MSCs since EVs do not pass from the lower to the upper chamber. Conditioned medium experiments can suggest that BM-MSCs could uptake hepatocyte-derived EVs but this not drive to a hepatocyte-like profile in a short period of time. More studies will be necessary to clarify the dynamic of EVs transfer and their long time effects.
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Transcriptional Regulation During Adipocyte Differentiation: A Role for SWI/SNF Chromatin Remodeling Enzymes: A DissertationSalma, Nunciada 02 March 2006 (has links)
Chromatin has a compact organization in which most DNA sequences are structurally inaccessible and functionally inactive. Reconfiguration of thechromatir required to activate transcription. This reconfiguration is achieved by the action of enzymes that covalently modify nucleosomal core histones, and by enzymes that disrupt histone-DNA interactions via ATP hydrolysis.
TheSWI/SNF family of ATP-dependent chromatin remodeling enzymes has been implicated not only in gene activation but also in numerous cellular processes including differentiation, gene repression, cell cycle control, recombination and DNA repair. PPARγ, C/EBPα and C/EBPβ are transcription factors with well established roles in adipogenesis. Ectopical expression of each of these factors in non-adipogenic cells is sufficient to convert them to adipocyte-like cells.
To determine the requirements of SWI/SNF enzymes in adipocyte differentiation, we introduced PPARγ, C/EBPα or C/EBPβ into fibroblasts that inducibly express dominant-negative versions of the Brahma-Related Gene 1 (BRG1) or human Brahma (BRM), which are the ATPase subunits of the SWI/SNF enzymes. We found that adipogenesis and expression of adipocyte genes were inhibited in the presence of mutant SWI/SNF enzymes. Additionally, in cells expressing C/EBPα or C/EBPβ, PPARγ expression was SWI/SNF dependent. These data indicate the importance of these remodeling enzymes in both early and late gene activation events.
Subsequently, we examined by chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay the functional role of SWI/SNF enzymes in the activation of PPARγ2, the master regulator of adipogenesis. Temporal analysis of factors binding to the PPARγ2 promoter showed that SWI/SNF enzymes are required to promote preinitiation complex assembly and function.
Additionally, our studies concentrated on the role of C/EBP family members in the activation of early and late genes during adipocyte differentiation. During adipogenesis, C/EBPβ and δ are rapidly and transiently expressed and are involved in the expression of PPARγ and C/EBPα, which together activate the majority of the adipocyte genes. Our studies determined the temporal recruitment of the C/EBP family at the promoters of early and late genes by ChIP assay during adipocyte differentiation. We found that all of the C/EBP members evaluated are present at the promoters of early and late genes, and the binding correlated with the kinetics of the C/EBPs expression. Binding of C/EBPβ and δ is transient, subsequently being replaced by C/EBPα. These studies demonstrated that C/EBPβ and δ are not only involved in the regulation of PPARγ and C/EBPα, but also in the activation of late expressed adipocyte genes.
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Films biomimétiques multicouches pour les applications dans l'ingénierie tissulaire musculosquelettique. / Biomimetic multilayer films for musculoskeletal tissue engineering applicationsGribova, Varvara 25 November 2013 (has links)
L'ingénierie tissulaire consiste à assembler de façon intelligente des cellules et des matériaux biocompatibles dans le but de créer des tissus artificiels. Pour la construction de tissus en laboratoire, il est indispensable d'élaborer des matériaux qui miment cet environnement. Dans ce cadre, la collaboration entre les scientifiques de différents domaines (matériaux, chimie, biologie, biochimie) s'avère nécessaire. L'ingénierie du muscle squelettique est prometteuse pour remplacer le tissu musculaire endommagé et pour le traitement des maladies du muscle, mais aussi pour les essais pharmaceutiques. Dans ce but, les matériaux avec les propriétés mécaniques et chimiques contrôlées sont requis -- pour l'amplification et la différenciation in vitro de cellules souches musculaires, mais aussi pour l'étude de la myogenèse sur des microenvironnements contrôlés 2D et dans les matrices 3D. Dans ce travail, nous avons utilisé la technique d'assemblage couche par couche (LbL, layer-by-layer) pour deux buts. Le premier a été de développer de nouveaux films biomimétiques possédant des propriétés biochimiques et mécaniques parfaitement contrôlées, pour étudier les interrelations entre ces deux paramètres sur les processus cellulaires. En plus, nous avons associé ces films biomimetiques aux substrats avec la topographie contrôlée, afin de guider la formation du tissu. Dans un second temps, nous avons utilisé la technique LbL pour organiser les cellules en structures 3D. Nous avons ainsi crée des microtissus d'épaisseur contrôlée, qui pourraient être utilisés en tant que modèles de tissus artificiels pour les applications thérapeutiques ou pour les évaluations de médicament en industrie pharmaceutique. / Tissue engineering approach consists in combining cells, engineering and biomaterials to improve the biological functions of damaged tissues or to replace them. Production of “artificial tissues” is still challenging and requires collaboration of scientists from different domains like cell biology, chemistry, materials and polymer science. Skeletal muscle tissue engineering holds promise for the replacement of muscle due to an injury and for the treatment of muscle diseases, such as muscle dystrophies or paralysis, but is also required for pharmaceutical assays. To this end, materials with tunable mechanical and biochemical properties for myoblast expansion and differentiation in vitro, as well as for the studies of myogenesis on controlled 2D microenvironments or in 3D scaffolds, are crucially needed. In this work, we use layer-by-layer (LbL) assemblies for two goals. The first consisted in the development of multifunctional biomimetic thin films for the control of skeletal muscle cell fate on 2D substrates. We use LbL films made of polypeptides, which can be stiffened by chemical cross-linking and can be specifically functionalized by grafting of biomimetic peptides onto their surface. In addition, we combined the peptide-grafted films with substrate microtopography. Such approach is promising for the development or multifunctional materials that combine the different stimuli present in in vivo ECM, among them physical and biochemical cues, but also microtopography. In the second part, we use LbL assemblies for the construction of 3D skeletal muscle microtissues. This allows to rapidly build 3D muscle tissues and is promising for the in vitro construction of physiologically relevant skeletal muscle tissue models.
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Diferenciação de células tronco mesenquimais em células tipo-hepatócitosAngiolini, Virgínia Andrea January 2017 (has links)
Introdução: O fígado é um órgão chave na manutenção da homeostasia corpórea e o transplante hepático ainda continua sendo o padrão-ouro no tratamento da insuficiência hepática aguda. A falta de doadores tem favorecido o desenvolvimento da terapia celular. Células derivadas de medula óssea podem se diferenciar em células tipo-hepatócitos em menos de 24 horas e a comunicação através de vesículas extracelulares (VEs) é um dos mecanismos propostos para explicar essa capacidade. Muitos estudos têm demonstrado que as células-tronco mesenquimais (CTMs) da medula tem alta plasticidade para se diferenciar em hepatócitos, mas os protocolos normalmente utilizados levam entre 7 e 28 dias. Objetivo: Analisar a capacidade de diferenciação das CTMs da medula em se tornar uma célula tipo-hepatócito através do mecanismo de comunicação celular por VEs em cultura (6 e 24 horas). Materiais e métodos: Para avaliar o efeito de hepatócitos primários isolados de ratos saudáveis e lesados com CCl4 na diferenciação das CTMs foi utilizado um sistema de co-cultivo com insertos que não permitem o contato entre as células colocando as CTMs na câmera superior e os hepatócitos na câmera inferior do sistema. Meio condicionado de hepatócitos com lesão foi utilizado para avaliar a capacidade das CTMs de capturar VEs e se diferenciar em célula-tipo hepatócito. Os marcadores de célula tipo-hepatócito avaliados foram expressão gênica (alfa fetoproteina, albumina e citoqueratina-18), armazenamento de glicogênio e liberação de ureia. Para rastrear VEs, hepatócitos de ratos lesados foram marcados com PKH-26. As VEs foram obtidas por ultracentrifugação do sobrenadante e analisadas por citometria de fluxo. Hepatócitos e CTMs também foram analisados por citometria de fluxo na busca de marcação positiva. Resultados: CTMs co-cultivadas durante 6 e 24 horas com hepatócitos não apresentaram expressão de genes hepáticos, mesmo quando expostas a um ambiente de lesão. Os ensaios funcionais confirmaram a falta de sinais de diferenciação, sendo que não foi observado armazenamento de glicogênio nem liberação de ureia nas CTMs. Um achado interessante foi que ao analisar o sobrenadante da câmera superior do sistema de co-cultivo, não foram achadas VEs marcadas com PKH-26 nem CTMs com rastros do marcador. Por outro lado, os experimentos utilizando meio condicionado mostraram que as CTMs têm capacidade de capturar VEs. A citometria de fluxo mostrou que às 6 horas e 24 horas respetivamente 2,28% e 3,97% das CTMs eram positivas para o marcador PKH-26. Quando analisadas no microscópio de fluorescência, foram vistos pontos vermelhos nas CTMs alguns dos quais parecem carregar a proteína albumina. Porém a expressão gênica e analise de ureia não se adequaram a um perfil de célula tipo-hepatócito. Conclusões: O sistema de co-cultivo não foi adequado para permitir a transferência e comunicação através de VEs entre hepatócitos e CTMs sendo que as VEs não conseguem atingir a câmara superior. Os experimentos com meio condicionado sugerem que as CTMs têm capacidade de capturar VEs derivadas de hepatócitos, porém a captação não conduz ao desenvolvimento de um perfil de célula tipo-hepatócito em 6 e 24 horas. São necessários mais estudos para esclarecer a dinâmica de transferência das VEs e suas consequências em longo prazo. / Introduction: Liver is a key organ for corporeal homeostasis maintenance and whole organ replacement still remains the gold standard procedure to treat acute liver failure. Shortage of liver donor has promoted the increase on cell-therapy research. Bone marrow (BM) derived cell have shown potential for differentiation into hepatocyte-like cells in a short time and extracellular vesicles communication (EVs) is one of the proposed mechanisms. Plasticity of bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSCs) is extensively supported by scientific literature but protocols applied to differentiation usually take from 7 to 28 days. Objective: To analyze in vitro differentiation potential of BM-MSCs into hepatocyte-like cells through EVs transfer mechanism in 6 and 24 hours. Materials and Methods: Co-culture system with cell-impermeable inserts and conditioned medium experiments were used to explore the effects of healthy and CCl4-injured hepatocytes, over BM-MSCs differentiation. Assessment of hepatocyte-like cell profile on BM-MSCs was revealed by gene expression (alpha fetoprotein, albumin and cytokeratin-18), glycogen storage and urea release. Hepatocytes from CCl4-injured rats were labeled by PKH-26 to track EVs. Ultracentrifugation was used to isolate EVs from supernatant medium of the two chamber of the co-culture system. PKH-26 positive EVs and PKH-26 positive cells were revealed by flow cytometry analysis and fluorescent microscopy. BM-MSCs cultured with conditioned medium were stained with ALB-FITC antibody. Results: Co-cultured BM-MSCs for 6 and 24 hours, showed no expression of hepatocyte-like genes, even after exposure to damaged microenvironment. Functional assays confirm the lack of differentiation signs there were no glycogen storage or urea release. Interestingly, EVs traffic analysis revealed no PKH-26 positive EVs at the upper chamber of co-culture system and no positive BM-MSCs were found either. On the other hand, conditioned medium experiment showed that BM-MSCs could uptake EVs. Flow cytometry analysis showed positive PKH-26 BM-MSCs at 6 (2.28%) and 24 (3.97%) hours. Flourescence microscopy revealed red points into BM-MSCs and immunofluorescence suggest that some EVs contain albumin. Gene expression and urea assay of BM-MSCs were not in accordance with a hepatocyte-like profile. Conclusions: Co-culture system, by using cell-impermeable membrane, was not adequate to promote EVs transfer between hepatocyte and BM-MSCs since EVs do not pass from the lower to the upper chamber. Conditioned medium experiments can suggest that BM-MSCs could uptake hepatocyte-derived EVs but this not drive to a hepatocyte-like profile in a short period of time. More studies will be necessary to clarify the dynamic of EVs transfer and their long time effects.
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Fosfoproteômica e proteômica quantitativa de células mesenquimais durante a diferenciação osteoblástica mediada por BMP2, expressão e purificação de diferentes tipos de proteínas morfogenéticas ósseas / Quantitative phosphoproteomics and proteomics of mesenchymal stem cells during BMP2-mediated osteoblastic differentiation, expression and purification of different types of bone morphogenetic proteinsErik Halcsik 11 October 2012 (has links)
As fraturas e perdas ósseas representam altos riscos para o Sistema público de Saúde (SUS), além de afetar a qualidade de vida do paciente, portanto é necessário o entendimento das bases moleculares que envolvem os mecanismos de reparo ósseo. Citocinas secretadas por células do sistema imune presentes no local da inflamação, como as IL-6, IL-10 e TNFα atuam como fatores quimiotáticos para células mesenquimais, que proliferam e se diferenciam em osteoblastos pela ação autócrina e parácrina de Proteínas Morfogenéticas Ósseas (BMPs), principalmente a BMP2. Embora seja conhecido que a ação de BMP2 ocorra através de sua ligação nos receptores ActRI/BMPR, que ativam proteínas SMADS 1/5/8 efetoras, pouco se sabe sobre os mecanismos intracelulares que participam do processo de diferenciação osteoblástico. Neste estudo propôs-se analisar as diferenças no conteúdo de proteínas totais e de proteínas fosforiladas em células mesenquimais de pele induzidas à osteogênese pelo tratamento com BMP2 por diferentes períodos de tempo, utilizando-se de Isótopos Estáveis de Dimetila acoplado ao LC/MS. A partir de 150µg de material inicial, foi possível identificar 2.264 proteínas, as quais foram quantificadas nos diferentes pontos de indução, sendo que 235 são fosforiladas. Análise de motivos de quinases mostrou que diversos substratos possuem sítios fosforilados correspondentes àqueles dos motivos de fosforilação das quinases Casein Kinase, p38, CDK e JNK. A análise da ontologia gênica mostrou um aumento de processos biológicos relacionados com sinalização e diferenciação após a primeira hora de indução com rhBMP2. Além disso, proteínas envolvidas com o rearranjo do citoesqueleto e com vias de sinalização Wnt e Ras foram encontradas como tendo fosforilação diferencial durante todos os períodos estudados. Os dados revelaram novos substratos intracelulares que são fosforilados nos primeiros momentos do comprometimento com a diferenciação osteoblástica mediada pelo tratamento com rhBMP2 em células mesenquimais derivadas da pele. Além disso, clones celulares que superexpressam as proteínas recombinantes humanas BMP2 e BMP4 foram gerados, e sua atividade verificada in vitro. Paralelamente, a rhBMP7, obtida anteriormente, foi purificada por cromatografia de afinidade utilizando-se uma coluna de Heparina-Sepharose, que foi posteriormente utilizada para ensaios in vitro e in vivo, nos quais se mostrou capaz de gerar osteoblastos e tecido ósseo, respectivamente, o que abre novas possibilidades para o uso destas proteínas como biofármacos no Brasil. / Bone fractures and loss represent significant costs for the public health system and often affect the patients quality of life, therefore, understanding the molecular basis for bone regeneration is essential. Cytokines, such as IL-6, IL-10 and TNFα, secreted by inflammatory cells at the lesion site, at the very beginning of the repair process, act as chemotactic factors for mesenchymal stem cells, which proliferate and differentiate into osteoblasts through the autocrine and paracrine action of bone morphogenetic proteins (BMPs), mainly BMP-2. Although it is known that BMP-2 binds to ActRI/BMPR and activates the SMAD 1/5/8 downstream effectors, little is known about the intracellular mechanisms participating in osteoblastic differentiation. We assessed differences in the phosphorylation status of different cellular proteins upon BMP-2 osteogenic induction of isolated human skin mesenchymal stem cells using Triplex Stable Isotope Dimethyl Labeling coupled with LC/MS. From 150 µg of starting material, 2,264 proteins containing two or more peptides were identified and quantified at five different time points, 235 of which are differentially phosphorylated. Kinase motif analysis showed that several substrates display phosphorylation sites for Casein Kinase, p38, CDK and JNK. Gene ontology analysis showed an increase in biological processes related with signaling and differentiation at early time points after BMP2 induction. Moreover, proteins involved in cytoskeleton rearrangement, Wnt and Ras pathways were found to be differentially phosphorylated during all timepoints studied. Taken together, these data, allow new insights on the intracellular substrates which are phosphorylated early on during commitment to BMP2-driven osteoblastic differentiation of skin-derived mesenchymal stem cells. Cell clones overexpressing the human BMP 2 and 4 recombinant proteins were also generated, and their biological activity was confirmed in vitro. In parallel, chromatography-affinity purified rhBMP7, obtained using heparin-Sepharose columns, was used for in vivo and in vitro assays to evaluate the ability of this purified protein to generate osteoblasts and bone tissue, respectively, opening new avenues for the use of these proteins as biopharmaceuticals in Brazil.
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Análise da diferenciação osteoblástica in vitro sobre superfícies de materiais vítreos e vitrocerâmicos bioativos / In vitro osteoblastic differentiation on bioactive glass and glassceramic surfacesOlivia Cherubin Alves 17 August 2012 (has links)
Materiais vítreos e vitrocerâmicos bioativos podem ser usados particulados ou como scaffolds em diferentes tratamentos de defeitos ósseos. Tratamentos térmicos que possibilitam o desenvolvimento de scaffolds a partir de composições de vidros bioativos introduzem fases cristalinas em sua estrutura amorfa com potencial impacto na bioatividade e biocompatibilidade do material. O objetivo do presente estudo foi avaliar, qualitativa e quantitativamente, o desenvolvimento do fenótipo osteogênico de culturas de células osteoblásticas sobre substratos vítreos e vitrocerâmicos bioativos. Células MC3T3-E1 foram cultivadas em condições osteogênicas por períodos de até 21 dias sobre superfícies de Bioglass® 45S5, de duas preparações de vitrocerâmica bioativa e altamente cristalina, Biosilicato® e Biosilicato® para scaffold, e de borosilicato (vidro bioinerte). Foram avaliados, nos períodos de 7, 12 e 21 dias, morfologia celular, formação de matriz mineralizada e expressão de genes relacionados à osteogênese. Os resultados mostraram confluência das culturas sobre as superfícies de vidros e vitrocerâmicas, com progressiva formação de multicamadas celulares. A quantificação de vermelho de Alizarina revelou aumento de mineralização para culturas sobre materiais bioativos, com os maiores valores para Biosilicato® para scaffold. Expressão diferencial de genes foi observada nos 3 períodos de culturas sobre os materiais vítreo e vitrocerâmicos bioativos em comparação ao vidro bioinerte e sobre as vitrocerâmicas em comparação ao vidro bioativo. Os resultados permitem concluir que modificações em aspectos químicos de materiais vítreos e vitrocerâmicos, com efeitos sobre sua bioatividade, resultam em alteração do potencial osteogênico e do perfil de expressão gênica de células osteoblásticas in vitro. A maior atividade osteogênica sobre o Biosilicato® para scaffold permite considerar esse material um potencial candidato para aplicações em defeitos ósseos. / Bioactive glasses and glass-ceramics have been used as bone substitutes in either particulate or scaffold forms. Various thermal treatments that allow the development of scaffolds from bioactive glasses may create varied proportions of new crystalline phases in the amorphous phase with a potential impact on the bioactivity and biocompatibility of the material. The aim of the present in vitro study was to qualitatively and quantitatively evaluate the development of the osteogenic phenotype in osteoblastic cell cultures grown on bioactive glass and glass-ceramic surfaces. MC3T3-E1 cells, subclone 14, were cultured under an osteogenic condition for periods of up to 21 days on the following disc surfaces: Bioglass® 45S5 (bioactive glass), Biosilicate® (bioactive glass-ceramic), Biosilicate® as the material for scaffold preparation (Bio-sc, bioactive glass-ceramic), and borosilicate (bioinert glass). At days 7, 12, and 21 post-plating, cell morphology, mineralized matrix formation and the expression profile of genes associated with osteogenesis were evaluated. Epifluorescence of actin cytoskeleton and DAPI DNA stain revealed confluent cell cultures at day 7 for all groups, with progressive cell multilayering formation. The quantitative analysis of Alizarin red-stained cultures at day 21 revealed significantly enhanced mineralization in cultures grown on bioactive materials compared with the ones on borosilicate and the highest absorbance intensities for the Bio-sc group. Differential gene expression profiles were detected at the three time points evaluated in cultures grown on the bioactive materials in comparison with borosilicate, and on the glass-ceramics in comparison with Bioglass® 45S5. From the results presented, it can be concluded that changes in chemical characteristics of glass and glass-ceramic that may have an impact on their bioactivity index can affect the osteogenic potential and the gene expression profile of osteoblastic cells in vitro. The highest osteogenic activity on Bio-sc renders this material a good candidate for bone defect applications.
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Identificação de fatores de transcrição e sinais celulares que regulam a expressão do gene cspC em Caulobacter crescentus. / Identification of transcription factors and cellular signals that regulate cspC gene expression from Caulobacter crescentus.Juliana da Silva Santos 17 January 2012 (has links)
As proteínas de choque frio pertencem a uma família de proteínas com um domínio altamente conservado, denominado domínio de choque frio (CSD). Estão envolvidas em vários processos celulares, incluindo adaptação a baixas temperaturas, estresse nutricional e fase estacionária. Em C. crescentus, uma <font face=\"Symbol\">α-proteobacteria não patogênica, as proteínas CspC e CspD apresentam dois CSDs e seus níveis aumentam apenas durante a fase estacionária. Este trabalho tem como objetivo determinar os fatores de transcrição e sinais celulares envolvidos na regulação do gene cspC em C. crescentus. No presente trabalho, foi realizada a varredura de uma biblioteca de 4000 clones mutados pela inserção do transposon Tn5, onde foram identificados sete mutantes com expressão reduzida de cspC: CCNA03569 (proteína hipotética); CCNA02510 (deacetilase de oligossacarídeos); CCNA01594 (metiltransferase da proteína ribossomal L11); CCNA02186 (pequena subunidade da acetato lactato sintase); CCNA00084 (fosforibosil aminoimidazol carboxamida formiltransferase/ IMP ciclohidrase); CCNA03616 (sulfito redutase dependente de NADPH) e CCNA01448 (frutose-1,6-bisfosfatase). Através de ensaios de expressão na presença de um meio condicionado, verificou-se que cspC e cspD aparentemente não são induzidos em resposta ao aumento de densidade populacional. O fenótipo do mutante cspC na fase estacionária foi avaliado em relação a sua resistência a estresse oxidativo, e vimos que a linhagem <font face=\"Symbol\">DcspC é altamente sensível ao peróxido de hidrogênio e a superóxidos, mas não é sensível a hidroperóxido orgânico. A ausência de cspC provavelmente é compensada por dps, já que a expressão deste gene aumenta no mutante <font face=\"Symbol\">DcspC. Por outro lado, a transcrição de katG diminui, mas as atividades de KatG e SodB não são afetadas no mutante cspC. Em condições de estresses provocados por peróxido de hidrogênio, sacarose e sal a expressão de cspC não é afetada. Os fatores sigmas SigT e SigU e o regulador de transcrição Fur não estão envolvidos na regulação de cspC, mas no mutante <font face=\"Symbol\">DsigJ a expressão de cspC aumenta, e no mutante <font face=\"Symbol\">DoxyR ela é diminuída. Foi verificado também que cspC apresenta uma autoregulação positiva, que pode se dar por meio de estabilização de seu próprio mRNA. / The cold shock proteins belong to a family of proteins presenting a highly conserved domain, called cold shock domain (CSD). They are involved in various cellular processes, including adaptation to low temperature, nutritional stress, cell growth and stationary phase. In C. crescentus, a non-pathogenic <font face=\"Symbol\">α-proteobacteria, the cold shock proteins CspC and CspD have two CSDs and they are induced during stationary phase. This study aims to determine the transcription factors and cellular signals involved in cspC gene regulation in C. crescentus. In the present study we scanned a library of 4000 mutant clones with the Tn5 transposon, from which seven mutants were identified presenting reduced expression of cspC: CCNA03569 (hypothetical protein); CCNA02510 (polysaccharide deacetylase); CCNA01594 (ribosomal protein L11 methyltransferase); CCNA02186 (acetolactate synthase 3 regulatory subunit); CCNA00084 (bifunctional phosphoribosylaminoimidazolecarboxamide formyltransferase/IMP cyclohydrolase); CCNA03616 (sulfite reductase (NADPH)) e CCNA01448 (fructose 1,6-bisphosphatase II). Expression assays in the presence of a conditioned medium, showed that cspC and cspD are apparently not induced in response to increased cell density. The phenotype of the mutant cspC was evaluated as to oxidative stress resistance in the stationary phase. The results showed that the <font face=\"Symbol\">DcspC strain is highly sensitive to hydrogen peroxide and superoxide but is not sensitive to organic hydroperoxide. The absence of cspC probably is compensated by dps, since the expression of this gene is increased in <font face=\"Symbol\">DcspC strain. In contrast, the transcritpion of katG is decreased, but the activities of KatG and SodB are not affected in the cspC mutant. Under conditions of stress caused by hydrogen peroxide, sucrose or salt, cspC expression is not affected. The sigma factors sigmas SigT and SigU and transcription regulator Fur are not involved in the regulation of cspC, but cspC expression is increased in <font face=\"Symbol\">DsigJ and decreased in <font face=\"Symbol\">DoxyR strains, respectively. It was also determined that cspC shows a positive autoregulation, which may occur via stabilization of its own mRNA.
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Efeito da terapia com células-tronco musculares e células-tronco mesenquimais na regeneração do músculo esquelético: modulação por ácido oléico. / Effect of muscle stem cells and mesenchymal stem cells transplantation on skeletal muscle regeneration: modulatory effect of oleic acid.Carlos Hermano da Justa Pinheiro 26 June 2012 (has links)
O objetivo do presente trabalho foi investigar alterações na composição de ácidos graxos durante a diferenciação de células-tronco musculares (CTmusc) e seu possível envolvimento na miogênese. Aumento no conteúdo de ácido oléico foi observado. Quando as CTmusc foram tratadas com esse ácido graxo, a miogênese foi acelerada através da estimulação da via de sinalização da beta-catenina. Ainda nas CTmusc, o ácido oléico inibiu a sinalização do Notch e a capacidade proliferativa. Nenhum efeito do tratamento com ácido oléico foi observado na capacidade proliferativa de células-tronco mesenquimais. O transplante de CTmusc e células-tronco mesenquimais aceleram a regeneração e recuperação da função no músculo esquelético lacerado. O pré-tratamento com ácido oléico reduziu a ativação, proliferação e enxerto de CTmusc no músculo esquelético lesionado do hospedeiro e não teve efeito sobre o enxerto de células-tronco mesenquimais. Dessa maneira, o ácido oléico tem efeito modulador no efeito da terapia celular no músculo esquelético lesionado. / The purpose of the present study was to investigate alterations on fatty acid (FA) composition and a possible involvement of FA on muscle stem cell function. Na increase in content of oleic acid was observed when muscle stem cell (muscSC) differentiated to myotube. The treatment with oleic acid accelerated myogenesis through stimulation of beta-catenin signaling pathway. Notch signaling pathway was inhibited by oleic acid reducing the proliferative capacity of muscSC. No effects were observed in mesenchymal stem cells. Transplantation of both muscSC and mesenchymal stem cells accelerates muscle regeneration and recovery of function. The pre-treatment with oleic acid decreased activation, proliferation, differentiation and engrafment of muscSC in host injured muscle. Thus, oleic acid has modulatory effect on cellular therapy in injured skeletal muscle.
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Estudo do controle traducional de PPAR durante o processo de diferenciação de macrófagos / Translation control of PPAR during macrophage differentiationTavane David Cambiaghi 12 February 2010 (has links)
A diferenciação das células THP-1 em macrófagos, induzida por PMA, é associada ao aumento da expressão de PPAR. A UTR 5` de PPAR regula negativamente sua síntese, porém, o mecanismo molecular envolvido não foi esclarecido. Neste estudo, o estado traducional das células THP-1 diferenciadas por PMA foi investigado em associação à superprodução de PPAR. A presença de uORFs no transcrito de PPAR, contendo códons de iniciação compatíveis com seqüências de Kosak, poderia ser a causa do efeito inibitório da UTR 5`. A incorporação reduzida de L-[U-14C]leucina revelou que a superprodução de PPAR ocorre durante inibição global da tradução, confirmada pela redução dos polissomos. Além disso, desfosforilação de 4E-BP1 foi observada após tratamento com PMA e é associada a inibição da iniciação da tradução e estimulação da tradução dependente de IRES. De fato, a estrutura da UTR 5` de PPAR apresenta características de transcritos que formam IRES. Assim, a produção de PPAR pode ser regulada por IRES e ocorre concomitantemente com a inibição da tradução dependente de cap / The differentiation of THP-1 cells in macrophages, induced by PMA, is associated to overexpression of PPARb. Previous studies have shown that the PPARb 5\' UTR negatively regulates its expression. In our study the translational status of PMA-differentiated THP-1 cells was investigated in association to PPARb overexpression. Putative compatible Kosak initiation codons were identified in the PPARb uORFs and could be involved in the inhibitory effect of 5\' UTR. Decreased incorporation of L-[U-14C]leucine in proteins revealed that the overproduction of PPARb in PMA-differentiated THP-1 cells coincides with a global decrease in the protein synthesis process. Translation impairment was confirmed by polysome profile assay. An intense dephosphorylation of 4E-BP by PMA treatment was observed. Dephosphorylated 4E-BP causes inhibition of eIF4E cap-dependent translation initiation and favors IRES-dependent translation. The PPARb 5\' UTR structure has some characteristics that resemble the one described for IRES. Therefore, the PPARb production may be controlled by IRES
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Sobrevivência, integração e diferenciação neuronal de células-tronco mesenquimais murinas da medula óssea em ratos normais / Neuronal survival, integration and differentiation of mesenchymal stem cells in normal ratsCinthia Elim Jannes Lepski 12 April 2010 (has links)
Introdução. A possiblidade de restauração do Sistema Nervoso Central representa um desafio em Neurociências, e a integração bem sucedida de células-tronco no cérebro adulto tem se tornado um importante objetivo. Objetivo. Testar a hipótese de que a sobrevivência e diferenciação de células-tronco mesenquimais (CTMs) sejam dependentes de condições microambientais de acordo com o alvo de implante no cérebro. Métodos. CTMs foram isoladas de ratos adultos e geneticamente modificadas por meio de transfecção lentiviral para expressarem GFP. O fenótipo neuronal foi satisfatoriamente induzido in vitro. Uma suspensão de células foi implantada estereotaxicamente no cérebro de 40 ratos da mesma linhagem, em uma área neurogênica (hipocampo) e outra não-neurogênica (estriado). Os animais foram sacrificados 6 e 12 semanas após a cirurgia, e os cérebros foram corados com marcadores de neurônios maduros. Células co-expressando NeuN e GFP foram contadas estereologicamente nos dois alvos. Resultados. A população de célula isolada foi capaz de gerar 14,5 ± 1,1 % de neurônios NF200-positivos in vitro. Uma vez implantados no hipocampo, as células migraram além do enxerto e geraram neurônios maduros (1634±231 células GFP/NeuN+). Por outro lado, maciça degeneração celular foi vista no estriado, onde não ocorreu migração significativa, sendo que somente 108±24 NeuN/GFP+ neurônios (p<0.001) foram contados. Conclusão. Nossos dados demonstraram que a sobrevivência e diferenciação de CTMs são altamente dependentes do sítio de implante no cérebro hospedeiro, indicando assim a importância de um microambiente permissivo. Futuros estudos para identificação dos fatores pró-neurogênicos presentes no hipocampo poderão subsequentemente permitir a integração de células-tronco em áreas do SNC nãopermissivas, assim contribuindo para se alcançar o objetivo de introduzir a restauração do SNC na prática clínica. / The possibility of CNS restoration represents a challenge in Neuroscience, and the successful integration of stem cells in adult brain has become an important goal. The working hypothesis of the present study is that survival and neurodifferentiation of mesenchymal stem cells (MSCs) may be dependent upon microenvironmental conditions according to the site of implant in the brain. Methods: MSCs were isolated from adult rats and labeled with eGFP lentivirus. The neuronal phenotype was successfully induced in vitro. A cell suspension was implanted stereotactically into the brain of 40 young rats of the same strain, in neurogenic (hippocampus) and non-neurogenic (striatum) areas. Animals were sacrificed six or twelve weeks after surgery, and brains were stained for mature neuronal markers. Cells co-expressing NeuN-GFP were counted stereologically at both targets. Results: The isolated cell population was able to generate 14.5±1.1% of NF200+-neurons in vitro. Once implanted into the hippocampus, cells migrated away from the graft and gave rise to mature neurons (1634±231 cells GFP/NeuN+). By contrast, massive cell degeneration was seen in the striatum, with no significant migration, while only 108±24 NeuN/GFP+ neurons (p<0.001) were counted. Conclusions: Our data demonstrated that survival and differentiation of MSCs are strongly dependent upon the site of implant in the brain, thus indicating the importance of a permissive microenvironment. Future studies for identification of the pro-neurogenic factors present in the hippocampus could subsequently allow the integration of stem cells into non-permissive areas of the CNS and thus contribute for the challenging goal of introducing CNS repair in the clinical practice.
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